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Patent Searching and Data


Title:
DIRECT DETECTION OF INDIVIDUAL MOLECULES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/086285
Kind Code:
A2
Abstract:
The invention relates to a method for directly detecting an analyte in a sample fluid while flowing inside a microchannel, and to a device suited for implementing said method.

Inventors:
Rigler, Rudolf (Rue du Centre 115 St-Sulpice, CH-1025, CH)
Application Number:
PCT/EP2001/005408
Publication Date:
November 15, 2001
Filing Date:
May 11, 2001
Export Citation:
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Assignee:
Gnothis, Holding SA. (Ecublens, CH-1015, CH)
Rigler, Rudolf (Rue du Centre 115 St-Sulpice, CH-1025, CH)
International Classes:
G01J3/44; G01N21/64; G01N33/53; B01L3/00; C40B40/06; C40B40/10; C40B60/14; (IPC1-7): G01N33/00
Domestic Patent References:
WO1999066318A11999-12-23
WO1999064840A11999-12-16
Foreign References:
US5699157A1997-12-16
US5807677A1998-09-15
EP0953837A11999-11-03
Other References:
RIGLER R: "Fluorescence correlations, single molecule detection and large number screening - Applications in biotechnology" JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, Bd. 41, Nr. 2, 31. Juli 1995 (1995-07-31), Seiten 177-186, XP004036934 ISSN: 0168-1656
GÖSCH, MICHAEL ET AL: ANALYTICAL CHEMISTRY, Bd. 72, Nr. 14, 15. Juli 2000 (2000-07-15), Seiten 3260-65, XP002180726
STERRER S ET AL: "FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY (FCS) - A HIGHLY SENSITIVE METHOD TO ANALYZE DRUG/TARGET INTERACTIONS" JOURNAL OF RECEPTOR AND SIGNAL TRANSDUCTION RESEARCH, MARCEL DEKKER, NEW YORK, NY, US, Bd. 17, Nr. 1/3, 1997, Seiten 511-520, XP000671058 ISSN: 1079-9893
Attorney, Agent or Firm:
WEICKMANN & WEICKMANN (Postfach 860 820 München, 81635, DE)
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Claims:
Ansprüche
1. Verfahren zum direkten Nachweis eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend die Schritte : (a) Inkontaktbringen der Probeflüssigkeit mit einem oder mehreren markierten analytspezifischen Rezeptoren unter Bedingungen, bei denen die Rezeptoren an den Analyten binden können, wobei bei Vorhandensein des Analyten in der Probe ein Analyt RezeptorKomplex gebildet wird, der eine im Vergleich zu nicht an den Analyten gebundenen Rezeptoren höhere Anzahl von Markierungsgruppen enthält, (b) Leiten der Probeflüssigkeit oder eines Teils davon durch einen Mikrokanal unter Bedingungen, bei denen ein vorgegebenes Flussprofil im Mikrokanal vorliegt, und (c) Identifizieren des AnalytRezeptorKomplexes während des Flusses durch den Mikrokanal.
2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt aus Nukleinsãuren, Peptiden, Proteinen und Proteinaggregaten ausgewählt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Analyten in der Probeflüssigkeit < 10 9 Mol/I und insbesondere <_ 1012 Mol/I betragt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung eines Nukleinsãureanalyten als Rezeptoren markierte Sonden mit einer zum Analyten komptementären Sequenz verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere unterschiedliche, vorzugsweise nicht miteinander überlappende markierte Sonden eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Sonden in vorgefertigter Form der Probeflüssigkeit zugesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Sonden in situ erzeugt werden, indem Primer, markierte Nukleotidbausteine und eine NukleinsãurePolymerase der Probeflüssigkeit zugesetzt werden und in Anwesenheit des Analyten eine enzymatische Primerelongation unter Einbau der markierten Nukleotidbausteine erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung eines Analyten ausgewahlt aus Peptiden, Proteinen und Proteinaggregaten als Rezeptoren markierte Antikörper gegen den Analyten verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Rezeptoren in einen molaren Überschuss bezüglich des Analyten eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsgruppen Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe sind.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluss ein hydrodynamischer Fluss ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass der Fluss ein parabolisches Flussprofil aufweist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser des Mikrokanals im Bereich von 1 bis 100, um liegt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussgeschwindigkeit durch den Mikrokanal im Maximum im Bereich von 1 bis 50 mm/sec liegt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Konzentrierung der Analytmoleküle in einem elektrischen Feld erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld in einem Reaktionsraum angelegt wird, von dem die Analytmoleküle in einen Mikrokanal geleitet werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum eine zylindrische oder kegelförmige Gestalt aufweist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Identifizieren des Analyten durch Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in einem oder mehreren konfokalen Raumelementen oder/und durch Time Gating erfolgt.
20. Vorrichtung zum direkten Nachweis eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend : (a) einen Reaktionsraum zum Inkontaktbringen der Probeflüssigkeit mit einem oder mehreren markierten Rezeptoren, wobei bei Vorhandensein des Analyten in der Probe ein AnalytRezeptorKomplex gebildet wird, der eine im Vergleich zu nicht an den Analyten gebundenen Rezeptoren höhere Anzahl von Markierungsgruppen enthalt, (b) Mittel zum Einbrigen von Probeflüssigkeit und Rezeptoren in den Reaktionsraum, (c) einen Mikrokanal, durch den die Probeflüssigkeit oder ein Teil davon mit einem vorgegebenen Flussprofil geleitet werden kann,.
21. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 20 zur Durchführung dieses Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
22. Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszierenden Molekülen in einer einen Mikrokanal durchstrõmenden Probenflüssigkeit, mit einem Laser (106) als FluoreszenzAnregungslichtquelle für die Moleküle, einer optischen Anordnung (114, 116, 120,122) zur Leitung und Fokussierung von Laserlicht des Lasers (106) auf einen Fokalbereich des Mikrokanals (100) und zur konfokalen Abbildung des Fokalbereichs auf eine Fotodetektoranordnung (118) zur Erfassung von Fluoreszenzlicht, welches im Fokalbereich von einem oder ggf. mehreren optisch angeregten Molekülen emittiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anordnung ein Beugungselement (108) oder phasenmodulierendes Element (108) im Strahlengang des Lasers (106) aufweist, welches ggf. in Kombination mit einem oder mehreren optischen Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl des Lasers (106) ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen (112) in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich (1 12) konfokal für die Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung (118) abzubilden.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Fotodetektoranordnung (118) an eine Auswerteeinrichtung (120) angeschlossen ist, die eine Korrelatoreinrichtung zur fluoreszenz korrelationsspektroskopischen Auswertung der Fotodetektorsignale aufweist. korrelationsspektroskopischen Auswertung der Fotodetektorsignale aufweist.
24. Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszierenden Moleküle in einer einen Mikrokanal (154) durchströmenden Probenflüssigkeit, gekennzeichnet durch zwei den Mikrokanal 154 an einander gegenüberliegenden Seiten begrenzenden Wänden (156,162), von denen eine ein Array von vorzugsweise integrierten, in den Mikrokanal (154) emittierenden Laserelementen (152) als FluoreszenzAnregungslichtquellen aufweist und von denen die andere ein Array von vorzugsweise integrierten, den Laserelementen (152) jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen (164) als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweisen.
25. Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserelemente (152) PotenzialtopfLaserelemente (quantum well laser) sind.
26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Fotodetektorelemente (164) AvalancheDioden sind.
Description:
Direkter Nachweis von Einzelmolekülen Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum direkten Nachweis eines Analyten in einer Probeflüssigkeit und eine dafür geeignete Vorrichtung.

