双羰基还原酶、 其编码基因及应用 技术领域 本发明涉及生物催化合成技术领域， 具体而言， 涉及一种双羰基还原酶、 其编码 基因及应用。 背景技术 手性醇是一类重要的中间体化合物， 广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品 的合成。 3R, 5S-二羟基 -6-苄氧基-己酸叔丁酯是 3-羟基 -3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶的 抑制剂他汀类降血脂药物的关键手性中间体， 可以通过化学合成和生物催化合成的方 法制得。 然而， 通过化学合成 3R， 5S-双羟基产物存在下列问题： 一般需用手性金属 催化剂， 生产成本高； 产物的光学纯度较难达到要求； 大量使用有机溶剂， 造成环境 污染严重。 采用生物催化合成这类化合物是一种有效的方 法， 即将含有羰基的底物通过特定 的酶催化还原为相应的手性醇。 Wolberg等利用细菌 Jacto6ac//¾y 6re ^将一种 β， δ- 双羰基底物中的 δ-羰基还原成 δ-羟基， ee为 98.1%; 去氧核糖 -5-磷酸醛缩酶（DERA) 能够以乙醛和氯乙醛为底物， 通过两步醛缩反应同时引入两个手性中心得到 3R， 5S- 双羟基产物， ee>99.9%, de=96.6%,但去氧核糖 -5-磷酸醛缩酶催化反应生产成本较高。 Guo等利用 Acinetobacter species SCI 3874还原制备得到 3R， 5S-二羟基 -6-苄氧基 -己酸 酯， 但 de=63.3%。也有报道腈基水解酶通过对 3-羟基戊二腈去对称化得到单羟基中间 体 R-4氰基 -3-羟基丁酸， 再经过多步反应得到 3R， 5S-二羟基 -6-苄氧基-己酸酯。 可 见， 通过生物催化方法合成 3R， 5S-双羟基产物的现有技术也仍存在一些技术问 题： 腈水解酶反应路线较长难度较大， 成本较高； Wolberg等利用细菌 Jactotoc/to 6re ^ 合成方法中需用其他方法引入另一个手性中心 ； 利用去氧核糖 -5-磷酸醛缩酶（DERA) 合成方法中需要用酶量较大， 底物抑制作用很强并且初始反应原料为易燃易 爆试剂， 工业化生产难度较高。 发明内容 本发明旨在提供一种双羰基还原酶、 其编码基因及应用， 以简化 3R， 5S-二羟基化 合物的合成步骤， 降低生产污染和生产成本。 为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种双羰基还原酶。 该双羰 基还原酶具有下列之一的氨基酸序列： 1 ) SEQ N0.1的氨基酸序列； 2) 将 SEQ N0.1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、 和 /或缺失、 和 /或添加， 且具有将 o o o OH OH O

Ri\ 、

R ₂ 立体选择性地还原为 ¹ ^ ^^^^2功能的由 SEQ N0.1衍生 的氨基酸序列， 且 SEQ N0.1衍生的氨基酸序列与 SEQ N0.1具有 80%以上的同源性， 其中， 选自芳香基、 烷基、 环烷基、 烷基取代的芳香基、 卤素取代的芳香基、 芳烷 杂环基、 环状杂烷基或环状杂烷化烷基， R ₂ 选自烷基、 环烷基、 ¾烷基或 ¾环烷基。 根据本发明的另一个方面， 提供一种上述双羰基还原酶的编码基因。 进一步地， 上述编码基因具有下述之一的脱氧核苷酸序列 ： SEQ N0.2的脱氧 核苷酸序列； 2)与 SEQ N0.2的脱氧核苷酸序列具有 80%同源性且编码的蛋白质具有 o o o OH OH O

