DISTROFIAS MUSCULARES

ALCANCE DE LA INVENCIÓN

La presente Invención se refiere a un método para el tratamiento de distrofias musculares usando una combinación de terapias que se descubrió ser más efectiva que la aplicación individual de esas terapias.

Específicamente, la presente Invención se refiere al uso de un medicamento botánico aislado de Andrographispaniculata en combinación con una terapia celular para el tratamiento de distrofias musculares, por ejemplo, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).

En la presente Invención, se demuestra el impacto del andrografólido en la progresión de enfermedades distróficas, evaluando la inducción de fibrosis, la fuerza muscular y, por último, se demuestra que el andrografólido genera un nicho favorable para aumentar el prendimiento de la terapia de células madre.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las distrofias musculares son un grupo de enfermedades musculares genéticas. La más seria es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). La DMD es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X que afecta a 1 entre 3500 recién nacidos, para el cual no existe una terapia efectiva (Kapsa et al., 2003). La causa es la ausencia de distrofina, una proteína del citoesqueleto que fija las fibras musculares a la matriz extracelular (ECM). La ausencia de dicha proteína aumenta la susceptibilidad de una ruptura de las fibras musculares ocasionada por los ciclos continuados de contracción y relajación (Alien and Whitehead, 2011 ; Blau et al., 1983). Así, los niños con esta condición pierden de manera gradual y progresiva la fuerza muscular, haciendo necesario el uso de una silla de ruedas desde los 10 años y llevando a su muerte a fines de su segunda o principios de su tercera década de vida por un paro cardiorrespiratorio debido a un serio daño muscular a los músculos del corazón y el diafragma. Una causa de este daño y pérdida de la función muscular es la aparición de fibrosis, que se caracteriza por una acumulación excesiva de ECM que reemplaza el tejido muscular con tejido conectivo, afectando dramáticamente el ambiente de las fibras y, por ende, la fisiología muscular normal. Algunas características patológicas de DMD son: atrofia de miofibrillas, degeneración grasa, necrosis y fibrosis, pero se ha correlacionado únicamente la fibrosis mediante estudios clínicos con un deficiente resultado motor estimado por la fuerza muscular y la edad al momento de perder la capacidad de caminar o moverse (Desguerre et al., 2009). Este descubrimiento apoya la noción que la fibrosis contribuye directamente a la disfunción muscular progresiva y el fenotipo letal de DMD.

En términos patológicos se define la fibrosis como una reparación inapropiada mediante tejidos conectivos y se caracteriza por la pérdida de una arquitectura normal de tejidos a cambio de componentes ECM densos, homogéneos y cada vez más estables, tales como colágenos y fibronectina (que pueden deteriorar la función tisular). El proceso conduce a una distorsión progresiva de la arquitectura tisular con la consiguiente disfunción y falla definitiva de los órganos fibróticos (Varga et al., 2005; Wynn, 2008). Por lo tanto, para el área especialidad resulta muy importante hallar nuevos medicamentos y nuevas terapias.

Los glucocorticoides constituyen una terapia de primera línea en el tratamiento de DMD, que retrasa el uso de sillas de ruedas en unos 2 a 4 años, pero acarrea efectos secundarios molestos y graves. La suposición más común es que el tratamiento de distrofias con glucocorticoides alivia el proceso distrófico principalmente a través de inmunosupresión y reducción de la inflamación. Sin embargo, las fracturas vertebrales son una complicación conocida asociada al uso de esteroides y deben ser tratadas de manera agresiva con una terapia de bifosfonatos (Verma et al., 2010).

El andrografólido, una lactona diterpenoide bicíclica, es el principal constituyente de Andrographispaniculata, una planta indígena a países del sudeste asiático que se ha usado como medicina herbaria oficial en China hace mucho tiempo (Shen et al., 2002). Tradicionalmente se usa para tratar resfríos, fiebres, laringitis e infecciones en muchos países asiáticos. Se dice que el extracto de la planta posee actividades inmunológicas, antibacterianas, anti-inflamatorias, antitrombóticas, hepato-protectoras, anti- hipertensivas y anti-diabéticas (Akbar, 2011). Se ha informado que es en especial eficiente para regular respuestas inmunológicas (Calabrese et al., 2000; Rajagopal et al., 2003) y que presenta propiedades anti-inflamatorias al reducir la generación de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos humanos (Shen et al., 2002). Se ha demostrado que el andrografólido no sólo regula la inflamación sino que además regula la fibrosis en enfermedades renales y hepáticas crónicas. En términos mecánicos, el andrografólido forma un aducto covalente con NF-kappaB, bloqueando así la unión de oligonucleótidos NF-kappaB y proteínas nucleares (Xia et al., 2004). Resulta notable que NF-kappaB sea un importante factor de transcripción involucrado en la progresión de enfermedades distróficas (Acharyya et al., 2007).

Sin embargo, los trastornos distróficos tales como DMD tienen un origen genético y la única manera de restablecer la expresión genética es mediante Terapia génica y/o celular. Con todo, dichas terapias representan un importante desafío, pues los músculos son los tejidos que más abundan en el cuerpo y, además, la fibrosis reduce la eficacia de estos enfoques (Zhou and Lu, 2010). Por lo tanto, aun cuando los presentes ensayos sean exitosos, no es probable que logren beneficios significativos al ser ofrecidos a personas que presentan una etapa más avanzada de la enfermedad.

Las terapias génicas y celulares han demostrado resultados prometedores, reduciendo la gravedad de la enfermedad. Los injertos de células madre o de progenitoras de músculos restablecen en parte la expresión de distrofina, reduciendo de manera significativa el daño muscular y restableciendo la función. Un problema asociado a dichas terapias es la baja eficiencia de colonización tisular por parte de las células madre/ progenitoras de músculos debido a la presencia de una importante barrera física formada por los excesivos tejidos conectivos (fibroticos) que están presentes en el músculo distrófico, lo cual impide una eficiente migración y colonización de dichas células madre/ progenitoras (Gargioli et al., 2008). Por lo tanto, el entender los mecanismos celulares y moleculares que son la razón fundamental de la fibrogénesis muscular asociada a la deficiencia de distrofina, resulta crucial para desarrollar terapias anti-fibróticas efectivas para DMD.