Im Rahmen diagnostischer Verfahren erfolgt ein Nachweis von Analyten in biologischen Proben, wobei diese Analyten oftmals nur in sehr geringer Konzentration vorliegen. insbesondere bei Analytkonzentrationen im Bereich : 5 1 0-l'Mol/l, beispielsweise bei Viruspartikeln, ist ein direkter Nachweis des Analyten jedoch problematisch.

Um einen Nukleinsäure-Analyten in sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen, kann die Anzahl der in der Probe vorhandenen Analytmoleküle durch Amplifikationsverfahren wie PCR oder analoge Methoden auf ein Konzentrationsniveau erhöht werden, welches einen Nachweis durch konventionelle Methoden wie etwa Gelelektrophorese oder Sequenzierung ermöglicht. Derartige Amplifikationsverfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig und haben viele Fehlerquellen, sodass das Auftreten von falsch positiven oder falsch negativen Testergebnissen nicht ausgeschlossen werden kann.

Ein direkter Nachweis von einzelnen Analytmolekülen ist mit dem im europäischen Patent 0 679 251 beschriebenen Verfahren zur Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie (FCS) beschrieben. Mittels FCS kann in einem kleinen Messvolumen von beispielsweise < 10-'4 I ein einziges oder nur wenige mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Moleküle nachgewiesen werden. Das Messprinzip der FCS beruht darauf, dass ein kleines Volumenelement der Probeflüssigkeit einem starken Anregungslicht, z. B.

eines Lasers ausgesetzt wird, sodass nur die jenigen Fluoreszenzmoleküle, die sich in diesem Messvolumen aufhalten, angeregt werden. Das emittierte Fluoreszenzlicht aus diesem Volumenelement wird dann auf einen Detektor, z. B. einen Fotomultiplyer abgebildet. Ein Molekül, das sich im Volumenelement befindet, wird sich gemäß seiner charakteristischen Diffusionsgeschwindigkeit mit einer durchschnittlichen, aber für das betreffende Molekül charakteristischen Zeit wieder aus dem Volumenelement entfernen und dann nicht mehr zu beobachten sein.

