Películas bioactivas comestibles a base de quitosano o una mezcla de quitosano-proteínas de quínoa, impresas con nanopartículas de quitosano- tripolifosfato-timol; su procedimiento de obtención; bioenvases que las comprenden; y uso de estos en frutas frescas de bajo Ph

La presente invención se refiere a películas bioactivas comestibles, procedimiento de obtención de las mismas, uso de dichas películas, bioenvases que comprenden dichas películas, procedimiento de formación de bioenvases y uso de dichos bioenvases. Dichas películas son a base de quitosano de alto peso molecular o una mezcla de quitosano de alto peso molecular y extracto acuoso de proteínas de quínoa extraídas a pH 11 , obteniendo un material como una hoja de papel imprimible, incorporando mediante impresión una dispersión de agentes antimicrobianos nanopartículados con actividad antimicrobiana.

Los bioenvases divulgados en la presente invención son para aumentar la vida útil de frutas de bajo pH, manteniéndolas frescas, debido a que la incorporación de nanopartículas en su composición permite disminuir la permeabilidad al vapor de agua (PVA) de materiales hidrofílicos, dar mayor barrera a los microorganismos patógenos y mejorar las propiedades mecánicas.

Descripción de lo conocido en la materia

El consumo de frutas y hortalizas frescas ha sido reportado como una de las principales causas de contaminación de microorganismos patógenos y guarda estrecha relación con brotes de enfermedades entéricas asociadas al consumo de estos productos.

La colonización de los alimentos frescos por microorganismos de riesgo para el consumidor puede ocurrir en los diversos procesos de la cadena de producción, teniendo como principales focos los suelos para el cultivo, aguas de riego y fertilizantes de origen animal. Los alimentos también pueden ser contaminados durante la cosecha y en etapas posteriores debido a la higiene de los manipuladores y al proceso de sanitización de la planta procesadora originando el fenómeno de contaminación cruzada de los alimentos (Heaton y cois., 2008).

En la actualidad, diversos son los esfuerzos por generar nuevos materiales de envasado los cuales logren extender la vida útil de alimentos frescos o mínimamente procesados, entreguen seguridad al consumidor disminuyendo los brotes de enfermedades transmitidas por alimentos, disminuyan pérdidas importantes para el sector productivo y además sean amigables con el ecosistema. Una variada gama de materiales han sido ensayados con esta finalidad, siendo los biopolímeros los más utilizados, tales como lípidos, proteínas, polisacáridos y mezclas entre ellos, con el objetivo de potenciar las propiedades de películas.

De acuerdo al estado del arte previo se conoce de la solicitud 2032-14 una composición con capacidad antimicrobiana que comprende quitosano, ácidos orgánicos, ácidos grasos y aditivos.

De la solicitud nacional 2385-12 se divulgan mezclas comestibles formadoras de películas preservantes para frutas que contiene soluciones de extractos acuosos proteico de quínoa y lípidos; proceso de formación de la película comestible; proceso de elaboración de la mezcla comestible que comprende mezclar la solución de extracto acuoso proteico de quínoa con el lípido e incorporar la solución de quitosano; proceso de aplicación de la película comestible que comprende aplicar a frutas la película comestible por inmersión o pulverización. En el documento CN102743745 se hace referencia a una vacuna de células de hepatoma de liberación controlada en función de granulocitos-macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) envuelto por nanopartículas de quitosano.

En el documento CN103750565 se divulga una barra de filtro de cigarrillo cargado con quitosano nanoparticulado y el método de preparación de los mismos.

El documento DE10201 1085217 se refiere a una composición, útil para el tratamiento del cabello, que comprende la proteína de la quínoa, un compuesto de amonio cuaternario, tal como un compuesto de imidazolina cuaternario, y un componente nutritivo graso que comprende silicona y/o un aceite.

En el documento CN 103275358 se describe una película de material compuesto a base de quitosano y un método para la preparación del revestimiento que contiene dicha película.

El estado del arte antes descrito es muy diferente en varios sentidos, ya que en ninguno de estos documentos se presenta un material o película biodegradable para ser usado como bioenvase en que en una de sus . caras está impresa con nanoparticulas antimicrobianas para constituir un envase para almacenar frutas, de acuerdo a como se describirá más adelante.

Las películas comestibles (PC), corresponden a matrices poliméricas y se definen como una delgada capa de material comestible que proporciona una barrera a la humedad, al oxígeno, CO2 y al movimiento de aromas y solutos desde el alimento. El material puede ser un recubrimiento o una lámina (o película) independiente. Este tipo de materiales han recibido una atención considerable en los últimos años debido a sus ventajas con respecto a las películas sintéticas, como su comestibilidad y biocompatibilidad. Por ser biodegradables se presentan como una alternativa para reducir la generación de desperdicios, ya que, incluso si las películas no se consumen, se degradan más fácilmente que los materiales sintéticos.

Pueden ser producidas a partir de distintos materiales con capacidad de formación de película. De manera general, se pueden clasificar en tres categorías: hidrocoloides (como las proteínas y polisacáridos), lípidos (como los ácidos grasos, triglicéridos y ceras) y compósitos de naturaleza heterogénea, que consisten en una mezcla de polisacáridos, proteínas y/o lípidos. El objetivo de producir películas de tipo compósitos es bajar la permeabilidad al vapor de agua (PVA) de materiales hidrofílicos y mejorar las propiedades mecánicas. Estas películas heterogéneas se aplican en forma de emulsión, suspensión, a través de la dispersión de los componentes no miscibles, en capas sucesivas o en forma de solución en un solvente común y pueden ser utilizados para el envasado individual de porciones pequeñas de alimentos, en particular de productos que actualmente no se envasan individualmente, como las peras, las nueces y las frutillas.

De acuerdo a lo dicho anteriormente nuestra invención está dirigida a películas basadas en compósitos de naturaleza heterogénea, que consisten en una mezcla de polisacáridos, proteínas y/o lípidos.

Las películas basadas en polisacáridos tiene la capacidad de formar películas comestibles (PC) por sí solas debido a la linealidad que presentan sus cadenas poliméricas, lo que facilita la interacción de los grupos funcionales con el solvente.

Dentro de los polisacáridos que poseen capacidad de generar películas se encuentran: alginatos, carragenina, pectinas, almidones, gomas, mucilago, quitosano y mezclas entre ellos, destacando el quitosano (Qo) por sus propiedades mecánicas, fisicoquímicas y antimicrobianas (AM).

Estructuralmente las proteínas son más complejas que los polisacáridos, ya que en su estructura pueden contener entre 100 a 500 residuos de aminoácidos, que les confieren a los polipéptidos la capacidad de generar mayores tipos de interacciones intra e intermoleculares, siendo más versátiles. Sin embargo, las proteínas no son capaces de generar PC por sí solas, siendo necesario generalmente agregar agentes plastificantes como glicerol en concentraciones altas (3-63%), de lo contrario se obtienen películas quebradizas y poco manipulables.

Dentro de las fuentes de proteínas estudiadas destaca la semilla de quínoa, debido a su alto contenido de proteínas. El contenido de proteína promedio se encuentra entre un rango de 12 a 17% (Ando y cois., 2002; Karyotis y cois., 2003; Abugoch y cois., 2008). El contenido proteico de la quínoa en base seca (bs) corresponde a un 16,3%, lo que es bastante superior al de otros granos como: la cebada (11% bs), arroz (7,5% bs), o el maíz (13,4% bs), y es comparable a la del trigo (15,4% bs).

El uso de plastif ¡cantes en las películas basadas en proteínas presenta una mayor elongación que las de polisacáridos, y una mayor permeabilidad al vapor de agua (PVA).

Como se mencionó anteriormente el quitosano (Qo), es el polisacárido que formará parte da la composición de las películas biodegradables comestibles a estudiar. El Qo también llamado chitosán (del griego "coraza"), es un polisacárido lineal compuesto por cadenas formadas por unidades de 2-acetamido-2-desoxi-D- glucopiranosa (N-acetilglucosamina) y 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa (N- glucosamina) unidas por enlaces glicosídicos β(1→4), con un grado de desacetilación no menor al 65% (Majeti y Kumar, 2000). Es un. polisacárido blanco, duro, inelástico y nitrogenado. Esta sustancia, se descubrió en el año 1859. Se puede usar en agricultura como fungicida y en la industria vitivinícola para evitar el deterioro del vino. En medicina se usa a veces como añadido en vendajes para reducir el sangrado y disminuir la cantidad de infecciones. El quitosano se produce comercialmente mediante la desacetilación de la quitina, que es un elemento estructural del exoesqueleto de los crustáceos (cangrejos, gambas, langostas , etc.). El grado de desacetilación (DA) puede ser determinado por espectroscopia NMR-H ¹ , o por espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier (IR-TF): en los quitosanos está en el rango de 60-100%.

La fórmula del quitosano, es la siguiente:

El grupo amino en el quitosano tiene un valor pKa alrededor de los 6,3, razón por la cual posee una ligera carga positiva y es soluble en medios ácidos o en soluciones neutras con dependencia de la carga del pH y del valor DA. En otras palabras, es un bioadhesivo y puede ligarse a las superficies cargadas negativamente tales como las membranas mucosas. Debido a esta propiedad física, permite el transporte de principios activos polares a través de las superficies epiteliales, siendo además biocompatible y biodegradable.

El peso molecular del Qo varía entre 100 a 1.500 kDa, donde se considera un Qo de bajo peso molecular entre los valores 100 a 300 kDa, un Qo de peso molecular medio entre 300 y 600 kDa y uno de alto peso molecular alto sobre 600 kDa. Además Qo es básico, como se dijo anteriormente con un pKa aproximado de 6,3. Es soluble en ácidos minerales y orgánicos diluidos. La solubilización del Qo se produce vía protonación de su grupo amino libre en ambientes ácidos y permanece en solución hasta un pH cercano a 6,2 después del cual comienza a formar precipitados similares a geles hidratados.

El Qo es un copolímero catiónico que puede ser modificado químicamente con el fin de modificar sus propiedades físicas y químicas. Es posible la modificación química del grupo amino y de los hidroxilos primario y secundario. Derivatizaciones posibles incluyen su entrecruzamiento, eterificación, esterificación y copolimerización (Lloyd y cois., 1998). Dada su versatilidad y sus propiedades de biocompatibilidad, baja toxicidad, biodegradación y bioactividad, ha encontrado muchas aplicaciones tecnológicas y biomédicas, las que incluyen la ingeniería de tejidos.

Más aún, el Qo es un material abundante, renovable y su producción es de bajo costo y de interés ecológico, de ahí el interés en su aplicación en el área de alimentos. Otro uso conocido del quitosano es como coadyuvante para el crecimiento de las plantas, debido a que permite promueve la defensa de las plantas contra infecciones provocadas por hongos. Su uso ha sido aprobado por muchos cultivadores de plantas de interior y exterior. Dado su bajo índice de toxicidad y su abundancia en el medio ambiente, no es de esperar que dañe a las plantas ni a los animales de compañía, siempre que se emplee de acuerdo con las indicaciones establecidas.

El quitosano (Qo) tiene la propiedad de formar películas por sí solo, como resultado de la linealidad de su cadena, en donde los grupos catiónicos pueden establecer enlaces del tipo puentes de hidrógeno intra e intermoleculares con el solvente.

Se ha descrito que las películas de Qo son biodegradables, biocompatibles, flexibles, de larga duración, de consistencia firme y dura, con baja flexibilidad y difícil de romper, presentan una muy buena barrera al oxígeno, con valores moderados de permeabilidad al vapor de agua, además presenta actividad antimicrobiana (AM) frente a un amplio espectro de microorganismos.