Hemos demostrado que el uso del andrografólido reduce de manera significativa la fibrosis asociada a músculos, aumentando la eficiencia de la terapia celular en un modelo animal de DMD, el ratón mdx. El andrografólido ya ha sido usado para otras enfermedades con ningún o pocos efectos secundarios negativos.

La Invención propuesta consiste de un método para mejorar la eficiencia de la terapia celular usando el compuesto natural (andrografólido) en tejidos fibroticos. Este tipo de estrategia es completamente nuevo, puesto que no hay un método o terapia efectiva disponible para el tratamiento de DMD.

EL ARTE PREVIO El DMD es la enfermedad genética muscular más común. Si bien la terapia génica y la terapia celular podrían a la larga brindar una cura para DMD, en la actualidad es una enfermedad devastadora, sin terapias efectivas. Estudios recientes han demostrado que el mejorar/aliviar la fibrosis muscular podría representar un enfoque terapéutico viable para DMD (Zhou and Lu, 2010). Sin embargo permanece la etiología de la enfermedad, pues el DMD es un desorden genético.

Terapias para distrofias musculares de Duchenne

Mendell et al. analizan diferentes estrategias terapéuticas que han surgido y han sido usadas en ambientes pre-clínicos y clínicos. Resultan más atractivas las terapias basadas en moléculas que pueden expresar la proteína de distrofina faltante (Mendell et al., 2010). Sin embargo ha sido muy difícil llevar estas terapias a ensayos clínicos, porque la distrofina es una proteína grande y, además, un gen grande, por lo que es un problema encontrar buenos vectores para entregar el gen. Dichos enfoques tienen una eficacia muy baja. El tamaño del gen de distrofina dificulta el trabajar con él en la terapia génica. Así, se ha desarrollado genes más pequeños, micro o mini-distrofina, que pueden ser insertados en un vector. Hasta ahora, el vector más idóneo es un virus asociado con el adenovirus, un parvovirus no patogénico, pero se ha demostrado que causa una respuesta inmunológica. Para evaluar la respuesta, se crearon ratones mdx dys-/dys-, y existe evidencia que al inyectar el gen, se expresa parcialmente la distrofina y se mejora la fuerza muscular. Sin embargo, en estudios preliminares en seres humanos, 90 días después de iniciado el tratamiento se perdió la expresión génica (Arechavala-Gomeza et al., 2010; Mendell et al., 2010). Estos resultados sugieren que la inmunidad celular inhibe el éxito de esta terapia.

Otros enfoques incluyen: aumentar la fuerza de los músculos (inhibidores de mioestatina), reducir la fibrosis muscular, y disminuir el estrés oxidativo. Objetivos adicionales incluyen: inhibir NF-_B para reducir la inflamación o promover el flujo sanguíneo del músculo esquelético y contractibilidad muscular usando inhibidores de fosfodiesterasa o donantes de óxido nítrico (NO). Con todo, estos enfoques sólo controlan los síntomas pero no la causa principal de las distrofias DMD que es la ausencia de la expresión del gen de distrofina, por lo cual la enfermedad es menos grave pero no ha sido curada.

Mendellet. al. han usado moléculas pequeñas para el Salto de Exón y la supresión de mutaciones y transferencia de genes para remplazar o proporcionar genes sustitutos a modo de herramientas para enfoques basados en moléculas para el tratamiento de distrofias musculares. El Salto de Exón está dirigido al nivel pre-mARN permitiendo que se omitan uno o más exones para restablecer el marco de lectura. En el caso de DMD, se ha realizado ensayos clínicos con dos oligómeros diferentes: un 2'0-metil- ribo-oligonucleósido-fosforotioato (2'OMe) y un fosforo diamidato morfolino (PMO). Ambos han mostrado los primeros indicios de eficacia (Mendell et al., 2012). Este medicamento tiene la desventaja que el efecto es sólo transitorio y limitado al tiempo durante el cual este oligonucleótido anti-sentido permanece en los tejidos.

Otro enfoque molecular involucra la supresión de codones de terminación para fomentar una lectura del gen de DMD (Pichavant et al., 2011). En cultivos de células, la gentamicina interactúa con la subunidad ribosomal 40S en la transcripción del ARN, suprimiendo los codones de terminación e insertando en su lugar otro aminoácido que lo reemplace. En estudios con ratones mdx y en humanos, la gentamicina fue capaz de producir la expresión de distrofina en fibras musculares en un 20% de los niveles normales (Pichavant et al., 2011). Sin embargo, sigue habiendo controversias en torno a los estudios de pacientes con DMD. De hecho, uno de ellos mostraba un efecto favorable de la fuerza muscular y una re-expresión de distrofina en los músculos, mientras que otro estudio realizado en 12 pacientes con DMD llevado a cabo en un periodo de seis meses se detectó la expresión de distrofina en sólo 6 de los 12 pacientes y no se observaron beneficios clínicos (Malik et al., 2010; Wagner et al., 2001 ).

El andrografólido y los desórdenes fibróticos

Hay evidencia que apoya el uso del andrografólido como un compuesto anti-fibrótico. Por ejemplo, Lee MJ et. al. estudiaron el efecto antidiabético en nefropatías que brindaba el andrografólido de lactones diterpenos (AP1) y 14-deox¡-1 1 ,12- didehidroandrografólido (AP2) de Aridrographispaniculata (Lee et al., 2010a). Ellos sugirieron que la adición de los compuestos AP1 ó AP2 reduce los fenotipos que indican una nefropatía diabética en células MES-13. El compuesto AP2 demostró una actividad (más) potente que AP1 en la reducción del marcador de apoptosis caspasa- 3, el marcador de fibrosis TGF-_1 , y PAI-1. Asimismo AP1 y AP2 no poseen una capacidad antioxidante en un ambiente celular; sin embargo la adición de AP1 y AP2 redujo los estados oxidativos intracelulares en células MES-13 cultivadas en un medio rico en glucosa. Lee TY, et al. identificaron al andrografólido como un potente protector contra apoptosis ¡n vivo inducida por colestasis. Su acción antiapoptótica depende en gran medida de la inhibición de la vía de estrés oxidativo (Lee et al., 2010b). Toda esta evidencia apoya la noción que un andrografólido puede inhibir la inflamación y fibrosis en los órganos tales como ríñones, pulmones e hígado dañados. Sin embargo no hay evidencia de estos resultados en el músculo esquelético y menos en distrofias musculares.