Wird nun die Lumineszenz ein-und desselben Moleküls wãhrend seiner durchschnittlichen Aufenthaltsdauer in dem Messvolumen mehrmals angeregt, so lassen sich von diesem Molekül viele Signale erfassen.

Um die von der Diffusionsgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle abhängige, zum Teil relativ lange Messzeit zu reduzieren, beschreibt das europäische Patent 0 679 251 verschiedene Verfahren, mit denen die nachzuweisenden Moleküle im Messvolumen aufkonzentriert werden können.) Im Prinzip beruhen diese Verfahren darauf, den nachzuweisenden Analyten durch ein gerichtetes elektrisches Feld vorzukonzentrieren oder aber die unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten der in der Probe vorhandenen Moleküle aufgrund der unterschiedlichen Molekülgrõl3e auszunutzen.

Das deutsche Patent 195 08 366 beschreibt eine Anwendung des FCS- Verfahrens auf den direkten Nachweis von Analyten in einer Probe. Dabei wird eine Testlösung mit einem Gemisch unterschiedlicher kurzer Primer, die jeweils eine zu einem Abschnitt eines Nukleinsäureanalyten komplementäre, sogenannte Antisense-Sequenz aufweisen und mit einem oder mehreren Farbstoffmolekülen markiert sind, bereitgestellt. Diese Testlösung wird mit der Untersuchungslõsung gemischt und das Gemisch zur Hybridisierung der Primer mit den nachzuweisenen Nukfeinsäuresträngen inkubiert. Dann werden die Zielsequenzen in der inkubierten Lösung durch Diskriminieren

weniger, vorzugsweise eines der nachzuweisenden Nukfeinsäurestränge an die bzw. den ein oder mehrere Primer hybridisiert sind, vor dem Hintergrund der nicht hybridisierten Primer mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie identifiziert. Die Identifizierung erfolgt vorzugsweise mittels FCS, wobei ein Messvolumenelement von vorzugsweise 0,1 bis 20 x 10-15 I der inkubierten Lösung einem Anregungslicht des Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Markierungsgruppen zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Diffusionsgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Eine Verbesserung der Sensitivität kann durch Anlegen elektrischer Felder an die Probeflüssigkeit erreicht werden, beispielsweise durch eine kapillarelektrophoretische Trennung von ungebundenen Markierungen und an Analytmoleküle gebundenen Markierungen, wobei eine Kapillare mit einer Spitzenöffnung von < 0,01 mm vor das Messvolumen plaziert und in der Kapillare ein elektrisches Gleichfeld erzeugt wird, das die an den Analyten gebundene Markierungen in Richtung auf das Messvolumen bewegt.

Obwohl sich das im deutschen Patent 195 08 366 beschriebene Verfahren bewährt hat, besteht-insbesondere für die Bestimmung von sehr geringen Analytkonzentrationen-ein Bedürfnis, die Sensitivität des Nachweises weiter zu verbessern.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zum Nachweis eines gering konzentrierten Analyten in einer Probeflüssigkeit bereitzustellen, welches einerseits die mit Amplifikationsprozeduren verbundenen Nachteile vermeidet und andererseits eine verbesserte Sensitivität besitzt.

Gelost wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum direkten Nachweis eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend die Schritte : (a) Inkontaktbringen der Probeflüssigkeit mit einem oder mehreren markierten analytspezifischen Rezeptoren unter Bedingungen, bei denen die Rezeptoren an den Analyten binden können, wobei bei Vorhandensein des Analyten in der Probe ein Analyt-Rezeptor- Komplex gebildet wird, der eine im Vergleich zu nicht an den Analyten gebundenen Rezeptoren höhere Anzahl von Markierungsgruppen enthãlt, (b) Leiten der Probeflüssigkeit oder eines Teils davon durch einen Mikrokanal unter Bedingungen, bei denen ein vorgegebenes Flussprofil im Mikrokanal vorliegt, und (c) Identifizieren des Analyten über die Bindung von Rezeptor während des Flusses durch den Mikrokanal.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Analyten, die in extrem geringen Konzentrationen von beispielsweise < 10-9 Mol/I und insbesondere <_ 10-'2 Mol/I in der Probeflüssigkeit vorliegen. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist hoch genug, dass sogar Analytkonzentrationen bis zu 1 Moll oder 10-15 Mol/l nachgewiesen werden können. Die Analyten sind vorzugsweise Biopolymere, wie etwa Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und Proteinaggregate, Zellen, subzelluläre Partikel, z. B. Virionen etc. Besonders bevorzugt sind die Analyten Nukleinsäuren, z. B. Nukleinsäuren von pathogenen Mikroorganismen, beispielsweise virale Nukleinsäuren. Die Probeflüssigkeit ist vorzugsweise eine biologische Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit wie etwa Blut, Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Lymphe oder ein Gewebeextrakt.

