Zur gentechnischen Herstellung von Proteinen stehen verschiedene Systeme zur Ver- fügung, z. B. rekombinante Mikroorganismen, die Expressionsplasmide tragen, bei denen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen die Expression von Fremd- genen gesteuert wird. Häufig werden Bakteriensysteme verwendet, da sie leicht zu vermehren sind. Sie haben aber den Nachteil, dass sie pyrogene Substanzen erzeu- gen, die bei der Gewinnung von Medikamenten oder Impfstoffen vor der Verwendung entfernt werden müssen. Außerdem können in Bakterien keine glykosylierten Poly- peptide hergestellt werden. Es wurden daher auch eine Reihe anderer Systeme für die Expression von Polypeptiden oder Proteinen in eukaryontischen Zellen entwickelt.

Außer Zellkulturen werden hierfür Hefen inbetracht gezogen, insbesondere die weit- verbreitete Hefe Saccharomyces cerevisiae, deren Genom inzwischen bekannt ist und für die einige Vektoren und Expressionssysteme erhältlich sind.

Eine weitere Hefe-Gattung, die aufgrund günstiger Eigenschaften für bio- technologische Verfahren inbetracht gezogen wird, ist Kluyveromyces. Die Arten K. lactis und Kmarxianus werden als GRAS (Generally Recognized As Save) einge- stuft und können daher mit derselben Sicherheit wie Saccharomyces verwendet wer- den. Darüberhinaus kann Kmarxianus eine Vierzahl von Kohlenstoffquellen und Ener- giequellen für das Wachstum nutzen und ist nicht sehr temperaturempfindlich.

Kluyveromyces marxianus kann bei Temperaturen bis zu 45°C wachsen und bietet daher in dieser Hinsicht gegenüber den temperaturempfindlicheren Saccharomyces- Stämmen Vorteile bei der Züchtung. Die Zellen von schnell wachsenden Kmarxianus- stammen Können sicn bei optimalen tedingungen alle ; ib Mmuten teilen. Allerdings konnten diese guten Eigenschaften bisher nicht optimal ausgenutzt werden, da für diese Hefeart kaum Expressionssysteme zur Verfügung stehen, mit denen Proteine in guter Effektivität hergestellt werden können, und es an klonierten und zuverlässigen, getesteten, expressionsstarken Promotoren mangelt.

Bei der Herstellung von Proteinen und Polypeptiden auf gentechnischem Weg ist es darüberhinaus wünschenswert, dass die entstehenden Produkte nicht in der Zelle verbleiben, sondern in das umgebende Medium ausgeschieden werden, da sie sich dann leichter gewinnen lassen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Promotoren mit verbesserter Effektivität bereit- zustellen, die die Expression von Proteinen und Peptiden in Hefezellen steuern kön- nen. Eine weitere Aufgabe war es, Vektoren zur Verfügung zu stellen, mit denen Po- lypeptide und Proteine exprimiert und die exprimierten Produkte aus der Zelle ausge- schleust werden können.

Diese Aufgaben werden mit den erfindungsgemäß bereitgestellten DNA-Sequenzen, Expressionskassetten und-vektoren, Plasmiden und Verfahren, die in den Ansprüchen definiert sind, gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer neuen DNA-Sequenz, neu- er regulatorischer Elemente, eines Verfahrens zum Ausschleusen von Proteinen aus der Zelle sowie die Bereitstellung geeigneter Expressionskassetten, Plasmide und Mik- roorganismen.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung werden eine DNA mit einer Sequenz ge- mäß SEQ ID Nr. 1 oder einer Teilsequenz davon, bevorzugt mit mindestens 10, be- vorzugter mindestens 100 Nucleotiden zur Verfügung gestellt : Die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 ist eine Nucleinsäuresequenz, die die regulato- rischen Regionen und den offenen Leserahmen für das Enzym Triosephosphatisome- rase codiert. Im Bereich der Nucleotide 1 bis 1112 finden sich als Promotor aktive regulatorische Regionen dieses Gens.

Das Enzym Triosephosphatisomerase (im Folgenden auch als TPI bezeichnet) ist ein glycolytisches Enzym, das an dem Abbau von Glucose und Fructose, der zur Energie- gewinnung in Zellen stattfindet, beteiligt und daher weit verbreitet ist. Die Triose- phosphatisomerase dient dazu, das bei der Spaltung von Fructose-1, 6-biphosphat neben dem Glycerinaldehyd-3-phosphat entstehende Dihydroxyacetonphosphat eben- falls zu Glycerinaldehyd-3-phosphat zu isomerisieren, das dann schließlich über meh- rere Stufen unter Energiegewinnung in Pyruvat umgewandelt wird. Das Enzym ist auch am Metabolismus komplexer Lipide beteiligt. Es ist ein Homodimer, dessen Un- tereinheiten aus etwa 250 Aminosäuren bestehen.