La Solicitud de Patente N° US 2011/0224128 (Whalen et. al., 2011), llamada "Methods and compositions for treatment of muscular dystroph [Métodos y composiciones para el tratamiento de distrofias musculares] propone combinaciones de compuestos que posean actividad estimulatoria hacia un elemento promotor de integrina alfa 7 o una actividad inhibidora hacia la activación génica mediada por NF-kappaB para tratar distrofias musculares, siendo el andrografólido uno de los medicamentos listados. Sin embargo, no demuestran evidencia experimental directa del uso de dicho medicamento - y más importante aun es que no muestran ni proponen el uso del andrografólido en combinación con terapias celulares o moleculares para tratar las distrofias musculares.

Para resumir, el andrografólido es un medicamento interesante que presenta actividad anti-inflamatoria y anti-fibrótica en órganos como los pulmones, el hígado y los ríñones: sin embargo no hay evidencia de dichas actividades en enfermedades del músculo esquelético. Queda claro que las terapias anti-fibróticas y anti-inflamatorias disminuyen o retrasan los síntomas en las distrofias musculares, pero ninguna de estas terapias tiene la capacidad de restablecer la expresión génica. Se ha usado un abanico de estrategias diferentes para restablecer la expresión de distrofina; con todo, ninguna ha resultado ser completamente efectiva.

No hay evidencias anteriores que hayan sometido a prueba los métodos que funcionan con medicamentos anti-fibróticos o anti-inflamatorios y las terapias génicas o moleculares que trabajen juntas. La presente Invención propone un método que usa el medicamento botánico -el andrografólido- o extractos con un alto contenido de andrografólido junto con la terapia celular. Los resultados de la presente Invención muestran un interesante e inesperado efecto sinérgico de dichos enfoques, ya que el efecto de la terapia combinada es mejor que la suma de los dos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. El Andrografólido inhibe la inducción de fíbrosis por TGF-βΙ in vitro. A)

Se incubaron Mioblastos C2C12 por 6 horas con 10 ng/ml de TGF-βΙ and 50 μ de Mandrografólido para evaluar la expresión de CTGF por análisis Northern Blot. Se evaluaron como control de carga las subunidades ribosomales 28 and 18s. B) Se incubaron Mioblastos C2C12 con 10 ng/ml de TGF-βΙ 50μ de Mandrografólido por 24 hrs para determinar los niveles de fibronectina (FN) y colágeno tipo III (Col III). Se evaluaron como control de carga los niveles de tubulina (Tub).

Figura 2. El Andrografólido reduce la expresión de actividad citoquina pro- fibrótica, TGF-βΙ, en ratones mdx. Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicios durante 3 meses. Durante este período un grupo fue tratado con 1 mg/kg de andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 4 animales por grupo). A) Se determinaron los niveles de mARN de TGF-βΙ , una importante citoquina pro-fibrótica en el músculo tibial anterior del ratón tipo silvestre (WT), del ratón mdx tratado con vehículo y del tratado con el andrografólido por RT-qPCR utilizando el gen GAPDH como referencia. Los valores corresponden al promedio de dCT ± DS de tres experimentos independientes, utilizando cuatro ratones por cada condición experimental y normalizándolo a niveles WT (*,P< 0.05 relativa a ratones WT; #,P < 0.05 relativa a ratones mdx tratados con el vehículo). B) Detección de pSmad-2 (un mediador intracelular de TGF-βΙ mediator) a través de análisis de inmunofluorescencia indirecta en criosecciones de músculo tibial anterior de ratones mdx tratados con el vehículo y tratados con el andrografólido. La barra corresponde a 200 μηι.

Figura 3. El Andrografólido modula la acción de CTGF in vivo. A) Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicio durante 3 meses. Durante este período un grupo fue tratado con 1 mg/kg de andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 4 animales por grupo). Se determinaron los niveles de mARN de CTGF, un mediador pro-fibrótico rio abajo de TGF- β1 en el músculo tibial anterior del ratón tipo silvestre (WT), del ratón mdx tratado con vehículo y del tratado con el andrografólido por RT-qPCR, utilizando el gen GAPDH como referencia. Los valores corresponden al promedio de dCT ± DS de tres experimentos independientes, utilizando cuatro ratones por cada condición experimental y normalizándolo a niveles WT (*,P< 0.05 relativa a ratones WT; #,P < 0.05 relativa a ratones mdx tratados con el vehículo). B) Detección de macrófagos (células positivas F4/80) a través de análisis de inmunofluorescencia indirecta (inmuno-histoquímico) en criosecciones de músculo tibial anterior de ratones WT tratados con el andrografólido que sobre-expresan CTGF por infección de adenovirus (adv CTGF).

Figura 4. El Andrografólido reduce el daño de músculo esquelético en ratones mdx. Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicio durante 3 meses. Durante este período un grupo fue tratado con 1mg/kg de andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 6 animales por grupo). A) La tinción con hematoxilina y eosina del músculo tibial anterior mostró sorprendentemente menores áreas dañadas del músculo en ratones mdx tratados con andrografólido en comparación con los ratones mdx no tratados (barras de escala = 200 μιη). B) Captación de colorante azul de Evans en fibras musculares de tibial anterior del tipo silvestre (WT), ratones tratados con vehículo y ratones tratados con andrografólido mdx. Los núcleos fueron marcados con Hoechst. Los ratones fueron inyectados i.p. con 1 % de colorante azul de Evans, 24 horas antes de fijar el músculo. La barra corresponde a 200 μιη. C) Gráfico de barra que muestra una reducción significativa de la actividad de creatina quinasa sérica (CK) en ratones mdx tratados con andrografólido en comparación con los ratones mdx tratados con el vehículo. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, utilizando ocho ratones para cada condición experimental. (*, P <0,05 con respecto a los ratones WT; #, P <0,05 con respecto a los ratones mdx tratados con vehículo).

