ESTADO DE LA TECNICA Para la producción del 7ß-(4-carboxibutanamido) cefalosporánico, también denominado glutaril-7-aminocefa- losporánico (en lo sucesivo referido como GL-7ACA) a partir de cefalosporina C, es conocido el uso de la enzima D-ami- noácido oxidasa (en lo sucesivo referida como DAO) proce- dente de distintos microorganismos como Trigonopsis varia- bilis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31 : 709), Rho- dotorula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269 : 17809) y Fusa- rium solani (J. Biochem. (1990) 108 : 1063). La producción de DAO mediante el empleo de estos microorganismos presenta

muchos inconvenientes. Por un lado el nivel de producción de actividad DAO es muy bajo, y por otro, junto con dicha enzima están presentes otras actividades enzimáticas inde- seables como esterasas y catalasas. Las primeras degradan el ácido GL-7ACA, disminuyendo el rendimiento y encarecien- do por tanto el proceso de purificación. Las segundas des- truyen el peróxido de hidrógeno necesario en la catálisis y obligan a la adición de este compuesto, lo que también en- carece el proceso y al mismo tiempo produce una pérdida de actividad de la enzima acortando sus posibilidades de reutilización. Para evitar dicha contaminación enzimática es necesario purificar la actividad DAO, lo cual encarece y dificulta mucho el procedimiento enzimático de obtención de GL-7ACA a partir de cefalosporina C.

Recientemente se ha descrito un procedimiento para aislar el gen que codifica para DAO en T. variabilis y ex- presarlo en E. coli y en T. variabilis (Japanese Patent Application Laid-Open No. 71180/1988; European Patent Application No. 93202219.7, Publication No. 0583817A2). Por otra parte, también se ha clonado y expresado en E. coli y Achremonium chrysogenum el gen que codifica para la activi- dad DAO de F. solani (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000181/1990; J. Biochem. (1990) 108 : 1063; Bio/Techno- logy (1991) 9 : 188) y más recientemente se ha clonado y expresado en E. coli el gen que codifica para DAO en R. gracilis (Patente Española P9600906).

Dado el gran interés que industrialmente posee en la producción de GL-7ACA la disponibilidad de una actividad DAO purificada, el objetivo de la presente invención se centró en la producción de una enzima con actividad DAO que fuera fácilmente purificable. En este sentido es conocido que una de las maneras más eficaces para la purificación de una proteína es el empleo de la cromatografía de afinidad (Sassenfeld, H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8 : 88). Para ello es necesario encontrar un soporte cromatográfico que permita la unión y/o elución de forma selectiva de la proteína de interés. Dicho soporte cromatográfico ha de

contener una molécula o ligando de reconocimiento para di- cha proteína de tal manera que la interacción entre el li- gando y ella sea lo suficientemente específica y fuerte co- mo para permitir la elución selectiva de la proteína. El desarrollo de un soporte cromatográfico de afinidad no es sencillo y hasta la fecha no se había descrito ningún proceso que permitiera la purificación por afinidad en un sólo paso de actividades enzimáticas DAO.

Por otra parte, es conocido que ciertos procedimientos de ingeniería genética permiten la modificación de proteí- nas mejorando determinadas propiedades que facilitan su pu- rificación. Así, se han desarrollado diferentes sistemas de modificación de la estructura de una proteína para permitir su purificación por afinidad (Sii, D. and Sadana, A. (1991) J. Biotechnol. 19 : 83; Narayanan, S. R. and Crane, L. J.

(1990) Trends Biotechnol. 8 : 12; Scouten, W. H. (1991) Curr.

Opinion Biotechnol. 2 : 37; Sassenfeld, H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8 : 88). En esencia, estas modificaciones consis- ten en fusionar a la proteína un polipéptido que posea propiedades específicas de interacción con un determinado soporte cromatográfico y que por lo tanto confiera a la proteína de fusión la capacidad para ser purificada por cromatografía de afinidad. Una de estas modificaciones con- siste en fusionar a la proteína en cuestión una secuencia de polihistidina que confiere a la proteína de fusión la propiedad de poder ser purificada por afinidad utilizando un soporte que contiene iones metálicos divalentes (Arnols, F. H. (1991) Bio/Technology 9 : 151; Hochuli et al. (1988) Bio/Technology 6 : 1321).

Aunque la obtención de proteínas de fusion para mejo- rar las propiedades de purificación es en principio una técnica sencilla y eficaz, su mayor inconveniente radica en el hecho de que la modificación de una proteína en su es- tructura primaria conlleva cambios que pueden tener un reflejo importante en sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos cambios de estructura pueden afectar a la proteína hasta el punto de que pierda su funcionalidad

total o parcialmente, convirtiéndola en una proteína inútil para la función que se había previsto. Por ello, la obten- ción de una proteína de fusión conlleva siempre una gran incertidumbre ya que el resultado final es en gran medida impredecible y sobre todo cuando se realiza el primer expe- rimento de fusión, es decir cuando no se conoce el resul- tado de fusiones anteriores. Es en esta incertidumbre del resultado final en lo que radica la novedad del proceso de obtención de una proteína de fusión, ya que actualmente no es posible predecir con certeza lo que va a suceder cuando se realiza un experimento de fusión de proteínas.

