La présente invention concerne un gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD), un gène chimère contenant ce gène comme séquence codante et son utilisation pour l' obtention de plantes résistantes à certains herbicides.

On connait certains herbicides tels que les isoxazoles décrites notamment dans les demandes de brevets français 95 06800 and 95 13570 et notamment risoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0496 630, 0496 631, en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH3- 4-CF3 phényl) propane- 1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-SO CH3-2,3 CI2 phényl) propane- 1, 3-dione, les tricétones décrites dans les demandes européennes 0 625 505 et 0 625 508, en particulier la sulcotrione. Cependant aucun gène de tolérance à de tels herbicides n' a été décrit.

L'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase est une enzyme qui catalyse la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate en homogentisate.

Par ailleurs, la séquence en acides aminés de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase issue de Pseudomonas sp. P.J. 874 a été décrite, sans qu'il y ait une description de son rôle dans la tolérance des plantes aux herbicides (Rϋetschi et col: Eur. J. Biochem. 205, 459-466, 1992). Ce document ne donne pas de description du gène codant pour cette protéine.

Il a maintenant été découvert la séquence d'un gène de ce type et qu'une telle séquence pouvait, une fois incorporée dans des cellules végétales, fournir une surexpression ou une activation de l'HPPD dans les plantes conférant à ces dernières une tolérance intéressante à certains herbicides récents, tels que ceux de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones.

La présente invention a pour objet une séquence d'ADN d'un gène d'origine non humaine et d'une origine bactérienne non marine, ou encore d'un gène de plante, isolée ou une séquence pouvant s'hybrider avec cette séquence isolée, caractérisé en ce qu'elle exprime une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygénase (HPPD).

Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle que notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que notamment de plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou d'ombellifères comme par exemple la carotte (Daucus carotta). Elle peut être native ou sauvage ou éventuellement mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance

herbicide contre les inhibiteurs de l'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones.

L'invention comprend également un procédé d'isolement du gène ci-dessus, caractérisé en ce que:

- on choisit, comme amorces, quelques oligonucléotides issus de la séquence en acides aminés d'une HPPD,

- à partir de ces amorces, on synthétise des fragments d'amplification par PCR

- on isole le gène par création et criblage d'une banque génomique et - on clone le gène.

De préférence on utilise des amorces issues de la séquence de l'HPPD d'une bactérie du genre Pseudomonas . De manière particulièrement préférée, elles sont issues de Pseudomonas fluoré scens.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un gène codant pour l'HPPD dans un procédé pour la transformation des plantes, comme gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une toléranceà certains herbicides. Il peut également être utilisé en association avec d'autres gènes marqueurs et/ou séquence codante pour une propriété agronomique.

Le gène codant peut être de toute origine, natif ou sauvage ou éventuellement muté tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide contre les inhibiteurs de l'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones. Comme séquence codante on peut notamment utiliser celle selon l'invention telle que décrite ci-dessus.

La transformation des cellules végétales peut être obtenue par tout moyen connu approprié. Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplates avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.

Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante d'un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri dAgrobacterium rhizogenes. La présente invention a encore pour objet un gène chimère comprenant, dans le sens de la transcription, au moins une séquence de régulation promotrice, une séquence codante hétérologue qui exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.

Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'a tubuline ( Demande européennne EP n° 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante tel que, par

exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), mais tout promoteur convenable connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP 0507698.

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande WO87/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande européenne n° 0508 909.

Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n° 0633 317.

La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, transformées selon l'un des procédés décrits ci-dessus et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène exprimant l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). On a observé que des plantes transformées de cette façon présentent une toléranceimportante à certains herbicides récents tels que lèse isoxazoles décrites notamment dans les demandes de brevets français 9506800 and 95 13570 et notamment du 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl) benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole, et notamment l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, , les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0496 630, 0496 631 , en particulier la 2-cyano-3-cycloρropyl-l-(2-Sθ2 CH3-4-CF3 phényl) propane- 1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane- 1, 3-dione, les tricétones décrites dans les demandes européennes 0625 505 et 0 625 508, en particulier la sulcotrione.

L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide

sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

L'invention a encore pour objet l'utilisation du gène HPPD comme gène marqueur au cours du cycle "transformation-régénération" d'une espèce végétale et sélection sur l'herbicide ci-dessus

Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.

Exemple 1 : Isolement du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 . A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 ( publié par Rϋetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit la séquence de différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence codante de l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl Bacteriol. 53:305- 316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène codant pour cette enzyme.