Figura 5. El andrografólido reduce la fibrosis del músculo esquelético en ratones mdx Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicio durante 3 meses. Durante este período un grupo fue tratado con 1 mg/kg de andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 6 animales por grupo. A) Se detectó colágeno I y fibronectina a través de análisis de inmunofluorescencia indirecta en criosecciones de músculo tibial anterior de ratones silvestres, ratones mdx tratados con el vehículo y tratados con el andrografólido. La barra corresponde a 200 pm. B) Los niveles de proteína fibronectina (FN) fueron detectados por Western Blot en extractos obtenidos a partir del músculo tibial anterior de ratones WT, ratones mdx tratados con el Vehículo. C) Los niveles de proteína colágeno tipo III (Col III) fueron detectados por Western Blot en extractos obtenidos a partir del músculo tibial anterior de ratones WT, ratones mdx tratados con el Vehículo. Como control de carga se muestran los niveles de la proteína GAPDH; se muestran los pesos de los marcadores moleculares en kDa. Figura 6. El andrografólido aumenta la fuerza del músculo esquelético y desempeño durante ejercicios en ratones mdx. Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones de tipo silvestre y ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicio durante 3 meses. Durante este período un grupo fue tratado con 1 mg/kg de andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 6 animales por grupo. A) Se aisló el músculo tibialis anterior de los ratones silvestres (WT), ratones mdx tratados con el vehículo y los mdx tratados con el andrografólido, para evaluar la fuerza isométrica específica (mN/mm2) en diferentes frecuencias de estimulación (pulsos por segundo, pps). B) Gráfico de barra que muestra la fuerza tetánica específica. Los valores se expresan como porcentaje de la fuerza isométrica específica generada por el músculo del ratón silvestre (*, P < 0.05 con respecto a los ratones WT; #, P < 0.05 con respecto a los ratones mdx tratados con vehículo). C) Gráfico de barra que muestra la fuerza de contracción involuntaria (*, P < 0.05 con respecto a los ratones WT; #, P <0,05 con respecto a los ratones mdx tratados con vehículo). D) Se sometieron ratones a un desafío de ejercicios en la caminadora a razón de 15 metros/min durante 5 minutos y se contó el número de pasos hacia atrás (stepbacks) (*, P < 0.05 con respecto a los ratones WT; #, P <0,05 con respecto a los ratones mdx tratados con vehículo).

Figura 7. El Andrografólido aumenta la migración celular mediante la inhibición de la fibrosis. A) La migración de células de fibroblastos del tendón marcados con Dil después de una inyección en el músculo tibial anterior en ratones mdx de 7 meses de edad (los ratones mdx de 3 meses de edad se ejercitaron durante cuatro meses). El análisis de inmunofluorescencia revela el colágeno I. B) Se calculó el análisis cuantitativo de las células de fibroblastos del tendón marcados con Dil que se difundían, al contar las células marcadas con Dil en cuadrados de 200 μηη x 200 μητι de tres secciones trasversales no seriales para tres ratones por grupo. Nótese que la distribución de las células marcadas con Dil es más homogénea en los músculos de ratones mdx tratados con el andrografólido que los músculos de ratones mdx tratados con vehículo.

Figura 8. La terapia de células madre de músculo con células satélite mejora al reducir la fibrosis muscular mediante el tratamiento con andrografólido. A) Para aumentar el grado de fibrosis muscular se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicio durante 4 meses. Durante este período un grupo fue tratado con andrografólido o vehículo (i.p. inyecciones 3 veces por semana, 6 animales por grupo). Después de 1 semana de la última administración del medicamento (en ratones de 7 meses de edad), se trasplantaron 500 células satélite recién aisladas (SC) purificadas de ratones WT en ambos músculos tibialis anterior de cada ratón mdx. 4 semanas después del prendimiento, se determinó el número de fibras que expresaban distrofina y colágeno I mediante análisis de inmunofluorescencia en criosecciones. Las imágenes son representativas de 2 grupos experimentales con 6 ratones por grupo. B) Cuantificación de los datos obtenidos en A que muestra el número de miofibrillas que expresan distrofina por músculo tibialis anterior en cada caso. C) Se determinó el número de células satélite (núcleos positivos para PAX-7) en fibras musculares individuales del músculo extensor digitorium longus (EDL) aisladas en cada caso, como indicativo de la supervivencia de SC endógena.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Introducción

Las realizaciones divulgadas en la presente Descripción se refieren al uso de un medicamento botánico aislado de Andrographispaniculata combinado con terapia de células madre para un tratamiento eficiente de distrofias musculares, p. ej. Distrofia Muscular de Duchenné (DMD).

El DMD es un trastorno genético causado por una mutación en el gen de distrofina. La ausencia de distrofina se traduce en daño muscular progresivo, fibrosis y debilidad muscular. Los niños con esta condición necesitan usar una silla de ruedas desde los 10 años de edad y fallecen durante su tercera década de vida debido al grave daño muscular. La única manera de restablecer la expresión de distrofina es mediante terapia génica y/o celular. Sin embargo, la presencia de tejido fibrótico forma una barrera física para la entrega eficiente de cualquiera de dichas estrategias terapéuticas.

En un ejemplo de realización, un método usa el andrografólido, que reduce el tejido fibrótico en los músculos distróficos, generando un nicho favorable para aumentar la eficiencia de la terapia de células madre. Dicha estrategia es completamente nueva, puesto que no hay métodos o terapias efectivos disponibles para el tratamiento de DMD.

Métodos

Cultivos celulares La línea celular C2C12 del músculo esquelético, obtenida de la pata de un ratón adulto (American Type Culture Collection), fue cultivada e inducida para su diferenciación, según lo descrito (Larrain et al., 1997). Se trataron miotubos con 10 ng/ml TGF-_1 y/o 50 μ de Mandrografólido. Las células fueron privadas de suero y luego fueron tratadas por los tiempos indicados.

Aislación de ARN y Análisis Northern Blot

Se separó el ARN total de los cultivos según lo descrito anteriormente (Brandan et al., 1992). Se aplicó electroforesis a veinte microgramos de muestras de ARN en gel de agarosa/ formaldehido ai 1.2%, fueron transferidos a membranas Nytran (Schieicher & Shuell, Dassel, Alemania) e hibridados con sondas de cADN aleatorias preparadas marcadas con [ ³² P]dCTP para CTGF de ratón en un buffer de hibridación durante la noche a 42°C ó 65°C, respectivamente. Luego se lavaron las membranas hibridadas a 42°C y fueron expuestas a Phosphor Imager y placas de rayos X Kodak. La sonda cADN para CTGF de ratón corresponde a un fragmento de 532 bp que fue amplificado por RT-PCR usando los siguientes cebadores: Directo: 5'-GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG G-3' e Inverso: 5 -ATG TCT CCG TAC ATC TTC CTG TAG T-3' (Vial et al., 2008).