En el trabajo de Jeon y cois, (2002), se reporta que el esfuerzo de tracción al corte (ETR) y la elongación de las películas preparadas a partir de Qo de alto peso molecular son superiores que las observadas con Qo de bajo peso molecular. Las películas de Qo presentan valores altos de ETR, en relación a películas de otros polímeros, pero tienen valores bajos a medios de elongación, por formar estructuras ordenadas y compactas en las que las moléculas están muy próximas entre si y dejan poco volumen libre. Esta característica se mejora cuando se agregan plastificantes principalmente, u otros componentes como proteínas y lípidos a las formulaciones. Como se menciona anteriormente, la semilla de quínoa tiene una alta concentración de proteínas, lo que es beneficioso para la elaboración de películas, las proteínas de reserva de la quínoa son principalmente del tipo globulares 1 1 S y albúminas 2S (Brinegar y cois., 1996), al igual que las de otros extractos o aislados de proteínas que se han utilizado para la elaboración de films, como la proteína de soya (Cunningham y cois., 2000). Con respecto a las características generales de esta semilla se puede mencionar que, en comparación con la mayoría de los cereales, la quínoa posee un mayor valor nutricional; el contenido de proteína de las semillas varía de un 12 a un 23% (Abugoch, 2009), constituidas principalmente por albúminas y globulinas (44-77% de la proteína total), y un inexistente o muy bajo contenido de prolaminas (0,5 a 7%), es considerada un alimento sin gluten (Jancurová y cois., 2009). Presenta un balance de aminoácidos esenciales excelente debido a un mayor espectro de aminoácidos que cereales y legumbres, con elevados niveles de lisina (5,1 a 6,4%) y metionina (0,4-1 ,0%) (Abugoch y cois., 2008).

Estudios de la estructura molecular de las proteínas de quínoa permiten caracterizar la proteína de almacenamiento 1 1 S, llamada chenópodina, que representa el 37% del total de proteínas. La globulina 1 1S es una proteína hexamérica que consiste en seis pares de subunidades polipeptídicas básicas y ácidas, con masas moleculares de 20-25 y 30-40 kDa, respectivamente, cada par conectados por un puente disulfuro (Brinegar y Goudan, 1993; Abugoch y cois., 2008). La chenópodina tiene un alto contenido de glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, arginina, leucina, serina, y glicina. De acuerdo con la protéína de referencia de la FAO (U.S. Department of Agricultura, 2005), la chenópodina cumple con los requisitos para leucina, isoleucina, fenilalanina y tirosina. La otra proteína importante (35% de proteína total) es una proteína 2S (albúmina), que presenta una masa molecular de 9,8 kDa. Esta proteína es alta en cisteína, arginina e histidina. Propiedades como la elasticidad, plasticidad interna, características hidrofílicas de la película comestible así formada vislumbran a este nuevo compósito como una alternativa adecuada para el envasado de alimentos frescos el cual posee la capacidad de formar películas sin el uso de plastificantes. Sin embargo, la actividad AM del Qo es disminuida al interactuar con la proteína de quínoa y si bien al adicionar proteínas, mejora la elongación de los films de Qo, dado que estaría actuando como plastificante, sin embargo, dado la naturaleza hidrofílica de estas películas, aumenta su permeabilidad al vapor de agua.

Debido a esto es que actualmente son ensayadas nuevas técnicas para modificar las propiedades de estas películas, una de estas estrategias corresponde a incorporar lípidos en las películas de manera de disminuir la permeabilidad al vapor de agua (PVA), como lo reportado por Valenzuela y cois. ,(2013) en donde fue posible disminuir el PVA de películas de quitosano y extracto protéico de quínoa (Qo/EPQ) hasta un 30% cuando es adicionando aceite de girasol alto oleico en una concentración de 4,9% p/v a la mezcla.

Una estrategia que ha sido explorada para disminuir el PVA es la incorporación de nanopartículas. Diversos estudios han mostrado que la incorporación de nanopartículas a películas generadas a partir de cómpósitos mejora las propiedades de barrera al vapor de agua, así como sus propiedades mecánicas, ya que, las nanopartículas adicionadas se limitan a los dominios confinados entre los enlaces de los polímeros que forman la película, además análisis a nivel de nanoestructura, demuestran que la dispersión de las nanopartículas sobre las películas se alinean e interaccionan con la matriz, lo que dificulta la difusión de los gases y moléculas de agua a través de la película, generando un efecto de tortuosidad difusiva en su recorrido a través de las películas.

La adición de nanopartículas ha sido evaluada en diferentes matrices, tales como hidroxipropilmetil celulosa (HPMC), Qo, alginato, almidón, entre otros polímeros, obteniendo resultados positivos en cuanto a la disminución de PVA (25% a 32%), dependiendo del tipo de nanopartícula utilizada, evidenciando que la adición de nanoparticulas en las películas supera la PVA reportada para las películas con aceite. El estudio de nanoparticulas es completamente multidisciplinario y los resultados de cada investigación pueden ser aplicados rápidamente para mejorar diversas características de productos existentes.

Los nanocompuestos generados y aplicados en formulaciones de diferentes películas pueden presentar diferentes geometrías como fibras, escamas, esferas o partículas, representando una alternativa radical en el desarrollo de nuevos compuestos. Esta nueva generación de compuestos exhibe mejoras significativas en la estabilidad mecánica y resistencia a disolventes con respecto a matrices sin la incorporación de rellenos a nivel de nanoescala.

Los nanocompuestos también ofrecen beneficios adicionales como baja densidad, transparencia, mejora propiedades de superficie, barrera y mecánica de las películas utilizando muy bajos contenidos de relleno, generalmente inferior al 5%. La incorporación de nanoparticulas permite mejorar una de las principales deficiencias tecnológicas de películas en base a hidrocoloides en cuanto a la capacidad de disminuir la permeabilidad al vapor de agua, igualando y/o superando los resultados obtenidos mediante la incorporación de aceites. Las nanoparticulas se han preparado frecuentemente a partir de tres métodos: (1) dispersión de polímeros preformados, (2) polimerización de monómeros, y (3) gelificación iónica o coacervación de polímeros hidrofílicos.

Se han descrito nanoparticulas de Qo mediante gelificación iónica utilizando tripolifosfato de sodio (TPP), cargadas con iones de plata mostrando una liberación controlada y sostenida en el tiempo del activo.

El mecanismo propuesto para la formación de nanoparticulas de Qo-TPP plantea que la gelificación ionotrópica del Qo ocurre por interacciones electrostáticas entre productos de la disociación del TPP en solución acuosa ((P ₃ O ₁₀ ) ^"5 y (HP ₃ Oi ₀ ) ^{~ 4} ), con los grupos NH ₃ ⁺ del Qo.

En general, se ha descrito que por gelificación iónica de Qo con soluciones TPP es posible obtener partículas con tamaños que fluctúan entre 100-350 nm presentando normalmente una morfología esférica (Goycolea y cois., 2009).

La ventaja de este método, radica en el uso condiciones de trabajo bastantes simples. Requiere la mezcla de dos fases acuosas a temperatura ambiente, con agitación, moderada y evita el uso de solventes orgánicos potencialmente tóxicos para las células y/o la estabilidad del activo a encapsular. Calvo y cois. (1997), determinaron la liberación de albúmina sérica de bovino (BSA) desde nanoparticulas de Qo-TPP. Se obtuvo que la formación de las nanoparticulas, se genera utilizando soluciones de Qo de hasta 4 mg/ml y de TPP de 0,75 mg/ml.

Esta técnica ofrece ventajas en muchos aspectos, incluyendo una mayor precisión y eficiencia, la flexibilidad del diseño de la plataforma de liberación, ahorro de costos y menor consumo de materias primas y reactivos. La eficiencia del proceso de mezclado y la rápida reacción química a las escalas de microlitros o nanolitros permite a los sistemas de microfluídos un mayor control del proceso y, por lo tanto, del tamaño y las propiedades de las partículas obtenidas (Hung y Phillip Lee, 2007).

Los dispositivos de microfluídos pueden ser de diversos materiales dependiendo de las aplicaciones; se han utilizado polímeros, silicatos y metales para su fabricación.

Típicamente a través de la utilización de microbombas se genera un flujo de presión en los microcanales, además, sistemas electrocinéticos pueden proporcionar otras opciones para el bombeo de los líquidos (Goycolea y cois., 2009).

En el trabajo de Yang y cois., (2007), se diseñó un sistema de microfluídos de empalme cruzado ("Cross-Junction") para la generación de micropartículas Qo-TPP. Se demostró que el tamaño de las partículas generadas puede ser controlado al variar la tasa de flujo y se pueden obtener micropartículas Qo-TPP, de tamaño homogéneo. Existen antecedentes de adición de AM a películas para envasado de alimentos para retrasar el desarrollo de bacterias y hongos, utilizando esta técnica.

Con respecto a la utilización de nanotecnología como sistema de entrega de activos, esta técnica presenta ventajas comparativas con respecto a otros sistemas, como (a) la fácil manipulación del tamaño y características de superficie de las nanopartículas, (b) su capacidad de controlar y sostener la liberación de activos desde la matriz a un lugar, momento o condición determinada, (c) la capacidad de control de degradación y liberación de partículas puede ser fácilmente modulada por la elección de los constituyentes de la matriz, (d) la carga de activos puede ser relativamente alta, además pueden ser incorporados en los sistemas sin reacciones químicas indeseadas.

A pesar de estas ventajas, las nanopartículas tienen sus limitaciones, por ejemplo, su pequeño tamaño y gran área superficial pueden llevar fácilmente a la agregación de las partículas, haciendo difícil su manipulación tanto en formas líquidas como sólidas (Hung y Phillip Lee, 2007).

La incorporación de agentes activos nanopartículados en las películas se hará por medio de la técnica de inyección térmica de tinta (ITT).

El sistema de inyección térmica de tinta (ITT), logra una dispersión controlada y precisa de impresión y de mayor eficiencia en el depósito de la tinta sobre el material a imprimir. El sistema ITT comprende un depósito de líquido impulsado por presión de vapor en donde el cabezal de impresión se compone de una serie de dos cámaras llenas de líquido con un volumen máximo 30 mi. Un pulso eléctrico resulta en un rápido aumento de la temperatura hasta 300° C, lo que vaporiza algunos núcleos de líquido el que luego se expande en una burbuja de vapor. A medida que la burbuja se expande por un periodo de tiempo comprendido entre 3 a 10 ps (microsegundo), el líquido es expulsado de la cámara a través de los orificios del cabezal a una velocidad de 10 m/s formando una microgota de aproximadamente 180 pl (picolitro, que es la billonésima parte de un litro). Estos parámetros de dispersión son optimizados de acuerdo a las propiedades fisicoquímicas del fluido (tensión superficial, viscosidad y otros).

En los últimos años, se han realizado diversos esfuerzos por transformar al sistema de inyección térmica de tinta (SIIT) como una herramienta versátil en diversas áreas de aplicación pudiendo ser considerada como una tecnología clave en el área en donde sea requerido el depósito y fijación de una o varias moléculas y/o polímeros en una matriz determinada;

Recientemente, el uso de SIIT por ITT ha sido reportado ampliamente en el área farmacéutica (Buanz y cois., 2011 ; Meléndez y cois., 2008; Pardeike y cois., 2011 y Scoutaris y cois., 2011), principalmente con el objetivo de generar y administrar fármacos de manera personalizada según los requerimientos de cada paciente, generando así una revolución en el área de la medicina y farmacología al generar dosis personalizadas de una liberación constante y controlada desde la matriz contenedora mediante la tecnología de SIIT denominada "medicina imprimible", posicionando a esta tecnología cotidiana más allá de la impresión de simples documentos e imágenes.

