本発明の実施の一形態について説明すれ� ��、以下のとおりである。しかし、本発明の� ��囲はこれらの説明に拘束されることはなく� ��以下の例示以外についても、本発明の趣旨� ��損なわない範囲で適宜変更して実施するこ� ��ができる。

 〔本発明に係るDNA断片〕
 本発明に係るDNA断片は、ヘアピン構造を形� ��する一本鎖DNA断片であって、ヘアピン構造� ��にバルジ構造を有するものであればよく、� ��れを核酸増幅反応に用いるプライマーの5’ 末端に結合して用いればよい。

 本発明に係るDNA断片が有するヘアピン構� ��は、一本鎖のDNAが分子内で対合して、DNAの� ��状領域と二本鎖領域が形成されることによ� ��なる。そして、本発明に係るDNA断片は、当� ��二本鎖領域中にバルジ構造を有する。

 本発明に係るDNA断片の有するヘアピン構� ��を構成する塩基の数は、DNAの弧状領域及び� ��本鎖領域を形成し、さらに当該二本鎖領域� ��にバルジ構造を有する限り、限定されるも� ��ではないが、24~33であることが好ましく、� �らに好ましくは24~28である。24以上であれば� ��DNAの弧状領域、二本鎖領域及びバルジ構造� ��好適に形成することができ、33以下であれ� �、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。

 また、上記弧状領域のDNAを構成するDNAの� ��基配列は、弧状領域の形成が可能である限� ��、特に限定されるものではないが、構成す� ��塩基の数は、3~7が好ましく、さらに好まし� ��は4である。そして、4個の塩基により上記� �状領域が形成される場合、その配列は、TTTT� ��らなる配列であることが好ましい。TTTTによ る弧状領域を備えるヘアピン構造は、核酸増 幅反応において良好に伸長されるからである 。

 本発明に係るDNA断片の塩基配列は、以下� ��ようにして設計すればよい。

 例えばCCAAXXXXTTGG(Xは任意の塩基)のように� ��任意の塩基配列の両端に、互いに対合可能� ��塩基配列を設計する。そして、CCAA又はTTGG� �の任意の位置にバルジ塩基が含まれるよう� �設計する。このように設計することにより� �XXXXが湾曲して弧状領域を形成し、CCAAとTTGG� �がハイブリダイズして二本鎖領域を形成し� �当該バルジ塩基が含まれることでバルジ構� �が形成される。

 つまり、弧状領域を形成するDNAに対応す� ��塩基配列の両端に、互いにハイブリダイズ� ��能な塩基配列を設計し、ハイブリダイズす� ��領域の塩基配列にバルジ塩基が含まれるよ� ��に設計する。このように設計した塩基配列� ��基づいてDNA断片を合成することで本願発明� ��係るDNA断片を得ることができる。なお、DNA� ��片の合成は、従来公知の方法、装置を用い� ��行なえばよく、例えば化学合成により合成� ��ればよい。

 なお、上の例では、本発明に係るDNA断片� ��、DNAの弧状領域と、バルジ構造を含む二本� ��領域とにより形成されるヘアピン構造のみ� ��らなる場合について説明した。この例のよ� ��に、本発明に係るDNA断片はヘアピン構造の� ��からなることが最も好ましいが、ヘアピン� ��造の3’末端及び/又は5’末端に、さらなる� ��酸が連結していてもよい。当該さらなる核� ��を含む場合は、その塩基の数は、3’末端、 5’末端それぞれにおいて、1~20であることが� ��ましい。この範囲であれば、核酸増幅反応� ��影響を及ぼさない。

 本明細書において「バルジ構造」とは、D NAの二本鎖領域において、一方の鎖のDNAに、� ��剰の塩基が存在するために生じるふくらみ( バルジ)をいう。例えば、TCT部分とAA部分とを 有するDNA断片が折れ曲がってヘアピン構造を 形成し、上記TCT部分とAA部分とが向かい合う� ��置となった場合、TCT部分の二つのTとAA部分� ��二つのAとがそれぞれ対合する。その結果、 当該二つのTの間に存在するCは対合する塩基� ��無いため、当該Cの部分が膨らむこととなる 。この膨らんだ構造がバルジ構造である。な お、この例のように余剰の塩基がC(シトシン) であることにより形成されるバルジ構造を、 本明細書において「シトシンバルジ構造」と 表記する。A(アデニン)、G(グアニン)、T(チミ� ��)についても同様に、「アデニンバルジ構造 」等と表記する。また、本明細書において「 バルジ塩基」とは、バルジ構造中の余剰の塩 基をいう。

 (バルジ構造の数)
 本発明に係るDNA断片が有するバルジ構造の� ��は、1つのみでもよいが、複数であることが 好ましく、さらに好ましくは、2~4個である。 バルジ構造を複数備えることで、後述するバ ルジ構造結合分子が結合可能な部位が増える ため、高感度な上記ヘアピンプライマーの検 出が可能となる。