En la literatura científica no se ha descrito ningún procedimiento para producir la enzima DAO de T. variabilis modificada genéticamente de forma que permita su purifica- ción en un sólo paso y que pueda ser hiperproducida en for- ma activa ya sea en E. coli u otro microorganismo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para la descripción de esta invención se parte de la levadura T. variabilis ATCC 20931 como donador del ácido desoxirribonucleico (en lo sucesivo referido como ADN). Una vez obtenido el ADN genómico de la levadura (el cual con- tiene el gen con la información genética relativa a la pro- ducción de la DAO, también denominado en lo sucesivo gen dao) se utilizó para la construcción de una genoteca en E. coli utilizando el vector fágico B-GEM12. El análisis de la genoteca se realizó mediante técnicas estándar de hibrida- ción utilizando como sondas oligonucleótidos sintéticos di- señados en función de regiones de similitud encontradas en- tre distintas DAOs. De esta manera se aislaron una serie de clones recombinantes de E. coli que contenían un fragmento de ADN de T. variabilis que codificaba para el gen dao. El fragmento de ADN así obtenido se subclonó en un vector plasmídico obtenido de una cepa de E. coli. El vector re- combinante se utilizó para obtener la secuencia del frag- mento de ADN que contenía el gen dao de T. Variabilis (SEQ

ID NO : 1). E1 análisis de dicha secuencia permitió carac- terizar el gen dao, el cual está estructurado en dos exones y un intrón.

Como el fragmento de ADN anteriormente obtenido que contiene la secuencia genómica del gen dao de T. variabilis posee un intrón, no puede ser utilizado directamente para su expresión en E. coli. Por esto, se procedió a la obten- ción de un gen dao carente de dicho intrón. Para ello se realizó una amplificación del gen dao mediante PCR utili- zando dos oligonucleótidos sintéticos. El primero de ellos se diseñó de tal manera que contuviera los siguientes ele- mentos : un sitio de unión al ribosoma, un sitio de inicia- ción de la traducción, la secuencia completa del primer exón y los primeros nucleótidos del extremo 5'del segundo exón. El segundo oligonucleótido contenía la secuencia com- plementaria del extremo 3'correspondiente al segundo exón del gen dao, incluyendo un codon de terminación de la tra- ducción. En estos oligonucleótidos sintéticos se incluyeron además distintos sitios de restricción útiles para la clo- nación de fragmentos de ADN. Se obtuvo así un nuevo frag- mento de ADN que una vez aislado fue clonado en un vector plasmídico de E. coli (Figura 1). Utilizando las dianas de restricción creadas anteriormente, el fragmento de ADN que contenía el gen dao completo sin el intrón fue posterior- mente subclonado en distintos vectores plasmídicos de E. coli que poseen promotores que permiten la hiperexpresión de genes en esta bacteria huésped. La valoración de la ac- tividad DAO producida por los distintos clones se llevó a cabo por técnicas colorimétricas y por cromatografía de HPLC. De esta manera se obtuvieron clones recombinantes de E. coli que producían una gran cantidad de enzima DAO activa.

A continuación se procedió a modificar el gen dao adicionando una secuencia de nucleótidos que codifica para una polihistidina. Para ello se digirió un plásmido que contenía el gen dao con una enzima de restricción que cor- taba en el codón de iniciación de la traducción y los ex-

tremos del ADN resultantes de la digestión se hicieron romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. <BR> <BR> <BR> <BR> coli. Después se ligaron en presencia de un conector sinté- tico que contenía los codones de la polihistidina con lo que se generó un plásmlodo que contenía el gen dao modifi- cado en el extremo 5'de su región codificante (SEQ ID NO : 2). El plásmido recombinante así generado se transformó en una cepa de E. coli y se seleccionó por técnicas de hibri- dación utilizando los oligonucleótidos del conector de po- lihistidina como sonda. El gen dao modificado se secuenció para comprobar que la fusión deseada se había producido correctamente.

A continuación se estudió la producción de DAO modi- ficada con polihistidina (en lo sucesivo denominada hisDAO) utilizando, como huéspedes de los plásmidos anteriormente construidos, distintas cepas de E. coli. De esta manera se comprobó que la enzima hisDAO era activa.

Para la producción de hisDAO utilizando los clones re- combinantes de E. coli previamente seleccionados, se cul- tivan en un medio que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales minerales. La temperatura de incubación se encuentra entre 18°C y 37°C y el pH debe man- tenerse entre 5 y 9. Para la fermentación a pequeña escala pueden utilizarse matraces de distintos volúmenes, desde 50 ml hasta 1.000 ml, con una cantidad de medio entre el 10% y el 50% del volumen del matraz. La duración de la fermenta- ción puede oscilar entre 12 y 90 horas.