Análisis de Inmunoblot

Para los análisis de inmunoblot, se homogenizaron los músculos en un buffer Tris- EDTA de 10 volúmenes con 1 mM PMSF según lo descrito con anterioridad (Morales et al., 2011). En resumen, se determinaron las proteínas en alícuotas de extractos musculares con ayuda del kit de ensayo del ácido bicinconínico para proteínas (Pierce, IL), usando BSA como estándar. Se sometieron las alícuotas (50-100 g) a electroforesis en gel de SDS en geles de poliacrilamida al 8% ó 10%, se transfirieron electroforéticamente a membranas PVDF (Schieicher & Schuell) y sondearon con anticuerpos específicos contra fibronectina (Sigma-Aldrich, USA), colágeno III (Rockland, USA) y GAPDH (Millipore, USA), tubulina (Sigma-Aldrich, USA) y GAPDH (Sigma-Aldrich, USA). Se visualizaron todas las inmuno-reacciones mediante el kit de quimioluminiscencia mejorada (Pierce, USA). Se realizó un análisis de densitometría y una cuantificación, usando ImageJ software (NIH, USA) (Cabello-Verrugio et al., 2012).

Animales y ejercicios experimentales Se estudiaron ratones machos de control o mdx (de 12 meses de edad) de cepa C57BL/10 ScSn. Se mantuvo a los animales a temperatura ambiente con un ciclo día- noche de 24 horas y fueron alimentados con pellets y agua ad libitum. Se llevaron a cabo ejercicios experimentales para que los ratones corrieran en una caminadora tres veces por semana, 30 minutos cada vez a razón de 12 m/min durante 3 ó 4 meses (De Luca et al., 2005; De Luca et al., 2003). Durante este tiempo, se diseñaron dos grupos experimentales: aquellos tratados con vehículo o con andrografólido (1 mg/ Kg/día). Al final del experimento, los músculos fueron seccionados y retirados bajo anestesia: luego los animales fueron sacrificados. Se congelaron rápidamente y almacenaron los tejidos a -80°C hasta su procesamiento, o fueron usados para la medición electrofisiológica. Se siguieron estrictamente los protocolos del Comité de Ética y Bienestar Animal de la P. Universidad Católica de Chile, con su aprobación formal.

Medición de creatina quinasa sérica (CK)

Se anestesió ratones con gas isofluorano y se obtuvo sangre del plexo vascular de la región periorbitaria directamente en tubos para micro-hematocritos (70 μΙ, Fisher Scientific). Se obtuvo el suero al permitir que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego centrifugándola a 1 ,700 χ g durante 10 minutos. Se midió la creatina quinasa sérica mediante el sistema enzimático (Valtek, Chile) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Osses and Brandan, 2002).

Captación de EBD

Se inyectó colorante azul de Evans (al 1% en PBS) en los animales y se dejó por 24 horas. Entonces los ratones fueron sacrificados y se sometieron los músculos tibialis anterior a ultracongelación en ¡sopentano; luego fueron seccionados en 7 pm criosecciones y fijados en para-formaldehido al 4%. Se visualizaron las secciones trasversales de músculo bajo un microscopio invertido Nikon Diaphot, equipado para epifluorescencia. Se contó manualmente el porcentaje de fibras positivas para colorante azul de Evans "a ciegas" (Straub et al., 1997).

Microscopía de inmunofluorescencia

Para un análisis de inmunofluorescencia, se seccionaron los músculos ultracongelados en isopentano para deshelar, y se fijaron criosecciones (7 m) en para-formaldehido al 4%, se bloquearon durante 1 hora en suero de cabra al 10% en PBS, fueron incubados durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpos específicos contra fibronectina (Sigma, USA), colágeno I (Chemicon, USA), F4/80 (abcam, USA), p-Smad2 (abcam, USA) y distrofina (Santa Cruz, USA). A modo de anticuerpo secundario se usó IgG de cabra anti-conejo conjugado FITC e IgG de conejo anti-ratón (Thermom USA). Para los antígenos monoclonales anti-ratón se hicieron todas las incubaciones con solución de bloqueo de IgG de ratón proveniente del kit M.O.M. (Vector Lab, USA) diluida en Tritón X-100/PBS al 0.01%. Para la tinción nuclear, se incubaron secciones con 1 pg/ml Hoechst 33258 en PBS durante 10 minutos; después del enjuague, se montaron los cubreobjetos usando Fluoromount (Dako, USA) y se los observó bajo un microscopio invertido Nikon Diaphot equipado para epifluorescencia (Morales et al., 201 1).

Histología de músculo esquelético

La arquitectura e histología fueron detectadas mediante tinción con hematoxilina- eosina (H&E) en secciones transversales de músculo (Morales et al., 201 ).

Propiedades contráctiles

Se midió la fuerza isométrica de músculos aislados según lo descrito anteriormente (Cabello-Verrugio et al., 2012). Para resumir, se determinó la longitud óptima de músculo (Lo) y el voltaje de estimulación a partir de la micro-manipulación de la longitud de músculo para producir la fuerza isométrica máxima de contracción involuntaria. Se determinó la fuerza isométrica tetánica máxima (Po) a partir de la meseta en la relación frecuencia-fuerza después de estimulaciones sucesivas a 1 hasta 200 Hz durante 450 ms, con descansos de 2 minutos entre estímulos. Una vez determinadas las propiedades contráctiles isométricas, los músculos fueron sometidos a 3 protocolos de estimulación tetánica reiterada. Se estimularon los músculos en Lo al máximo durante 450 ms una vez cada 5 segundos. Después de una prueba de funcionamiento, se retiró los músculos del baño, se les quitó sus tendones y cualquier tejido no muscular adherido, fueron secados una vez sobre el papel filtro y pesados. Se usó la masa muscular y Lo para calcular la fuerza neta específica (fuerza normalizada por sección transversal (CSA) de fibra muscular total, mN/mm2) (Morales et al., 2011).