R ₂ 立体选择性还原为 OR ₂ 功能的脱氧核苷酸序列, 根据本发明的再一个方面， 提供一种含有上述双羰基还原酶的编码基因的 重组表 达载体。 根据本发明的又一个方面， 提供一种含有上述双羰基还原酶的编码基因的 转基因 细胞系。 根据本发明的再一个方面， 提供一种含有上述双羰基还原酶的编码基因的 转基因 重组菌。

o o o 根据本发明的又一个方面，提供一种上述双羰 基还原酶在将 ^^^^^0« ₂ 立

OH OH O

体选择性还原为 ^Rl ^c OR ₂ 中的应用。 步地， 双羰基还原酶在制备 3R， 5S-二羟基 -6-苄氧基-己酸叔丁酯中的应用,

采用本发明的双羰基还原酶（Diketoreductase, DKR)为生物催化齐 可以一步还原二酮底物， 制备得到单一光学纯度的 3R， 5S-二羟基化合物， 将其应用到合成他汀类药物中间体， 得到 ee 值为 99%， de值为 90%左右的 3R， 5S-二羟基化合物， 简化了合成步骤， 降低了生产污染和 生产成本， 适合于大规模工业化生产。 具体实施方式 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将结合实施例来详细说明本发明。 本发明的羰基还原酶基因， 來源于 Rhodococcus etythmpolis SK121该羰基还原酶 具有双羰基还原酶的功能。 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种双羰基还原酶。 该双羰基还原酶具有 一的氨基酸序列： 1 ) SEQ N0.1 的氨基酸序列； SEQ N0.1 为：

YKG; 2 ) 将 SEQ NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取� �、 和 /或缺失、 和 /

O O O OH OH O

或添加且具有将 ¹ ^^^^^^ ₂ 立体选择性还原为 ^{K l} vU^/ ^ _OR2 功能的由 SEQ N0.1衍生的氨基酸序列，，且 SEQ N0.1衍生的氨基酸序列与 SEQ N0.1具有 80% 以上的同源性， 其中， 选自芳香基、 烷基、 环烷基、 烷基取代的芳香基、 卤素取代 的芳香基、 芳烷杂环基、 环状杂烷基或环状杂烷化烷基， R ₂ 选自烷基、 环烷基、 卤烷 基或卤环烷基。 采用本发明的双羰基还原酶（Diketoreductase, DKR) 为生物催化剂， 可以一步 还原二酮底物， 制备得到单一光学纯度的 3R， 5S-二羟基化合物， 将其应用到合成他汀类药物中间 体， 简化了合成步骤， 降低了生产污染和生产成本， 适合于大规模工业化生产。 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种上述双羰基还原酶的编码基因， 该编 码基因具有下述之一的脱氧核苷酸序列： 1 ) SEQ N0.2的脱氧核苷酸序列； SEQ N0.2

2)与

SEQ N0.2 的脱氧核苷酸序列具有 80%同源性且编码的蛋白质具有将 o o o OH OH O

R ₂ 立体选择性还原为〜 OR ₂ 功能的脱氧核苷酸序列, 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种含有上述双羰基还原酶的编码基因的 重组表达载体。 该载体可以是 pET-22b ( +)、 pET-22b ( +)、 pET-3a ( + )、 pET-3d ( +)、 pET-l la ( +)、 pET-12a ( + )、 pET-14b ( +)、 pET-15b ( + )、 pET-16b ( +)、 pET-17b ( +)、 pET-19b ( + )、 pET-20b ( + )、 pET-21a ( + )、 pET-23a ( + )、 pET-23b ( + )、 pET-24a ( + )、 pET-25b ( + )、 pET-26b ( + )、 pET-27b ( + )、 pET-28a ( + )、 pET-29a ( + )、 pET-30a ( + )、 pET-31b ( + )、 pET-32a ( + )、 pET-35b ( + )、 pET-38b ( + )、 pET-39b ( + )、 pET-40b ( + )、 pET-41a ( + )、 pET-41b ( + )、 pET-42a ( + )、 pET-43a ( + )、 pET-43b ( + )、 pET-44a ( + )、 pET-49b ( + )、 pQE2、 pQE9、 pQE30、 pQE31、 pQE32 pQE40、 pQE70、 pQE80、 pRSET-A、 pRSET-B、 pRSET-C、 pGEX-5X-l pGEX-6p-l pGEX-6p-2 pBV220 pBV221 pBV222 pTrc99A、 pTwinK pEZZ18、 pKK232-18 pUC-18 或 pUC-19。 表达载体在大肠杆菌 中过量表达， 经过量表达的双羰基还原酶在 SDS-PAGE上呈现的分子量约为 30KD, 在 30°C， pH6.0条件下， 可以一步还原得到光学纯度较高的 3R， 5S-双羟基化合物。 当然， 包括上述编码基因的转基因细胞系、 转基因重组菌也在本发明的保护范围 之内。 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种上述双羰基还原酶在将 o o OH OH O