 バルジ構造を複数備える場合、隣り合う� ��ルジ塩基の間には、好ましくは3~5、さらに� ��ましくは4の塩基が存在することが好ましい 。バルジ構造が近接しすぎると、後述するバ ルジ構造結合分子がそれぞれのバルジ構造に 良好に結合することが妨げられる。バルジ塩 基間の間隔が広すぎると、ヘアピン構造が安 定になり、ヘアピンの伸長が良好に行われな い恐れがあり、また、本発明に係るDNA断片が 大きくなり、合成コストが高くなる。

 (バルジ構造の種類及びそれを形成する配列 )
 本発明に係るDNA断片が備えるバルジ構造は� ��アデニンバルジ構造、シトシンバルジ構造� ��チミンバルジ構造、グアニンバルジ構造の� ��ずれでもよい。

 チミンバルジ構造又はシトシンバルジ構� ��の場合、後述するナフチリジン環を有する� ��合物が結合すると、当該蛍光分子から発光� ��れる蛍光強度の吸収極大波長がシフトする� ��よって、核酸増幅反応の前後で、シフトし� ��吸収極大波長における蛍光が弱くなれば、� ��酸増幅が得られたものと確認できる。

 また、アデニンバルジ構造、グアニンバ� ��ジ構造の場合、後述するナフチリジン環を� ��する化合物が結合すると消光し、結合して� ��ない状態で蛍光を発光する。よって、核酸� ��幅反応後の蛍光が、核酸増幅反応前より強� ��なれば核酸増幅を得ることができたものと� ��認できる。

 本発明に係るDNA断片が有するバルジ構造� ��、シトシンバルジ構造であることが好まし� ��。後述する2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリジンは� ��光物質であり、シトシンバルジ構造に結合� ��ることで、蛍光の吸収極大波長がシフトし� ��シフトした波長において強い強度の蛍光を� ��光する。そのため、2,7-ジアミノ-1,8-ナフチ� ��ジンを用いることで、特異的かつ高感度な� ��酸増幅の検出が可能となるからである。

 本発明に係るDNA断片が有するシトシンバ� ��ジ構造を形成するための塩基配列は、シト� ��ンバルジ構造が形成される限り、限定され� ��ものではないが、一本鎖DNA断片中のTCT配列� ��おける二つのTとAA配列における二つのAとが 、T-A塩基対で、当該DNA断片の分子内で対合(� �子内対合)し、TとTとの間に位置するCがバル� ��塩基となることで、シトシンバルジ構造が� ��成されることが好ましい。DNAのTCT配列とAA� �列におけるT-A塩基対の対合により形成され� �シトシンバルジ構造を含むヘアピン構造は� �安定であるためバルジ構造結合分子が良好� �結合し、かつ、過度に安定ではないため、� �酸増幅反応によるヘアピン構造の伸長が、� �好に行なわれるからである。また、後述す� �ナフチリジン環を有する化合物を用いた場� �、得られる蛍光波長が、より長波長となる� �め、測定感度が向上するからである。

 (本発明に係るDNA断片の塩基配列の具体例)
 以上に述べた本発明に係るDNA断片の塩基配� ��の具体例としては、配列番号1~5に示す塩基� ��列を挙げることができる。これらの中では� ��DNAのTCT部分とAA部分の対合によりシトシン� �ルジ構造が形成されていることから、配列� �号1~4に示す塩基配列が好ましく、さらに好� �しくは、シトシンバルジ構造を複数形成す� �配列番号1~3に示す塩基配列が好ましい。

 〔本発明に係るヘアピンプライマー〕
 本明細書において「ヘアピンプライマー」� ��は、核酸増幅反応に用いるプライマーの5’ 末端に、本発明に係るDNA断片を結合させたも のが意図される。

 本発明に係るヘアピンプライマーは、標� ��とする核酸を増幅可能なように、任意に設� ��した核酸増幅反応に用いるプライマーの5’ 末端に、本発明に係るDNA断片を結合させたも のであればよい。

 即ち、従来公知の設計手法により、核酸� ��幅反応に用いるプライマーを設計して、当� ��プライマーの5’末端に、上述の本発明に係 るDNA断片を結合すればよい。

 なお、核酸増幅反応に用いるプライマー� ��、本発明に係るDNA断片を結合する方法は、� ��来公知のDNAリガーゼを用いればよい。また� ��本発明に係るDNA断片と、核酸増幅反応に用� ��るプライマーとが連なった塩基配列に基づ� ��連続して化学合成しても本発明に係るヘア� ��ンプライマーを得ることができる。

 本発明に係るヘアピンプライマーは、様� ��な核酸増幅反応に好適に用いることができ� ��。上記核酸増幅反応としては、例えば、Nest ed-PCR、逆転写PCR、ホットスタートPCR、Taq Man� �PCR等のPCR、ICAN法、UCAN法、LAMP法等が挙げら� �る。中でもPCRに好適に用いることができる� �PCRは核酸増幅反応の中でも簡便に行なうこ� �ができるため、PCRに本発明に係るヘアピン� �ライマーを用いることで、標的となる核酸� �増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便� �行なうことができる。

 〔本発明に係る核酸増幅確認方法〕
 本発明に係る核酸増幅確認方法は、本発明� ��係るヘアピンプライマーを、少なくとも一� ��のプライマーとするプライマーセットを含� ��核酸増幅反応液を調製する工程と、バルジ� ��造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液� ��のヘアピンプライマーの量を測定する反応� ��ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅� ��応を行なう工程と、バルジ構造結合分子を� ��いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅� ��応液中のヘアピンプライマーの量を測定す� ��反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含� ��ばよい。