A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32.

La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minnimum M63 (KH2PO4 13,6g/l, (NH4)2S04 2g/l, MgSθ4 0,2g/l, FeSθ4 0,005 g/1 pH7 plus L-tyrosine lOmM comme seule source de carbone) à 28°C pendant 48 heures.

Après lavage, les cellules sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (tris HC1 100 mM pH 8,3, NaCl 1,4 M et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65°C. Après un traitement au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides nucléiques sont précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 μl d'eau stérile et traités à la RNAse 10 μg/ml final. L'ADN est de nouveau traité au phénol/chloroforme, chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M pH5 et 2 volumes d'éthanol. L'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé.

B) Choix des oligonucléotides et synthèses.

A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 on choisit cinq oligonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la protéine vers le COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir figure 1). Le choix a été dicté par les deux règles suivantes:

-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité. -une dégénérescence la plus faible possible.

Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes: PI : 5 A(C/T)GA(G/A)AA(CT)CCIATGGG3' P2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'

P3: 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3' P4: 5'AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3' P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3' Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque MΓLLPORE.

Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on doit obtenir théoriquement d'après la séquence SEQ ID N° 1 ont les tailles suivantes: avec les amorces PI et P3 > environ 690 bp avec les amorces PI et P4 > environ 720 bp avec les amorces PI et P5 > environ 1000 bp avec les amorces P2 et P3 > environ 390 bp avec les amorces P2 et P4 > environ 420 bp avec les amorces P2 et P5 > environ 700 bp

C) Amplification d'une partie codante de l'HPPD de P. fluorescens A32. Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et avec la Taq polymérase PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 50μl de réaction il y a les dNTP à 200μM, les primers à 20μM, la Taq polymérase 2,5 unités et l' ADN de P. fluorescens A32 2,5 μg.

Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 95°C puis 35 cycles <45 sec 95°C, 45 sec 49°C, 1 min 72°C> suivis de 5 min à 72°C.

Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de la spécificité des amplifications.

Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/P5 et P2/P4 sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n°5 pi 156.

Un clone de chacun des trois types est séquence partiellement; ceci permet de confirmer qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P. fluorescens A32. Le fragment P1/P4 est retenu comme sonde pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.

D) Isolement du gène.

Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P. fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD P1/P4. On a donc fait digérer 400μg d'ADN de P. fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI et purifier sur gel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.

Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Bam HI et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation dans E. coli DHlOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD P1/P4.

Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée figure 2. Sur cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle est composée de 1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N° 1 ). L'HPPD de P. fluorescens A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de Pseudomonas sp. strain P.J. 874, il y a en effet 92% d'identité entre ces deux protéines ( voir figure 3 ).

Exemple 2: Construction de deux gènes chimères.

Pour conférer la tolérancede plantes aux herbicides inhibant l'HPPD, on construit deux gènes chimères:

Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur double histone (Demande de Brevet européen N° 0 507

698) suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase. L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme.

Le deuxième sera identique au premier, à ceci près qu'entre l'activateur de translation TEV et la partie codante de l'HPPD, on intercale le peptide de transit optimisé (OTP) (Demande européennne EP n° 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.

A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:

- pRPA-RD-11 Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant le site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) ( Demande européennne EP n° 0 652 286) est clone entre les sites Kpnl et Sali. Le site Kpnl est transformé en un site Notl par traitement avec la T4 ADN polymérase I en présence de 150 μM de deoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker Notl (Stratagene catalog #1029). Ainsi on obtient une cassettte de clonage NOS polyA . - pRPA-RD-127: Un dérivé de ρRPA-BL-466 (Demande européennne EP n° 0 337

899) clone dans pRPA-RD-11 créant une cassette d'expression du gène oxy et contenant le promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:

" promoter (SSU) - oxy gène - NOS polyA"

Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-488 a été digéré avec Xbal et HindIII pour isoler un fragment de 1.9 kbp contenant le promoteur SSU et le gène oxy qui a été ligué dans le plasmide pRPA-RD-11 digéré avec des enzymes compatibles.

- pRPA-RD-132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européennne EP n° 0 507 698) clone dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène oxy avec le promoteur double histone:

" promoteur double histone - oxy gène - NOS polyA " Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindLTI, traité par la Klenow puis redigéré avec Ncol. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par Xbal, traité Klenow et redigéré par Ncol.

- pRPA-RD- 153: C'est un dérivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J.