Die Aminosäure-und Nucleotidsequenz des Enzyms Triosephosphatisomerase (EC 5.3.1.1) aus der Hefeart Kluyveromyces marxianus var. marxianus wurde von den Erfindern aufgeklärt und letztere ist in SEQ ID Nr. 1 angegeben. Sequenzen des En- zyms TPI in anderen Organismen sind bekannt ; die Sequenz für TPI in S. cerevisiae wurde aufgeklärt und mit der Nummer YDR050CCDS bezeichnet. Bei einem Sequenz- vergleich wurde gefunden, dass die Übereinstimmung der TPI codierenden DNA- Sequenzen in verschiedenen Mikroorganismen im Hinblick auf den offenen Leserah- men hoch ist, im Hinblick auf die regulatorischen Sequenzen jedoch gering.

Bei der Untersuchung der Expression dieses Enzyms in dem speziellen Organismus K. marxianus wurde gefunden, dass der die Expression von TP steuernde Promotor ein sehr starker Promotor ist und sowohl in funktioneller Verbindung mit Fremdproteinen als auch in Zellen von anderen Hefearten und-stämmen effizient ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Bereitstellung eines neuen Promo- tors, der die Nucleotide 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 oder Teile davon, die als Promo- tor aktiv sind, aufweist. Der erfindungsgemäße Promotor kann in an sich bekannter Weise in funktioneller Verbindung mit Fremdgenen eingesetzt werden.

Eine DNA-Sequenz mit den Nucleotiden 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 wird im folgen- den auch als Promotor-Sequenz bezeichnet.

Erfindungsgemäß wird ein Promoter zur Verfügung gestellt, der in Hefen aktiv ist und ein Expressionssystem liefert, das sehr variabel ist. Es ist unter anderem für Kluyveromyces und andere Hefearten geeignet und kann z. B. für Hefearten wie Sac- charomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis eingesetzt werden. Versuche, die im experimentellen Teil beschrieben werden, haben gezeigt, dass unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors eine hocheffektive Expression von Fremdprotein er- folgt. l Der neue erfindungsgemäß bereitgestellte konstitutive Promotor ist für die Expression von rekombinanten Proteinen in Hefezellen geeignet. Unter Promotor wird hier eine DNA-Sequenz verstanden, von der aus die Transkription eines Genes gesteuert wird.

Die Bezeichnung"als Promotor aktiver Teil"bedeutet eine Teilsequenz des Promotors, die in Verbindung mit einem offenen Leserahmen zur Expression des von dem Le- serahmen codierten Polypeptids führt.

Es wurde festgestellt, dass der Promotor, der in Kmarxianus die Expression von TPI reguliert, im Folgenden auch als KmTPI-Promotor bezeichnet, sieben mögliche Tran- skriptionsstartstellen aufweist. Diese sind in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 als Tran- skriptionsstart &num 1 bis #7 bezeichnet. Es wurde auch gefunden, dass zur Expression verschiedene Mikroorganismen verschiedene Sequenzmotive als Transkriptionsstart- punkt nutzen. Die Leistung des Promotors hängt unter anderem davon ab, welche der Transkriptionsstartpunkte bei der Expression verfügbar sind und daher läßt sich die Stärke des Promotors durch Auswahl der Sequenzteilstücke jeweils maßgenau für den Mikroorganismus, in dem die Expression erfolgen soll, einstellen.

Zum Beispiel wirkt der KmTPI-Promotor in Kluyveromyces marxianus so stark, dass schon ein Teilbereich der Promotor-DNA mit nur einer Transkriptionsstartstelle zur Expression eines Polypeptides führt. In anderen Kluyveromyces-Arten, wie z. B. K. lactis, ist es vorteilhaft, wenn mindestens drei, bevorzugter mindestens fünf Tran- skriptionsstartpunkte in der Sequenz enthalten sind. Daher wird für die Expression in Kluyveromyces-Arten, wie K. lactis bevorzugt als Promotor eine Sequenz verwendet, die mindestens fünf Transkriptionsstartstellen umfasst, z. B. eine Sequenz mindestens mit den Nukleotiden 352 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1.

Der erfindungsgemäß bereitgestellte KmTPI-Promotor ist auch in Saccharomyces funktionell. Um eine zufriedenstellende Expression zu erreichen, wird allerdings emp- fohlen, in Organismen dieser Gattung den KmTPI-Maximalpromotor mit den Nucleoti- den 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 zu verwenden.

Die beschriebenen Nucleinsäuresequenzen mit Promotor-Aktivität schließen solche Sequenzen ein, die durch Modifikation, Substitution, Deletion oder Insertion oder Kombinationen hiervon entstanden sind. Hierzu kann auch die Promotor-Sequenz mit weiteren regulatorischen Upstream-Sequenzen mit Enhancer-, Aktivator-und/oder Repressorfunktionen versehen sein. Als Sequenz mit Promotor-Aktivität werden sol- che Sequenzen angesehen, die einen Teil der beanspruchten Sequenz oder ein Derivat davon umfassen, das noch als Promotor für die Expression von Proteinen wirkt Erfindungsgemäß werden weiterhin auch solche Sequenzen inbetracht gezogen, die mit der beanspruchten Nucleotidsequenz bzw. den beanspruchten Teilen davon, z. B. der Promotorsequenz, eine Homologie von mindestens 70%, bevorzugter mindestens 90% und insbesondere mindestens 95% aufweisen, solange die jeweiligen Sequen- zen auch eine vergleichbare biologische Funktion haben. Für die Zwecke der vorlie- genden Erfindung wird die Homologie dabei in üblicher Weise unter Verwendung der üblichen Algorithmen bestimmt. Teil der Erfindung sind auch solche Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren.