 核酸増幅反応によって、本発明に係るヘ� ��ピンプライマーが備えるバルジ構造は伸長� ��れる。そのため、バルジ構造結合分子を用� ��れば、核酸増幅反応前後における、上記反� ��液中のバルジ構造の量、ひいてはヘアピン� ��ライマーの量を比較することができる。即� ��、ヘアピンプライマーの量が、当該増幅反� ��前に比べて当該増幅反応後で減少していれ� ��、核酸の増幅が生じたことが確認でき、減� ��していなければ、核酸の増幅が生じなかっ� ��ことが確認できる。

 以下に、本発明に係る核酸増幅確認方法� ��一実施形態を、図1に基づいて説明する。

 図1は、本実施の形態に係る核酸増幅確認 方法の原理を模式的に表した図である。なお 、図1では核酸増幅反応としてPCRを用いた場� �を示している。

 図1の(1)において、下側の線分は増幅対象 の核酸を含むDNAを示している。即ち、図1の(1 )は、当該核酸を増幅可能なプライマーの5’� ��端に、シトシンバルジ構造を含むヘアピン� ��造を形成した本発明に係るDNA断片が結合し� ��本発明に係るヘアピンプライマーと、解析� ��象の核酸とがアニールしている状態を示し� ��いる。そして、伸長反応により破線方向に� ��補鎖が合成される。

 次いで、図1の(2)に示すように、図1の(1)� �合成されたDNA鎖にリバースプライマーがア� �ールし、破線方向、つまり図1の(1)と逆方向� ��DNA鎖が合成される。

 図1の(1)、(2)のようにPCRが進行した結果、 図1の(3)に示すようにフォワード側のヘアピ� �プライマーが形成していたヘアピン構造が� �長され、ヘアピン構造中に含まれていたバ� �ジ構造が消失する。

 図1の(4)は、図1の(1)のように、増幅対象� �核酸にヘアピンプライマーがアニールした� �態でバルジ構造結合蛍光分子1を反応液中に� ��加したときの状態を表している。すなわち� ��バルジ構造結合蛍光分子1はシトシンバルジ 構造に結合し、シフトした吸収極大波長にお いて蛍光を発する。なお、バルジ構造結合蛍 光分子については後述するが、本実施の形態 で用いられているバルジ構造結合蛍光分子1� �端的に説明すれば、蛍光物質であってバル� �構造に結合することで発光する蛍光の吸収� �大波長がシフトする物質である。

 図1の(5)は、PCR終了後の反応液にバルジ構 造結合蛍光分子1を添加したときの状態を表� �ている。元のヘアピンプライマーはPCRによ� �ヘアピン構造が伸長し、バルジ構造が消失� �たため、バルジ構造結合蛍光分子1は増幅さ� ��た核酸と結合できない。したがって、蛍光� ��度は非常に小さくなる。

 このようにPCRの前後において、本発明に� ��るヘアピンプライマーの量を測定し、これ� ��減少すれば、目的の核酸領域が増幅された� ��とが確認できる。

 なお、核酸増幅反応は、従来公知の方法� ��装置を用いて行なえばよく、反応条件は、� ��いる試料やプライマー等に応じて適宜設定� ��ればよい。

 また、本発明に係る核酸増幅確認方法に� ��用可能な試料は、核酸を含むものであれば� ��に限定されることはない。例えば、血液、� ��ンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の� ��液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織� ��鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗� ��した後の洗浄液、植物、微生物を挙げるこ� ��ができる。

 上記試料に由来する核酸は特に限定され� ��ものではなく、DNAでもRNAでもよい。DNAとし� ��はゲノムDNA、cDNAなどを挙げることができる 。RNAとしては、mRNA、rRNA、tRNAなどを挙げるこ とができる。RNAの場合には、逆転写反応によ りDNAを合成する工程を含むことが好ましい。

 (バルジ構造の検出)
 反応前ヘアピンプライマー測定工程及び反� ��後ヘアピンプライマー測定工程は、バルジ� ��造結合分子を、本発明に係るヘアピンプラ� ��マーが有するバルジ構造に結合させて、バ� ��ジ構造を検出することにより行なう。

 本発明に係る核酸増幅確認方法に用いる� ��ルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合可� ��である限り限定されるものではないが、蛍� ��物質であって、バルジ構造と結合すること� ��、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフ� ��、又は、蛍光が消光する等、蛍光の発光状� ��が変化する物質を用いることが好ましい。� ��れらの蛍光を検出することで、容易にバル� ��構造を検出できるからである。なお、蛍光� ��質ではないバルジ構造結合分子を用いても� ��く、この場合、バルジ構造結合分子を別途� ��光物質等により標識化したり、バルジ構造� ��合分子をアフィニティクロマトグラフィー� ��カラムに充填したりして用いればよい。