Der Nachweis des Analyten erfolgt durch Bindung mit markierten analytspezifischen Rezeptoren, wobei ein Analyt-Rezeptor-Komplex gebildet wird, der vor dem Hintergrund nicht analytgebundener Rezeptoren nachweisbar ist. Als Markierungsgruppen kommen insbesondere nicht

radioaktive Markierungsgruppen und besonders bevorzugt durch optische Methoden nachweisbare Markierungsgruppen, wie etwa Farbstoffe und insbesondere Fluoresenzmarkierungsgruppen, in Betracht. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungsgruppen sind Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Fluorescein und andere in diagnostische Verfahren übliche Fluoreszenzfarbstoffe.

Der markierte Rezeptor ist für den nachzuweisenden Analyten spezifisch, d. h. er bindet unter den Testbedingungen mit ausreichend hoher Affinität und Selektivität an den nachzuweisenden Analyten, um eine Bestimmung zu ermöglichen.

Zur Bestimmung eines Nukleinsäureanalyten werden beispielsweise als Rezeptoren vorzugsweise markierte Sonden mit einer zum Analyten komplementären Sequenz verwendet, wobei diese Sonden Oligonukleotide oder Nukleotidanaloga z. B. Peptidnukleinsäure (PNA) umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere unterschiedliche, vorzugsweise nicht miteinander überlappende markierte Sonden mit einer Länge von vorzugsweise 10 bis 50 und besonders bevorzugt 15 bis 20 Nukleotid-oder Nukleotidanalog-Bausteinen eingesetzt werden. Dabei können beispielsweise insgesamt 5 bis 200, vorzugsweise 10 bis 100 verschiedene Sonden eingesetzt werden, die gegebenenfalls unterschiedliche, aber gemeinsam nachweisbare Markierungsgruppen tragen können.

Als Rezeptoren verwendete markierte Sonden können der Probeflüssigkeit in vorgefertigter Form zugesetzt werden. Andererseits können die markierten Sonden auch in situ, d. h. in der Probeflüssigkeit abhängig vom Vorhandensein des Analyten erzeugt werden. Hierzu werden vorzugsweise unmarkierte Primer, markierte Nukleotidbausteine und eine entsprechende Nukleinsäure-Polymerase, z. B. eine DNA-Polymerase oder eine Reverse Transkriptase, der Probeflüssigkeit zugesetzt, sodass in Anwesenheit des

Analyten der Primer an den Analyten bindet und eine enzymatische Primerelongation unter Einbau mehrerer markierter Nukleotidbausteine stattfindet. Die auf diese Weise in situ erzeugte markierte Sonde enthalt mehrere Markierungsgruppen und kann z. B. aufgrund der höheren Ftuoreszenzintensität von einem nicht an die Sonde eingebauten Nukleotid diskriminiert werden.

Auch andere Arten von Analyten, z. B. Peptide, Proteine und Proteinaggregate, können unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher, vorzugsweise nicht miteinander kompetierender markierter Rezeptoren, beispielsweise Antikõrper bestimmt werden.

Die markierten Rezeptoren werden günstigerweise in einem molaren Überschuss bezüglich des Analyten, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 100 nM, eingesetzt. Außerdem ist bevorzugt, dass die markierten Rezeptoren oder im Falle von in situ erzeugten Rezeptoren die markierten Rezeptorbausteine sich in physikalisch-chemischen Parametern wie Molekulargewicht oder/und Ladung von Analyt-Rezeptor-Komplexen unterscheiden, sodass durch Einstellung entsprechender Flussbedingungen eine Vorkonzentrierung der Analyt-Rezeptor-Komplexe mõglich wird.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Probeflüssigkeit oder ein Teil davon durch einen Mikrokanal geleitet wird und der Ana ! yt während des Flusses durch den Mikrokanal identifiziert wird. Der Fluss ist vorzugsweise ein hydrodynamischer Fluss, der Fluss kann jedoch auch ein elektroosmotischer Fluss sein, der durch einen elektrischen Feldgradienten erzeugt wird. Weiterhin ist eine Kombination von hydrodynamischem Fluss und Feldgradienten möglich. Der Fluss durch den Mikrokanal weist vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d. h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im Zentrum des Mikrokanals und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeitab. Die Flussgesch windigkeit d urch den Mikrokanal

liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 mm/sec, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/sec. Der Durchmesser des Mikrokanals liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100, um, besonders bevorzugt von 10 bis 50, um. Vorzugsweise wird die Messung in einem linearen Mikrokanal mit im Wesentlichen einem konstanten Durchmesser durchgeführt.