R ₂ 立体选择性还原为 ^^"^^^OR冲的应用。 该酶可以一步还原 二酮底物， 制备得到单一光学纯度的 3R， 5S-二羟基化合物， 可以应用到合成他汀类药物中间体。 优选的， 双羰基还原酶在制备 3R， 5S-二羟基 -6-苄氧基-己酸叔丁酯中应用， 其中， o o

、OR ₂ 可以为

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效 果。 实施例 1

( 1 ) 来源于 SK121菌株的双羰基还原酶的克隆与表达 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3 '末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.3 : 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID N0.4: 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （ SEQ

氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ

DEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b ( +) ( pET-22b (+) 也可以为 pET-3a (+)， pET-3d (+)， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9, pQE30, pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B， pRSET-C， pGEX-5X- 1， pGEX-6p- 1， pGEX-6p-2， pBV220， pBV221， pBV222， pTrc99A, pTwinl , pEZZ18， pKK232-18, pUC-18, pUC-19) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌感受态 DH5(x菌株中， 涂布于 含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB固体培养基（Luria-Bertani培养基） 中， 37°C培养过 夜。 挑取上述培养基上的单菌落接种于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基 中， 37°C振荡培养过夜， 经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后， 将正确的克隆载 体 pET-22b ( + ) - DKR转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中， 涂布于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄 青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。挑取上述培养基中上的单菌落� ��种于 5ml 含 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR (聚合酶链式反应） 鉴 定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述菌液转接于 5ml含 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养至 OD _6(X ^0.6时， 加入 IPTG (异丙基硫代半乳糖苷） 至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O.lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM和 1.0mM， 在 18°C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。 诱导 16h后， 取出菌 液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。菌体用超声破碎仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min 离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现 在终浓度为 0.02mMIPTG浓度时诱导表达双羰基还原酶的量最� �。 为提高双羰基还原 酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h，30°C诱导 8h以及 25°C诱导 16h条件下表达，并同时设立不加 IPTG 诱导剂的阴性对照。 诱导表达结束后， 分别将三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离 心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细胞， 4。C， 12000rpm/min离心 20min获 得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25°C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。

(2) 来源于 R/zoifococc er /zropofo SK121菌株的双羰基还原酶的活性鉴定 选用已经在市场上商业化的

为初始原料， 其中 选自芳香基、 烷基、 环烷基、 烷基取代的芳香基、 卤素取代的芳 香基、 芳烷杂环基、 环状杂烷基或环状杂烷化烷基； R ₂ 选自烷基、 环烷基、 卤烷基或 卤环烷基。 所述的双羟基产物由以下化学通式表达： 其中 ]^选 自芳香基、 烷基、 环烷基、 烷基取代的芳香基、 卤素取代的芳香基、 芳烷杂环基、 环 状杂烷基或环状杂烷化烷基； R ₂ 选自烷基、 环烷基、 ¾烷基或 ¾环烷基。 向 500ml 反应瓶中， 加入 10g 主原料"^ ^°^^^0八， 40ml 聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 360ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加酮还原酶： 加入 0.3g NAD ⁺ ， 41.2g甲酸铵， 0.5g辅酶甲酸脱氢酶和 lg 双羰基还原酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 17h; 用 400ml乙酸乙酯停止反应， 用 250g硅藻土过滤， 400ml乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓 缩得到粗品， 92.0 %， 收率 90%， ee值大于 99.5%， de值 90.4%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz, CDC13: δ 7.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据为： MW=310± 1。 向 500ml 反应瓶中， 加入 10g 主原料 ¹ ^^。^^ ¹ ^^ ， 40ml 聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 360ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加酮还原酶： 加入 0.3g NAD+， 41.2g甲酸铵， 0.5g辅酶甲酸脱氢酶和 lg 双羰基还原酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 17h; 用 400ml乙酸乙酯停止反应， 用 250g硅藻土过滤， 400ml乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓 缩得到粗品，二羟基^^° ^^ ₀ 产品 85.0 %，收率 90%， ee值大于 90-99%， de值 80-95%。 所得产品质谱数据为： MW=282± 1。 向 500ml 反应瓶中， 加入 10g 主原料、 0、^ ^\ ， 40ml 聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 360ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 0.3g\NAD+， 41.2 _§ \甲酸铵， 0.5g辅酶甲酸脱氢酶和 lg双羰基还原酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 17h; 用 400ml乙酸乙酯停止反应， 用 250g硅藻土过 滤， 400ml 乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， 二 品 80%， 纯度 98.0%， 收率 90%， ee值 90-99%， de值