 バルジ構造に結合して蛍光の発光状態が� ��化するバルジ構造結合分子としては、ナフ� ��リジン環を有する化合物を挙げることがで� ��る。ナフチリジン環を有する化合物は、ア� ��ニンバルジ構造又はグアニンバルジ構造に� ��合すると、蛍光は消光する。また、ナフチ� ��ジン環を有する化合物は、シトシンバルジ� ��造又はチミンバルジ構造と結合すると、ナ� ��チリジン環を有する化合物が発光する蛍光� ��吸収極大波長が、異なる波長にシフトする� ��この消光又はシフトした吸収極大波長にお� ��る蛍光の検出により、簡便にバルジ構造を� ��出することができる。

 さらに、ナフチリジン環を有する化合物� ��、核酸増幅反応に用いるDNAポリメラーゼ等� ��酵素を阻害しない。このため、ナフチリジ� ��環を有する化合物を混合したまま核酸増幅� ��応に供することができる。よって、一つの� ��応容器に、核酸増幅反応液を調製し、これ� ��予めナフチリジン環を有する化合物を混合� ��ることで、当該反応液の蛍光を測定し、当� ��反応液を、そのまま核酸増幅反応に供して� ��増幅反応終了後、同じ反応液の蛍光を測定� ��ることで、蛍光の変化を評価することがで� ��る。

 従って、バルジ構造結合分子として、ナ� ��チリジン環を有する化合物を用いることで� ��核酸増幅反応における核酸増幅の確認を、� ��便に行なうことができる(以下、ナフチリジ ン環を有する化合物を「バルジ構造結合蛍光 分子」と表記する)。

 本発明に係る核酸増幅確認方法に用いる� ��ルジ構造結合蛍光分子としては、下記式(1)

(R ¹ 、R ² は、それぞれ独立して、第1級アミン残基、� �2級アミン残基又は第3級アミン残基を示す。 )で示される2,7‐ジアミノナフチリジン誘導� �を用いることが好ましい。上記第1級アミン� ��基としては、-NH ₂ が挙げられる。また、上記第2級アミン残基� �しては、例えば、-NH(CH ₂ )NH ₂ 基、-NH(CH ₂ )2NH ₂ 基、-NH(CH) ₂ NH(CH ₃ )基等が挙げられる。上記第3級アミン残基と� ��ては、例えば、-N(CH ₃ )(CH ₂ ) ₂ NH ₂ 基等が挙げられる。中でも、R ¹ 及びR ² の内、少なくとも片方が第2級アミン残基で� �ることが好ましく、R ¹ 及びR ² の両方が第2級アミン残基であることがさら� �好ましい。上記バルジ構造結合蛍光分子が� �2級アミン残基を備えることで、上記バルジ� ��造との結合がより安定するからである。

 2,7‐ジアミノナフチリジン誘導体の中で� ��、下記式(2)

で示される2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリジンが特 に好ましい。上記2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリジ ンは、シトシンバルジ構造に結合すると、発 光する蛍光の吸収極大波長がシフトし、当該 波長において強い強度の蛍光を発光するため 、高感度かつ特異的に、シトシンバルジ構造 、ひいては核酸増幅反応に用いた本発明に係 るヘアピンプライマーを検出することが可能 となるからである。

 2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリジンは、従来公� ��の方法により合成すればよく、例えば日本� ��公開特許公報「特開2004-262827号公報」に記� �の方法により合成すればよい。上記2,7-ジア� ��ノ-1,8-ナフチリジンは、10mMリン酸ナトリウ� ��緩衝液(pH7.0)の条件下において、単独では吸 収極大が376nmで検出され、シトシンバルジ構� ��と結合することにより、396nmにシフトする� �

 なお、上記式(1)で示されるバルジ構造結� ��蛍光分子としては、下記式(3)

(R ³ 、R ⁴ は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ 基であり、l、m、nはそれぞれ独立して1~6の自 然数を示す)で示される2,7-ジアミノ-1,8-ナフ� �リジン誘導体であってもよく、下記式(4)

(R ⁵ 、R ⁶ は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ 基であり、o、pはそれぞれ独立して1~6の自然� ��を示す)で示される2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリ ジン誘導体であってもよい。

 なお、バルジ構造結合蛍光分子を用いて� ��本発明に係るヘアピンプライマーを検出す� ��ときのpH条件は、好ましくはpHが5以上、よ� �好ましくは6以上、さらに好ましくは6.5以上� ��ある。また、当該pHの上限は、好ましくは9� ��下、より好ましくは8以下、さらに好ましく は7.5以下である。pHが5以上、9以下であれば� �DNAは安定であるため、バルジ構造結合蛍光� �子は良好に本発明に係るヘアピンプライマ� �中のバルジ構造に結合する。これにより蛍� �の検出を良好に行なうことができる。

 バルジ構造結合蛍光分子は、核酸増幅反� ��に供する反応液に、直接添加してもよく、� ��えば、さらにリン酸緩衝液、トリス塩酸緩� ��液等を用いてもよい。

 バルジ構造結合蛍光分子の使用量は、核� ��増幅反応の反応液に予め加えられるヘアピ� ��プライマー1モルに対して、20モル~100モルで あることが好ましく、さらに好ましくは40モ� ��~60モルである。20モル~100モルであれば、十� ��にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結� ��し、さらにバックグラウンドシグナルによ� ��測定誤差等も生じない。