La producción de DAO por el microorganismo recombi- nante puede mejorarse si se eligen condiciones de cultivo adecuadas para mantener la estabilidad de los vectores re- combinantes, lo que se consigue mediante la adición al medio de cultivo de los antibióticos para los que el vector recombinante que contiene el gen dao presente un marcador de resistencia (ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, te- traciclina, etc.). Esto además de estabilizar la produc- ción, evita la contaminación del medio de cultivo con otros microorganismos indeseables y elimina también las cepas que

por haber perdido el vector recombinante han dejado de producir DAO.

Las células recombinantes productoras de hisDAO se se- pararon del medio de cultivo por centrifugación y poste- riormente se rompieron o permeabilizaron mediante procedi- mientos químicos, enzimáticos o mecánicos. Para obtener un extracto enzimático de mayor pureza, la hisDAO se purificó en un sólo paso mediante cromatografía de afinidad en co- lumnas de Co2+-IDA. Para ello se cargó el extracto enzimá- tico crudo en una resina Co2+-IDA y las proteínas contami- nantes se eluyeron mediante un lavado con tampón fosfato 20 mM pH 7,0 conteniendo NaCl 0,2 M. A continuación la enzima hisDAO se eluyó mediante un lavado con imidazol 10 mM.

Si en lugar de Co2+-IDA se utiliza como soporte croma- tográfico Cu2+-IDA o Zn2+-IDA, la enzima hisDAO queda fuer- temente unida a la matriz en forma activa sin que pueda ser eluida con altas concentraciones de imidazol. De esta mane- ra el soporte, convenientemente lavado para eliminar las proteínas contaminantes, puede ser utilizado como un siste- ma de enzima inmovilizada.

Utilizando la enzima hisDAO purificada a partir de los clones recombinantes de E. coli que expresaban el gen quimérico, se obtuvo GL-7ACA a partir de cefalosporina C.

Los extractos enzimáticos obtenidos de la cromatogra- fía en el soporte Co2+-IDA dializados y concentrados pueden también inmovilizarse haciéndolos reaccionar con otros so- portes sólidos inertes adecuados, pudiendo utilizar cícli- camente hisDAO inmovilizada.

La novedad de esta invención radica en el hecho de ser la primera vez que la enzima DAO de la levadura T. varia- bilis, modificada como hisDAO, puede ser expresada en forma activa en un microorganismo procariota como E. coli y puri- ficada en un sólo paso por cromatografía de afinidad. Adi- cionalmente, se ha conseguido un aumento de la producción de DAO con respecto a la cantidad obtenida en T. variai- lis, lo que facilita el empleo a escala industrial de esta enzima. La posibilidad de producir hisDAO en distintas

cepas de E. coli que carezcan de enzimas indeseables como catalasa o esterasas, así como la posibilidad de mejorar su estabilidad y propiedades catalíticas mediante nuevas modi- ficaciones por técnicas de ingeniería de proteínas son otros aspectos que aumentan el concepto de novedad de esta patente.

La presente invención, sin limitación, será ilustrada con más detalle en los Ejemplos que se describen a conti- nuación.

EJEMPLO 1 1. - Ensayo de la actividad DAO El ensayo de actividad de la DAO se realizó según un procedimiento previamente descrito (J. Biol. Chem. (1967) 242 : 3957), utilizando D-fenilglicina (25 mM) como sustrato.

La incubación se llevó a cabo en tampón fosfato 50 mM pH 8,0 durante 15 a 30 minutos, deteniéndose la reacción con 1/10 de volumen de ácido acético puro. La variación de la D. O. a 252 nm determina la actividad de la enzima, teniendo en cuenta que 89,77 nmol del ácido benzoil fórmico que se origina en la reacción presentan una D. O. 252 de 1,0.

2.-Preparación de los ADN vectores y de las células de E. coli competentes para la transformación.

Los vectores plasmídicos pBluescript I KS (+) (Apr) (Stratagene) y pKK233.2 (Apr) (Pharmacia), fueron prepara- dos siguiendo el método de lisis alcalina (Sambrook et al.

(1989) Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Para ello, las cepas de E. coli portadoras de los plásmidos an- teriormente citados se incubaron durante 16 horas con agi- tación en un agitador orbital a 250 r. p. m. y 37°C en 500 ml <BR> <BR> <BR> de LB con 100 Ag/ml de ampicilina. El ADN plasmídico obte-

nido por este método se purificó por centrifugación en gradiente de CsCl.

Las células competentes de E. coli TG1 y E. coli DH5a se obtuvieron por el procedimiento del RbCl (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA).

3.-Preparación del ADN donante que posee la información cfenética relativa a la producción de DAO La cepa T. variabilis ATCC 20931 se cultivó en el medio YMPG (extracto de malta 0,3%, extracto de levadura 0,3% peptona 0,5% y glucosa 1%). La incubación se prolongó durante 36 horas (D.O. 660 = 5, 0) con agitación en un agi- tador orbital a 250 r. p. m. y a una temperatura de 30°C.