Erfindungsgemäß werden darüberhinaus auch solche Nucleinsäuren inbetracht gezo- gen, die zu TPI homologe Polypeptide codieren, insbesondere solche mit mindestens 80% Homologie. Der Ausdruck"homologes Polypeptid"umfasst in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweist, wie das beanspruchte Po- lypeptid. Ein Homolog kann sich von dem Ausgangspolypeptid dadurch unterschei- den, dass es mehr, weniger oder andere Aminosäuren aufweist, wobei die Funktion aber erhalten bleibt. Der Fachmann kennt Verfahren, um entsprechend modifizierte Polypeptide zu erzeugen.

Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Promotors erfolgt in an sich bekannter Weise, indem entweder die natürlich vorkommende Sequenz isoliert wird, was bevor- zugt ist, oder die Sequenz gentechnisch hergestellt oder chemisch synthetisiert wird.

Verfahren zur Gewinnung oder Synthese sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung. Wesentlich ist nur, dass der Promotor der Triose- phosphatisomerase aus K. marxianus, mit den Nucleotiden bis einschließlich 1112 von SEQ ID Nr. 1, oder ein aktiver Teil davon verwendet wird.

Um die Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors zu erleichtern, wird weiterhin ein Expressionssystem bzw. eine Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die die Promotor-Sequenz, wie oben definiert, oder einen als Promotor aktiven Teil davon, einen Terminator und gegebenenfalls weitere regulatorische Sequenzen, wie Enhan- cer, und einen Insertionsklonierungsort aufweist. In den Insertionsklonierungsort kann das gewünschte zu exprimierende Gen oder die DNA für ein zu exprimierendes Fremdprotein eingesetzt werden, die unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Pro- motors transkribiert werden kann.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt in ihrer einfachsten Form eine Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, einen Insertionsklonie- rungsort, in den das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein einkloniert werden kann, und eine als Terminator wirksame Nucleotidsequenz. Als Insertionsklonierungs- ort geeignete Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner nähe- ren Erläuterung. Als Terminator kann z. B. die bei der Expression von TPI als Termina- tor wirkende Sequenz verwendet werden. Letzere umfasst die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID Nr. 1 oder als Terminator aktive Teile davon. Gute Ergebnisse wur- den auch erzielt bei Verwendung der Terminatorregion des Endopolygalacturonase- gens aus Kluyveromyces marxianus.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann vielfältig verwendet werden. Der Insertionsklonierungsort ist eine Schnittstelle, an der die Sequenz aufgeschnitten werden kann und das Polynucleotid für das gewünschte Protein oder Peptid einligiert werden kann. In dieser einfachsten Form wird bei der Expression das Protein intrazel- lulär produziert und nicht aus der Zelle ausgeschleust. Es kann dann nach Aufschluß der Zelle in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Diese Ausführungsform eig- net sich sowohl für kleine Peptide und Proteine, die außerhalb der Zelle instabil sind als auch für Proteine, die generell intrazellulär lokalisiert sind.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können zur Expression von DNA- Sequenzen in Zellen, insbesondere Hefezellen, verwendet werden. Besonders geeig- net sind die erfindungsgemäßen Expressionskassetten zur Expression in Hefezellen der Gattungen Saccharomyces und Kluyveromyces, z. B. S. cerevisieae, K. lactis, K. marxianus und andere.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette eignet sich sowohl zum Einbau in sich autonom replizierende Plasmide als auch zum Einbau in Hefechromosomen über inte- grative Vektoren.

Es ist jedoch bevorzugt, eine Expressionskassette, in die das gewünschte Polynucleo- tid zur Expression eines Peptids oder Proteins einligiert wurde, in einem E. coli-Plasmid zu amplifizieren und dann die E. coli-Plasmide zu gewinnen, die Expressionskassette mit geeigneten Restriktionsendonucleasen, für die Schnittstellen an den Rändern der Expressionskassette vorgesehen sind, auszuschneiden und die Expressionskassette in einen Hefevektor einzuligieren. Die Vektoren enthalten üblicherweise Selek- tionsmarker, um erfolgreich transformierte Zellen in an sich bekannter Weise selek- tieren zu können.

Die Plasmide können gegebenenfalls in E. coli vermehrt und dann in Kluyveromyces marxianus oder einen anderen Kluyveromyces-Stamm oder auch einen anderen He- festamm eingesetzt werden. Als Transformationssystem können beispielsweise be- kannte Plasmide auf Basis des Kluyveromyces drosophilarum-Plasmides pKD1 ver- wendet werden. Abkömmlinge dieses Plasmids eignen sich zur Verwendung in Kluyveromyces marxianus und führen bei Verwendung des erfindungsgemäßen Ex- pressionssystems zu einer effektiven Expression von Fremdproteinen im entsprechen- den Wirt.