Esta tecnología no ha sido reportada en el área de la ciencia y tecnología de alimentos, vislumbrándose como una estrategia innovadora para generar envases activos mediante la impresión de compuestos AM en películas de revestimiento. Se ha demostrado que las películas fabricadas en base a Qo y proteínas de quínoa presentan propiedades fisicoquímicas y mecánicas adecuadas para actuar como recubrimientos comestibles de berries, sin embargo es necesario mejorar sus propiedades de barrera y potenciar su efecto AM.

Se propone que es posible adicionar agentes antimicrobianos naturales nanoencapsulados a esta matriz mediante ITT. La mayoría de las veces, los agentes AM se añaden directamente sobre los alimentos, pero su actividad puede ser inhibida por interacciones con el alimento, disminuyendo su eficiencia. En tales casos, el uso de películas o recubrimientos AM puede ser más eficiente, ya que puede diseñarse una migración selectiva y gradual desde el envase a la superficie de los alimentos, de tal modo se mantiene una alta concentración en el tiempo.

Es importante considerar que los AM adheridos a polímeros requieren ser activos mientras están unidos al polímero. Esta actividad está relacionada con el modo de acción, si, por ejemplo, su modo de acción es actuar en la membrana de la célula o en la pared del microorganismo, es posible que el AM actúe, pero probablemente no será el caso si es necesario que para actuar el AM deba penetrar al citoplasma del microorganismo (Appendini y Hotchkiss, 2001). No existen hasta ahora estudios que reporten la actividad A de películas elaboradas en base a proteínas de quínoa y Qo sobre alimentos, con la incorporación de principios activos AM a este tipo de películas en particular, para evaluar su actividad AM, de liberación controlada de AM y aumento de vida útil de frutas y vegetales frescos.

Como se mencionó, Qo presenta propiedades AM y particularmente anti fúngicas y se ha probado su acción a bajas dosis, contra Botntys cinérea (Badawy y - Rabea, 2009), a partir de ello se espera que en las películas quínoa-quitosano se mantengan las propiedades anti fúngicas de Qo, pero además se pretende potenciar esta actividad mediante la incorporación de Qo nanoparticulado de manera de prolongar su acción AM en el tiempo.

Por otro lado, Hammer y cois., (1999) evaluaron la actividad de 52 extractos y aceites vegetales contra distintos microorganismos, encontrando la concentración mínima inhibitoria más baja para aceite esencial de tomillo (0,03% v/v). Omidbeygi y cois., (2007) determinaron que los principales componentes del aceite esencial de tomillo son timol (33,14%), carvacrol (19,59%), linalool (16%) y cimeno (10,3%), resultados que concuerdan con otras referencias de la literatura. Actualmente la FDA lista al timol, al aceite esencial de tomillo y al tomillo (como especia) como alimentos para consumo humano, así como aditivos alimentarios. Como se ha mencionado anteriormente, diversos agentes AM de origen natural han sido evaluados y enfrentados a los diversos patógenos y microorganismos deteriorantes de frutas y hortaliza, destacando entre otros, el timol y Qo debido a las bajas concentraciones que son requeridas para inhibir el crecimiento tanto de bacterias como de hongos.

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Para el caso de Qo con grado de desacetilación aproximado de 70% y masa molecular de 500 kDa se ha reportado que la concentración inhibitoria mínima (CIM), promedio para las cepas de B. cinérea, E. coli, S. aureus y S. typhimurium corresponde a 15 ppm, esta concentración de Qo inhibe la proliferación luego de 18- 24 h de incubación (Rabea y cois., 2003).

Con respecto al timol, este fenol tiene amplio espectro de acción al igual que Qo frente a bacterias, hongos y levaduras y se ha reportado una concentración inhibitoria mínima (CIM) para S. aureus, Listeria innocua, E. coli y A. niger de 250 ppm y para el caso de S. cereviciae 125 ppm (Guarda y cois., 2011).

Por tanto, consideramos que estos agentes activos, timol y Qo nanopartículados, incorporados mediante inyección térmica de tinta en películas de proteína de quínoa y Qo serán efectivos én controlar la proliferación de los patógenos de principal interés en el área de fruta fresca, mediante la liberación controlada del activo desde la matriz, evaluaremos su actividad AM frente a Staphylococcus aureus, Escheríchia coli, Pseudomona aeureginosa, Salmonella entérica serovar Typhimurium, Enterobacter aerogenes y Botrytis cinérea, esperando por un lado potenciar la actividad AM de las películas y mejorar las deficiencias tecnológicas actuales de estas como son las propiedades de barrera al vapor de agua y proyectar su potencial uso como material de envase. Para comprender mejor la invención, se describirá en base a figuras que tienen solamente un carácter ilustrativo, no limitándose el alcance de la invención ni a las dimensiones, ni a la cantidad de elementos ilustrados. Breve descripción de las figuras

La figura 1 : Representa la microscopía electrónica de transmisión de suspensión de NQoT. (A) Dispersión de NQoT sin la adición de glicerina y (B) Dispersión de NQoT con 20% de glicerina agregado y sonicadas durante 15 min.

La figura 2: Muestra las propiedades mecánicas de películas sin y con NQoT incorporadas mediante 4 capas de inyección térmica luego de 30 días en condiciones de almacenamiento (A) y (B) Películas quitosano/proteína de quinoa y (C) y (D) películas de Quitosano. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las dos muestras de la Figura 2 a un nivel de probabilidad de un 95% (p).

La figura 3: Muestra el espectro FTIR de películas de (A) Qo y (B) Qo/EPQ control y con NQoT impresas.

La figura 4: Compara el efecto de las soluciones de timol (T), solución de quitosano (QoLMW) y solución formadora de película (QoHV) sobre la concentración inhibitoria mínima (CIM) requerida para todos los microorganismos (M. O) estudiados.

La figura 5: Muestra la zona de inhibición del crecimiento de (A) E. coli y (B) S. aureus enfrentada a una dispersión de NQoT sin y con adición de glicerol. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las muestras que tienen letras distintas con un nivel de probabilidad de un 95% (p).

La figura 6: Muestra la zona de inhibición del crecimiento bacteriano de películas de Qo con NQo y NQoT incorporadas mediante Inyección térmica (InkJet) incubadas durante 3 h y 24 h a 37° C. Las películas fueron impresas 4 veces para cada dispersión de nanopartículas. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las muestras que tienen letras distintas con un nivel de probabilidad de un 95% (p).

La figura 7: Muestra la zona de inhibición del crecimiento bacteriano de películas de Qo/EPQ con NQo y NQoT incorporadas mediante Inyección térmica (InkJet) incubadas durante 3 h y 24 h a 37° C. Las películas fueron impresas 4 veces para cada dispersión de nanopartículas. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las muestras que tienen letras distintas con un nivel de probabilidad de un 95% (p).

La figura 8: Representa la inhibición del desarrollo de B. cinérea. (A) Germinación de esporas viables enfrentadas a películas de Qo y Qo/EPQ control y con NQoT y NQo impresas (InkJet) y (B) Comparación del desarrollo micelar vegetativo de B. cinérea frente a NQoT, T, NQo y mezcla en solución QoLMW-T, todas ellas diluida al 10, 25 y 50% en el medio de cultivo. Flecha ( ^* ) indica no desarrollo.

Descripción detallada de la invención

Materiales 1. Harina de quínoa: Harina de semillas de quínoa orgánica (Chenopodium quinoa Willd.), adquirida en la Cooperativa de Las Nieves, VI Región, Chile.

2. Quitosano (Qo): Se usaron 2 tipos de Qo en función a los requerimientos de fabricación, películas o nanopartículas, los cuales se describen a continuación.

2.1. Quitosano de alta viscosidad (Qo): Para la fabricación de las películas se utilizó quitosano de cangrejos de alta viscosidad (>400 mPa.s) (Qo), con un grado de desacetilación de 75-85% %. Fue adquirido en Sigma-Aldrich (crabs shells, Sigma, USA, C48165), 2.2. Quitosano de bajo peso molecular (QoLMW): En la fabricación de las nanopartículas de Qo (NQo) fue utilizado Qo 269 KDa (QoLW) con un grado de desacetilación 75-85% (Sigma, USA, C448869)

3. Cepas bacterianas de colección: Staphylococcus aureus ATCC 25923; Escheríchia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Salmonella entérica serovar Typhimuríum ATCC 14028; Enterobacter aerogenes ATCC 13048; Listeria innocua ATCC 33090. Todas las cepas fueron adquiridas en el Instituto de salud pública (Santiago, Chile.). Adicionalmente fue utilizado el hongo filamentoso Botrytis cinérea wt aislado desde vides RedGlobe.

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Preparación de las películas biodeqradables comestibles

1.- Preparación de la base de las películas 1.1 Obtención de extracto proteico de Quínoa

Se utilizó la metodología reportada por Abugoch y cois., (2011) y Valenzuela y cois. (2013). Se prepararon extractos proteicos (EPQ); usando proporciones de extracción de harina de quinoa:agua de 1 :5 (18% p/p), una vez obtenida esta suspensión, se ajustó el pH a 1 1 con NaOH 1 M utilizando el pH-metro (pH meter WTW pH330, Alemania). Se mantuvieron en agitación durante 60 min a temperatura ambiente, y posteriormente fueron centrifugados a 21 ,000 x g por 30 min a 15°C (HERMLE Z-323 Alemania). El EPQ fue preparado y utilizado fresco cada vez que fueron requeridos. El contenido de proteínas solubles (PS) en los extractos fue determinado de acuerdo a Bradford (1976).

1.2. Preparación de la solución de Qo.

Se prepararon soluciones de Qo en concentraciones 1 ,5 y 2,0 % (p/v) disuelto en ácido cítrico 0,1 M, disolviendo con agitación constante por 24 h. Las soluciones se dejaron en reposo en refrigeración a 4°C durante 12 h, y luego fueron sonicadas (Fisher Scientific FS30H, Argentina) por 30 min para eliminar las burbujas. Las soluciones se almacenaron a 4°C hasta su utilización. 1.3. Preparación de la base de las películas

Las películas de quitosano (Qo) fueron elaboradas a partir de una solución de Qo (1 ,5% y 2,0% p/v en ácido cítrico 0,1 mol/L), de alto peso molecular y alta viscosidad.