80-95%。 所得产品质谱数据如下： MW=268±1。 向 500ml反应瓶中， 加入 , 40ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 360ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 0.3g\NAD+， 41.2 _§ \甲酸铵， 0.5g辅酶甲酸脱氢酶和 3g双羰基还原酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3°C保温 17h; 用 400ml乙酸乙酯停止反应， 用 250g硅藻土过 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， 二 75%, 纯度 98.0%， 收率 90%， ee值 90-99%， de 值 80-95% 所得产品质谱数据如下： MW=324±1。 实施例 2 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶（SEQIDN0.5),该基因来源 于 Rhodococcus erythropolis PR4。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.6 : 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游引物 SEQ ID N0.7: 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （ SEQ ID NO.5 ：

氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ ID N0.8

YIDEGKLGVAVGEGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde I和 Xho I分别将目 的基因和 pET-22b (+) (pET-22b (+) 也可以为 pET-3a (+)， pET-3d (+)， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9, pQE30, pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222, pTrc99A, pTwinl , pEZZ18， pKK232-18, pUC-18, pUC-19) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5 a菌株的感受态中， 涂 布于含有 50 g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养 基上的单菌落接种于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养 过夜，经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体 pET22b ( + ) - DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 )中，涂布于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB培养基中， 37°C培养过夜。挑取上述培养基中上的单菌落� ��种于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述菌液转 接于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养至 OD _6QQ =0.6 时， 加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O.lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18°C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。 诱 导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4°C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还原酶的 量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25°C诱导 16h条件下 表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。 诱导表达结束后， 分别将三个温度 的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀，上清液用垂直电泳仪� ��行 SDS-PAGE检 测。 结果发现在 25°C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。 选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

\QR ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml 反应瓶中， 加入 0.05g 0.5ml 聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 4.5ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 1.5mg NAD ⁺ ， 20.6mg甲酸铵， 10mg辅酶甲酸脱氢酶和 20mg双羰基 还原酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 17h; 用 5ml乙酸乙酯停止反应， 用 1.25g 硅 取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗 83.0% , 收率 90%， ee值 98%， de值 91%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz, CDC13: δ 7.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310± 1。 实施例 3

与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶（SEQ ID N0.9); , 该基因为 SEQ N0.1的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID NO.10 : 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID N0.11： 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （ SEQ ID N0.9 ：

其 氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ ID NO.12 MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINA

KNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b ( +) ( pET-22b (+) 也可以为 pET-3a (+)， pET-3d (+)， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9 , pQE30 , pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80 , pRSET-A, pRSET-B , pRSET-C , pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222 , pTrc99A, pTwinl , pEZZ 18， pKK232-18 , pUC-18 , pUC-19 ) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5(x菌株的感受态中， 涂布 于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养基 上的单菌落接种于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养过 夜， 经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后， 将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中， 涂布于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养 基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养基中上的单菌落接种于 5ml含 50μ _§ /ιη1含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述 菌液转接于 5ml 含 50μ _§ /ιη1 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37 °C振荡培养至 OD ₆ 。。=0.6时，加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O. lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18 °C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性 对照。 诱导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎 仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳 仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还 原酶的量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25 °C诱导 16h条件下表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。诱导表达结束后， 分别将 三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4 °C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25 °C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。 选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

R ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅藻 土过滤， lml 乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， % , 收率 90 %， ee值 99.5%， de值 90.2%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz， CDC13 : 57.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m, lH), 4.07 ( m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310±1。 实施例 4 ： 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶 ( SEQ 1D 0. 13 ); 该基因为 SEQ NO.l的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.14 : 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID NO.15： 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （SEQ

基 酸 序 列 为 （ SEQ ID NO

KKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b ( + ) (pET-22b ( + ) 也可以为 pET-3a ( + )， pET-3d ( + )， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9 , pQE30 , pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80 , pRSET-A, pRSET-B , pRSET-C , pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222 , pTrc99A, pTwinl , pEZZ 18， pKK232-18 , pUC-18 , pUC-19 ) 质粒同时进行酶切， T4

DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5(x菌株的感受态中， 涂布 于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养皿 上的单菌落接种于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养过 夜， 经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后， 将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中， 涂布于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养 基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养基中上的单菌落接种于 5ml含 50μ _§ /ιη1含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述 菌液转接于 5ml 含 50μ _§ /ιη1 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37 °C振荡培养至 OD ₆ 。。=0.6时，加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O. lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18 °C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性 对照。 诱导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎 仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳 仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还 原酶的量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25 °C诱导 16h条件下表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。诱导表达结束后， 分别将 三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4 °C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25 °C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。

O O

R

选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

、OR ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅藻 土过滤， lml 乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品，

OH 0H 0

70 % , 收率 90 %， ee值 100%， de值 87.95%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz， CDC13: 57.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310±1。 实施例 5 ： 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶 (SEQ 1D 0.17); 该基因为 SEQ NO.l的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.18 : 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID NO.19： 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （SEQ

其 氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ ID NO.20

MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINA KNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b ( +) ( pET-22b (+) 也可以为 pET-3a (+)， pET-3d (+)， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9 , pQE30 , pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80 , pRSET-A, pRSET-B , pRSET-C , pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222 , pTrc99A, pTwinl , pEZZ 18， pKK232-18 , pUC-18 , pUC-19 ) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5(x菌株的感受态中， 涂布 于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养皿 上的单菌落接种于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养过 夜， 经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后， 将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中， 涂布于含有 50μ _§ /ιη1含氨苄青霉素的固体 LB培养 基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养基中上的单菌落接种于 5ml含 50μ _§ /ιη1含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述 菌液转接于 5ml 含 50μ _§ /ιη1 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37 °C振荡培养至 OD ₆ 。。=0.6时，加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O. lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18 °C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性 对照。 诱导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎 仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳 仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还 原酶的量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25 °C诱导 16h条件下表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。诱导表达结束后， 分别将 三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4 °C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25 °C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。 选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

R ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅藻 土过滤， lml 乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， .24 %， 收率 90%， ee值 100%， de值 88.98%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz， CDC13: 57.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310±1。 实施例 6 ： 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶 (SEQ ID NO.21); 该基因为 SEQ NO.l的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.22： 5 ' -GGAATTCCATATGACCGAACTGAAACAAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID N0.23 : 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3 '。 扩增得基因序列 （ SEQ

其氨基酸序列为（ SEQ ID N0.24: MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVV

ADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b ( + ) (pET-22b ( + ) 也可以为 pET-3a ( + )， pET-3d ( + )， pET-l la (+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9, pQE30, pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222, pTrc99A, pTwinl , pEZZ18， pKK232-18, pUC-18, pUC-19) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5 ci菌株的感受态中， 涂 布于含有 50 g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养 基上的单菌落接种于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养 过夜，经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 )中， 涂布于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养 基中， 37°C培养过夜。挑取上述培养基中上的单菌落� ��种于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述 菌液转接于 5ml 含 50 g/ml 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C振荡培养至 OD ₆ 。。=0.6时，加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O.lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18°C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性 对照。 诱导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎 仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳 仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还 原酶的量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25°C诱导 16h条件下表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。诱导表达结束后， 分别将 三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4°C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25°C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。 选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

R ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg主原料、 ^^^^^^S 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅 取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， 72.31 % , 收率 90%， ee值 100%， de值 89.16%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz, CDC13: δ 7.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310± 1。 实施例 7 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶 (SEQ ID N0.25); 该基因为 SEQ NO.l的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID N0.26：