Las células fueron seguidamente sedimentadas, lavadas y lisadas con zymolyasa y el ADN se extrajo siguiendo un procedimiento previamente descrito (Sherman et al. (1986) Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Para conseguir una mayor pureza el ADN se trató con RNasa, se extrajo varias veces con fenol y cloroformo-alcohol iso- amílico 24/1 (CIA) y se precipitó con isopropanol. El ADN precipitado se lavó con etanol al 100% y etanol al 70% y se disolvió en el tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 conteniendo EDTA 1 mM (tampón TE).

EJEMPLO 2 1.-Construcción de una genoteca de T. variabilis La obtención del ADN total de la cepa T. variabilis ATCC 20931 se realizó tal y como se describe el apartado 3 del ejemplo 1. Un total de 300 yg de dicho ADN total se digirieron parcialmente con 20 unidades de Sau3AI en un volumen de reacción de 600 yl a 37°C y se recogieron 3

alícuotas de 200 Hl a los 45 segundos, 1 minuto y 2 minutos respectivamente, deteniéndose la digestión con EDTA 20 mM frío. Tras comprobar las digestiones en un gel del 0,7% de agarosa, se mezclaron, se calentaron a 68°C durante 10 mi- nutos, se dejaron enfriar lentamente hasta temperatura am- biente y se colocaron sobre un gradiente de sacarosa (10- 40%) de 38 ml. Dicho gradiente se centrifugó a 26.000 r. p. m. durante 24 horas a 15°C, recogiéndose alícuotas de 0,5 ml, 10 pl de las cuales se analizaron en un gel del 0,4% de agarosa. Las alícuotas cuyo ADN poseía un tamaño entre 18 y 22 kb se mezclaron y se diluyeron con agua des- tilada hasta aproximadamente el 10% de sacarosa. Seguida- mente se precipitó el ADN con etanol, se resuspendió en 50 µl de un tampón TE y 3 lil de esta última solución se analizaron en un gel del 0,4% de agarosa. En dicho gel se comprobó que el tamano de los fragmentos de ADN era correc- to y que su concentración era de aproximadamente 50 ng/µl.

Paralelamente se preparó el ADN del bacteriófagoX- GEM12 (Promega) por procedimientos previamente descritos con ligeras modificaciones (Sambrook et al. (1989) Molecu- lar Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Para ello, la cepa E. coli NM538 (Promega) se creció durante 10 horas en NZCYM-0,2% maltosa y se midió su D. O. a 600 nm. El volumen de cultivo correspondiente a 3 x 109 células se centrifugó a 4.000 r. p. m. durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga de mesa y se resuspendió en 1,2 ml de tampón SM.

A estas células se añadieron 3 x 10'unidades formadoras de placa (ufp) del fago k-GEM12 y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 37°C sin agitación. Con 200/il de las células infectadas se inoculó cada uno de los matraces (de 500 ml con 100 ml de medio NZCYM-0,2% maltosa) precalentados a 37°C. Dichos matraces se incubaron a 37°C hasta que el cul- tivo apareció lisado (5-6 horas). Los lisados se t-rataron con DNasa (1 yg/ml) y RNasa (2 Hg/ml) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se adicionaron 5,8 gra- mos de NaCl por cada 100 ml de lisado y la mezcla se man-

tuvo durante 60 minutos en hielo. Transcurrido este tiempo el lisado se filtró para eliminar los restos celulares y tras anadir 20 ml de PEG-6.000 al 50% por cada 100 ml de lisado, la mezcla se mantuvo 60 minutos en hielo y se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos a 4°C. E1 preci- pitado se resuspendió en 1 ml de tampón TE y se extrajo 2 veces con CIA para eliminar los restos de PEG-6000 sin romper el fago. Posteriormente se extrajo dos veces con fe- nol neutro, una con fenol-CIA y una con CIA. La fase acuosa se llevó a 0,5 M NaCl (con NaCl 4 M) y el ADN se precipitó con dos volúmenes de etanol a-20°C. Una vez centrifugado durante 20 minutos a 4°C y 12.000 r. p. m. en una minicentrí- fuga, el ADN precipitado se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 50 Ul de tampón TE.

50 jig de ADN del bacteriófago se digirieron con las endonucleasas BamHI y XbaI a 37°C durante 2 horas. La doble digestión se extrajo con fenol-CIA y CIA, se precipitó con etanol y se resuspendió en 50 y1 de tampón TE. Tras recoger una alícuota de 2 pl, al resto se le anadió MgCl2 hasta 10 mM y se incubó a 42°C durante 1 hora para favorecer el re- anillamiento de los brazos del vector por sus extremos cohesivos. Nuevamente se recogió una fracción de 2 Ul que se analizó junto con la anterior en un gel del 0.5% de agarosa. Una vez comprobado el correcto reanillamiento por los extremos cohesivos, la mezcla se dispuso sobre un gra- diente (10-40%) de sacarosa de 38 ml. En este caso se evitó el calentamiento del ADN a 68°C antes de ser colocado en el gradiente, ya que esto conduciría a la separación de los extremos cohesivos del fago. El gradiente se centrifugó a 26.000 r. p. m. durante 24 horas a 15°C, recogiéndose segui- damente en alícuotas de 0,5 ml. Tras analizar 15 y1 de cada una de ellas en un gel del 0,5% de agarosa, se mezclaron aquellas que carecían del fragmento central dispensable o "stuffer"y se diluyeron con agua destilada hasta alrededor del 10% de sacarosa. El ADN se precipitó con etanol, se re- suspendió en 50 au de TE y 2 au de esta última solución se visualizaron en un gel de agarosa (0,5%) para confirmar la

ausencia del fragmento central y estimar que su concen- tración aproximada era de 100 ng/yl.