Prueba de carrera (Test de esfuerzo) Se sometió a ratones a una prueba de carrera durante 15 minutos a razón de 15 m/min en una caminadora. Se contó las veces que los ratones retrocedieron (step backs) al primer 1/3 de la plataforma móvil (Cabello-Verrugio et al., 2012).

Inyección de células en ratones mdx

Se sometieron ratones mdx de 3 meses de edad a un protocolo de ejercicios durante 4 meses y fueron tratados con 1 mg/Kg de andrografólido o vehículo. Pasada una semana del tratamiento, se anestesió los ratones con una inyección intramuscular de suero fisiológico (10 mi kg ^"1 ) que contenía ketamina (5 mg mi ^"1 ) y xilazina (1 mg mi ^"1 ); luego se les inyectó aproximadamente 5x10 ⁵ fibroblastos de tendón en el músculo tibialis anterior mediante una aguja con un diámetro de 0.20 mm insertada a lo largo del eje craneocaudal del músculo según lo descrito con anterioridad (Gargioli et al., 2008). Los fibroblastos habían sido marcados con 2 mMDil de acuerdo al protocolo entregado por el fabricante (Molecular Probes). Un mes después de la inyección, los ratones fueron sacrificados para los análisis morfológicos.

Aislación de miofibrillas individuales e injertos de células satélite

Se preparó la aislación de miofibrillas individuales básicamente según lo descrito (Kelly et al., 1995, Collins 2005). En resumen, se seccionó los músculos extensor digitorium (EDL) y soleus de ratones C57-BL10 de 6 semanas de edad y se los digirió en Colagenasa tipo 1 (Sigma) al 0. 2% (w/v) en DMEM (Gibco) 4 mM L-glutathatmine (Sigma) y penicilina al 1 % y solución de estreptomicina (Sigma) durante 90 minutos en un baño de agua a 37°C. Después de una suave trituración de músculo, se recolectó sólo las miofibrillas individuales y estiradas en DMEM. Se lavó las miofibrillas mediante transferencia en serie en 4 platillos (pre-recubiertos con suero de caballo para evitar adherencia de las miofibrillas) que contenían DMEM. Por último se recolectó las miofibrillas en DMEM que contenía FBS al 10%, suero de caballo al 10%, extracto de embrión de polluelo al 0.5% y 5 ng/ml de FGF-2 (R&D); fue cultivado durante 30 minutos en una incubadora de cultivos celulares con C02 al 5%.

Se separó las células satélite de las miofibrillas mediante trituración física, usando el método de Collins et al (2005). En resumen, las fibras aisladas intactas fueron suspendidas en 10 mi del medio completo y trituradas con una aguja 19G montada en una jeringa de 1 mi. La suspensión fue pasada secuencialmente a través de una criba celular (Falcon) de 70 um y 40 um para retirar detrito. Se centrifugó la suspensión de células satélite durante 15 minutos a 450 RCF. Se volvió a suspender el pellet en suero fisiológico (NaCI 0.9%). Se coloró una alícuota con Hoechst 1ug/ml y toxina de cholera subunidad B conjugada a Alexa Fluor 488 (Invitrogen) 1ug/ml por 5 minutos, se enjuagó con PBS y fue incubada con colorante azul Trypan. Se contó las células con doble tinción que excluyen el azul Trypan en un hemocitómetro, como células viables. Se ajustó la concentración de células a 25 células/μΙ. Para controlar la pureza de la célula satélite aislada, se sembró una alícuota al Matrigel (1 mg/ml) (Sigma) y se cultivó durante la noche en medio completo durante 18 horas antes de realizar la inmunocitoquímica para los marcadores miogénicos. Se hizo el injerto de la siguiente manera: se injertó 500 células satélite a ambos músculos TA de ratones mdx de 7 meses de edad en un background C57-BL10 bajo anestesia, usando una aguja 30 G de 8 mm bajo observación microscópica.

Estadísticas

La importancia estadística de las diferencias entre los medios de ios grupos experimentales fue evaluada usando el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con una prueba de comparación múltiple post-hoc Bonferroni (Prism 3.0, GraphPad). Se consideró estadísticamente importante una diferencia a llegar a un valor p < 0.05.

Ejemplos

Ejemplo 1. Efecto del andrografólido en la inducción de CTGF, fibronectina y colágeno tipo III in vitro. Para evaluar si el andrografólido puede ser un factor anti- fibrótico, nosotros determinamos los niveles de MARN in vitro de dos factores pro- fibróticos conocidos: Factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y de crecimiento transformante tipo factor beta 1 (TGF-βΙ). (Cabello-Verrugio et al., 2012; Morales et al., 2011). TGF-β induce la expresión de CTGF en células del músculo esquelético (Vial et al., 2008). La figura 1A muestra que el andrografólido redujo la inducción de la expresión de CTGF en respuesta a TGF-βΙ .

Una característica molecular de enfermedades fibróticas es la acumulación de moléculas ECM tales como colágeno y fibronectina, ambas moléculas son inducidos por TGF-βΙ . La Figura 1B muestra que el andrografólido disminuyó tanto los niveles de proteína de fibronectina y colágeno de tipo III, inducidos por TGF-βΙ in vitro. Ejemplo 2. Efecto del andrografólido en TGF-βΙ en ratones mdx. Ya que mostramos que el andrografólido tiene efectos anti-fibróticos in vitro, decidimos evaluar estos resultados in vivo. Con anterioridad mostramos los efectos anti-fibróticos del andrografólido in vitro, por lo que decidimos evaluar las propiedades andrografólidas en un modelo animal de la enfermedad.

La citoquina pro-fibrótica TGF-βΙ se ve aumentada en ratones mdx, lo que está relacionado con la inducción de la fibrosis del músculo esquelético (Andreetta et al., 2006). Por lo tanto, evaluamos si el andrografólido podría modular la expresión de TGF-βΙ in vivo. La Figura 2A muestra que el andrografólido redujo la expresión de TGF-βΙ en ratones mdx.

La vía de señalización canónica inducida por TGF-βΙ es a través de la fosforilación de proteínas Smad. De esta manera se evalúa la vía de señalización canónica de la actividad del TGF-βΙ por inmunofluorescencia de la proteína smad2 fosforilada (p- Smad 2). La Figura 2B muestra que el andrografólido redujo el número de núcleos positivos para la proteína Smad2 fosforilada. Por lo tanto, el andrografólido redujo tanto la expresión como la actividad de TGF-βΙ en ratones mdx.