Gegebenenfalls kann vor der Analytbestimmung im Mikrokanal noch zusätzlich eine Konzentrierung der Analytmoleküle durch Anlegen eines elektrischen Feldgradienten erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dieser elektrische Feldgradient in einem Reaktionsraum angelegt, von dem die Analytmoleküle dann in einen Mikrokanal geleitet werden. Der Reaktionsraum kann eine zylindrische oder kegelformige Gestalt aufweisen, z. B. die Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Der elektrische Feldgradient kann durch zwei Elektroden im Reaktionsraum erzeugt werden, wobei eine Elektrode als Ringelektrode konzentrisch um den oberen Teil des Reaktionsraums angeordnet sein kann, während die zweite Elektrode am Boden des Reaktionsraums als Punktelektrode oder Ringelektrode mit kleinerem Durchmesser angeordnet sein kann. Am Boden des Reaktionsraums befindet sich eine Öffnung mit dem Mikrokanal, durch den die im elektrischen Feld vorkonzentrierten Teilchen durch Saugwirkung oder Anlegen von Druck oder durch Anlegen eines weiteren elektrischen Feldes geleitet und bestimmt werden.

Die Identifizierung des Analyt-Rezeptor-Komplexes gemãß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels einer beliebigen Messmethode, z. B. mit einer orts-und/oder zeitaufge) östen Ffuoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanal vorliegt, sehr geringe Signale von Markierungsgruppen, insbesondere Fluoreszenzsignale bis hinunter zur Einze) photonenzäh) ung zu erfassen. Wichtig ist dabei, dass die von ungebundenen Rezeptoren oder

Rezeptorbausteinen stammenden Signale sich deutlich von denen unterscheiden, die von den Analyt-Rezeptor-Komplexen verursacht werden.

Beispielsweise kann die Detektion mittels Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie erfolgen, bei der ein sehr kleines Volumenelement, beispielsweise 0,1 bis 20 x 10-'2 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen.

Alternativ kann die Detektion auch durch eine zeitaufgetöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al.,"Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in :"Ultrafast Phenomenes", D. H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend-vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von 2 100 ps-das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermögtichen. Das Time Gating ist besonders zur Messung von Quench-oder Energietransfervorgängen geeignet.

Die Detektion erfolgt unter Bedingungen, bei denen zwischen analytgebundenen Rezeptoren und nicht analytgebundenen Rezeptoren diskriminiert werden kann. Diese Diskriminierung von Analyt-Rezeptor- Komplexen und ungebundenen Rezeptormolekülen erfolgt dadurch, dass der Komplex eine Vielzahl von Markierungsgruppen enthãlt, wãhrend ein ungebundener Rezeptor bzw. im Falle eines in situ erzeugten Rezeptors, ein Rezeptorbaustein nur eine erheblich geringere Anzahl von Markierungsgruppen, üblicherweise nur eine einzige Markierungsgruppe, aufweist. Diese unterschiedliche F) uoreszenzintensität zwischen Analyt- Rezeptor-Komplex und ungebundenem Rezeptor ermöglicht die Einstellung eines Cut-off-Werts im Detektor, d. h. der Detektor ist so eingestellt, dass er das Vorhandensein von nur einer einzigen Markierungsgruppe im Detektionsbereich nur als Hintergrundrauschen registriert, während die höhere Anzahl von Markierungsgruppen in Analyt-Rezeptor-Komplex als positives Signal erkannt wird.

Eine erfindungswesentliche Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeitvon Analyt-Rezeptor-Komplexen und somit eine Verbesserung der Sensitivität wird durch Einstellung des vorgegebenen Flussprofils im Mikrokanal und gegebenenfalls geeigneten Vorkonzentrierungsmaßnahmen erreicht.