In einer anderen Ausführungsform kann aus den erfindungsgemäßen, wie oben vorbe- reiteten Plasmiden die Expressionskassette einschließlich des zu exprimierenden Po- lynucleotids herausgeschnitten und als lineare oder zirkularisierte DNA als Integrati- onskassette direkt mit Hefezellen in Kontakt gebracht werden, um von diesen aufge- nommen zu werden. Ein stabiler Einbau in die Wirtszelle kann dann über homologe Rekombination erfolgen, sofern ein Teil der Nucleinsäuren für die Wirtszelle homolog ist. Aufgrund einer Homologie von Teilen der Expressionskassette, z. B. des TPI-Gens oder der regulatorischen Sequenzen davon, mit dem Genom der Hefe wird dann in einem Teil der behandelten Zellen die DNA in die entsprechenden Chromosomen durch Austausch mit den entsprechenden Sequenzen aufgenommen.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette wird stabil in Chromosomen eingebaut und führt, wenn die Zellen unter optimalen Bedingungen gezüchtet werden, zu einer guten Ausbeute des gewünschten Proteins. Abhängig von der Art des zu expri- mierenden Proteins oder Peptids kann die Kopienzahl des Systems eingestellt werden.

Falls eine höhere Kopienzahl erwünscht ist, werden in an sich bekannter Weise an die Enden der Expressionskassette Sequenzen eines in größerer Kopienzahl in dem Chro- mosomensatz vorliegenden Gens, z. B. für rDNA, anligiert, um eine höhere Anzahl an Austauschereignissen zu bewirken.

In an sich bekannter Weise kann zusätzlich noch ein Markergen in die Sequenz mit- eingebaut werden, damit die erfolgreich transformierten Zellen selektiert werden kön- nen. Verfahren und hierzu geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt und bedür- fen hier keiner näheren Erläuterung.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem ist geeignet zur Expression verschiedener heterologer und homologer Proteine. Vorteilhaft ist die Expression homologer Proteine dann, wenn die Expression eines in dem verwendeten Organismus vorhandenen Pro- teins verstärkt werden soll, da der erfindungsgemäße Promotor die Menge an produ- ziertem Protein stark verbessern kann. Bevorzugt wird das System verwendet zur Expression von Hormonen, z. B. Wachstumshormonen und Wachstumsfaktoren, im- munmodulierenden Faktoren, z. B. Interferonen und Interleukinen, Enzymen, z. B.

Endopolygalacturonase, Reportergenen, z. B. EGFP, oder Antigenen, z. B. Oberflächen- antigenen von Viren, unter anderem S-Antigene von Hepatitis-B-Virus oder Virus- protein 1 aus Polyoma-Virus. Letztere Proteine können besonders vorteilhaft als Impf- stoffe eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette ist unter anderem für Hefen der Stämme Kluyveromyces und Saccharomyces geeignet und wird bevorzugt in Hefestämmen der Art Kluyveromyces marxianus var. marxianus verwendet.

TPI ist ein intrazellulär wirkendes Enzym und katalysiert Stoffwechselvorgänge, die normalerweise innerhalb der Zelle ablaufen. TPI wird daher üblicherweise nicht in dem die Zelle umgebenden Medium erwartet und auch nicht gefunden. Wie nicht anders bei einem Enzym mit intrazellulärer Wirkung zu erwarten, wurde daher auch keine Signalsequenz gefunden.

Überraschenderweise wurde nun bei einem speziellen Mikroorganismus, nämlich Kluyveromyces marxianus, TPI im Zellüberstand nachgewiesen. Daraufhin wurde im offenen Leserahmen, der TPI codiert, nach Signalsequenzen gesucht, es konnten aber keine typischen Sequenzen gefunden werden. Die Ausschleusung dieses Enzyms, das im folgenden auch als KmTPI bezeichnet wird, scheint daher auf anderen, Golgi- unabhängigen Mechanismen zu beruhen. Die Eigenschaft des Enzyms KmTPI, die Zelle zu verlassen, macht sich die vorliegende Erfindung zunutze.

Natürlicherweise werden Peptide und Proteine dann aus der Zelle ausgeschleust, wenn sie über eine Signalsequenz verfügen. Diese Signalsequenz erzeugt bei der Translation einen Abschnitt, der für den Membranenkontakt und den Durchtritt des auszuschleusenden Proteins sorgt. Dieser Mechanismus liegt bei KmTPI aber offen- sichtlich nicht vor, sondern die spezielle Triosephosphatisomerase aus K. marxianus weist Eigenschaften auf, die ein Durchdringen der Zellmembranen ermöglichen. Dar- überhinaus wurde festgestellt, dass auch ein durch Fusion angehängtes Peptid oder Protein zusammen mit der Triosephosphatisomerase aus der Zelle ausgebracht wird.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass einerseits KmTPI nicht nur in K marxianus nach der Expression aus der Zelle ausgeschleust wird, son- dern dass es nach Transformation von anderen Hefestämmen mit autonom replizie- renden Plasmide, die das KmTPI-Gen exprimieren können, zu einer Überexpression und Ausschüttung von TPI in das Kulturmedium kommt, und dass es andererseits möglich ist, durch Bildung von Fusionsproteinen mit TPI, Fremdproteine nach der Transkription und Translation als Fusionsproteine in das umgebende Zellmedium aus- zuschleusen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Ausschleusen ei- nes Fremdproteins in Form eines Fusionsproduktes mit Triosephosphatisomerase, bei dem man eine Sequenz, die mindestens regulatorische Sequenzen und eine Fusions- DNA, die für Triosephosphatisomerase und das gewünschte Peptid oder Protein co- diert, zur Expression bringt, das gebildete Fusionsprotein isoliert und das Fremdpro- tein abtrennt.