5 ' -GGAATTCC ATATGACCGAACTGAAAC AAATCACC-3 '； 下游弓 |物 SEQ ID N0.27:

5'-CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTCAC-3'。 扩增得基因序列 （ SEQ

ID N0.25 ：

其 氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ ID N0.28 MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAY

YIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG) ₀ 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57 载体上， 用 Nde I和 Xho I分别将目的基因和 pET-22b (+) (pET-22b (+) 也可以为 pET-3a ( + )， pET-3d ( + )， pET-l la ( + )， pET-12a ( + )， pET-14b ( + )， pET-15b ( + )， pET-16b ( + )， pET-17b ( + )， pET-19b ( + )， pET-20b (+)， pET-21a (+)， pET-23a (+)， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9, pQE30, pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-l , pGEX-6p-l , pGEX-6p-2, pBV220, pBV221 , pBV222, pTrc99A, pTwinl , pEZZ18, pKK232-18, pUC-18, pUC-19) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转 化到大肠杆菌 DH5 α菌株的感受态中， 涂布于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的固体 LB 培养基中， 37°C培养过夜。挑取上述培养基上的单菌落接� ��于含有 50 μ g/ml含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养过夜， 经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴 定后， 将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中， 涂布 于含有 50 g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养基 中上的单菌落接种于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中，经过菌落 PCR 鉴定正确的表达载体进行诱导表达，将上述菌 液转接于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青霉素 的 LB 液体培养基中， 37°C振荡培养至 OD _6QQ =0.6 时， 加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM, 0.05mM， O. lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18°C下 进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。 诱导 16h 后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细胞， 4°C , 12000rpm/min 离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现 在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还原酶的量最多。� �提高双羰基还原 酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h，30°C诱导 8h以及 25 °C诱导 16h条件下表达，并同时设立不加 IPTG 诱导剂的阴性对照。 诱导表达结束后， 分别将三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离 心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细胞， 4。C， 12000rpm/min离心 20min获 得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25 °C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。 选用已经在市场上商业化的

为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

R ₂ ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30 ± 3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅 取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， 56.96 % , 收率 90 %， ee值 100%， de值 92.36%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz, CDC13 : δ 7.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m, lH), 4.07 ( m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310 ± 1。 实施例 8 与实施例 1中序列同源性大于 80%的双羰基还原酶 (SEQ ID NO.29); 该基因为 SEQ NO.l的突变体。 为了便于双羰基还原酶基因的表达以及鉴定， 在寡聚核苷酸引物的 5'和 3'末端设 计了兼容的限制性酶切位点。 其引物对如下： 上游引物 SEQ ID NO.30： 5 ' -GGAATTCC ATATGACCGAACTGAAAC AAATC ACC-3 '； 下游引物 SEQ ID N0.31： 5 ' -CCGCTCGAGACCTTTGTAGTTGTAAAAGCCGTC AC-3 '。 扩增得基因序列 ( SEQ

其 氨 基 酸 序 列 为 （ SEQ ID N0.32

IKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG)。 双羰基还原酶基因全合成后， 连接到 pUC57载体上， 用 Nde l和 Xho l分别将目 的基因和 pET-22b (+) (pET-22b (+) 也可以为 pET-3a (+)， pET-3d (+)， pET-l la