Ejemplo 3. Efecto de andrografólido en la acción CTGF in vivo. Otra citoquina pro- fibrótica sobre-expresada en el músculo esquelético es CTGF (Morales et al., 2011). La figura 3A muestra que el andrografólido redujo la expresión de CTGF en ratones mdx. Por otra parte, el andrografólido inhibe los efectos pro-inflamatorios de CTGF in vivo. La sobreexpresión de CTGF por un adenovirus induce la inflamación y fibrosis en los músculos de tipo silvestre (WT), mostrando características similares de músculos distróficos (Morales et al., 2011). Sin embargo, el andrografólido inhibió estos efectos. La Figura 3B muestra que el andrografólido redujo el número de células positivas F4/80 (un marcador específico de macrófagos) (Tidball y Villalta, 2010).

Ejemplo 4. Efecto del andrografólido en el daño del músculo esquelético distrófico. Para evaluar si el andrografólido tiene un efecto sobre el fenotipo distrófico de los ratones mdx, evaluamos, mediante tinción con hematoxilina y eosina, la histología del músculo tibial anterior del WT, de ratones mdx tratados con el vehículo y de ratones mdx tratados con andrografólido. La figura 4 A muestra que la administración del andrografólido evitó el incremento de las áreas dañadas observado en los músculos de ratones mdx distróficos en comparación con ratones mdx tratados con vehículo. Para evaluar específicamente el daño en el sarcolema, usamos el protocolo de captación de colorante azul de Evans (Straub et al., 1997). Las fibras musculares distróficas tienen daño de membranas, por lo que son permeables a algunas moléculas de colores tales como azul de Evans. La Figura 4B muestra la fluorescencia del colorante azul de Evans en fibras músculo tibial anterior de ratones tipo silvestre y ratones mdx tratados ya sea con vehículo o andrografólido. Se observó una menor absorción de colorante azul de Evans en las fibras de los músculos de ratones mdx tratados con andrografólido, lo que sugiere menor daño muscular. Concordantemente, los niveles de CK sérico (Figura 4C) se redujeron en ratones mdx tratados con andrografólido. En general la aparición de CK en la sangre ha sido considerada como un marcador indirecto de daño muscular, particularmente para el diagnóstico de distrofia muscular.

Estos resultados indican que andrografólido mejora la arquitectura de músculos esqueléticos distróficos, por lo tanto, previene el daño tisular.

Ejemplo 5. Efecto de andrografólido en la inducción de fibrosis en músculo esquelético distrófico. El desarrollo de la fibrosis en el músculo esquelético distrófico se caracteriza por un aumento en compuestos de la ECM, tales como fibronectina y varios tipos de colágeno (Cabello-Verrugio et al., 2012). Con anterioridad determinamos que el andrografólido disminuyó el daño del músculo esquelético distrófico, por lo tanto decidimos evaluar el impacto de este medicamento botánica en los niveles de proteínas ECM en ratones mdx distróficos. La tinción por inmunofluorescencia de músculo tibial anterior de ratones mdx tratados con andrografólido reveló una fuerte disminución en la acumulación de colágeno tipo I y fibronectina (Figura 5A). Del mismo modo, detectamos mediante análisis por Western Blot que el andrografólido disminuyó los niveles proteicos de colágeno I y fibronectina (Figura 5B y 5C). Estos resultados en conjunto sugieren que el tratamiento del músculo esquelético distrófico con andrografólido disminuye el desarrollo de la fibrosis en el músculo esquelético distrófico. La baja en los niveles de fibronectina y de colágeno significa una reducción de la fibrosis y por lo tanto una disminución en la barrera física que impide la migración celular en el músculo distrófico.

Ejemplo 6. Efecto del andrografólido en la fuerza del músculo esquelético distrófico en ratones.

Decidimos evaluar si estos efectos tenían un impacto en la fisiología del músculo esquelético, ya que el andrografólido inhibió el daño y la inducción de fibrosis en el músculo esquelético distrófico, mediante la evaluación de la fuerza contráctil de músculos aislados. Por lo tanto, se evaluó el impacto del tratamiento del andrografólido en la fuerza isométrica máxima del músculo tibial anterior distrófico. La Figura 6A muestra una curva de la fuerza neta generada a partir de los músculos normales y músculos mdx tratados con andrografólido y estimulados con frecuencias que van de 1 a 200 Hz. Bajo estas condiciones, los músculos esqueléticos distróficos produjeron una fuerza neta más baja, cerca del 80% o menos, en comparación con los músculos anteriores tibiales tipo silvestres en todo el rango de frecuencias de estimulación evaluadas. La Figura 6A también muestra que los músculos de ratones mdx tratados con andrografólido presentaron un aumento significativo en la generación de fuerza isométrica en comparación con ratones mdx tratados con vehículo a frecuencias que oscilaron entre 50 y 100 Hz. La fuerza de contracción tetánica y de contracción involuntaria mostró un aumento significativo en el músculo tibial anterior en ratones mdx tratados con andrografólido (Figura 6B y 6C respectivamente).

Dado que el tratamiento con andrografólido mejoró la fuerza muscular en músculos distróficos individuales aislados, nos preguntamos si el andrografólido puede afectar el rendimiento de todos los músculos del cuerpo cuando los ratones mdx son vencidos en un protocolo de carrera en cinta (caminadora). Para abordar esta interrogante se realizó una prueba de funcionamiento del ejercicio de resistencia a través del ejercicio continuo (De Luca et al, 2005; De Luca et al, 2003). La figura 6D muestra que los ratones mdx tratados con andrografólido tuvieron un mejor rendimiento, determinado por una disminución en el número de pasos hacia atrás (stepbacks) en la caminadora. Estos resultados en conjunto indican que el andrografólido no sólo reduce el daño y la fibrosis del músculo esquelético, sino que también mejora la fuerza muscular esquelética y la resistencia al ejercicio.

Ejemplo 7. Efecto de! andrografólido en la acción fibrótica en la migración celular in vivo hacia el músculo.

Hasta ahora, hemos demostrado que el andrografólido aumenta la fuerza del músculo esquelético, reduciendo el daño y la fibrosis. Sin embargo, los trastornos distróficos como DMD tienen orígenes genéticos, por lo tanto, la única manera de restablecer la expresión de genes es a través de terapias celulares y/o génicas.