Auf diese Weise ist es möglich, ein Fusionsprodukt im Zellüberstand zu erhalten. Das Fusionsprodukt kann sowohl ein Hybridmolekül sein, d. h. aus einem homologen und einem heterologen Anteil bestehen, als auch ein Fusionsprotein sein, das aus zwei, oder gegebenenfalls mehr, heterologen Teilen besteht. Bei dem Fusionsprotein kann der TPI-Teil an dem Fremdprotein sowohl N-terminal als auch C-terminal vorhanden sein. Für die Ausschleusung aus der Zelle ist der TPI-Teil am N-terminalen Ende des Fremdproteins bevorzugt. Das Fusionsprodukt kann anschließend in an sich bekannter Weise getrennt werden.

Um die Trennung des Fusionsproduktes zu erleichtern, wird bevorzugt zwischen die beiden die Proteine codierenden DNA-Sequenzen noch eine DNA-Sequenz, die einen Abstandshalter codiert, in an sich bekannter Weise eingefügt. Der Abstandshalter zwischen beiden Molekülteilen sollte groß genug sein, um ein leichtes Auftrennen zu ermöglichen und stellt in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Schnitt- stelle für Enzyme bereit.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch Ankopplung an Triosephos- phatisomerase sogar hydrophobe Peptide oder Proteine aus Zellen ausgeschleust werden, die bei Verwendung üblicher Signalsequenzen nicht oder nur in geringem Maße im Überstand zu finden sind. Dies wurde gezeigt für das Oberflächenantigen von Hepatitis B, (Hbs), das mit den üblichen Verfahren nicht aus der Zelle ausge- bracht werden kann.

Das Ausschleusen von Proteinen über die Fusion mit TPI ist daher besonders geeignet für solche Proteine, die aufgrund ihrer Hydrophobizität oder fehlender Signalpeptide normalerweise nicht äus der Zelle ausgeschleust werden.

Im experimentellen Teil werden Expressionsversuche gezeigt, die bei Verwendung dieser erfindungsgemäßen Kombinationen zu hohen Ausbeuten führen.

Wenn es erwünscht ist, ein Polypeptid oder Protein nach der Expression aus der Zelle auszuschleusen, wird dies daher bewirkt, indem ein Fusionsprodukt aus KmTPI und dem gewünschten Fremdprotein erzeugt wird. Dazu kann in den Insertionsklonie- rungsort der oben beschriebenen Expressionskassette z. B. ein ein Fusionsprotein co- dierendes Polynucleotid mit N-terminaler oder C-terminaler TPI, einligiert werden. Be- vorzugt wird zwischen den Sequenzen für die beiden Proteine noch eine einen Linker codierende DNA-Sequenz vorgesehen, um später die Spaltung des Fusionsproduktes zu erleichtern. Das Fremdprotein wird dann nach der Expression aufgrund der"Aus- schleusungsfähigkeit"von KmTPI zusammen mit diesem als Fusionsprodukt aus der Zelle ausgetragen und kann dann nach Abtrennung aus dem Zellmedium und durch Abspaltung von KmTPI in eleganter Weise gewonnen werden.

Natürlich kann zum Ausschleusen eines exprimierten Proteins auch eine an sich be- kannte Signalsequenz eingesetzt werden. Diese wird zwischen den Promotor und das zu exprimierende Fremdgen in an sich bekannter Weise einligiert. Bevorzugt wird als Signalsequenz eine solche, die für den verwendeten Organismus homolog ist, ver- wendet. Besonders gute Ergebnisse wurden erzielt mit einer Kombination aus dem Promotor der Triosephosphatisomerase, bzw. einem als Promotor wirksamen Teil da- von, und der Signalsequenz des Endopolygalacturonase-Gens aus Kluyveromyces marxianus.

Eine weitere Verbesserung der Expression und Sekretion wird erhalten, wenn die aus- schleusende Wirkung von TPI durch die Bereitstellung einer Signalsequenz verstärkt wird. Erfindungsgemäß kann daher auch die oben beschriebene Ausführungsform, in der eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprodukt aus KmTPI mit dem gewünschten Fremdprotein codiert, in Kombination mit einer bekannten Signalsequenz, wie im vor- hergehenden Abschnitt beschrieben, verwendet werden. Auch diese Kombination ist Teil der vorliegenden Erfindung.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Expressions-und Sekretionssystem bereitgestellt, das in operativer Verbindung die oben definierte Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, eine als Terminator ak- tive Sequenz, und, zwischen diesen beiden Sequenzen eine Signalsequenz aufweist.