Las películas se obtuvieron a partir de 110,5 ± 0,1 g de solución de Qo (1 ,5 y 2,0% p/v) y mediante moldeado en sobre placas de polietileno de baja densidad (diámetro = 14 cm), y posterior secado a 50° C hasta llegar a peso constante. Las películas híbridas (Qo/EPQ), se prepararon a partir de mezclas de extracto de proteína de quínoa (EPQ), obtenido a pH 11 y soluciones de Qo de alto peso molecular (1 ,5% y 2,0% p/v en ácido cítrico 0,1 mol/L), utilizando diferentes proporciones de ambas soluciones de polímeros (90:10, 80:20, 70:30, 60:40 y 50:50 % v/v). Para la obtención de las películas se utilizó el mismo procedimiento de moldeado y secado descrito para las películas de Qo. Las películas híbridas Qo/EPQ se obtuvieron a partir de 148,5 + 0,1 g de las respectivas mezclas en solución Qo/EPQ. El tiempo requerido para obtener las películas deseadas fluctúo entre 440 min para películas de Qo y hasta 780 min para películas híbridas Qo/EPQ. 2. Fabricación de nanopartículas

2.1 Fabricación de nanopartículas de Qo v Timol (NQoT)

Las nanopartículas de quitosano (NQo) con timol (T), fueron preparadas mediante gelificación ionotrópica con tripolifosfato de sodio (TPP) grado técnico, 85%,(Sigma, USA, C238503). Se preparó una solución acuosa de timol (T) (Sigma, USA, CT0501) al 0,1% (p/v) en ácido cítrico 0,1 M o en ácido acético al 1% p/v), a la cual se agregó quitosano de bajo peso molecular (QoLMW) al 0,3 % (p/v), las NQo sin activo se prepararon a partir de una solución de Qo 0,3 % (p/v) en ácido cítrico 0,1 M o en ácido acético al 1% p/v). Las soluciones se agitaron durante 24 h y posteriormente se filtraron (filtro whatman N°2). Adicionalmente, se preparó una solución TPP 0,1% (p/v). Se mezcló la solución de NQoT con TPP en una relación 2:1 mediante goteo (1 ,8 ml/min) por medio de una bomba de infusión (modelo KDS200, KD Scientific©) en agitación constante. La dispersión obtenida se centrifugó a 21.000 x g a 14° C por 30 min (centrifuga HermLe modelo Z32K).La concentración de NQoT fue de 4,4 ± 0,1 mg/mL. La caracterización de las NQoT y NQo, se realizó utilizando el equipo Zetasizer Nano ZS-90 (Malvern Instruments©). 2.2 Preparación de la dispersión tinta de NQoT

Las NQoT preparadas (4,4 ± 0,1 mg/ml), se le adicionó glicerina en 2 concentraciones 20 y 30% (v/v) con el objetivo de modificar la viscosidad cinemática y tensión superficial. Cada dispersión fue sonicadas durante 30 min y almacenadas a temperatura ambiente hasta su caracterización y utilización.

3 Caracterización de las dispersiones para impresión de NQo y NQoT.

3.1 Determinación de la viscosidad cinemática:

Las determinaciones de la viscosidad absoluta de las dispersiones de impresión que de aquí en adelante llamaremos "tintas" fue medida utilizando el viscosímetro de Ostwald U-tube, la viscosidad se determinó a 25 °C en baño termorregulado (Grant Instruments Ltd..Cambridge, UK). La viscosidad cinemática fue calculada utilizando la fórmula de Stokes y expresada en mm ² /s. (Buanz y cois., 2011).

3.2 Determinación de la tensión superficial: a 50 mi de cada tinta se le determinó la tención superficial, medida en microtensiometro (Kibron Inc, Finland). El patrón de tensión superficial fue comparada contra el agua destilada (tensión superficial = 72,8 mN/m a 25 °C). (Buanz y cois., 2011). 3.3 Determinación del tamaño, potencial Z e índice de polidispersidad:

Para la caracterización de la tinta de NQoTh se determinó la variación de tamaño y carga superficial, esta medición se realizó utilizando el equipo Zetasizer Nano ZS-90 (Malvern Instruments). Se tomó 1 ,0 mi de la suspensión de NQoTh con 20 y 30% p/v de glicerol (o también llamado como glicerina), respectivamente y fueron depositadas en una cubeta capilar plegada de poliestireno (modelo s90), los análisis en el equipo fueron realizados bajo condiciones estándares (dispersante: agua, T: 25° C, láser 633 nm).

3.4 Microscopía electrónica de transmisión (TEM):

Para la determinación del tamaño de las NQoT, adicional a las mediciones en Zetasizer, se utilizó TEM, para ello se analizaron en una grilla de cobre (SPI Supplies, Inc., West Chester, PA, EE.UU) en un equipo Philips Tecnai 12 Bio Twin.

3.5.- Angulo de contacto:

Para cada dispersión de activos se midieron los ángulos de contacto sobre la superficie de películas de Qo y películas de Qo/EPQ a temperatura ambiente (20°C), mediante un sistema óptico, que comprende una lente video zoom (Edmund Optics, NJ, EE.UU.) conectado a una cámara CCD (Pulnix Inc., San José, CA, EE.UU.) operado a través del programa Coyote. Las gotas de un volumen aproximado de 2 μΙ fueron colocados manualmente con una micropipeta (Gilson Pipetman U2). El ángulo de contacto aparente (ángulo entre el plano tangente a la superficie del líquido y el plano tangente a la película) se determinó utilizando el programa ImageJ (National Institutes of Health, USA) con el plug-in Drop Shape Analysis (Drop- - analysis, 2011). Las medidas del ángulo de contacto se realizaron dentro de los 30 s después de colocar la gota en la película, para despreciar el efecto de la evaporación. Se realizaron medidas de ángulo de contacto en 10 gotas.

4. Modificación del cartucho v determinación de las condiciones de impresión:

Todos los experimentos fueron realizados utilizando la impresora Hewlett- Packard, modelo 4000k210 (Hewlett-Packard Inc.), la cual utiliza tecnología "drop- on-demand" (DOD), mediante sistema de inyección térmica de tinta (ITT). Para el proceso de impresión se utilizó solo cartuchos de tinta negra modificado (HP 675, cn690A), el cual fue modificado cortando la parte superior y retirando la almohadilla de esponja que contiene en su interior, se enjuago 3 veces con agua destilada y luego con acetona.

Los cabezales fueron cargados con 20 mi de cada dispersión de tinta. Para la impresión de ambos tipos de tintas sobre las películas de Qo y Qo/EPQ, el templado de impresión fue preparado utilizando una figura geométrica diseñadas en Office World 2007 (Microsoft Inc), esta figura fue un cuadrado con dimensiones físicas de 8,8 x 8,8 cm, equivalente a un área de impresión de 77,44 cm ² . Los parámetros de impresión fueron la selección de color tinta negra y una resolución máxima de 600 dpi, lo cual permite un volumen de entrega por gota de 180 pl (Hewlett-Packard inc. Pagewidetechnology). Buanz y cois., (2011)

5. Ensayos microbiolóqicos 5.1 Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM):

Para evaluar la capacidad antimicrobiana que presenta la tinta preparadas a partir de la dispersión de NQoT, se determinó la concentración mínima que es capaz de inhibir el desarrollo visible de las cepas bacterianas S. aureus; E. coli; P. aeruginosa; S. typhimurium; E. aerogenes y L. innocua en medio de cultivo liquido (caldo soya tripticasa), luego de 24h de incubación. Las cepas bacterianas se obtuvieron a partir de una colonia aislada en placa de agar selectivo y diferencial para cada género, y fueron inoculadas en caldo nutritivo por 24 h a 37 °C con agitación hasta obtener un cultivo saturado. Luego, se determinó la concentración deseada de microorganismos, comparando con el estándar de McFarland 0,5 y se efectuaron las diluciones correspondientes de modo de alcanzar una concentración de 1x10 ⁵ UFC/ml (unidades formadoras de colonia/ml). A cada tubo de cultivo se agregó los activos en diluciones seriadas y se incubó a 37 °C durante 24 h, luego se determinó, la concentración más baja de la mezcla capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, dado por ausencia de turbidez en el medio de cultivo. Las soluciones utilizadas para generar las Nps y nanopartícula carentes de T en su formulación (NQo) fueron utilizadas como controles. 5.2 Determinación de la zona de inhibición del crecimiento:

El ensayo de difusión se realizó basado en el método estándar descrito en la literatura (Sambrook y cois., 1989; Bauer y cois., 1966). Cada cepa bacteriana fue sembrada en césped en agar Müller-Hinton. Las películas impresas fueron recortadas en disco de 6 mm ² de diámetro obteniendo un volumen impreso de 0,072 mm ³ en donde la concentración de T fue 3,0 pg/mm ³ para la película impresa con NQoT y 3,5 pg/mm ³ para la película impresa con la solución de T, Como controles, 10 pl de cada solución stock fue cargada en un disco de papel filtro estéril de 6,0 mm ² de diámetro con un espesor de 0,65 mm según lo. descrito por Sambrook y cois., (1989), las concentraciones en el disco para las soluciones stock de QoLMW fue de 30 pg y 0,06 pg para la solución de T. Luego de la incubación, fue determinado el halo de inhibición generado y es expresada el área de inhibición en mm ² .

5.3 Preparación de los inóculos de B trytis cinérea v obtención de esporas:

Se creció el hongo en superficie de agar papa dextrosa hasta observar desarrollo abundante de micelio (aprox. 5 días a 25°C), a partir de este cultivo se obtuvieron las esporas con ayuda de un rastrillo Drigalsky, posteriormente se suspendieron en un matraz con agua peptonada al 0,1% p/v, adicionado además de perlas de vidrio. Se agitó y posteriormente se filtró a través de algodón hidrofílico para retener el micelio y de esa forma obtener la suspensión de esporas. Mediante el uso de cámara de Petroff-Hauser se determinó la concentración de éstas y fueron diluidas cuando fue necesario hasta obtener una concentración de 1 ,0 x10 ² esporas/ml.

5.4 Inhibición del micelio de Botrvtís cinérea: Se evaluó la actividad antifúngica de la dispersión de NQoT mediante la inhibición del desarrollo radial en placa del micelio del hongo, descrito por Yildirim y cois., (2007). Para ello, se tomó de forma estéril con un sacabocado una porción de micelio desde una cepa previamente cultivada durante 5 días a 25 °C, la cual fue depositada en el centro de una placa de agar Papa dextrosa mezclada con diluciones de la dispersión de NQoT hasta obtener en el agar concentraciones de 0,44 mg/ml (dispersión diluida al 10% v/v), 1 ,1 mg/ml (dispersión diluida al 25% v/v) y 2,2 mg/ml (dispersión diluida al 50% v/v). Estas placas fueron incubadas durante 6 días a 25 °C, siendo evaluada cada 24 h. La actividad antifúngica fue determinada a través del área de propagación del micelio de las placas que contenían NQoT y fueron comparada con placas de agar que contenían soluciones de T, mezcla de QoLMW-T y la dispersión de NQo en las mismas diluciones y un cultivo del hongo sembrado en placa sin tratamiento cuya propagación por la superficie de la placa (8,5 cm ² ), equivalente al 100% de desarrollo, lo que fue utilizado como parámetro de comparación de crecimiento.

5.5 Inhibición de la germinación de espora de Botrvtis cinérea:

Las película de Qo y Qo/EPQ impresas 4 veces con NQoT fueron dispuestas en un matraz erlenmeyer el que contenía una suspensión de esporas de B. cinérea en una concentración de 1 ,0x10 ² esporas/ml en caldo Sabouraud-Dextrosa y se incubaron con agitación a 25 ± 0,1 ° C durante 5 días. Cada día, se tomó un inoculo de 1 ,0 mi y se sembró en profundidad en placas con agar Sabouraud incubándolas posteriormente a 25 ± 0,1 ° C durante 5 días, determinando así el recuento de la germinación. Se utilizaron películas de Qo y Qo/EPQ sin imprimir y películas de Qo y Qo/EPQ impresas con NQo como parámetro de comparación.