 バルジ構造結合蛍光分子が、バルジ構造� ��結合したときに発光する蛍光の検出は、こ� ��を検出可能である限り限定されるものでは� ��いが、400nm~480nmの波長が好ましく、さらに� �ましくは430~460nmである。当該蛍光の蛍光強� �は、400nm~480nmの蛍光波長において、上記2,7-� �アミノ-1,8-ナフチリジンがバルジ構造に結合 していない場合に発光する蛍光と明確に区別 することができるからである。

 以上に述べた蛍光強度の検出は、既存の� ��光プレートリーダーなど、公知の方法、装� ��により行なえばよい。

 〔SNP検出方法〕
 本発明に係るSNP検出方法は、本発明に係る� ��酸増幅確認方法を用いればよい。

 検出対象のSNP部位の塩基の種類に応じて� ��核酸増幅反応による核酸が増幅されるか否� ��の結果が異なるように増幅条件を設定した� ��酸増幅反応に、本発明に係る核酸増幅確認� ��法を用いることで、当該核酸におけるSNP部� ��の塩基の種類を、迅速、簡便、安価かつ高� ��度に検出できる。

 つまり、本発明に係るSNP検出方法で用い� ��プライマーは、SNP検出対象の核酸の、SNP部� ��の塩基に応じて、核酸が増幅されるか否か� ��結果が異なるように設計されれば、限定さ� ��るものではないが、上記プライマーセット� ��含まれるプライマーの内、いずれか一方の� ��ライマーの3’末端の位置が、検出対象のSNP の位置になるように設計されていることが好 ましい。

 プライマーの3’末端に位置する塩基と、 核酸増幅反応に供する核酸とで、正常な塩基 対を形成するか否かは、核酸増幅反応の進行 に大きな影響を与える。よって、上記プライ マーセットに含まれるプライマーの内、いず れか一方のプライマーの3’末端の位置を、� �出対象のSNPの位置になるように設計するこ� �で、SNP部位の塩基の種類に応じて、核酸が� �幅されるか否かの結果が異なる増幅条件を� �容易に見出すことができる。

 本発明に係るSNP検出方法で用いる、3’末 端が検出対象のSNPの位置になるように設計さ れたプライマーの、当該3’末端の塩基の種� �は、SNP検出の目的や、SNP部位における検出� �象の塩基に応じて、適宜選択すればよい。

 例えば、SNP部位の塩基が、特定の塩基か� ��他の塩基に変異しているかを検出する場合� ��、当該3’末端の塩基を当該特定の塩基に相 補的な塩基とすればよい。これにより、核酸 が増幅されれば、当該SNP部位の塩基は当該特 定の塩基であることが判定でき、核酸が増幅 されなければ、当該SNP部位の塩基が当該特定 の塩基とは異なる塩基に変異していることが 判定できる。

 また、予め、SNP部位の塩基の種類が予測� ��能な場合は、3’末端の塩基を当該予測され る種類に相補的な塩基としたプライマーを、 それぞれ用意して、それぞれのプライマーを 用いた核酸増幅反応を行なえば、さらに検出 結果の信頼性を向上させることができる。つ まり、いずれかのプライマーを用いた核酸増 幅反応では、核酸が増幅され、他のプライマ ーを用いた核酸増幅反応では核酸が増幅され ないため、よって、さらに確実にSNP部位の塩 基の種類を特定することができる。

 以下に、本発明に係るSNP検出方法の一実� ��形態を、図2に基づいて説明する。

 図2は、本実施の形態に係るSNP検出方法の 原理を模式的に表した図である。なお、図2� �は核酸増幅反応としてPCRを用いた場合を示� �ている。

 図2の(1)において、A(アデニン)が含まれて いる直線は、A(アデニン)の位置にSNPを有する 解析対象の核酸を示している。即ち、図2の(1 )は、3’末端に当該A(アデニン)に相補的な塩� ��であるT(チミン)を備えるプライマーの5’末 端に、シトシンバルジ構造を含むヘアピン構 造を形成した本発明に係るDNA断片が結合した 本発明に係るヘアピンプライマーと、解析対 象の核酸とがアニールしている状態を示して いる。そして、伸長反応により破線方向に相 補鎖が合成される。

 次いで、図2の(2)に示すように、図2の(1)� �合成されたDNA鎖にリバースプライマーがア� �ールし、破線方向、つまり図2の(1)と逆方向� ��DNA鎖が合成される。なお、ここで用いるリ� ��ースプライマーは、SNPの位置より下流側に� ��計されていればよい。

 図2の(1)、図2の(2)のようにPCRが進行した� �果、図2の(3)に示すようにフォワード側のヘ� ��ピンプライマーが形成していたヘアピン構� ��が伸長され、ヘアピン構造中に含まれてい� ��バルジ構造が消失する。

 図2の(4)は、図2の(1)のように、解析対象� �核酸にヘアピンプライマーがアニールした� �態でバルジ構造結合蛍光分子1を反応液中に� ��加したときの状態を表している。すなわち� ��バルジ構造結合蛍光分子1はシトシンバルジ 構造に結合し、シフトした吸収極大波長にお いて蛍光を発する。