Bevorzugt wird als Signalsequenz eine bekannte Sequenz eingesetzt. Dabei handelt es sich um die Signalsequenz des Enzyms Endopolygalacturonase (EPG) aus K. marxia- nus. Bevorzugt wird daher die Signalsequenz des Enzyms EPG aus K. marxianus ver- wendet.

Bei beiden eben erwähnten Ausführungsformen erfolgt die Züchtung in an sich be- kannter Weise, wobei entweder in einem kontinuierlichen Verfahren das Protein stän- dig ins Medium abgegeben wird und aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich ge- wonnen werden kann oder in einem diskontinuierlichen Verfahren die Zellen gezüch- tet, geerntet und dann das Protein aus der Brühe gewonnen werden kann.

Das erfindungsgemäße System ist sehr variabel. So kann z. B. nur die oben definierte erfindungsgemäße Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon zu- sammen mit anderen Nucleinsäuresequenzen, die weitere regulatorische Sequenzen bereitstellen, und mit einer heterologen Nucleotidsequenz kombiniert werden. Es kann die erfindungsgemäß definierte Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon mit einer Terminator-Sequenz, zum Beispiel der oben definierten, kombiniert werden, um ein für Kluyveromyces marxianus homologes System bereitzustellen, in das das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein eingesetzt wird, oder aber es kann ein System aus dem erfindungsgemäßen Promotor, einer Signalsequenz und einem Terminator zusammen mit einem zu exprimierenden Gen, das ein gewünschtes Protein codiert, kombiniert werden, um ein in die Kultur abzugebendes Protein zu er- zeugen. Schließlich kann die erfindungsgemäße Promotorsequenz oder ein als Promo- tor aktiver Teil davon mit einer Terminator-Sequenz und einer Nucleinsäure aus Km- TPI und dem gewünschten Fremdgen kombiniert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die erfindungsgemäße Expres- sionssysteme enthalten, insbesondere Plasmide, die den Promotor, das TPI-Gen und den Terminator von TPI aus K. marxianus enthalten. Beispiele sind die in den Figuren 1 bis 4 näher erläuterten Plasmide R64, R53, R48 und R11. Diese Plasmide sind re- kombinante Plasmide und können in der vorliegenden Form zur Amplifikation der Ex- pressionskassetten und zur Erzeugung der von der einligierten DNA codierten Proteine in Hefen verwendet werden.

Das Plasmid pD1, das die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 enthält, wurde in Ecoli DH5a als Wirtszelle bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSMZ) am 4. Ja- nuar 2001 mit der Hinterlegungsnr. DSM 13973 hinterlegt.

Da Kluyveromyces marxianus-Zellen mit vielen verschiedenen C-Quellen wachsen können und bezüglich weiterer Nährstoffe nicht sehr anspruchsvoll sind, darüber hin- aus temperaturunempfindlich sind, wird hier ein sehr effektives System bereitgestellt.

Die zuverlässige Expression der Fremdproteine wird durch die erfindungsgemäß be- reitgestellte regulatorische Sequenz der Erfindung erreicht.

Erfindungsgemäß wird ein System bereitgestellt, das es zuläßt, die aufgrund ihrer au- ßergewöhnlichen physiologischen Leistungen als Wirt vielversprechende Hefeart Kluy- veromyces marxianus zu nutzen.

Das erfindungsgemäße System eignet sich zur Expression von RNA, Peptiden, Poly- peptiden, Proteinen und Hybridmolekülen einschließlich glycosylierter Proteine.

Im folgenden werden einige Definitionen für Begriffe angegeben, die in der Beschrei- bung verwendet werden.

Als"Expressionsvektor"wird ein DNA-Molekül bezeichnet, das linear oder ringförmig sein kann und ein Segment enthält, das eine Sequenz für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, das operativ verbunden ist mit regulatorischen Sequenzen. Diese regulatorischen Sequenzen schließen mindestens Promotor-und Terminatorsequenzen ein. Der Expressionsvektor kann zusätzlich selektierbare Marker und weitere regulato- rische Elemente enthalten und muß die Übertragung und Vermehrung in Wirtszellen ermöglichen. Die Replikation der Expressionsvektoren kann autonom oder durch Integ- ration in das Wirtsgenom erfolgen.

Der Ausdruck"DNA"oder"Polynucleotid"schließt polymere Formen von Desoxyri- bonucleotiden beliebiger Länge und beliebiger Modifikation in einzel-und doppel- strängiger Form ein.

"Sekretionsvektor"bezeichnet in dieser Beschreibung einen Expressionsvektor der zusätzlich zur Expression eines Polypeptids auch die Ausschleusung des Polypeptids in Form eines Fusionsproteins bzw. durch die Signalsequenz bewirkt.

Der Ausdruck"operativ verbunden"bedeutet, dass die einzelnen Segmente so ange- ordnet sind, dass sie dem vorgesehenen Zweck dienen, d. h. die Transkription initiie- ren und terminieren können und die Expression fördern können bzw. die Expression und Sekretion ermöglichen.

I.