Posteriormente se realizaron una serie de ligaciones utilizando 0,25 Ug de inserto y cantidades de vector com- prendidas entre 0,25 y 0, 75 yg, variando la relación inser- to/vector. Las reacciones se incubaron a 12-14°C durante 16 horas. Tras comprobar en un gel del 0,4% de agarosa la aparición de fragmentos de ADN (originados por ligación) de tamaño superior al del vector o inserto, se mezclaron todas las reacciones de ligación, se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 4 yl de tampón de ligación.

La encapsidación del ADN fágico recombinante originado tras la ligación se realizó con los extractos de empaqueta- miento"in vitro"Packagene (Promega). Con el resultado de la reacción de encapsidación resuspendido en 500 µl de SM se realizaron infecciones de E. coli NM538 para titular el número de fagos presentes y de E. coli NM539 (Promega) con la finalidad de determinar el porcentaje de fagos recombi- nantes. E. coli NM539 es una cepa lisógena del fago P2 y sólo origina placas de lisis cuando el fago que la infecta carece de la región central dispensable. La genoteca cons- truida contenia unas 200.000 ufps y alrededor del 85% de los fagos eran portadores de un fragmento de ADN exógeno.

Una vez realizados estos cálculos, se infectó E. coli NM539 y la librería genética completa se extendió sobre placas Petri de 150 mm de diómetro.

2. - Identificación de los clones que contienen el gen dao La genoteca completa se transfirió a filtros de nitro- celulosa y el proceso de selección de fagos positivos se llevó a cabo de acuerdo con un procedimiento de hibridación previamente descrito con ligeras modificaciones (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). E1 proceso se inició con la prehibridación de los filtros de nitrocelulosa mediante su incubación a 42°C du-

rante 3 horas en tampón de hibridación. La hibridación se realizó retirando el tampón utilizado en la prehibridación e introduciendo nuevo tampón de hibridación junto con 10 pmol de los oligonucleótidos OA (5'-TCTTGTCCTCGACACC-3') y OB (5'-GACGTGATTGTCAACTG-3') marcados en su extremo 5'con <BR> <BR> <BR> 32p mediante polinucleótido quinasa del fago T4 y [y-32P] ATP (ICN Biochemicals) por procedimientos estándar (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Los filtros se incubaron a 42°C durante 16 horas y se lavaron dos veces durante 20 minutos a temperatura ambiente en 2 X SSC-0,1% SDS, seguidos de otros dos lavados del mismo tiempo a la temperatura de hibridación en tampon 0,1 X SSC-0,1% SDS. Por último, los filtros de nitrocelulosa se expusieron con Hyperfilm-MP (Amersham) bajo pantallas amplificadoras a-70°C durante 48 horas.

Una vez completado el proceso de prehibridación, hi- bridación, lavados y autorradiografía se seleccionaron 63 clones que originaban senales positivas con las dos sondas OA y OB. Unicamente 9 de las placas de lisis positivas se recogieron individualmente con la ayuda de una pipeta Pasteur y cada una de ellas se resuspendió en 1 ml de SM más 50 ni de cloroformo. Seguidamente se titularon los fa- gos presentes en dicha solución. Para ello fue necesario diluir 5.000 veces dicho fago para que al realizar la in- fección con 20 pl del mismo, el número de placas de lisis por placa Petri oscilara entre 500 y 1.000. Una vez trans- ferido el contenido de cada placa Petri a su correspon- diente filtro de nitrocelulosa, estos últimos se hibridaron nuevamente con las mismas sondas OA y OB. La autorradio- grafía mostró que entre el 20 y el 50% de los fagos de cada placa Petri generaban una señal positiva. Por lo tanto, se hizo necesario purificar cada uno de los fagos positivos a través de un tercer ciclo de hibridación. Para ello, se re- cogieron con pipeta Pasteur aquellas placas de lisis posi- tivas que se encontraban más aisladas del resto o las que estaban rodeadas de placas de lisis también positivas y se

resuspendieron en 1 ml de SM más 501 de cloroformo. Tras diluir 100 veces dicha solución fágica e infectar con 15 Hl de ella, se consiguieron títulos de alrededor de 300 placas de lisis por placa Petri. Una vez procesadas en idénticas condiciones a los dos ciclos anteriores, se consiguió que el 100% de los fagos de cada placa Petri fueran positivos.