6. Caracterización de la suspensión de nanopartículas de quitosano-timol (NQoT) para ser impresas en películas.

La Tabla 1 muestra los resultados de las propiedades fisicoquímicas (viscosidad cinemática y tensión superficial), potencial Z, tamaño de partícula (Z- average) e índice de polidispersidad (PDI) de la dispersión de NQoT luego de la adición de glicerina al 20 y al 30% (v/v) a la formulación. Los valores de viscosidad cinemática (U), de la dispersión de NQoT sin glicerina adicionada muestra una U de 1 , 1 + 0.0 (mm ² /s), la cual es muy similar a los valores reportados para el agua destilada. Los valores de U de la dispersión incrementan significativamente en relación a la glicerina adicionada, 1 ,5 ± 0,0 y 2,3 ± 0,0 (mm ² /s) con 20 y 30% v/v, respectivamente, este aumento es debido a que la glicerina aumenta las fuerzas de cohesión de la dispersión, disminuyendo la gradiente de velocidad de flujo. Con respecto a los valores de tensión superficial (γ) de la dispersión sin glicerina (73,2 ± 0,0 mN/m), es levemente superior al valor reportado el agua destilada (72,8 mN/m), lo que indica que las NQoT interaccionan ¡ntermolecularmente con el agua que las contiene, aumentado la resistencia de la dispersión para aumentar la superficie (Kipphan, 2001). Posterior a la adición de glicerina al 20 y al 30% v/v, la γ de la dispersión disminuye a 49,3 ± 0,0 y 53,1 ± 0,3 mN/m, respectivamente, debido a que la glicerina por su carácter de tensoactivo, incrementa la densidad de la dispersión y modifica la interface agua-NQoT-agua, influyendo en el espacio físico para la interacción entre el agua y las NQoT, aumentando la solubilidad de las NQoT. Por lo tanto, en solución acuosa, las NQoT, difunden hacia la interface aire-líquido y son preferentemente absorbidas en la superficie, lo que reduce la y de la dispersión. Al adicionar glicerina al 20% v/v, se obtuvieron valores de γ (49,3 ± 0,1 mN/m) y U (1 ,5 ± 0,0 mm ² /s) similares a los reportados por de Gans y cois., (2004) y Khan y cois. ,(2010) para soluciones de tinta comerciales (γ = 47,5 mN/m y U=1 ,3 mm ² /s), lo que permite asegurar una reposición rápida del líquido creado por el vacío al momento de la impresión impidiendo el goteo del cabezal para evitar humedecer en exceso la matriz impresa. Tabla 1 : Efecto de la glicerina sobre las propiedades fisicoquímicas, potencial Z, tamaño de partícula y PDI de la suspensión de nanopartículas quitosano-timol. Letras diferentes señalan diferencias significativas (p<0,05). Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las muestras que tienen letras distintas con un nivel de probabilidad de un 95% (p).

Glicerina Viscosidad Tensión Potencial Z Variación PDI agregads cinemática superficial (mV) de tamaño

(%v/v) . (mm ² /s) (mN/m) de partícula

(nm)

0 1 ,1 ± 0,0 73,2 ± 0,0 49,9 ± 2,3 310,4 ± 69,6 0,41 ± 0,0

20 1 ,5 ± 0,0 49,3 ± 0,1 42,1 ± 4,8 383,8 ± 58,7 0,46 ± 0,0

30 2,3 ± 0,0 53,1 ± 0,3 37,3 ± 2,7 417,4 ± 53,1 0,55 ± 0,0 En la Tabla 1 , se evidencia además, el efecto de la adición de glicerina (20 y 30% v/v) sobre las propiedades de la dispersión de NQoT, las que fueron evaluadas a través de la variación de tamaño y potencial zeta de las nanopartículas, en relación a los valores de la dispersión NQoT sin glicerina.

La dispersión de NQoT con 20% (v/v) de glicerina, mostró un potencial Z significativamente mayor al ser comparado con NQoT con 30% (v/v) de glicerina, (42,1 mV ± 4,84 y 37,3 mV ± 2,71 , respectivamente), mientras que el PDI aumentó aproximadamente un 25% con la adición de 30% (v/v) glicerina, desde 0,46 ± 0,0 hasta 0,55 ± 0,0. La variación de tamaño con la adición de 30% p/v glicerina, aumento en un 25% (417,36 ± 53,12 nm), en relación con glicerina al 20% (p/v) (383,83 ± 58,76 nm). La variación de estos parámetros, comparados con los valores para la dispersión sin glicerina, se atribuye a que la glicerina al interactuar con partículas en solución, apantanaría las cargas eléctricas superficiales lo cual hace que disminuya el potencial Z, además disminuye la repulsión electrostática entre ellas pudiendo inducir la aglomeración, aumentando el tamaño y el índice de polidispersidad de las partículas, además la presencia de glicerina en una solución de nanopartículas induce la coalescencia entre partículas (Khoee y cois., 2012). Ha sido descrito por Müller y cois., (2001), que nanopartículas con potenciales sobre +30 mV y PDI inferiores a 0,7 son estables y funcionales, por lo que la adición de glicerina, en el rango estudiado, no afecta la estabilidad de la NQoT.

. . - - Adicionalmente el tamaño fue determinado por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La Figura 1 , muestra las microfotog rafias de las NQoT sin la adición de glicerina (Fig. 1A) y con la adición de glicerina 20% (Fig. 1 B), luego de someter durante 15 min la muestra a ultrasonido. Se observa el efecto dispersarte y de ordenamiento que proporciona la glicerina a las NQoT en solución, permitiendo obtener Nps de geometría claramente definida y aislada, comparadas con las NQoT presentes en la dispersión sin glicerina.

Al comparar los resultados de tamaño de las Nps obtenidos mediante TEM y DSL (Tabla 1), se observan una clara diferencia entre los valores obtenidos en donde mediante DSL los tamaños son casi 10 veces superiores a los arrojados por TEM (partículas entre 30 y 60 nm). La gran diferencia presentada por ambas técnicas reside en que en el caso de TEM, se realiza una medición microscópica directa de la muestra deshidratada mientras que el equipo Zetasizer Nano ZS-90 determina el tamaño asociado al movimiento de las partículas en solución (movimiento Browniano) determinando así el diámetro hidrodinámico (variación de tamaño) de las Nps, (Akbari y cols.,2011).

7. Propiedades mecánicas y PVA de películas con NQoT en cámara de frío de almacenamiento. 7.1 Efecto de NQoT impresas en las propiedades mecánicas de las películas bajo condiciones de almacenamientos en cámara de frío.

A películas con 4 capas de impresión de NQoT se les midieron sus propiedades mecánicas antes y después de enfrentarlas a las condiciones de almacenamiento en cámara de frió (85% HR y 0°C), estos resultados son mostrados en la Figura 2.

El almacenamiento en cámara fría por 30 días incrementa significativamente la elasticidad (A%) y disminuye significativamente la resistencia mecánica (ETR). Lo que está de acuerdo con la captación de agua bajo esta condición (85% H.R) y su consecuente efecto hidratante en la película.

Para el caso de la películas de Qo/EPQ, no se encuentran diferencias significativas en lá elasticidad (A%) entre las películas con y sin NQoT (Figura 2A), tanto en la condición sin almacenamiento (36,1 ± 1 ,3 vs 41 ,8 ± 2,1) como en la condición de almacenamiento por 30 días (76,9 ± 2,2 vs 78,2 ± 4,2). En cambio en la Figura 2B, si se observa un incremento significativo en la resistencia mecánica (ETR) cuando se incorporan NQoT, con (12,7 + 0,5 vs 16,3 ± 0,1) o sin almacenamiento (4,7 ± 0,3 vs 10,4 ± 0,2). Para el caso de las películas de Qo (Figura 2C), se encuentra que sin almacenamiento no hay diferencias de elasticidad entre películas con y sin NQoT (51 ,3 ± 1 ,7 vs 49,2 ± 2,0), pero a diferencia de las películas Qo/EPQ, la incorporación de NQoT disminuye la resistencia mecánica (15,4 ± 1 ,7 vs 12,3 ± 0,8), lo que es observado en la Figura 2D. En la condición bajo almacenamiento, las películas sin NQoT son un 32% más elásticas (111 ,0 ± 3,6 vs 75, 1 ± 4,7), pero no difieren significativamente su resistencia mecánica en relación a las que tienen Nps incorporadas (10,2 ± 2,7 vs 12,5 ± 3,2). Si se evalúa el efecto del almacenamiento en ambas películas se encuentra que se incrementa significativamente la elasticidad, pero sólo en las películas sin NQoT disminuye la resistencia mecánica. Para el caso de las películas Qo/EPQ la heterogeneidad y porosidad de estas películas permiten que el Qo nanopartículado actué como relleno a nivel estructural lo cual es evidenciado en el incremento de la resistencia mecánica y la elasticidad al ser comparado con las películas que carecen de estas Nps. En contraste, las películas de Qo presentan una microestructura absolutamente heterogénea y compacta, por lo que las NQoT impresas se disponen superficialmente en esta matriz lo cual no afecta considerablemente el ETR a diferencia de la elasticidad, ya que el Qo nanopartículado actuaría como refuerzo de la estructura de este tipo de películas. 7.2 Efecto de NQoT impresas en las propiedades de barrera al vapor de agua de las películas bajo condiciones de almacenamientos en cámara de frío.

Como se mencionó anteriormente, las películas con aplicación en frutas requieren un grado de hidrofobicidad para evitar la pérdida de humedad durante el almacenamiento y así aumentar su vida útil post-cosecha. Los resultados obtenidos de PVA para las películas control de Qo y Qo/EPQ de este trabajo presentan valores de barrera al vapor de agua superiores a los reportados por Abugoch y cois., (2011) y Valenzuela y cois., (2013), sin embargo, ambos tipos de películas presentan valores de barrera bajas al vapor de agua, en comparación a materiales fabricados a partir de derivados del petróleo tales como polietileno de baja densidad (LDPE), policloruro de vinilo (PVC) o polipropileno (PP), los cuales presentan niveles de permeabilidad al vapor de agua inferiores a 0,1x10 ^"7 g mm h ^"1 m ^"2 Pa ^"1 (Han, 2014), debido a que estas películas (Qo y Qo/EPQ), estructuralmente están estabilizadas por puentes de hidrógeno, lo cual las hace hidrofilicas evidenciado por los análisis de FTIR (Figura 3) (Abugoch y cois., 2011 ; Valenzuela y cois., 2013).

Ha sido reportado que es posible disminuir el PVA de este tipo de películas hasta un 30% cuando es adicionando aceite de girasol alto oleico en una concentración de 4,9% (p/v) a la mezcla, sin embargo, disminuye drásticamente la resistencia mecánica (ETR) entre un 90-95%, mientras que la elasticidad (A%) disminuye hasta un 80% (Valenzuela y cois., 2013)

Estas desventajas en la elaboración de un material con el propósito de empaque de frutas no son beneficiosas, de manera que se requiere desarrollar otra estrategia con esta finalidad, lo que justifica la incorporación de Nps, las cuales han sido descritos que mejoran las propiedades de barrera al vapor de agua en las películas hidrofílicas, sin afectar las propiedades mecánicas (Clapper y cois., 2008: Adame y Bael, 2009).

Tabla 2. Permeabilidad al vapor de agua (PVA) de películas de Qo y Qo/EPQ impresas con NQoT a 0 ^o C y 85% HR. Letras diferentes indican diferencias significativas. Las diferencias significativas señalan que estadísticamente hay diferencias entre las muestras que tienen letras distintas con un nivel de probabilidad de un 95% (p).