 図2の(5)は、PCR終了後の反応液にバルジ構 造結合蛍光分子1を添加したときの状態を表� �ている。元のヘアピンプライマーはPCRによ� �ヘアピン構造が伸長し、バルジ構造が消失� �たため、バルジ構造結合蛍光分子1は増幅さ� ��た核酸と結合できない。したがって、蛍光� ��度は非常に小さくなる。

 これにより、解析対象の核酸が有するSNP� ��位置の塩基は、A(アデニン)であることが判� ��できる。

 図2の(6)は、3’末端にG(グアニン)を備え� �5’末端にシトシンバルジ構造を含むヘアピ� ��構造を形成した本発明に係るDNA断片を結合� ��せた本発明に係るヘアピンプライマーを、� ��ォワードプライマーとして用いたPCRに、(1)� ��同じ核酸を解析対象として供した状態を表� ��ている。当該G(グアニン)は、解析対象の核� ��がSNPを有しており、当該SNPの位置にある塩� ��がC(シトシン)である場合に、PCRが進行する� ��うに設計されたものである。

 しかし、図2の(6)の場合、PCRに供した核酸 のSNPの位置にある塩基はC(シトシン)ではなく A(アデニン)である。そのため、PCRは進行せず 、当該PCR後の反応液中には、シトシンバルジ 構造を備えた未反応のヘアピンプライマーが 多量に残存することとなる。

 図2の(7)は、図2の(6)に示したPCRが行なわ� �た後の状態を表している。上述の通り、図2� ��(6)においてPCRは進行していないため、本発� ��に係るヘアピンプライマーは、未反応のま� ��残存している。このため、反応液中のバル� ��構造結合蛍光分子1は、当該ヘアピンプライ マー中のシトシンバルジ構造に結合し、シフ トした吸収極大波長において蛍光を発光する 。従って、図2の(6)に示したPCRの前後におい� �、バルジ構造結合蛍光分子1が当該波長にお� ��て発光する蛍光強度は、ほとんど変化しな� ��。つまり図2の(7)では、図2の(5)の場合と比� �して、当該波長における蛍光強度が大きい� �

 これにより、解析対象の核酸が有するSNP� ��位置の塩基は、C(シトシン)ではないことが� ��定できる。

 このように、例えば、アレル特異的PCRの� ��うに、標的とする核酸がSNP等の変異を有す� ��か否かにより、核酸が増幅されるか否かの� ��果が異なるように増幅条件を設定した核酸� ��幅反応に、本発明に係るヘアピンプライマ� ��を用いることで、当該核酸における変異の� ��無を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出� ��きる。

 (コンペティタープライマー)
 本発明に係るSNP検出方法では、上述した3’ 末端の位置が検出対象のSNPの位置になるよう に設計されているプライマーにヘアピンプラ イマーを用いればよい。さらに、上記核酸増 幅反応液には、コンペティタープライマーを 含み、
 当該コンペティタープライマーの3’末端は 、検出対象のSNPの位置になるように設計され ており、かつ、3’末端には、上記ヘアピン� �ライマーにより、野生型核酸の増幅を目的� �する場合は、変異型核酸における、当該検� �対象のSNPの位置の塩基に相補的な塩基、又� �、上記ヘアピンプライマーにより、変異型� �酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸� �おける、当該検出対象のSNPの位置の塩基に� �補的な塩基、を有することが好ましい。

 これにより、例えば、野生型核酸の増幅� ��目的としたヘアピンプライマーを用いる場� ��、変異型核酸における、当該検出対象のSNP� ��位置の塩基に相補的な塩基を3’末端に備え たコンペティタープライマーが、優先して変 異型核酸にアニールする。よって、当該ヘア ピンプライマーが、変異型核酸にアニールす ることを防ぐことができる。つまり、野生型 核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマー が変異型核酸の増幅に用いられ、ヘアピン構 造が消失することを防ぐので、変異型核酸の 増幅を、野生型核酸の増幅と誤認することを 防ぐことができる。従って、SNP検出の検出結 果の信頼性が向上する。

 また、例えば、変異型核酸の増幅を目的� ��したヘアピンプライマーを用いる場合、野� ��型核酸における、当該検出対象のSNPの位置� ��塩基に相補的な塩基を3’末端に備えたコン ペティタープライマーが、優先して野生型核 酸にアニールする。よって、上述の野生型核 酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを 用いる場合と同様に、野生型核酸の増幅を、 変異型核酸の増幅と誤認することを防ぐこと ができる。従って、SNP検出の検出結果の信頼 性が向上する。

 なお、本明細書において「コンペティタ� ��プライマー」とは、核酸増幅反応に用いる� ��ライマーが、非増幅確認対象核酸にアニー� ��する可能性があるとき、非増幅確認対象核� ��に対して、当該プライマーより優先的にア� ��ールするプライマーをいう。

 また、本明細書において「野生型核酸」� ��は、検出対象のSNPの位置に、高い頻度で現� ��る塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸� ��とは、検出対象のSNPの位置に、低い頻度で� ��れる塩基を有する核酸をいう。