Die beanspruchten Sequenzen können weitere kurze Sequenzen aufweisen, die die biologische Aktivität des Moleküls nicht stören. Weiterhin umfassen die beanspruch- ten Sequenzen auch allelische Varianten der Sequenz, d. h. alternative Formen des Gens, die durch Mutation entstanden sind.

Der Begriff"Protein oder Peptid"bezieht sich auf eine molekulare Kette von Ami- nosäuren mit biologischer Aktivität. Der Ausdruck Polypeptid bezeichnet üblicherwei- se Aminosäuresequenzen mit bis zu 200 Aminosäuren, während längere Ketten in der Regel als Proteine bezeichnet werden. In der vorliegenden Beschreibung soll der Aus- druck Polypeptid auch Proteine umfassen bzw. umgekehrt der Ausdruck Proteine auch Polypeptide mitumfassen. Die Proteine und/oder Polypeptide können in vivo oder in vitro modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung und Phosphorylierung.

Als unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors zu exprimierendes Gen wird jede DNA verstanden, deren Expression gewünscht wird."Fremd-DNA"ist dabei jede DNA, die normalerweise nicht unter der Kontrolle des TPI-Promotors exprimiert wird. Fremd-DNA kann Gene, Teile von Genen, fusionierte Gene, cDNA oder andere DNA-Sequenzen umfassen, sowie DNA, die Polypeptide oder Proteine oder auch RNA oder anti-sense-RNA codiert. Fremd-DNA kann auch ein Reportergen sein. Die Fremd- DNA kann eine natürlich vorkommende, gentechnisch hergestellte oder chemisch syn- thetisierte Sequenz oder eine Kombination davon sein. Die verwendete Nucleotidse- quenz und das Verfahren ihrer Herstellung sind nicht kritisch.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekom- binanten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Hefezelle mit einem sich autonom replizierenden Plasmid transformiert, das eine erfindungsgemäße Ex- pressionskassette und ein Polynucleotid, das ein Fremdprotein kodiert, umfaßt, die Hefezelle unter Bedingungen, die zur Expression des Fremdproteins geeignet sind, züchtet und das Protein gewinnt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine erfindungsgemäße Expressi- onskassette in eine Hefezelle bringt, wo die Expressionskassette in das Genom der Wirtszelle eingebaut wird, die Zelle züchtet und anschließend das Protein gewinnt.

Besonders bevorzugt wird die erfindungsgemäße Expressionskassette als Modul ein- gesetzt das die Konstruktion von episomalen oder integrativen Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen und ggf. Signalsequenzen ent- halten, ermöglicht.

Wie in den Figuren und den Beispielen gezeigt, führt die Verwendung des erfindungs- gemäßen Promotors in Kombination mit einer Sequenz für ein gewünschtes Protein und mit einem Terminator zur Expression des gewünschten Proteins, insbesondere in Hefezellen. Um zu prüfen, wie stark der erfindungsgemäß bereitgestellte Promotor ist, wurde die Expression des Gens EGFP (enhanced green fluorescent protein) unter Kon- trolle des CMV- (Cytomegalie-Virus)-Promotors mit der des EGFP-Gens unter der Steuerung des TPI-Promotors verglichen. Dabei wurde gefunden, dass die Expression unter dem erfindungsgemäßen TPI-Promotor etwa das 50-fache der Expression des CMV-Promotors bewirkt, was zeigt, dass der erfindungsgemäße Promotor zu einer Verstärkung der Expression von Fremdproteinen führt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> ;<BR> <BR> <BR> In den Figuren zeigt<BR> - i Fig. 1. eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette (R64), in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der Leserahmen des EGFP-Gens und ein funktio- neller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.

Fig. 2. die erfindungsgemäße Expressionskassette R53, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens und ein funktioneller Teil des Km-TPI- Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.

Fig. 3. die erfindungsgemäße Expressionskassette R48, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, der Leserahmen für Triosephosphati- somerase ohne Start-Methionin (Position 1116 bis 1859 entsprechend SEQ ID Nr. 1) und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entspre- chend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.

Fig. 4. die erfindungsgemäße Expressionskassette R11, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1112 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der Leserahmen für Triosephosphatisomerase (Position 1113 bis 1856 entsprechend SEQ ID Nr. 1) der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1857 bis 2037 entsprechend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.

Fig. 5 den Vergleich der Expression des TPI-Gens im K. marxianus Ausgangsstamm und nach Transformation mit dem Plasmid pKmarTI, das aus der Sequenz entspre- chend SEQ ID Nr. 1 und dem K. marxianus-Vektor pKDU8 besteht. Neben den Kultur- überständen der K. marxianus Stämme wurden Kulturüberstände nicht transformierter Stämme von K. lactis und S. cerevisiae in gleicher Menge aufgetragen.

Fig. 6. den Vergleich der Sekretierbarkeit von HBs Antigen nach Expression mittels verschiedener Expressionskassetten.

Fig. 7. den Vergleich der Expression von HBs-Antigen mit Hilfe verschiedener Expres- sionskassetten.