Tipo de película

Película de Qo Película de Qo + Película de Película de Q0/EPQ+

NQoT Qo/EPQ NQoT

PVA* 3,0 x10 ^s " ± 0,0 2,0 X10 ^~JD ± 0,0 3,0 X10 ^'ja ± 0,0 2,6 X10 ^"JD ± 0,0 -·>

*g mm h ^{"1 '¿} Pa ^"1

a: 3,0 X10 ^"3 es la notación científica del valor 0,003; b: 2,0 X10 ^"3 es la notación científica del valor 0,002 y 2,6 X 0 ^"3 es la notación científica del valor 0,0026.

La Tabla 2, muestra los resultados obtenidos para la permeabilidad al vapor de agua (PVA), a 85% HR y a 0 °C de las películas de Qo y Qo/EPQ impresas con la dispersión de NQoT con 20% (v/v) de glicerina agregada. La PVA de ambas películas sin Nps, no muestran diferencias significativas en este parámetro (p>0,05). Mientras que luego de la incorporación de 4 capas de Nps mediante impresión, este valor disminuye 33,3 % (3,0 X10 ^"3 ± 0,0 hasta 2,0 X10-3 ± 0,0 g mm h ^"1 m ^"2 Pa ^"1 ), para las películas de Qo y 13,3% para las películas híbridas (3,0 X10 ^"3 ± 0,0 hasta 2,6 X10 ^"3 ± 0,0). La disminución de PVA presentada al incorporar NQoT en ambas películas se puede atribuir por una parte por la formación de un camino tortuoso para la difusión del vapor de agua (Duncan., 201 1). Mediante éste concepto las moléculas de gas tendrían que atravesar canales formados por las nanopartículas intercaladas en la matriz poiimérica en vez de atravesar directamente de manera perpendicular el polímero. De esta forma; el camino tortuoso incrementaría la longitud promedio de difusión del vapor de agua (Duncan., 2011). Por otro lado, al incorporar Nps a las películas se podría cambiar la estructura del compósito en las regiones interfaciales (Duncan., 201 1). Esto podría darse debido a la formación de puentes de hidrógeno entre las Nps, la interface de Qo y los radicales polares de los aminoácidos que conforman la estructura de las proteínas de quínoa. Es así como las hebras del polímero en contacto cercano con las Nps podrían quedar parcialmente inmovilizadas y de esta forma se disminuirían el volumen libre de agujeros, su densidad y tamaño. Dificultándose el paso de las moléculas de vapor a través del nanocomposito (Duncan., 2011). La disminución del valor de PVA debido a la incorporación de nanopartículas es congruente con lo señalado por diversos autores. Así; Medina (2013) quien trabajó con películas de quitosano-extracto acuoso proteico de quínoa, logró disminuir el PVA a un máximo de un 19% al cargar las películas a un 5% de nanopartículas de quitosano-tripolifosfáto producidas mediante la técnica de gelificación ionotrópica. De igual manera; Savé (2011) presentó una disminución en el PVA equivalente al 9% trabajando con el mismo tipo de nanopartículas a una concentración del 1 % usando la misma matriz poiimérica que Medina (2014). Se piensa que el incremento del valor de _. PVA cuando las películas son sometidas a 0°C se debe al aumento de la presión del vapor de agua que se genera a una alta HR (Wiles y cois., 2000; Phan The y cois., 2009). Esto provocaría una mayor adsorción de moléculas de agua por parte de las moléculas polares que conforman las películas, generando hinchamiento y tumefacción de éstas. De esta forma ocurriría un cambio conformacional en la microestructura de las películas, lo que separaría la estructura poiimérica permitiendo un aumento del flujo permeable de vapor de agua (Valenzuela y cois., 2013). Se piensa que debido a este fenómeno, el uso de nanopartículas resultó más eficiente para películas acondicionadas a 0°C frente a 23°C (51 % de reducción máxima de PVA frente a un 18%, respectivamente). Puesto que las separaciones y espacios vacíos que pudiesen formarse debido al hinchamiento y la tumefacción podrían ser cubiertos por las nanopartículas. 8. Actividad antimicrobiana.

8.1 Concentración inhibitoria mínima bacteriana y fúngica de las soluciones utilizadas en la fabricación de nanopartículas v soluciones formadoras de películas. La Tabla 3 muestra los resultados de la concentración inhibitoria mínima

(CIM) de las soluciones de T y Qo de bajo peso molecular (QoLMW) utilizado para generar la dispersión de NQoT, además fueron testeadas las soluciones formadoras de película de Qo y la mezcla entre Qo y EPQ en proporción 90:10 v/v, frente a los microorganismos (M.O) modelo de esta invención.

Tabla 3: Concentración mínima inhibitoria de los activos frente a los

microorganismos utilizados en este trabajo.

Microorganismo

£. aerogenes L innocua Ps. S. e.

Antimicrobiano S. Tiphymurium E. coli aeruginosa aureus cinérea

Timol (gL ¹ ) 0,250 0,250 0,250 0,275 0,225 0,275 0,550

QoLMW(gL ^"1 ) 1,0 1.0 1 ,0 0,8 1 ,0 1,0 2,5

Qo (gL- ¹ ) 7,5 7,5 8,0 7,5 9,0 8.5 10,5

Qo/EPQ (%)* ' 90 90 90 100 ND" 100 ND**

* Desde la solución stock generadora de película; ** ND: No detectado

Los valores de la CIM para la solución de T en bacterias Gram negativo fue 0,250 g/l para S. tiphymurium y E. coli, mientras que para P. aeruginosa fue 0,225 g/l. Para el caso de las bacterias Gram positivos (L. innocua y S. aureus) fue 0,275 g/l, estos valores evidencian una moderada resistencia de los M.O Gram positivos en comparación a bacterias Gram negativas, estas concentraciones se aproximan a las reportadas previamente por Guarda y cois., (2011). Para hongo B. cinérea, la concentración requerida para inhibir su desarrollo fue aproximadamente 2 veces superior que al de ambos tipos de bacterias (0,550 g/i). Con respecto a los valores de la CIM de la solución de QoLMW, no hay diferencian en las concentraciones requeridas para inhibir la proliferación de bacterias Gram positivo y Gram negativo (1 ,0 g/l), a excepción de L. innocua, la cual es inhibida con una concentración 20% menor (0,8 g/l), evidenciando una mayor sensibilidad al QoLMW.

Al igual que en lo observado para la solución de T, B. cinérea requiere concentración superior a las bacterias (2,5 g/l) para ser inhibido.

La concentración inhibitoria requerida de la solución formadora de película de Qo fue 7,5 g/l para inhibir S. tiphymurium, E. coli y L. innocua y de 8,0, 8,5 y 9,0 g/l para inhibir el desarrollo de E. aerogenes, S. aureus y P. aeruginosa, respectivamente. B. cinérea requiere una concentración aproximada de 1 ,5 veces superior de la solución formadora de película de Qo para observar un efecto en su inhibición respecto a las bacterias. Las CIM de la solución formadora de película es aproximadamente 85% superior a la concentración de la solución QoLMW en todas las bacterias. ensayadas. La masa molecular del Qo, guarda estrecha relación con su capacidad AM, siendo esta característica una de las más relevantes, estudios demuestran qué la actividad AM disminuye significativamente, hasta en un 95% a medida que se utiliza Qo de mayor peso molecular (Dutta y cois., 2009).

Con respecto a la mezcla Qo/EPQ, es evidente que la presencia de EPQ, disminuye entre un 90 hasta un 100% la actividad AM del Qo. Esto concuerda con lo reportado por Rabea y cois., (2003), quienes señalan que el Qo al combinarse con proteínas su AM es inhibida.

Los resultados obtenidos desde la CIM, demuestran que a excepción de la solución mezcla entre Qo y proteínas de quínoa, tiene la capacidad de limitar el desarrollo celular de los M.O estudiados. Adicionalmente, de todas las soluciones ensayadas, la solución de T es quien presentó la mayor efectividad en la inhibición de la proliferación de todos los M.O ensayados al ser comparada con las soluciones de QoLMW, Qo y la mezcla de este Qo con proteínas de quínoa, debido a que son requeridas concentraciones inferiores que las otras soluciones. Los resultados obtenidos desde las CIM de ambas soluciones formadoras de películas, ratifican el objetivo de potenciar la actividad AM de las películas de Qo y las películas de Qo/EPQ utilizando NQoT.

El potente efecto del T en la inhibición del desarrollo de todos los M.O estudiados es mostrado en la Figura 4, en donde son analizadas las CIM de todas las soluciones en función a las concentraciones inhibitorias requeridas de la solución T. Se observa que es requerida una concentración de QoLMW de aproximadamente 4 veces mayor y aproximadamente 30 veces mayor de la solución formadora de película de Qo para ejercer el mismo efecto inhibitorio del T.

Esta diferencia de efecto se debe a los mecanismos de acción de cada una de estas moléculas (Qo y T) al enfrentarse a las células bacterianas y/o fúngicas. Diversos mecanismos de acción han sido propuestos para explicar el efecto de la molécula de Qo tanto en bacterias como en hongos. En las bacterias la molécula de Qo podría ejercer su efecto biocida mediado por tres mecanismos, los cuales implicarían: a) el Qo podría penetrar a! interior celular de los M.O bloqueando de la replicación y transcripción del ADN cromosómico bacteriano (Rabea y cois., 2003); b) el Qo al adsorberse a la superficie microbiana, precipitaría debido a las propiedades ácido-base de la fosfatidilcolina, fosf atíd i Ig licero [ y cardiolipina, principales componentes de las membranas celulares, las que otorgan el pH neutro de éstas, este precipitado de Qo, formaría una barrera física lo que provocaría el bloqueo de los canales de transporte de solutos, tales como porinas (Qin y cois., 2006); y

c) el Qo actuaría como quelante de ciertos metales, tales como Mg ⁺² y K ⁺¹ , requeridos como grupos prostéticos o cofactores de enzimas involucradas en el metabolismo energético de las bacterias (Roller y Covill, 1999). Para el caso de hongos filamentosos como β. cinérea, los mecanismos propuestos para el Qo comprenden la deleción y regulación negativa en la expresión de genes concomitante a la disminución en la tasa de procesos metabólicos; la disrupción de la integridad de las membranas biológicas (Márquez y cois., 2013). Adicionalmente, Rui y Hahn, (2007), han reportado que el Qo puede inhibir competitivamente la actividad enzimática de la hexoquinasa de Botrytis, bloqueando el primer paso de la metabolización de la glucosa.

Con respecto al mecanismo biocida de T se ha reportado que luego de 30 min de tratamiento en concentraciones subletales es suficiente para causar efectos negativos en la viabilidad celular procarionte (La Storia y cois., 2011).

El T al interactuar en la superficie celular microbiana, debido a su carácter lipofílico le permitiría intercalarse en la membrana, modificando la estructura de barrera y su consecuente alteración de permeabilidad y osmolaridad, gatillando la rápida e irreversible salida de componentes celulares.

Adicionalmente, complejos enzimáticos responsables de la cadena transportadora de electrones de los M.O son afectados, resultando en la inhibición de la síntesis de ATP. Por otra parte, Braga y cois. (2012), han reportado que el T posee la capacidad de inhibir la formación de glicocalix laxo ("slime"), por lo que inhibiría la formación biopelículas bacterianas. Los mecanismos de acción AM se atribuyen a las diferencias de efectos observados en este estudio. 8.2 Eficiencia en la inhibición bacteriana de la dispersión de NQoT

Para evaluar la eficiencia AM de la dispersión de NQoT, se comparó su efectividad en diluciones seriadas contra diluciones de la solución stock de mezcla entre QoLMW y T, utilizada para fabricar las NQoT y con diluciones de la dispersión de Nps de Qo carentes de T en su formulación (NQo), estos resultados son presentados en la Tabla 4. Tabla 4: Concentraciones (%) mínimas requeridas para inhibir el desarrollo de las cepas microbianas utilizadas en este estudio.