 本発明に係るSNP検出方法に用いるコンペ� ��ィタープライマーの塩基配列の設計は、3’ 末端の塩基を、野生型核酸の増幅を目的とし たヘアピンプライマーを用いる場合は、変異 型核酸のSNPの位置の塩基に相補的な塩基とし 、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプ ライマーを用いる場合は、野生型核酸のSNPの 位置の塩基に相補的な塩基とすればよい。

 例えば、上述の図2の(6)に示したヘアピン プライマーであって、Aに相補的な塩基であ� �Tを3’末端に備えた以外は、当該ヘアピンプ ライマーのヘアピン構造を除いた部分と同一 の塩基配列からなるように設計したプライマ ーは、図2の(6)に示すPCRにおいてコンペティ� �ープライマーとして用いることができる。� �して、当該コンペティタープライマーは、� �該ヘアピンプライマーより優先して、図2の( 6)に示したPCRに供した核酸にアニールする。� ��って、図2の(6)に示したヘアピンプライマー の一部が、図2の(6)において、検出対象では� �い塩基であるAを有する核酸にアニールして� ��PCRが進行することを防ぎ、当該SNP部位の塩� ��がCであるという誤認を防ぐことができる。

 なお、リアルタイムPCRでは、増幅を目的� ��しない核酸が増幅されても蛍光が検出され� ��ため、これをSNP検出に用いても、結果の信� ��性に欠ける。そのため、信頼性を向上させ� ��ために、別途、SNP部位の塩基の種類に応じ� ��特異的にハイブリダイズする蛍光標識プロ� ��ブなどを用いる必要があり、作業も煩雑と� ��る。

 しかし、コンペティタープライマーを用� ��た本発明に係るSNP検出方法によれば、SNP部� ��の塩基が、検出対象ではない塩基に変異し� ��核酸の増幅に、ヘアピンプライマーが用い� ��れることを防ぐことができる。よって、確� ��される核酸増幅の結果の信頼性が向上し、� ��アルタイムPCRよりも信頼性の高いSNP検出を� ��簡便に行なうことができる。

 なお、コンペティタープライマーを用い� ��ば、SNP検出のみに限らず、PCR等の核酸増幅� ��応において、本発明に係るヘアピンプライ� ��ーが、増幅確認対象ではない核酸に、アニ� ��ルすることを防ぐことができる。つまり、� ��幅確認対象ではない核酸の増幅を、目的の� ��酸増幅が得られたものと誤認することを防� ��ことができる。

 この場合、コンペティタープライマーの� ��基配列は、増幅確認対象ではない核酸に対� ��て、本発明に係るヘアピンプライマーがア� ��ールする恐れのある領域を含む領域に、ア� ��ールするように設計し、かつ、当該コンペ� ��ィタープライマーが、当該増幅確認対象で� ��ない核酸にアニールする領域における、当� ��増幅確認対象ではない核酸に対する相同性� ��、当該ヘアピンプライマーより高くなるよ� ��に、設計すればよい。なお、当該ヘアピン� ��ライマーがアニールする恐れのある領域の� ��基配列は、既知であることが必要である。

 これにより、増幅確認対象ではない核酸� ��増幅に、本発明に係るヘアピンプライマー� ��用いられることを防ぐことができる。つま� ��、誤った核酸増幅反応に起因する、上述し� ��バルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度の低下� ��防ぐことができ、増幅確認の特異性が向上� ��る。

 〔本発明に係る試薬キット〕
 本発明に係る試薬キットは、少なくとも本� ��明に係るDNA断片を含めばよい。さらに、本� ��明に係るDNA断片をキットの使用者が任意に� ��計した核酸増幅用プライマーの5’末端に結 合するためのDNAリガーゼ等の試薬を含んでも よい。

 さらに、本発明に係る試薬キットには、� ��知のSNP情報に基づき、特定のSNPを検出可能� ��、本発明に係るヘアピンプライマーを含ん� ��いてもよいし、上述したバルジ構造結合分� ��又はバルジ構造結合蛍光分子を含んでもよ� ��。また、上述したコンペティタープライマ� ��を含んでもよい。

 また、キットの構成としては上記挙げた� ��のに限定されるものではなく、他の試薬や� ��具を含んでもよい。例えば、PCR関連試薬・� ��具(DNAポリメラーゼ、dNTP、PCR用バッファー� �PCR用チューブ等)、増幅核酸精製用試薬・器� ��を含んでもよいし、DNA断片を安定的に保持� ��るための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分� ��又はバルジ構造結合蛍光分子を安定的に保� ��するための試薬や緩衝液を含んでもよい。

 上記の何れの構成であっても、核酸増幅� ��応における核酸増幅の確認を行なうために� ��ましい薬剤等が含まれている。そのため、� ��発明に係る試薬キットを用いることで、核� ��増幅反応における核酸増幅の確認を容易か� ��迅速に実施することができ、本発明を臨床� ��査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用� ��ることが可能となる。

 また、本発明に係る試薬キットの提供形� ��は、本発明に係るDNA断片、バルジ構造結合� ��光分子、その他の試薬全てを、適切な容量� ��び/又は形態で含有した一つの容器として提 供してもよいし、それぞれ別の容器により提 供してもよい。また、本発明に係る試薬キッ トには、核酸増幅反応における核酸増幅の確 認を行なうための手順等を記載した説明書を 含んでもよい。