Aufgrund der-z. B. durch unterschiedliches Molekulargewicht oder/und unterschiedliche Ladung-des Komplexes aus Analytmolekül und Rezeptor (en) im Vergleich zu den meist kleineren ungebunden Rezeptoren bzw. im Falle von in situ erzeugten Rezeptoren, den kleineren Rezeptorbausteinen zeigen sich Unterschiede im Wanderungsverhalten durch das elektrische Feld oder/und den Mikrokanal, die dazu führen, dass eine Aufkonzentrierung der Analyt-Rezeptor-Komplexe um mindestens den Faktor 104 gegenüber der unbehandelten Probefiüssigkeit erfolgt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum direkten Nachweis eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend :

(a) einen Reaktionsraum zum Inkontaktbringen der Probeflüssigkeit mit einem oder mehreren markierten Rezeptoren, wobei bei Vorhandensein des Analyten in der Probe ein Analyt-Rezeptor- Komplex gebildet wird, der eine im Vergleich zu nicht an den Analyten gebundenen Rezeptoren höhere Anzahl von Markierungsgruppen enthãlt, (b) Mittel zum Einbrigen von Probeflüssigkeit und Rezeptoren in den Reaktionsraum, (c) einen Mikrokanal, durch den die Probeflüssigkeit oder ein Teil davon mit einem vorgegebenen Flussprofil geleitet werden kann, (d) Mittel zur Identifizierung von Analyt-Rezeptor-Komplexen während des Flusses durch den Mikrokanal.

Die Vorrichtung enthält vorzugsweise automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz-oder Kühleinrichtungen wie Peltier- Elemente, Reservoirs und gegebenenfatls Zufuhrleitungen für Probeflüssigkeit und Reagenzien sowie elektronische Auswertungsgeräte.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können für alle diagnostischen Verfahren zum direkten Nachweis von Analyten eingesetzt werden.

Weitere Gesichtspunkte der Erfindung sind in den Ansprüchen 22 bis 26 angegeben.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen : Figur 1 zwei Ausführungsformen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. (A) : Der Analyt (1), beispielsweise ein Nukleinsãuremolekül wie etwa eine Virus-DNA, wird mit einer Vielzahl von Rezeptorsonden (2a, 2b, 2c) in Kontakt gebracht, die gleiche oder

unterschiedliche Markierungsgruppen tragen und gleichzeitig an den Analyten binden können. (B) : Der Nukleinsãure-Analyt wird mit einem dazu komplementãren Primer (4), markierten Nukleotidbausteinen (6) und einem zur Primerelongation geeigneten Enzym (nicht gezeigt) in Kontakt gebracht.

Durch enzymatische Primerelongation wird ein verlãngertes, mehrere Markierungsgruppen tragendes zum Analyten kompiementäres Rezeptormolekül erzeugt. Beiden Ausführungsformen ist gemeinsam, dass der bei Vorhandensein des Analyten gebildete Analyt-Rezeptor-Komplex eine höhere Anzahl von Markierungsgruppen als die bei Abwesenheit des Analyten vorliegenden Rezeptormoleküle bzw. Rezeptorbausteine aufweist.

Figur 2 die schematische Darstellung des Nachweises von Analyt- Rezeptor-Komplexen in einem Mikrokanal. In einem Mikrokanal (10) mit einem vorgegebenen Flussprofil wandern die Analyt-Rezeptor-Komplexe (12) zu einem Detektionsvolumen (14). Im Detektionsvolumen (14) erfolgt mittels eines Detektors (16) der Nachweis. Der Detektor kann beispielsweise eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Apparatur mit einem Laser, der über einen Strahlteiler und eine konfokale Abbildungsoptik das Detektionsvolumen ausleuchtet, und auf einen Fotodedektor abbildet, umfassen.

Figur 3 die schematische Darstellung einer bevorzugten Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. (A) : Die Vorrichtung enthalt einen Reaktionsraum (18), in dem Probeflüssigkeit und Rezeptormoleküle in Kontakt gebracht und anschließend durch Druck oder Saugwirkung oderdurch Anlegen eines weiteren elektrischen Feldgradienten in den Mikrokanal (20) zur Detektion wie in Figur 2 gezeigt, weiter geleitet werden können. Im Reaktionsraum erfolgt eine Vorkonzentrierung durch Anlegen eines elektrischen Feldgradienten zwischen den Elektroden (22) und (24). Die Elektrode (22), üblicherweise die Anode, kann ringförmig um den oberen Bereich des Reaktionsraums (18) herum ausgebildet sein. Die Elektrode (24), üblicherweise die Kathode, befindet sich am Boden des

Reaktionsraums und kann beispielsweise als Metallschicht und gegebenenfalls ebenfalls in Form eines Ringes ausgebildet sein. (B) : Die Vorrichtung (26) kann eine Vielzahl von Reaktionsräumen (18) wie in Figur 3 (A) dargestellt, enthalten, um eine parallele Prozessierung einer Vielzahl von Proben, beispielsweise 10 bis 100 Proben zu ermöglichen.

Fig. 4 zeigt in schematisierter und stark vereinfachter Darstellung eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszierenden Molekülen, insbesondere Einzelmolekülen, in einer einen Mikrokanal durchströmenden Probenflüssigkeit.