Microorganismo

Agente S. E. coli E. L. innocua Ps. S. aureus antimicrobiano Tiphymuríum aerogenes aenjginosa

NQoT

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30% +

20% +

10%

90%

80%

70%

60% +

50% + +

40% + + + +

30% + + + + +

20% + + + + +

10%

Stock

QoLMW-T

100%

90%

80%

70%

60%

50% + + +

40% + + + 30% + + + 20%

10% (-) No hay desarrollo bacteriano; (+) desarrollo bacteriano. El desarrollo es evidenciado por turbidez del medio. Cada ensayo fue realizado en triplicado en 3 experimentos independientes. Los resultados evidencian que la dispersión de NQoT es capaz de afectar la viabilidad de las bacterias Gram negativo Salmonella tiphymurium, Escherichia coli y Enterobacter aerogenes desde un 20% de la concentración inicial, mientras que para obtener el mismo efecto inhibitorio sobre estas bacterias, las diluciones control requieren entre el 30% y 40% desde la concentración inicial. Un efecto similar fue observado para las cepas Gram positivo Listeria innocua y Staphylococcus aureus en dónde el efecto de la dispersión NQoT comienza la inhibición de la proliferación a partir de diluciones al 30% desde la concentración inicial, mientras que las soluciones controles inhiben a estas bacterias a partir de las diluciones al 50 y 60%. En todos los M.O analizados, las NQoT evidencian un potente efecto inhibitorio en comparación a las soluciones control, ya que es capaz de lograr la inhibición en el desarrollo microbiano a concentraciones diluidas.

En este sentido, se ensayó la actividad AM de NQo de un tamaño de 115,5 nm, generadas mediante gelificación ionotrópica con TPP a partir de una solución de Qo de 440 kDa al 1 ,0% p/v, frente Staphylococcus aureus, estas NQo logran disminuir la concentración de Qo requerida para inhibir el desarrollo de esta bacteria en un 50% al compararla con la concentración requerida de Qo sin nanoparticular. 8.3 Sinergia en la actividad AM de la dispersión de NQoT

Para definir el tipo de efecto observado por las NQoT sobre los M.O estudiados (sinérgico o por adición de componentes), fue realizado un cálculo teórico de la CIM en base a los resultados obtenidos a partir de la CIM (Tabla 3) y fue comparada con la CIM experimental calculada en base a la concentración de los componentes en solución requeridos para la preparación de las NQoT (75% de QoLMW y 25% de T), descrito por Medina (2014) y los resultados obtenidos en el ensayo de eficiencia de inhibición a partir de las diluciones de la dispersión de NQoT (Tabla 4). Los resultados son presentados en la Tabla 5. Tabla 5: Evaluación cuantitativa del efecto sinérgico o aditivo de dispersión de NQoT y solución stock de Qo-T sobre los microorganismos utilizados en este estudio.

Formulación

NQoT dispersión Stock solution mezcla

QoLMW-T

Microorganismo CIM CIM Diferencia CIM CIM Diferencia

Teórico Experimental de efecto Teórico Experimental de efecto

(gL ^"1 ) (gL ^"1 ) (%) (gL ^"1 ) (gL ^"1 ) (%)

S. Typhimuríum 0,813 0,334 58,92 125,0 106,8 14,56

E. cotí 0,813 0,334 58,92 125,0 106,8 14,56

E. aerogenes 0,813 0,334 58,92 125,0 80, 1 39,92

Ps. Aeruginosa 0,806 0,500 37,96 122,5 106,8 12,81

L. innocua 0,819 0,500 38,94 107,5 106,8 1 ,39

S. aureus 0,819 0,500 38,94 128,5 106,8 16,88

Para el caso de las bacterias Gram negativo S. typhimuríum, E. coli y E. aerogenes se obtuvo una CIM teórica desde la dispersión de NQoT y desde la solución mezcla de QoLMW-T de 0,813 g/l y de 125,0 g/l, respectivamente, mientras que las CIM experimental obtenidas para estas bacterias desde la dispersión de NQoT fue de 0,334 g/l y la mezcla en solución de QoLMW-T fue de 106,8 g/l para S. typhimuríum y E. coli, mientras que para E. aerogenes fue de 80,1 g/l. Las CIM teóricas para Ps. aeruginosa obtenidas de desde las NQoT y desde la mezcla en solución de QoLMW-T fue de 0,806 g/l y 122,5 g/l, respectivamente.

Los resultados obtenidos para las bacterias Gram positivo, L. innocua y S. aureus se obtuvieron CIM teóricos desde las NQoT de 0,819 g/l mientras que para la solución mezcla este fue de 107,5 g/l para Listeria y 128,5 g/l para Staphylococcus. Las CIM experimental para estos M.O desde las NQoT fueron de 0,500 g/l, mientras que para la solución QLMW-T fue de 106,8 g/l.

Los cálculos experimentales de las CIM para ambas formulaciones evidencian que el QoLMW preparado en un sistema incorporando con T potencian el efecto de inhibición bacteriana, ya sea en solución o en la dispersión nanoparticulada, debido a que los CIM experimentales, (con variaciones dependiente de la bacteria ensayada), resultaron en una diferencia de efecto entre un 37,96% a un 58,92% inferior respecto a los valores de las CIM teóricas para las NQoT, mientras que la diferencia de efecto entre la CIM teórica y la CIM experimental de la mezcla en solución QoLMW-T fue inferior entre un 1 ,39 a 39,92%.

Estos resultados demuestran la sinergia que existe entre QoLMW y T en su AM, sin embargo, las concentraciones experimentales requeridas de la dispersión de NQoT fueron entre aproximadamente 1 ,5 hasta aproximadamente 30 veces más bajas que las CIM experimentales observadas para la solución mezcla, demostrando que la dispersión de NQoT presenta una potente AM en comparación a una mezcla en solución de ambos activos.

8.4 Efecto del glicerol en la actividad AM de la dispersión de NQoT La adición de glicerol al 20% v/v, fue requerido para modificar las propiedades fisicoquímicas de la dispersión de NQoT, logrando la incorporación eficiente de las NQoT a las películas de Qo y Qo/EPQ mediante impresión, sin embargo, el tamaño de partícula, PDI y potencial Z y fueron afectados (ver Tabla 1), por lo que es importante evaluar el efecto del glicerol en las propiedades AM de las NQoT.

Se determinó la zona de inhibición del crecimiento para la bacteria Gram negativo E. coli y la bacteria Gram positivo S. aureus enfrentadas a la dispersión de NQoT y comparadas con la dispersión de NQoT con glicerina al 20% v/v, estos resultados son mostrados en la Figura 5.

La zona de inhibición del crecimiento de la bacteria E. coli por la dispersión de NQoT fue de 9,4 ± 0,4 mm ² , mientras que para la dispersión con glicerol al 20% v/v, fue de 8,8 ± 0,3 mm ² , lo que evidencia que la adición de glicerol no afecta significativamente la AM de la dispersión NQoT para esta bacteria. En contraste, la zona de inhibición del crecimiento de S. aureus por la dispersión de NQoT fue de 6,8 ± 0,4 mm ² , mientras que para la dispersión con glicerol al 20% v/v, fue de 5,3 ± 0,1 mm ² . Estos resultados evidenciaron que la adición de glicerol incide en la AM de las NQoT dependiendo del tipo de bacteria a la cual son enfrentadas, este efecto es atribuido a la características estructurales de cada bacterias, la S. aureus presenta una gruesa pared de peptidoglicano la cual disminuye la interacción con la membrana celular bacteriana, la adición de glicerol de las NQoT disminuiría la interacción electrostática de las NQoT a la pared bacteriana, ya que la adhesión efectiva del activo en la superficie bacteriano es requerido para lograr el efecto biocida (Kim y cois., 2013), mientras que E. coli está provista de una membrana externa (ME) la que está compuesta principalmente por lipopolisacáridos, lipoproteínas y fosfolípidos (Koebnik y cois., 2000) y como fue descrito en la sección 8.1 esta clase de bacterias presenta una mayor susceptibilidad a los activos ensayados, adicionalmente, proteínas en estructura de β-barril integrales de la ME de las bacterias Gram negativo denominadas genéricamente porinas, permiten el paso de diversos solutos de variados pesos moleculares, sean éstos nutrientes o tóxicos antibacterianos, lo cual incrementa la susceptibilidad de E. coli a las NQoT con y sin glicerol.

8.5 Actividad antimicrobiana de películas de Qo v QO/EPQ impresas con

NQoT.

Se determinó la zona de inhibición del crecimiento (ZIC) bacteriano producido por las películas impresas con NQoT luego de 3 y 24 h de incubación frente a las bacterias estudiadas y fue comparada contra la inhibición generada por las películas control (sin NQoT impresas) y por películas impresas con Nps de Qo carentes de T (NQo). Los resultados obtenidos para las películas de Qo y Qo/EPQ son presentados en la Figura 6 y Figura 7, respectivamente.

Respecto a los resultados en la ZIC generada por la película control de Qo en E. coli (4,4 ± 0,6 mm2 y 4,6 ± 0,6 mm ² ), E. aerogenes (4,0 ± 0,2 mm ² y 4,1 ± 0,2 mm ² ), P. aeruglnosa (3,4 ± 0,1 mm ² y 3,5 ± 0,1 mm ² ) y S. typhimurium (3,9 ± 0,2 mm ² y 3,9 ± 0,2 mm ² ), no se encontraron diferencias significativas entre 3 y 24 h posterior a la incubación. Similares valores de ZIC fueron encontradas para las bacterias Gram positivo L innocua (3,4 ± 0,1 mm ² y 3,5 ± 0,1 mm ² ) y S. aureus (3,8 ± 0,2 mm ² y 4,0 ± 0,4 mm ² ). Estos valores indicaron que las películas control de Qo presentan una moderada actividad AM a partir de 3 h de ser enfrentadas en ambos tipos de bacterias (en promedio aproximadamente 4,0 mm ² ), sin embargo, esta fue limitada ya que su efectividad no incrementó con mayor tiempo de incubación (24 h), manteniendo los valores de la ZIC relativamente constantes. Estos resultados se explican de acuerdo a lo descrito por Dutta y cois , 2009 quienes establecieron que la AM del Qo depende del estado de aplicación, siendo más eficaz en la forma de solución que en película.

La inhibición generada por las películas impresas con NQo en E. coli fue de 10,1 ± 0,5 mm ² y 26,2 ± 1 ,2 mm ² , E. aerogenes 8,1 ± 1 ,7 mm ² y 25,9 ± 1 ,2 mm ² , P. aeruginosa 8,3 ± 0,8 mm ² y 22,3 ± 0,3 mm ² y S. typhimurium 7,9 ± 1 ,5 mm2 y 22,7 ± 2,1 mm ² , luego de 3 y 24 de incubación, respectivamente. Un aumento significativo de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,0 veces fue observado en la inhibición de estas bacterias Gram negativo luego de 24 h respecto a 3 h de incubación. Similar efecto inhibitorio fue encontrado por estas películas en las bacterias Gram positivas en donde las ZIC fueron de 7,2 ± 1 ,6 mm ² y 23,6 ± 1 ,0 mm ² para L. innocua y de 7,7 ± 1 ,2 mm ² y 25,4 ± 2,2 mm ² para S. aureus.