 本発明は上述した各実施形態に限定され� ��ものではなく、請求項に示した範囲で種々� ��変更が可能であり、異なる実施形態にそれ� ��れ開示された技術的手段を適宜組み合わせ� ��得られる実施形態についても本発明の技術� ��範囲に含まれる。

 〔本発明のコストの優位性〕
 本発明によれば、上述のSNP解析等を、従来� ��方法に比べて低コストで行なうことができ� ��。

 この点について、本発明に係るヘアピン� ��ライマーを用いたPCRによってSNPを解析する� ��法と、従来、SNP解析に用いられてきたInvader 法とを比較して説明する。なお、以下に述べ るInvader法については、M.Olivier, The Invader ass ay for SNP genotyping, 2005, Mutation Research, 573,� �103-110を参考としている。

 まず、本発明に係るヘアピンプライマー� ��用いたPCRと、従来のInvader法とに用いられる 主な試薬について表1に示す。

 また、表2に、表1に示した試薬等に関する� �ストを定性的に比較した結果を示す。なお� �表2において、バツ印はコストが極めて高い� ��とを示し、三角印はコストが高いことを示� ��、丸印はコストが低いことを示し、二重丸� ��はコストが極めて低いことを示す。

 表1及び表2に示すように、オリゴマーの数� �、本発明に係るヘアピンプライマーを用い� �PCRの方が、従来のInvader法に比べて少ないの� ��、この点でコストが低くなる。

 つまり、本発明に係るヘアピンプライマ� ��を用いたPCRでは、オリゴマーは2又は3種類� �よい。例えば、本発明に係るヘアピンプラ� �マーをフォワードプライマーとして用い、� �らに、別途作製したリバースプライマーを� �いればPCRは可能であるのでオリゴマーは2種� ��でよい。なお、図2に説明したように、核酸 増幅が起こる場合と起こらない場合とで比較 検討する場合は、本発明に係るヘアピンプラ イマーの3’末端の塩基を他の塩基に変えた� �のを用いるが、リバースプライマーの配列� �変える必要はないので、3種類のオリゴマー� ��即ち、3’末端の塩基がそれぞれ異なる2種� �の本発明に係るヘアピンプライマーと、1つ� ��プライマーとを用いればよい。

 一方、従来のInvader法では、インベーダー オリゴ(Invader Oligo)、プライマリープローブ(P rimary Probe)、フレットカセット(FRET Cassette)の 少なくとも3種類のオリゴマーが必要となる� �また、核酸増幅が起こる場合と起こらない� �合とで比較検討する場合、プライマリープ� �ーブ、レットカセットがさらに1種類ずつ必� ��となるので、合計5種類のオリゴマーが必要 になる。

 つまり、必要なオリゴマーが少ない点で� ��本発明に係るヘアピンプライマーを用いたP CRは、従来法に比べて有利である。

 また、表1及び表2に示すように、オリゴ� �ーの化学修飾は、本発明に係るヘアピンプ� �イマーでは不要であるが、従来のInvader法で� ��必須である。よって、この点で、本発明に� ��るヘアピンプライマーを用いるPCRは、従来� ��Invader法に比べてコストが極めて低くなる。

 具体的には、従来のInvader法では、フレッ トカセットを蛍光色素及び消光剤で2ヶ所化� �修飾する必要がある。この化学修飾は極め� �高価である。

 なお、表1及び2に示すように、オリゴマ� �以外の試薬として、本発明に係るヘアピン� �ライマーを用いれば、DNAポリメラーゼ及び� �ルジ構造結合蛍光分子が必要となるが、従� �のInvader法では酵素としてフラップエンドヌ� ��レアーゼ(Flap Endnuclease)を用いればよい。し かし、DNAポリメラーゼのコストは、フラップ エンドヌクレアーゼのコストと同程度であり 、また、バルジ構造結合蛍光分子は極めて安 価に得ることができる。そのため、オリゴマ ー以外の試薬については、本発明に係るヘア ピンプライマーでは、従来のInvader法に比べ� �若干高くなるにとどまる。

 例えば、後述の実施例で用いた2,7-ジアミ ノ-1,8-ナフチリジン等の多くのバルジ構造結� ��蛍光分子は、2,6-ジアミノピリジン及びDL-リ ンゴ酸を原料に製造することができる。いず れも、東京化成工業株式会社から購入可能で あり、価格はそれぞれ25gで5900円、500gで2200円 と安価である。しかも大量に購入する場合は 、この10分の1の価格で購入できる。当該原料 以外にも、1,3-ジアミノプロパン及びオキシ� �化リンを用いる場合もあるが、前者は500mlで 5400円と安価あり、後者は工業原料として極� �て安価に入手可能である。しかも、一回のPC Rに必要なバルジ構造結合蛍光分子は、50μmol/ L程度でもよく、使用するオリゴマーと比較� �ると、そのコストは全体のコストに比べて� �めて小さく、無視できる程度である。

 以上を総合的に評価すると、本発明によ� ��ば、上述のSNP解析等を、従来の方法に比べ� ��極めて低コストで行なえるといえる。