De esta forma se purificaron 9 placas de lisis indepen- dientes. Cada placa de lisis se resuspendió en 100 Hl de SM más 10 pl de cloroformo y con 2 µl de esta solución se consiguieron placas de lisis confluyentes con la finalidad de amplificar en medio sólido dichos fagos positivos. Tras recoger la capa superior de agarosa y resuspenderla en 5 ml de SM se obtuvieron soluciones con una concentración apro- ximada de 107 ufp/µl para cada uno de los fagos positivos.

Los oligonucleótidos anteriormente mencionados OA y OB también se utilizaron como sonda para determinar por el mé- todo de Southern (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) aquellos fragmentos de ADN genómico que incluían el gen dao de T. variabilis. Para ello se realizó en las condiciones que se describen segui- damente una hibridación con el ADN digerido con las endo- nucleasas (Pharmacia) de restricción BamHI, EcoRI, HindIII, <BR> <BR> <BR> KpnI, PstI, PvuII, XbaI y XhoI y fraccionado en gel de agarosa. El gel de agarosa en el que se separaron fragmen- tos de ADN por su tamaño molecular se incubó secuencial- mente a temperatura ambiente y con agitación suave durante 15 minutos en HC1 0,25 M, 1 hora en solución desnaturali- zante y 1 hora en solución neutralizante. Seguidamente el gel se colocó sobre un taco de papeles de filtro Whatman 3 MM empapados en 10 x SSC y sobre él se dispuso un filtro de nitrocelulosa BA85 (0,45 Um) (Schleicher and Schuell) de las dimensiones del gel y empapada en 2 x SSC evitando la formación de burbujas. Sobre el filtro de nitrocelulosa se colocaron dos láminas de papel Whatman 3MM embebidos en 2 x SSC, encima se emplazaron 8-10 centímetros de altura de papel de filtro seco de las mismas dimensiones y sobre todo

ello un peso de alrededor de 500 gramos. El proceso de transferencia se mantuvo durante 16 horas. Una vez transfe- rido el ADN, el filtro de nitrocelulosa se sumergió cuida- dosamente en 6 x SSC durante 5 minutos, se dejó secar a temperatura ambiente 1 hora y se incubó entre dos láminas de papel Whatman 3MM a 80°C con vacío 3 horas mas para conseguir la fijación del ADN al filtro. Seguidamente se prehibridó e hibridó en las mismas condiciones descritas anteriormente para el rastreo de la genoteca. El resultado de la autorradiografía mostró la aparición de bandas espe- cíficas de hibridación para cada una de las digestiones.

Concretamente, el tamaño de dichas bandas fue el siguiente : 10,2 kb para la digestión EcoRI, 3,7 kb para la BamHI, 3,5 <BR> <BR> kb para la HindIII, 11,6 kb para la KpnI, 11,3 para la<BR> <BR> <BR> PstI, 4,8 kb para la PvuII, 2,8 para la XbaI y 4,7 kb para la XhoI.

3. Clonación del fragmento de ADN que codifica para el gen dao Tras purificar el ADN de los fagos tal y como se indica en el apartado 1 del ejemplo 2 para el bacteriófago B-GEM12, se realizó una digestión SalI identificándose una banda de 9,2 kb que se subclonó en el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) digerido con SalI utilizando ADN ligasa del fago T4 (Amersham), ATP y el tampón recomendado por los suministradores de la enzima. La mezcla de ligación resultante se incubó durante 5 horas a 12°C y se utilizó para transformar células competentes de E. coli TG1 (Amersham). Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se habían adicionado ampicilina (100 µg/ml), X-gal (40 yg/ml) e IPTG 0.2 mM. Entre los clones que pre- sentaban el fenotipo blanco de selección se aisló el plásmido pALTl. A continuación utilizando la técnica de Southern y la sonda OB se localizó el gen dao en un fragmento de 3,7 kb BamHI incluido en el plósmido pALTl.

Este fragmento BamHI se subclonó en el plósmido pBluescript

I KS (+) (Stratagene) digerido con BamHI. Así se aislaron los plásmidos pALT2 y pALT3, los cuales contienen el fragmento BamHI de 3,7 kb en ambas orientaciones (Figura 1).

4.-Secuenciación del fragmento que contiene el gen dao La secuencia de nucleótidos del fragmento contenido en el plásmido pALT2 se determinó sobre el mismo plásmido me- diante un método previamente descrito (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74,5463-5464) utilizando el T7 <BR> <BR> <BR> ADN polymerase Kit (Pharmacia) y [35S] dATP. Esta secuencia se muestra en la SEQ ID NO : 1. Los análisis de la secuencia y su comparación con otras secuencias conocidas en los ban- cos de datos internacionales (GeneBank/EMBL) indicaron que el fragmento clonado codificaba para el gen dao de T. variabilis.