(+)， pET-12a (+)， pET-14b (+)， pET-15b (+)， pET-16b (+)， pET-17b (+)， pET-19b ( + )， pET-20b ( + )， pET-21a ( + )， pET-23a ( + )， pET-23b ( + )， pET-24a ( + )， pET-25b ( + )， pET-26b ( + )， pET-27b ( + )， pET-28a ( + )， pET-29a ( + )， pET-30a ( + )， pET-31b ( + )， pET-32a ( + )， pET-35b ( + )， pET-38b ( + )， pET-39b ( + )， pET-40b ( + )， pET-41a ( + )， pET-41b ( + )， pET-42a ( + )， pET-43a ( + )， pET-43b ( + )， pET-44a ( + )， pET-49b ( + )， pQE2, pQE9 , pQE30 , pQE31 , pQE32, pQE40, pQE70, pQE80 , pRSET-A, pRSET-B， pRSET-C， pGEX-5X- 1， pGEX-6p- 1， pGEX-6p-2， pBV220， pBV221， pBV222， pTrc99A, pTwinl , pEZZ 18， pKK232-18 , pUC-18 , pUC-19 ) 质粒同时进行酶切， T4 DNA连接酶进行连接反应， 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5 ci菌株的感受态中， 涂 布于含有 50 g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养基中， 37°C培养过夜。 挑取上述培养 基上的单菌落接种于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C振荡培养 过夜，经过质粒提取， PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体 pET22b ( + ) -DKR 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3 )中， 涂布于含有 50 μ g/ml含氨苄青霉素的固体 LB培养 基中， 37°C培养过夜。挑取上述培养基中上的单菌落� ��种于 5ml含 50 μ g/ml含氨苄青 霉素的 LB液体培养基中， 经过菌落 PCR鉴定正确的表达载体进行诱导表达， 将上述 菌液转接于 5ml 含 50 g/ml 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C振荡培养至 OD ₆ 。。=0.6时，加入 IPTG至终浓度分别为 0.02mM， 0.05mM， O. lmM, 0.2mM, 0.4mM， 0.6mM， 0.8mM禾 P 1.0mM， 在 18 °C下进行诱导表达， 并设立不加 IPTG诱导剂的阴性 对照。 诱导 16h后， 取出菌液， 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎 仪破碎细胞， 4°C， 12000rpm/min离心 20min获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳 仪进行 SDS-PAGE检测。结果发现在终浓度为 0.02mM IPTG浓度时诱导表达双羰基还 原酶的量最多。 为提高双羰基还原酶的表达量， 将含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 )在 IPTG终浓度为 0.02mM， 分别于 37°C诱导 8h， 30°C诱导 8h以及 25 °C诱导 16h条件下表达， 并同时设立不加 IPTG诱导剂的阴性对照。诱导表达结束后， 分别将 三个温度的诱导菌体于 8000rpm/min离心 lOmin收集菌体。 菌体用超声破碎仪破碎细 胞， 4 °C， 12000rpm/min 离心 20min 获得上清液和沉淀， 上清液用垂直电泳仪进行 SDS-PAGE检测。 结果发现在 25 °C诱导 16h时表达双羰基还原酶的量最多。

o o o 选用已经在市场上商业化的原料或者容易制备 的酮类化合物 ^^^^0« ₂ 为初始原料， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。所述的双羟基产物由以下化学 通式表

OH OH O

达： " 。、^^、人 ， 其中 选自芳香基； R ₂ 选自烷基。 向 10ml反应瓶中， 加入 O.Olg 0.04ml聚乙二醇 PEG-400, 原料溶解后， 加入 0.86ml磷酸盐缓冲液 ClOOmM, pH=6.0)， 底物均匀分散于 缓冲液中； 加入 lmg NAD ⁺ ， 4.12mg甲酸铵， 2mg辅酶甲酸脱氢酶和 4mg双羰基还原 酶， 体系 pH=6.0， 并于 30±3 °C保温 15-24h; 用 lml乙酸乙酯停止反应， 用 0.25g硅 藻土过滤， lml乙酸乙酯萃取两次， 静置分液， 有机相经干燥， 过滤， 浓缩得到粗品， 收率 90%， ee值 100%， de值 88.29%。 所得产品的核磁数据如下： 400Hz, CDC13: δ 7.29 (m, 5H),4.54(s,2H), 4.22(m,lH), 4.07 (m, 1H) ,3.45~3.40(m,4H), 2.4 l(d, 2H), 1.65 (t,2H) , 1.43(S,9H)。 所得产品质谱数据如下： MW=310± 1。 从以上的描述中， 可以看出， 本发明上述的实施例实现了如下技术效果： 采用本 发明的双羰基还原酶（Diketoreductase, DKR) 为生物催化剂， 可以一步还原二酮底物， 制备得到单一光学纯度的 3R， 5S-二羟基化合物， 将其应用到合成他汀类药物中间体， 简化了合成步骤， 降低了生产污染和生产成本， 适合于大规模工业化生产。 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的 任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。