Virol. 64: 1590-1597) est digéré avec Ncol et EcoRI et le fragment de 150 bp est ligué dans pRPA-RD-132 digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression contenant le promoteur:

"double histone promoter - TEV -oxy gène - NOS polyA" B) Construction du vecteur pRPA-RD- 185 : pUC19/GECA: Un dérivé de pUC-19 (Gibco catalog #15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRI et ligué avec l'oligonucleotide linker 1 :

Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA

Le clone sélectionné contient un site EcoRI suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRI, Apal, Avril, Pmel, Sfîl, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sali, PstI, SphI et HindIII. pRPA-RD-185: c'est un dérivé de pUC19/GECA contenant un polylinker modifié. pUC19/GECA est digéré par HindIII et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:

Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG

AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA

Le clone sélectionné contient un site HindIII site au milieu du polylinker qui contient maintenant les sites suivants: EcoRI, Apal, Avril, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sali, PstI, SphI, HindIII, Pacl, Ascl Xhol et EcoNI.

C) Construction du vecteur pRP T:

- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O,

pRPA-RD153 est digéré par Hind III, traité par la Klenow puis redigéré par Ncol pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP A par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par Ncol.

- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et Sacl, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et Sacl.

- pRP T: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP R après digestion par Sacl et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes (Demande européennne EP n° 0 508 909).

Le gène chimère du vecteur pRP T a donc la structure suivante:

D) Construction du vecteur pRP V

- pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n° 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été obtenu par ligation de la partie codante de l'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et Ncol, traitement à la Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.

- pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le construire le plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigéré par Ncol pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP P par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par Ncol.

- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et Sacl pour sortir le gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et Sacl. - pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après digestion par Sacl et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP n° 0 508 909).

Le gène chimère du vecteur pRP Q a donc la structure suivante:

Exemple 3: Transformation du tabac industriel PBD6.

Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été transférés dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909. 1 transformation :

Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène dAgrobacterium EHA 101(Hood et al,1987)porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986).La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229- 1231.

2) Régénération:

La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 200ug/ml de kanamycine.Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985Nol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (AN A) et 2 mg 1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g 1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours,les pousses enracinées sont passées en terre.

Exemple 4: Mesure de la tolérancedu tabac au 4-14-CF3-2-(méthylsulfonyl ^" ) benzoyll-5- cyclopropyl isoxazole: traitement de postlevée.

Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20°C la nuit et 23°C la jour) pendant cinq semaines puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole. Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine( couvrant environ 80% des feuilles terminales).

Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à la dose de 400 g/ha.

Si l'enzyme surexprimée est dans le cytoplasme, c'est à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le vecteur pRP T, alors la plante présente de très légères chloroses toutes localisées sur les feuilles intermédiaires.

Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le verteur pRP V, alors la plante est parfaitement protégée, ne présente aucun symptôme.

Exemple 5: Mesure de la tolérancedu tabac au 4- ^r 4-CF3-2-( ^" méthylsulfoyl) benzoyll-5- cyclopropyl isoxazole: traitement de prélevée a) test in vitro:

On utilise des graines de tabac récoltées à partir des plantes issues du cycle "transformation - régénération" résistantes à un traitement foliaire d'isoxaflutole à la dose de 400g/h décrites aux exemples 1 à 3.

Ces graines ont été semées sur des boites contenant du phytagar à 10 g/1 et de l'isoxaflutole à différentes concentrations allant de 0 à 1 mg/1. La germination a été faite ensuite à 25°C avec une photopériode de 12 heures de lumière/12 heures d'obscurité.

Selon ce protocole des graines de tabacs sauvages ont été mises à germer ainsi que des graines des deux types de tabacs transgéniques c'est à dire tabacs CY, avec localisation de l'HPPD dans le cytoplasme, et les tabacs CO avec localisation de l'HPPD dans le chloroplaste.

Les mesures de résistances sont faites visuellement entre 2 et 3 semaines après le semis.

Les résultats sont consignés dans le tableau ci-dessous.

° les symptômes que présentent les plantules en cours de germination sont des déformations des cotylédons plus ou moins importantes et surtout un blanchiment des tissus normalement photosynthétiques et donc verts.

* 75% des graines germent car ont été semées des graines issues de l'autofécondation de plantes mono-loccus sortant du cycle "transformation - régénération" ne portant donc le gène de toléranceque sur un chromosome.