EJEMPLO 3 1.-Eliminación mediante PCR del intrón del gen dao Una muestra de 0,15 yg de ADN del plósmido pALT2 se mezcló con 10 til (25 µM) de cada uno de los siguientes oligonucleótidos: DAO1 (5'-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3') el cual codifica la secuencia completa del primer exón y los primeros nucleótidos del extremo 5'del segundo exón y contenía un sitio de restricción NcoI; y DA02 (5'-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3') que contenía un sitio de restricción HindIII y la secuencia del extremo 3'corres- pondiente al segundo exón del gen dao incluyendo un codon de terminación de la traducción. A esta mezcla se adiciona- ron 2,5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer) junto con el tampón adecuado recomendado por los suministradores y el preparado fue sometido a un proceso de amplificación en un aparato de PCR (Gene-ATAQ, Pharmacia) empleando 30 ciclos,

cada uno de los cuales consistió en : 95°C (1 minuto), 50°C (2 minutos) y 72°C (2,5 minutos). El resultado de la ampli- ficación se visualizó mediante tinción con bromuro de eti- dio después de una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

El fragmento de ADN obtenido por PCR, de un tamano de aproximadamente 0,9 kb, se purificó mediante extracción del gel de agarosa utilizando ß-agarasa (Biolabs) siguiendo las recomendaciones del fabricante. 0,2 Hg del fragmento puri- ficado se ligaron con 1 yg del vector M13tgl30 (Amersham) digerido con la enzima HincII (Pharmacia) mediante la ADN ligasa del fago T4 (Amersham) en presencia de ATP usando el tampon recomendado por el suministrador. De esta manera se generó el fago M13DAO (Figura 1) que fue posteriormente se- cuenciado para comprobar que se había eliminado el intrón adecuadamente. La secuencia de nucleótidos del fragmento contenido en fago M13DAO se determinó sobre el mismo fago recombinante mediante un método previamente descrito (San- ger et al. (1977) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74 : 5463-5464) <BR> <BR> <BR> utilizando el T7 ADN polymerase Kit (Pharmacia) y [35S] dATP.

La secuencia de nucleótidos reveló que el fragmento clonado poseía 0,9 kb y contenía la secuencia del gen dao de T. variabilis sin el intrón.

2.-Subclonación del zen dao carente de intrón en pKK233.2.

Una muestra de 0, 1 µg de ADN del plásmido pKK233.2 se digirió con las endonucleasas de restricción NcoI y HindIII (Pharmacia) a 37°C, en un tampon recomendado por los sumi- nistradores, durante 1 hora y se calentó durante 10 minutos a 65°C para detener la reacción. El plásmido digerido se mezcló con 0,2 pg del fago M13DAO digerido con las mismas endonucleasas de restricción antes indicadas y ambos DNAs se ligaron mediante la enzima ADN ligasa del fago T4 (Amersham) en presencia de ATP usando el tampón recomendado por el suministrador.

La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de E. coli TG1. Los trans-

formantes se aislaron en medio LB con ampicilina (100 yg/ml). Mediante este procedimiento se obtuvo un clon que contenía el plásmido recombinante pKDA03 (Figura 1) que posee el fragmento de ADN de 0,9 kb resultante de la ampli- ficación por PCR insertado entre los sitios NcoI y HindIII del plásmido pKK233.2, es decir, expresado bajo el control del promotor trc.

EJEMPLO 4 1.-Diseño de una enzima DAO quimérica conteniendo una cola de 6 histidinas.

Para insertar la cola de polihistidinas en el extremo amino-terminal de la enzima DAO de T. variabilis se digi- rieron 0,1 yg del plásmido pKDA03 con la endonucleasa de restricción NcoI (Pharmacia) a 37°C durante 1 hora, en las condiciones recomendadas por el suministrador y se calentó durante 10 minutos a 65°C para detener la reacción. El plásmido así digerido se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones recomendadas por el suministrador y des- pués se calentó la muestra durante 10 minutos a 65°C para detener la reacción. El plásmido linealizado resultante se ligó a un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para 6 residuos de histidina, mediante la enzima ADN ligasa del fago T4 (Amersham) en presencia de ATP usando el tampón recomendado por el sumi- nistrador. E1 fragmento codificante de los 6 residuos de histidina se obtuvo mediante una mezcla de 1,5 Ug de dos oligonucleótidos complementarios denominados HIS1 (5'- CATCATCACCACCATCACTT-3') e HIS2 (5'-AAGTGATGGTGGTGATGATG-3') que fue posteriormente calentada a 100°C durante 5 minutos y enfriada a tempera- tura ambiente para hibridar formando un fragmento de ADN de doble cadena.

La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de E. coli TG1. Los trans- formantes se aislaron en medio LB con ampicilina (100 Ug/ml). Mediante este procedimiento se obtuvo un clon que contenía el plásmido recombinante pKDAOHIS que posee el gen dao unido a una secuencia de 18 nucleótidos que codifican para 6 residuos de histidina en su extremo 5'. Para compro- bar que el plásmido pKDAOHIS (Figura 1) contenía la cons- trucción quimérica esperada se determinó la secuencia sobre el mismo plásmido recombinante mediante un método previa- mente descrito (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Aca. Sci.