Ausführungsbeispiete Beispiel 1 Aufbau allgemeiner Expressionskassetten Um eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen Promotor bereitzustellen, wird durch PCR mittels der Primer P23 und P36 ein DNA-Fragment amplifiziert, das aus Promotor, codierendem Bereich und Terminator des KmTPI-Gens besteht und an den Enden durch künstliche Restriktionsenzymerkennungsstellen für Mlul begrenzt wird. Dieses Fragment wird in den Maul Site des Plasmides pSL1180 kloniert. Im co- dierenden Bereich des KmTPI-Gens befindet sich eine Restriktionserkennungsstelle für das Restriktionsenzym AcZ (AACGTT). Durch PCR wird an dieser Stelle eine stumme Mutation eingeführt, die den Ac/l Site zerstört, jedoch die durch GTT codierte Ami- nosäure Valin nicht verändert (AACGTT zu AACGTC). Ein Site für ACfl kann nun durch PCR unmittelbar vor dem Startcodon generiert werden, da sich hier die Nucleo- tidsequenz AAC ATG befindet (AACgtt ATG).

Unmittelbar vor dem Stopcodon des TPI codierenden Bereiches (GTC TAA) kann ebenfalls mittels PCR ein künstlicher AcA Ort generiert werden (aacGTt TAA). Durch Verbindung des MlullAcA Promoterfragmentes mit dem AcA/M/ul Terminatorfragment entsteht eine leere Expressionskassette mit einem unikalen AcA Ort für die Insertion von fremden Leserahmen (Kassette = pTIMex).

Die KmTPI Kassetten mit unikalem AcA Ort vor dem Startcodon bzw. vor dem Stop- codon stellen die Sekretionskassetten dar, die eine Expression von Fremdproteinen als Fusionsproteine mit TPI am N-oder C-terminalen Ende ermöglichen und zu einer Se- kretion der entsprechenden Fusionsproteine führen (Kassetten = pTIMfusN und pTIMfusC).

Die Kassetten können in bekannter Weise über MluI in entsprechende integrative- oder sich autonom replizierende Vektoren eingebaut und mit diesen in Rezipientenzel- len eingebracht werden.

Beispiel 2 Generierun, g von Expressionseinheiten Die Generierung von Expressionseinheiten kann auf der Basis der regulatorischen Se- quenzen des KmTPI auch generell durch sich überlappende PCR Reaktionen mittels Hybridprimern erfolgen, ohne dass AcA Schnittstellen in der Sequenz generiert wer- den müssen. Dem Fachmann sind entsprechende Techniken und PCR-Regimes be- kannt. Das in Beispiel 1 beschriebene System ist deshalb nicht ausschließlich, son- dern nur beispielhaft zu sehen.

Beispiel 3 Spezielle Expressionskassetten Es wurden einige spezielle Expressionskassetten, die a) s R64, R 53, R48 und R11 bezeichnet werden, durch PCR-Techniken generiert. Diese Kassetten sind durch Schemata und Restriktionskarten in den Figuren 1 bis 4 näher charakterisiert.

Plasmid R64 (Figur 1) Die Kassette enthält den KmTPI-Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEQ ID Nr. 1, den EGFP Leserahmen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleo- tiden 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1 (TPlpr-MetEGFP-TPltr).

Plasmid R53 (Figur 2) Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEQ ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S- Antigen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entspre- chend Sequenz SEQ ID Nr. 1 (TPlpr-HBS-TPltr) Plasmid R48 (Figur 3) Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEC ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S- Antigen an dessen C-Terminus der Leserahmen für TPI ohne Methionin fusioniert ist und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entsprechend Se- quenz SEQ ID NR. 1 (TPlpr-HBS-TPI-TPltr).

Plasmid R 11 (Figur 4) Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter und den gesamten. Leserahmen für KmTPI an dessen C-Terminus mit Methionin beginnend der Leserahmen für Hepatitis B Virus S-Antigen fusioniert ist. Dieser endet mit eigenem Stopcodon (UAG). Der hier verwendete funktionelle Teil des KmTPI-Terminators überlappt mit dem Stopcodon der HBs-Sequenz (TAAATTAAATTAGG) und beginnt mit dem Stopcodon UAA bei Position 1857 entsprechend SEQ ID Nr. 1. Er umfaßt lediglich 180 Basenpaare. Diese Kassette wurde über stumpfe Enden in den Smal O. rt entsprechender Plasmide klo- niert (TPlpr-TPI-HBS-TPltr). rUDAPESIER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT MICROMUN GmbH Walther-Rathenau-Str. 49a 17489 Greifswald EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEIN HNTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : pDl DSM 13973 II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UNDJODER VORGESCHLAGENE TAXONObtISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter b bezeichneten Mikrooreanismus wurde (X) eine wissenschaftliche Beschreibung (X) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen). III. EINGANG UND ANNAHME Diese internationale Hinterlegungsstelle úimnat den unter I bezeichneten Mii ; roorganismus an, der bei ihr am 2 0 01-01-0 4 (Darum der Ersthinterlegung) eingegangen ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Intemationalen Hinterlegungsstelle am einge5angen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Anschrift : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Datum : 2001-01-10 Falls Regel 6. 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.