En opérant de la même manière avec les produits suivants produit n° 51 du brevet américain 4 780 127, on obtient les mêmes résultats à une concentration de 0 mg/1 et 0,1 mg/1 sur tabac sauvage et tabac CO. b) test en serre:

On opère comme à l'exemple 4, si ce n'est que le traitement est effectué en prélevée, 24 heures avant le semis. Le semis sauvage s'effectue normalement. Dans ces conditions on observe que pour les semis témoins non traités, il n'y pas de germination pour toute dose d'herbicide au moins égale à 10 g/ha. Au contraire les tabacs CY ne présentent aucun symptôme, tel que défini au paragraphe a), jusqu'à 100 g/ha compris. De même les tabacs CO ne présentent aucun symptôme, tel que défini au paragraphe a) jusqu'à 200 g/ha compris.

Ces résultats montrent clairement que le gène de l'HPPD de P. fluorescens confère une toléranceau tabac contre les traitements en prélevée à l'isoxaflutole. Cette toléranceest meilleure si la protéine est localisée dans le chloroplaste au lieu du cytoplasme.

Exemple 6:

Dans le but d'étudier si le gène de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens peut être utilisé comme gène marqueur au cours du cycle "transformation - régénération" d'une espèce végétale, le tabac a été transformé avec le gène de l'HPPD et des plantes transformées ont été obtenues après sélection sur isoxaflutole.

Matériel et méthodes et résultats

Le gène chimérique pRP V décrit ci-dessous est transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909.

Le gène chimère du vecteur pRP V a la structure suivante:

1 transformation:

Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène dAgrobacterium EHA 101 (Hood et al, 1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et al, 1986) . La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).

2) Régénération:

La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 350 mg/1 de cefotaxime et 1 mg/1 d'isoxaflutole. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985Nol 227,p.l229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (AΝA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/1 d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose et 1 mg/1 d'isoxaflutole mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et 1 mg/1 d'isoxaflutole et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours,les pousses enracinées sont passées en terre.

Toutes les plantules obtenues selon ce protocole sont analysées par PCR avec des amorces spécifiques de l'HPPD de P.fluorescens. Cette analyse PCR a permis de confirmer que toutes les plantules ainsi obtenues ont bien intégré le gène de l'HPPD.

En conclusion, cet essai confirme que le gène de l'HPPD peut être utilisé comme gène marqueur et que, associé à ce gène, l'isoxaflutole peut être un bon agent de sélection.

1 2

FE )LLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)

Exemples 7 et 8 : Isolement du gène de l'HPPD d 'Arabidopsis thaliana et du gène de l'HPPD de carotte (Daucus carotta)

a) Construction des banques d'ADNc. Des mRNAs extraits de jeunes plantules d'Arabidopsis thaliana, et des mRNAs extraits de cellules de carotte en culture, ont servi à construire deux banques d'ADNc dans le vecteur Uni Zap™ XR commercialisé par la société Stratagen, suivant le protocole préconisé par cette société.

b) Criblage des banques d'ADNc

Ces deux banques ont été criblées à l'aide d'une sonde correspondant à un ADNc d'Arabidopsis thaliana de longueur partielle, obtenu via l'Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio, USA) et répertorié : EST clone N° 91B13T7. Ce clone est constitué d'environ 500 paires de bases dont seulement 228 avaient été séquencées par le MSU-DOE Plant Research Laboratory dans le cadre du séquençage au hasard des ADNc d'Arabidopsis thaliana. Nous avons séquence complètement les 500 paires de bases avant d'utiliser ce clone pour cribler nos banques d'ADNc d'Arabidopsis thaliana et de carotte à l'aide de la technique classique d'hybridation des plages de lyse (référence ?).

c) Un ADNc d'Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 2) correspondant à 1338 paires de bases a été obtenu. Cet ADNc possède un codon de début d'initiation de la traduction à la position 25 et un codon de fin de traduction à la position 1336. Cet ADNc est donc complet et code pour une protéine de 445 acides aminés.

d) Un ADNc de carotte (Daucus carotta) (SEQ ID N° 3) correspondant à 1329 paires de bases à été obtenu. Cet ADNc possède un codon de début d'initiation de la traduction à la position 1 et un codon de fin de traduction à la position 1329. Cet ADNc est donc complet et code pour une protéine de 442 acides aminés.

Les séquences illustrées sont les suivantes:

SEQ ID N° 1 Séquence du gène de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens A32.