Sin embargo, las terapias génicas y celulares representan un gran desafío, ya que el músculo es el tejido más abundante en el cuerpo y, más encima, la fibrosis reduce la eficacia de estos enfoques. Por lo tanto, incluso si los ensayos actuales tienen éxito, es poco probable que logren un beneficio significativo cuando sea extendido a personas que están en las etapas más avanzadas de la enfermedad. Por ende, se evaluó si la reducción de la fibrosis es capaz de aumentar la eficiencia de la terapia celular que facilita la migración intramuscular de células. Se trataron ratones mdx ejercitados con andrografólido durante 3 meses, y una semana más tarde, inyectamos fibroblastos del tendón teñidos con rojo con Dil en el músculo tibial anterior. Después de un mes, medimos el grado de difusión de fibroblastos de tendón desde el sitio de inyección hasta el límite muscular. El análisis de ¡nmunofluorescencia muestra que los fibroblastos del tendón se encuentran principalmente en regiones no fibróticas o menos dañadas (Figura 7). La Figura 7 además muestra que la distribución de las células marcadas con Dil es más homogénea en los músculos no fibróticos (ratones mdx tratados con andrografólido) que en los músculos fibróticos (ratones mdx tratados con vehículo). Estos resultados sugieren que las células migran evitando regiones fibróticas, prefiriendo migrar a zonas no fibróticas. Ya que el andrografólido reduce la fibrosis, los músculos distróficos tratados con este fármaco botánico no muestran áreas fibróticas, siendo un tejido más homogéneo en comparación con músculo distrófico no tratado, que muestra parches fibróticos en diferentes áreas.

Estos resultados muestran por primera vez, que la inhibición directa del entorno del músculo con fibrosis ayuda en gran medida a la migración de células musculares.

Ejemplo 8. Efecto de andrografólido en terapia de células madre de músculo sobre músculos distróficos.

Hemos demostrado que el tratamiento con andrografólido disminuye la fibrosis asociada a músculo esquelético, mejorando la fuerza muscular. Además, el entorno disminuido de fibrosis claramente mejoró la migración de fibroblastos, probablemente debido a la reducción en la barrera física impuesta por el exceso de compuestos ECM asociados con fibrosis muscular. Estos resultados sugieren que la terapia utilizando células precursoras puede ser mejorada en los ratones tratados con andrografólido, ya que las células tipo silvestre trasplantadas podrían migrar lejos y colonizar una mayor extensión de músculo, fusionándose con un mayor número de miofibrillas de regeneración mdx, restaurando la expresión de distrofina. Para evaluar esta hipótesis, células satélite recién purificadas de miofibrillas individuales aisladas de ratones donantes tipo silvestre (WT), fueron injertadas en ambos músculos tibiales anteriores de ratones mdx de 7 meses de edad, pre-tratados con ya sea andrografólido o vehículo por un período de 3 meses bajo un protocolo de ejercicios. Se paró el tratamiento con andrografólido 1 semana antes del trasplante dejando tiempo suficiente para la completa limpieza de la droga, para descartar cualquier efecto directo de la droga en las células trasplantadas. Un mes después del trasplante de células satélite, se analizó la presencia de miofibrillas que expresan distrofina y colágeno-l en el músculo. La figura 5A muestra que el número de fibras positivas para distrofina en el background mdx aumentó 3 veces en los músculos de los ratones tratados con andrografólido, en comparación con los controles, lo que se cuantificó en la Figura 5B. Esto último fue acompañado por una clara reducción del contenido de colágeno-I , Figura 5A. Para comprobar la pureza de las células trasplantadas, se sembró una alícuota de las células antes del injerto en gel ECM durante 12 horas. Luego fueron fijadas y analizadas para la expresión de la transcripción específica de factores musculares Pax7, MyoD y Miogenina. El 92% de los núcleos eran positivos para al menos uno de ellos, lo que indica la pureza de la preparación (datos no mostrados).

Una posible explicación de este resultado es la mayor migración de las células trasplantadas. Por otro lado, es posible que el músculo huésped tenga una densidad disminuida de las células satélite, por lo tanto, las células injertadas no tendrían competencia para la regeneración de fibras musculares, o bien las células trasplantadas presentan un mejor rendimiento de proliferación en los músculos de ratones tratados con andrografólido. La primera posibilidad parece ser plausible, teniendo en cuenta los datos de migración de fibroblastos (Figura 5), mientras que se excluyó la segunda hipótesis ya que no se observaron cambios en el número de células satélite presente en miofibrillas EDL aisladas obtenidas de los mismos ratones trasplantados observados en la Figura 5A, con una media de 12,5 células satélite por miofibrillas EDL, como se ve en la Figura 5B. Para probar la última posibilidad, si las células injertadas tienen una mejor tasa de proliferación o supervivencia, purificamos células satélite de ratón C57BL transgénicos EGFP/6 que expresan constitutivamente el transgén EGFP bajo el control del gen de la b-actina de pollo (C57BL/6-Tg (ACTbEGFP) 10sb / J; Act-EGFP). Se purificaron estas células satélites y se injertaron exactamente como en los experimentos descritos anteriormente. Los músculos se diseccionaron inmediatamente después del trasplante (día 0) o después de 2 o 15 días (días 2 y 15 respectivamente). Se purificó el ADN genómico como se indica en los métodos. Se detectó el transgen EGFP presente en los músculos injertados mediante qPCR en tiempo real en paralelo con la b-actina de ratón como gen de limpieza. Dado que cada célula injertada lleva sólo una copia del gen EGFP (los ratones EGFP homocigotos mueren dentro de 2 semanas después de nacer), la detección del gen EGFP constituye una cuantificación específica, rápida, y objetiva de las células injertadas. La figura 5C muestra que en ambos casos el 60% de las células trasplantadas muere durante los primeros 2 días, lo que significa que en ambos casos las células proliferan más rápidamente, lo que aumenta el porcentaje de las células hasta 3 veces, en comparación con el día 0. Curiosamente, en ratones no fibróticos (tratados con andrografolido) el porcentaje de células fue 3 veces mayor en comparación con ratones fibróticos no tratados a los 15 días después del trasplante.

REFERENCIAS

Todas las referencias a continuación fueron incorporadas en esto por referencia.

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