Gemäß Fig. 4 ist der (senkrecht zur Zeichenebene verlaufend dargestellte) Mikrokanal 100 in einem Träger 102 ausgebildet, der an der Seite 104 zum Mikrokanal 100 hin lichtdurchlässig zumindest für die hier interessierenden Wellenlängen des Anregungslichtes für die Fluoreszenzanregung und für die Wellenlängen des Fluoreszenzlichtes ist.

Die Vorrichtung nach Fig. 4 umfasst als Lichtquelle einen Laser 106, in dessen Strahlengang ein optisches Beugungselement oder phasenmodulierendes Element 108 angeordnet ist, welches aus dem Laserstrahl 110 durch Lichtbeugung ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von"Fokalpunkten"1 12 erzeugt.

Die von dem Beugungselement 108 ausgehenden gebeugten bzw. phasenmodulierten Strahlen werden durch einen dichroischen bzw. wellenlängenselektiven Spiegel 114 zum Mikrokanal 100 hin reflektiert, wobei die Anordnung vorzugsweise so getroffen ist, dass die Fokalpunkte (nachstehend auch als konfokale Volumenelemente 1 12 bezeichnet) über den Querschnitt des Mikrokanals 100 hinweg einen im Wesentlichen lückenlosen"Detektionsvorhang"bilden. Jedes den Mikrokanal 100 in einer betreffenden Probenlösung durchwandernde Molekül muss somit den "Detektionsvorhang", also wenigstens eines der konfokalen Volumenelemente 112 passieren. Handelt es sich bei dem betreffenden

Molekül um eines, das von dem Laserlicht zur Fluoreszenz angeregt wird, so kann die Präsenz eines solchen Moleküls durch Erfassung und Auswertung des Fluoreszenzlichts nachgewiesen werden.

Das Fluoreszenzlicht kann den dichroischen Spiegel in Richtung nach oben hin in Fig. 4 passieren.

An einer zu den konfokalen Volumenelementen 112 jeweils konjugierten Stelle sind gemäß Fig. 4 Lochblenden 116 in Zuordnung zu den konfokalen Volumenelementen 1 12 vorgesehen. Im optischen Strahlengang hinter den Lochblenden 116 befindet sich eine Fotodetektoranordnung 1 18, bei der es sich um eine Gruppe einzelner oder zu einer Matrix (Array) auf einem Chip integrierter Avalanche-Fotodetektoren (Avalanche-Dioden) handeln kann.

Eine Steuereinrichtung bzw. Auswerteeinrichtung 120 wertet die Ausgangssignale der Fotodetektoranordnung 118 aus. Die Auswerteeinheit 120 enthalt Mittel zur Korrelation der Signale, so dass die Vorrichtung 4 zur Durchführung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, wie sie beispielsweise in Bioimaging 5 (1997) 139-152"Techniques for Single Molecule Sequencing", K) aus Dörre et al, prinzipiell erlãutert ist.

Bei der Vorrichtung gemäß Fig. 4 folgt eine konfokale Abbildung der Messvolumina bzw. konfokalen Volumenelemente 1 12 auf die betreffenden Fotodetektorelemente der Anordnung 1 18. Fluoreszenzlicht, welches von einem oder ggf. mehreren Molekülen ausgeht, die in betreffenden Volumenelementen 112 durch das Laserlicht zur Fluoreszenz angeregt wurden, wird über den dichroischen Spiegel 114 in die zu den betreffenden fokalen Volumenelementen 112 konjugierten Lochblenden 116 und schließlich auf das zugeordnete Element der Detektoranordnung 118 abgebildet. 120 und 122 bezeichnen in Fig. 4 schematisch dargestellte Abbildungelemente. Die Auswerteeinheit 120, bei der es sich z. B. um einen Personal Computer mit einer Korrelatorkarte handeln kann, wertet die Ausgangssignale der Detektoranordnung 118 aus, um Informationen über

die Präsenz bestimmter fluoreszierender Moleküle, insbesondere Einzelmolekule, bereitstellen zu können.

In Fig. 5 ist eine Abwandlung der Vorrichtung aus Fig. 4 dargestellt.

Anstelle der Lochblendenanordnung 116 aus Fig. 4 weist die Anordnung gemäß Fig. 5 ein entsprechend angeordnetes Array von Lichtleitfasern (Glasfiberbündeln) 1 17 auf, deren Lichteintrittsftächen an den zu den zugeordneten konfokalen Volumenelementen 112 konjugierten Stellen liegen. Die Lichtleitfasern sind optisch mit einer Fotodetektoranordnung 118 verbunden, welche der Fotodetektoranordnung 1 18 aus Fig. 4 entsprechen kann. Im Übrigen entspricht die Vorrichtung nach Fig. 5 der Vorrichtung nach Fig. 4. Beide Vorrichtungen eignen sich zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-19 und ganz aligemein zur Durchführung von Verfahren, bei denen es auf den Nachweis von Molekülen in hochverdünnten Probentösungen, insbesondere um den Nachweis von Einzelmolekülen, beispielsweise bei der Sequenzierung von Nukleinsãuren, geht.