SEQ ID N° 2

Séquence d' ADNc d'HPPD d'Arabidopsis thaliana

SEQ ID N° 3 séquence d' ADNc d'HPPD de Daucus carotta

Les figures ci-après sont données à titre indicatif pour illustrer l'invention.

La Figure 1 représente la séquence protéique de l'HPPD de Pseudomonas sp. strain P.J. 874 et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante; les cinq oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette région codante sont symbolisés par les cinq flèches.

La Figure 2 représente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN génomique de 7 kb contenant le gène de l'HPPD de P. fluorescens A32.

La Figure 3 donne la comparaison des séquences en acides aminés de l' HPPD de P. fluorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les acides aminés divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence consensus.

u

Liste de séquences

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Sailland, Alain Rolland, Anne Matringe, Michel Pallett, Kenneth E

(ii) TITLE OF INVENTION: SEQUENCE ADN D'UN GENE DE

LΗYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE ET OBTENTION DE PLANTES CONTENANT CE GENE DE LΗYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE, RESISTANTES A CERTAINS HERBICIDES

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 3

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: François Chrétien

(B) STREET: 14-20 rue Pierre BAIZET

(C) CITY: Lyon Cedex 09

(E) COUNTRY: France

(F) ZIP: 69263

(v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Releâse #1.0, Version #1.25

(vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: FR PH95033

(B) FILING DATE: 02-JUN-1995

(C) CLASSIFICATION:

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Chrétien, François

(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONE: 72-29-26-42

(B) TELEFAX: 72-29-28-43

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1077 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Pseudomonas fluorescens

.

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1 :

ATGCCAGAT TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 60 z~,zzz-?.z" —GGTACCCT GGA CCGAT-: TTCGAGATCA TC-GGCTT AC CAAAGTCGCG I; O

ACCCA GTT CAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 130

AACSAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240

ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300

CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360

GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420

GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480

GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540

AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600

ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660

TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720

CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780

ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 8 0

GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900

GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960

TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020

CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1338 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Arabidopsis thaliana

(B) STRAIN: Columbia

(D) DEVELOPMENTAL STAGE: Young green plant

(vii) IMMEDIATE SOURCE:

(A) LIBRARY: Uni zap XR STRATAGENE

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

ATGGGCCACC AAAACGCCGC CGTTTCAGAG AATCAAAACC ATGATGACGG CGCTGCGTCG 60

TCGCCGGGAT TCAAGCTCGT CGGATTTTCC AAGTTCGTAA GAAAGAATCC AAAGTCTGAT 120

AAATTCAAGG TTAAGCGCTT CCATCACATC GAGTTCTGGT GCGGCGACGC AACCAACGTC 180

G TCGTCGCT TCTCCTGGGG TCTGGGGATG AGATTCTCCG CCAAATCCGA TCTTTCCACC 240

3 AAACA7GG TTCACGCCTC T7ACCTACT ACCTCCGGTG ACC7CCGAT7 CC7TTTCACT 300

GC7 C77AC7 CT CGT TCT C7CCGCCGGA GAGATTAAAC CGACAACCAC AGCTTCTA7C 360

C AAGTTTCG ATCACGGCTC T7GTCGTTCC TTCTTCTCTT CACATGGTCT CGGTGTTAGA 420

GCCGTTGCGA TTGAAGTAGA AGACGCAGAG TCAGCTTTCT CCATCAGTGT AGCTAATGGC 480

GCTATTCCTT CGTCGCCTCC TATCGTCCTC AATGAAGCAG TTACGATCGC TGAGGTTAAA 540

CTA7ACGGCG ATGTTGTTCT CCGATATGTT AGTTACAAAG CAGAAGATAC CGAAAAATCC 600

GAATTCTTGC CAGGGTTCGA GCGTGTAGAG GATGCGTCGT CGTTCCCATT GGATTATGGT 660

ATCCGGCGGC TTGACCACGC CGTGGGAAAC GTTCCTGAGC TTGGTCCGGC TTTAACTTAT 720

GTAGCGGGGT TCACTGGTTT TCACCAATTC GCAGAGTTCA CAGCAGACGA CGTTGGAACC 780

GCCGAGAGCG GTTTAAATTC AGCGGTCCTG GCTAGCAATG ATGAAATGGT TCTTCTACCG 840

ATTAACGAGC CAGTGCACGG AACAAAGAGG AAGAGTCAGA TTCAGACGTA TTTGGAACAT 900

AACGAAGGCG CAGGGCTACA ACATCTGGCT CTGATGAGTG AAGACATATT CAGGACCCTG 960

AGAGAGATGA GGAAGAGGAG CAGTATTGGA GGATTCGACT TCATGCCTTC TCCTCCGCCT 1020

ACTTACTACC AGAATCTCAA GAAACGGGTC GGCGACGTGC TCAGCGATGA TCAGATCAAG 1080

GAGTGTGAGG AATTAGGGAT TCTTGTAGAC AGAGATGATC AAGGGACGTT GCTTCAAATC 1140

TTCACAAAAC CACTAGGTGA CAGGCCGACG ATATTTATAG AGATAATCCA GAGAGTAGGA 1200

TGCATGATGA AAGATGAGGA AGGGAAGGCT TACCAGAGTG GAGGATGTGG TGGTTTTGGC 1260

AAAGGCAATT TCTCTGAGCT CTTCAAGTCC ATTGAAGAAT ACGAAAAGAC TCTTGAAGCC 1320

AAACAGTTAG TGGGATGA 1338

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1329 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Daucus carota

(D) DEVELOPMENTAL STAGE: Suspension cells

(vii) IMMEDIATE SOURCE:

(A) LIBRARY: Uni zapXR STRATAGENE

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

ATGGGGAAAA AACAATCGGA AGCTGAAATT CTCTCAAGCA ATTCATCAAA CACCTCTCCT 60

1 7

GCAACATTCA AGCTGGTCGG TTTCAACAAC TTCGTCCGC3 CCAACCCCAA GTCCGATCAC 12 C

T7 3CCGTGA AGCGGTTCCA CCACATTGAG TTCTGGTGCG GCGACGCCAC CAACACGTCG 130

CGGCGGTTCT CGTGGGGCCT CGGCATGCCT TTGGTGGCGA AATCGGATCT CTCTACTGGA 240

AACTCTGTTC ACGCTTCTTA TCTTGTTCGC TCGGCGAATC TCAGTTTCGT CTTCACCGCT 300

CCTTACTCTC CGTCCACGAC CACTTCCTCT GGTTCAGCTG CCATCCCGTC TTTTTCGGCA 360

TCGGGTTTTC ACTCTTTTGC GGCCAAACAC GGCCTTGCTG TTCGGGCTAT TGCTCTTGAA 420

GTTGCTGACG TGGCTGCTGC GTTTGAGGCC AGTGTTGCGC GTGGGGCCAG GCCGGCTTCG 480

GCTCCTGTTG AATTGGACGA CCAGGCGTGG TTGGCTGAGG TGGAGTTGTA CGGAGATGTG 540

GTCTTGAGGT TTGTTAGTTT TGGGAGGGAG GAGGGTTTGT TTTTGCCTGG ATTCGAGGCG 600

GTGGAGGGGA CGGCGTCGTT TCCGGATTTG GATTATGGAA TTAGAAGACT TGATCATGCG 660

GTGGGGAATG TTACCGAGTT GGGGCCTGTG GTGGAGTATA TTAAAGGGTT TACGGGGTTT 720

CATGAATTTG CGGAGTTTAC AGCGGAGGAT GTGGGGACTT TGGAGAGTGG GTTGAATTCG 780

GTGGTGTTGG CGAATAATGA GGAGATGGTT CTGTTGCCCT TGAATGAGCC TGTGTATGGG 840

ACCAAGAGGA AGAGTCAGAT ACAGACTTAC TTGGAGCACA ATGAAGGGGC TGGAGTGCAG 900

CATTTGGCTT TAGTGAGTGA GGATATTTTT AGGACTTTAA GGGAGATGAG GAAGAGGAGT 960

TGCCTTGGTG GTTTTGAGTT TATGCCTTCG CCACCGCCTA CGTATTACAA GAATTTGAAG 1020

AATAGGGTCG GGGATGTGTT GAGTGATGAA CAGATCAAGG AGTGTGAAGA TTTGGGGATT 1080

TTGGTGGATA GGGATGATCA GGGTACATTG CTTCAAATCT TTACCAAGCC TGTAGGTGAC 1140

AGGCCTACCT TATTCATAGA GATCATTCAG AGGGTAGGGT GCATGCTCAA GGACGATGCA 1200

GGGCAGATGT ACCAGAAGGG CGGGTGCGGA GGATTTGGGA AGGGGAACTT CTCAGAGCTG 1260

TTCAAGTCCA TCGAAGAATA TGAAAAAACA CTTGAAGCTA AACAAATCAC TGGATCTGCT 1320

GCTGCATGA 1329