USA 74 : 5463-5464) utilizando el T7 ADN polymerase Kit <BR> <BR> (Pharmacia) y [35S] dATP. La secuencia obtenida se muestra en SEQ ID NO : 2.

La cepa E. coli TG1 transformada con el plásmido pKDAOHIS se fermentó en el medio LB durante 20 horas a 25°C y 250 r. p. m. Seguidamente las células se recogieron por centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos, se rompieron por sonicación y se ensayó su actividad DAO tal y como se describe en el apartado 1 del Ejemplo 1. La actividad DAO obtenida por este procedimiento fue de 350 U/mg de proteí- na. De esta manera se comprobó que la enzima quimérica DAO con la cadena de histidinas (hisDAO) así obtenida era acti- va. Además mediante electroforesis en gel de SDS-poliacril- amida se comprobó que, como era de esperar, la enzima hisDAO poseía un tamaño ligeramente superior al de la enzi- ma DAO nativa. La cepa E. coli TG1 transformada con el plósmido pKDAOHIS ha sido depositada en la Colección Espa- nola de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia), el 10.06.97, con el n° de depósito CECT4888.

EJEMPLO 5 1.-Preparación del soporte agarosa-quelato metálico A una suspensión de 7 g de agarosa CL6B en 57 ml de una solución de NaOH 0.1 N que contiene 340 mg de NaBH4, se añade lentamente una mezcla de 5,7 ml de epiclorhidrina y 11,4 ml de etilenglicoldimetileter y la suspensión se man- tiene en agitación suave a 25°C durante 4 horas. La agaro- sa-epóxido así obtenida se lava con abundante agua desti- lada y se añade a una disolución constituida por 2,5 ml de iminodiacetato sódico 2 M y 19 ml de tampón bicarbonato sódico 0.1 M pH 11. Esta suspensión se mantiene en agita- ción suave durante 12 horas a 25°C. Finalmente el soporte se lava con agua destilada y se resuspende en una solución acuosa que contiene la sal metálica deseada (5 mg/ml). El soporte de agarosa-quelato metálico así formado se lava con abundante agua y queda preparado para su utilización pos- terior. Cuando como sal metálica se añade CoCí se obtiene un soporte de agarosa-quelato de cobalto.

2.-Purificación de la enzima quimérica hisDAO en el soporte de aqarosa-quelato de cobalto.

La columna que contiene el soporte de agarosa-quelato de cobalto se equilibra con tampon fosfato sódico 20 mM (pH 7,0) y NaCl 0,2 M. En esta columna se carga el extracto celular soluble obtenido según se describe en el ejemplo anterior a partir de células de E. coli TG1 transformadas con el plásmido pKDAOHIS. Una vez cargado el extracto, la columna se lava abundantemente con el mismo tampon de equilibrado, eliminándose de esta forma todas las proteínas del extracto salvo hisDAO, que permanece retenida en la columna. A continuación se procede a la elución de la enzima hisDAO mediante la utilización de un tampon fosfato sódico 20 mM pH 7,0 que contiene imidazol 10 mM. Las fracciones que contienen la enzima hisDAO se reúnen y dia-

lizan frente a tampón fosfato sódico 20 mM pH 7,0. La enzima (9000 U/mg) así preparada presenta un grado de pure- za superior al 90% y está lista para ser utilizada para la transformación de cefalosporina C en GL-7ACA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS Figura 1.-Proceso de construcción del plásmido pKDAOHIS.

El gen dao, carente de intrón y con un sitio NcoI en el ATG que codifica para la primera metionina de la proteína, se obtuvo por PCR a partir del plásmido pALT2. Seguidamente, el fragmento amplificado por PCR se subclonó en el lugar HincII del vector M13tgl30 originando M13DAO. Un fragmento NcoI-HindIII obtenido de M13DAO se subclonó en los lugares NcoI-HindIII del plásmido pKK233.2 dando lugar a pKDA03.

Este plásmido posee el gen dao expresado bajo el control del promotor trc de E. coli. Por último, se introdujo el fragmento de DNA que codifica para la cola de polihisti- dinas en el extremo 5'del gen dao generando el plásmido pKDAOHIS. INDICACION RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-OR###ISMO (Regla 13 bis del PCT) A. Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción p igina 19... línea 3 2 B. mENTIFICACION DEL DEPOSITO Otros depósitos están identificados en una hoja suplementaria LJ Nombre de la institución de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país) Universidad de Valencia Edificio de Investigación Campus de Burjasot 46100 BURJASOT, Valencia Fecha de depósito n° de orden 10 Junio 1997 CECT4888 C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuaci6n de estos datos LJ D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITA LAS INDICACIONES (caso de que las indicaciones no se facilite para todos los estados designados) E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario) Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteriormente en la Oficina intemacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem."n° de orden del dep6sito") Reservado a la oficina receptora Reservado a la Oficina internacional Esta hoja ha sido recibida al mismo tiempo que la Esta hoja se ha recibido en la Oficina internacional el : solicitud internacional Funcionario autoriz Funcionario autorizado L-I I-