Anzumerken ist ferner noch, dass es sich bei den Fotodetektorelementen nicht unbedingt um Avalanche-Dioden handeln muss, sondern dass alternativ auch andere Detektoren, z. B. Fotomultiplyer, CCD-Sensoren usw. zum Einsatz kommen können.

In Fig. 6 ist eine weitere Ausführungsform einer Nachweisvorrichtung nach der Erfindung für den Nachweis von Molekülen in hochverdünnten Probenlõsungen, insbesondere Einzelmolekülen, dargestellt. Die Anordnung nach Fig. 6 umfasst ein Substrat oder einen Träger 150 mit einem linearen oder zweidimensionalen Array von oberffächenemittierenden Lasern, insbesondere Potenzialtopf-Lasern (quantum well laser) 152, die an der den Mikrokanal 154 begrenzenden Fläche 156 Licht in den Mikrokanal 154 emittieren. Der Mikrokanal 154 erstreckt sich senkrecht zur Zeichenebene

in Fig. 6. Jedes Laserelement 152 deckt aufgrund seiner Strahlungscharakteristik mit seinem Strahlungsfeld einen bestimmten Volumenbereich des Mikrokanals 154 ab. Die von den Laserelementen 152 ausgeleuchteten Volumenelemente sollten so eng nebeneinander liegen oder ggf. einander überlappen, dass sie in ihrer Gesamtheit einen möglichst lückenlosen"Detektionsvorhang"in dem Sinne bilden, dass jedes Analytmolekül den Mikrokanal 154 nur unter Durchgang durch ein betreffendes Volumenelement passieren kann.

In dem Substratbereich oder Trägerbereich 160 sind an der der Fläche 156 gegenüberliegenden Kanalbegrenzungswand 162 Fotodetektoren 164 zu einem Array gruppiert, welches geometrisch im Wesentlichen dem Array von Laserelementen 152 entspricht, so dass einem jeweiligen Laserelement 152 ein jeweiliges Fotodetektorelement 164 gegenüberliegend zugeordnet ist. Bei den Fotodetektoren 164 handelt es sich vorzugsweise um integrierte Avalanche-Fotodioden.

Vorzugsweise bilden die bisher unter Bezugnahme auf Fig. 6 beschriebenen Elemente Bestandteile eines integrierten Chip-Bauteils mit (nicht gezeigten) Anschlüssen für die Energieversorgung und Steuerung der Laserelemente 152 und für die Energieversorgung und Signalableitung der Fotodetektorelemente 164.

Die von den Fotodetektoren 164 erhaltenen Signale können mittels einer an dem Chip-Bauteil angeschlossenen Auswerteeinheit ausgewertet werden, wobei die Auswerteeinheit vorzugsweise eine Korrelatoreinrichtung umfasst, so dass sich die in Fig. 6 gezeigte Anordnung zur Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie (FCS) eignet.

Die Laserelemente 152 stellen die Anregungslichtquellen für die Fluoreszenzanregung der den Mikrokanal 154 durchströmenden, zur Fluoreszenz fähigen Moleküle dar. Die Fotodetektorelemente 164 sind für

Licht der betreffenden Fluoreszenzwellenlänge bzw-.

Fluoreszenzwellenlãngen empfindlich. Die Anordnung kann ggf.

Spektralfilter enthalten, um eine Wellenlãngenselektivitãt der Detektorelemente 164 zu realisieren.

Die Anordnung nach Fig. 6 kann zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-19 verwendet werden und darüber hinaus ganz aligemein zur Durchführung von Verfahren, bei denen es um den Nachweis von Molekülen in hochverdünnten Probenlösungen, insbesondere von Einzelmolekülen, geht.

Es sei noch auf eine mögliche Abwandlung der Vorrichtungen gemäß Fig.

4 und Fig. 5 hingewiesen. Diese Abwandlung besteht darin, dass-ähntich wie bei dem Kanal 154 in Fig. 6-Laserelemente 152, wie sie in Fig. 5 gestrichelt gezeichnet angedeutet sind, auch unmittelbar an dem Kanal 100 vorgesehen sind. Dies können z. B. Potenzialtopf-Laserelemente sein, die in einem den Kanal 100 enthaltenden Substrat 102 integriert sind. Auf die Elemente 106 und 108 kann dann verzichtet werden.

Es sei darauf hingewiesen, dass den Vorrichtungen nach den Figuren 4-6 und den erwähnten Abwandlungen ggf. selbständige Bedeutung im Rahmen der Erfindung zukommt.