En donde se observó que la actividad AM de la película incrementa en función al tiempo de exposición en los ¡nóculos bacterianos.

La impresión de NQo en la película de Qo incrementa significativamente la actividad AM mostrada por la película control en ambos tiempos de incubación. La mayor actividad AM observadas por las películas impresas con NQo versus las películas control, se puede explicar debido a la tumefacción observada en la película de Qo al entrar en contacto con la superficie del agar inoculado (datos no mostrados), la captación de moléculas de agua por parte de la película provenientes desde el agar incubado en estufa (37° C ± 1 ,0) es exacerbado a medida que aumenta el tiempo de incubación, lo que permitiría la desorción de las NQo dispuestas superficialmente en las caras externas de la película, las cuales podrían difundir radialmente por el agar aumentando la superficie de contacto con las bacterias ensayadas, concomitante al efecto biocida de estas. Las ZIC generadas por las películas de Qo impresas con NQoT impresas fueron de 21 ,4 ± 1 ,1 mm ² y 42,1 ± 1 ,3 mm ² para E. coli, de 28,6 ± 1 ,7 mm ² y 43,6 ± 1 ,8 mm ² para E. aerogenes, de 18,1 ± 1 ,2 mm ² y 31 ,6 ± 1 ,2 mm ² para P. aeruginosa y de 19,3 ± 1 ,7 mm ² y 37,5 ± 2,4 mm ² para S-. typhimuríum, luego de 3 y 24 de incubación, respectivamente.

Estos resultados evidenciaron el potente efecto AM de estas películas, superando significativamente las películas control en los valores de ZIC del orden de entre aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5 veces superior en 3 h de incubación, estos valores fueron incrementados hasta aproximadamente 10 a aproximadamente 12 veces luego de 24 h de incubación.

Al comparar con la película impresa con NQo, las películas con NQoT impresas superan los valores de ZIC en estas bacterias en el orden de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5 veces a las 3 h de ensayo, esta tendencia se mantuvo posterior a las 24 h. Una tendencia similar fue mostrada por las ZIC generadas en las bacterias Gram positivo L. innocua (16,81± 0,1 mm ² y 28,6 ± 1 ,3 mm ² ) y S. aureus (13,6 ± 0,5 mm ² y 35,4 ± 1 ,2 mm ² ).

El potente efecto AM asociado a las películas impresas con NQoT se puede justificar mediante variados factores, por una parte, como fue descrito en la sección 8.3 existe un efecto sinérgico entre la combinación QoLMW y T, la cual se incrementa al generar nanopartículas con estas soluciones, además de la desorción de las NQoT desde la matriz de Qo debido a la captación de moléculas de agua y el consecuente hinchamiento de estas durante los periodos de incubación, y la liberación de T desde las Nps impresas, en este contexto, se estimó la liberación de T desde NQo, la cual se inicia luego de 2 h de iniciado el ensayo en medio acuoso y es sostenida en el tiempo hasta al menos 48 h. La liberación de activos desde NQo ha sido reportada que puede ser desde la superficie de la NQo, difusión a través de la matriz por hinchamiento o por erosión superficial del Qo.

La Figura 7 presenta los resultados de la ZIC generadas por las películas de Qo/EPQ control, impresas con NQo y con NQoT. Las películas control carecen de actividad AM, no evidenciaron zona de inhibición en ningún género bacteriano ensayado en cualquiera de los 2 tiempos de incubación (3 y 24 h), esto es atribuido al efecto de las presencia de proteínas de quínoa en la mezcla y como fue discutido en la sección 8.1 , la mezcla en solución entre Qo/EPQ disminuye hasta un 100% la actividad AM del Qo, esto sumado a la disminución de la actividad AM intrínseca del Qo cuando se encuentra como película. Sin embargo, cuando fueron ensayadas este tipo de películas con NQo impresas se generaron ZIC en las bacterias Gram negativo E. coli (0,8 ± 0,4 mm ² y 4,1 ± 1 ,0 mm ² ), E. aerogenes (0,7 ± 0,4 mm ² y 4,0 ± 1 ,2 mm ² ), P. aeruginosa (0,3 ± 0,1 mm ² y 4,5 ± 1.2) y S. typhimurium iO,Z ± 0,1 mm ² y 3,7 ± 0,3 mm ² ), luego de 3 y 24 h de incubación, respectivamente.

Mientras que para las bacterias L. innocua y S. aureus se observaron ZIC de 0,3 ± 0,1 mm ² y 0,5 ± 0,2 mm ² respectivamente luego de 3 h de incubación y de 6,7 ± 0,2 mm ² y 5,6 ± 0,6 mm ² , respectivamente luego de 24 h de incubación.

Estos resultados demuestran la misma tendencia que se observó en películas de Qo impresas con NQo en donde las ZIC aumentan proporcionalmente con mayor tiempo de incubación.

Con relación a las películas de Qo/EPQ impresas con NQoT fueron las inhibiciones generadas fueron de 0,9 ± 0,7 mm ² y 4,9 ± 0,6 mm ² para E. coli, de 1 ,2 ± 0,7 mm ² y 4,8 ± 1 ,1 mm ² para E. aerogenes, de 0,3 ± 0,1 mm ² y 5,4 ± 0,9 mm ² para P. aeruginosa y de 0,3 ± 0,1 mm ² y 4,5 ± 0,1 mm ² para S. typhimurium, luego de 3 y 24 de incubación, respectivamente.

Las bacterias Gram positivo generaron una ZIC frente a esas películas de 0,4 ± 0,2 mm ² y 9,6 ± 0,3 mm ² para L. innocua y de 0,4 ± 0,1 mm ² y 5,7 ± 1 ,2 mm ² para S. aureus en cada tiempo de incubación.

Se obtuvo que la actividad inhibitoria se incremente dependiendo del tiempo de incubación frente a ambos tipos de M.O. Al comparar las ZIC generadas por las películas impresas con NQoT contra las películas impresas con NQo luego de 3 y 24 h de incubación, no se encontraron diferencias significativas tanto en bacterias Gram negativo como en bacterias Gram positivo.

8.6 Actividad de las películas de Qo y QO/EPQ impresas con NQoT frente a Botrytis cinérea

Las películas de Qo y Qo/EPQ impresas con NQoT fueron enfrentadas contra un cultivo que contenía esporas de B. cinérea en donde fue evaluada la capacidad de estas películas de mitigar la germinación durante 5 días, los resultados fueron comparados contra películas control (sin NQoT impresas) y contra ambos tipos de películas impresas con NQo. Adicionalmente, un control de germinación fue evaluado como parámetro de viabilidad.

Los resultados son presentados en la Figura 8A, la cual muestra que el cultivo de esporas sin la presencia de películas, germina exponencialmente evidenciando condiciones adecuadas para el proceso de germinación, por lo cual el ensayo carece de artefactos.

Luego de 24 h de incubación, cada cultivo (con el respectivo tipo de películas) germinó sin encontrar diferencias significativas entre los cultivos que contenían las películas control, películas impresas con NQo y películas impresas con NQoT, todos ellos proliferaron en el mismo nivel que el control de viabilidad (aproximadamente 1 ,2 ciclos logarítmicos).

Transcurridos 2 días de ensayo, ambos tipos de película impresas con NQoT y NQo, respectivamente, mostraron entre ellas una reducción similar en la germinación de esporas respectó a la película control, ambos tipos de película impresas con ambos tipo de Nps lograron reducir aproximadamente 30% la germinación de las esporas de Botrytis, mientras que la película control no evidenció una reducción de la germinación comparada con el control de viabilidad, la cual permitió el incremento de aproximadamente 2,1 log desde el inicio del ensayo. Un fenómeno similar a lo anterior, fue observado en el tercer día de ensayo, en donde las películas control no mostraron efecto significativo frente al desarrollo de las esporas, mientras que las películas de Qo y Qo/EPQ impresas con ambos tipos de Nps mantuvieron el efecto de inhibición de la germinación de aproximadamente 30% comparadas contra ambos tipos de películas control y el cultivo de viabilidad.

No fueron encontradas diferencias en la reducción de la germinación observada en función al tipo de matriz de Qo o Qo/EPQ y el tipo de Nps impresas en ellas. Luego de 4 días de iniciado el ensayo, la película de Qo impresa con NQoT muestra una reducción en la germinación de 2,3 ± 0,1 ciclos logarítmicos de esporas comparado contra el control de viabilidad y ambas películas control, las cuales posibilitaron el incremento de aproximadamente 2,5x10 ⁴ esporas/ml, adicionalmente, fue observado que no hubo un incremento de la germinación de esporas respecto al 3 día en el cultivo con este tipo de película, un fenómeno similar se observó con la película híbrida impresa con NQoT, la cual controló de igual manera la proliferación de esporas en el cultivo.

La impresión de NQoT en ambos tipos películas resultaron aproximadamente 2,5 veces más efectivas en la inhibición que las películas impresas con NQo.

Al finalizar el tiempo de ensayo (5to día), se observó que las películas de Qo y Qo/EPQ impresas con ambos tipos de Nps inhiben significativamente la germinación de esporas en 4 ciclos logarítmicos, (sin diferencias entre el tipo de película y tipo de Nps impresa), con respecto a las películas control y el control de viabilidad.

Interesantemente, este ensayo permitió establecer que las NQoT y las NQo incorporadas mediante inyección térmica en ambos tipos de películas, además de permitir el control de la germinación de esporas de B. cinérea, con respecto a las películas no impresas, lograron mostrar un potente efecto esporistatico debido a que la germinación de esporas no mostró un incremento desde el día 3 al día 5 de ensayo, manteniendo en promedio 2,5 x10 ³ esporas/ml cuando las películas impresas estuvieron presentes en el cultivo. Por otra parte, se ensayó la capacidad antifúngica de las NQoT enfrentadas a la forma vegetativa de Botrytis cinérea, en donde se evaluó la inhibición del desarrollo del micelio de este hongo, adicionando concentraciones diluidas al medio de cultivo de la dispersión de NQoT, las diluciones ensayadas correspondieron al 10%, 25% y 50% v/v, y fue comparado contra las soluciones de T, mezcla de QoLMW-T y la dispersión de NQo en las mismas diluciones. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8B.

Cuando el medio de cultivo carecía de las soluciones o dispersiones a ensayar (control de viabilidad), se observó que el hongo se propagó por toda la superficie de la placa (8,5 cm ² ), equivalente al 100% de desarrollo, lo que fue utilizado como parámetro de comparación de crecimiento.

Al evaluar el efecto de los activos en su mayor dilución (10% v/v), se observó que la dispersión de NQoT permite el desarrollo radial del micelio de B. cinérea de 3,1 ± 0,2 cm ² lo que equivalió a una inhibición del 63,5% respecto al control de viabilidad, a su vez, cuando la solución de T estuvo presente en el medio de cultivo, el hongo mostró un desarrollo en placa de 8,1 ± 0,1 cm ² , un 4,7% inferior al control de viabilidad. Las NQo inhibieron el crecimiento en un 44% (4,7 ± 0,3 cm ² de propagación micelar), mientras que la solución mezcla QoLMW-T, inhibió al mismo nivel que las NQo logrando el mismo porcentaje de inhibición. Estos resultados revelaron la efectividad de las NQoT inclusive un 90% diluidas desde la solución stock utilizada en este trabajo, ya que su efectividad en la inhibición de la forma vegetativa de B. cinérea fue 13,5 veces mayor al efecto inhibitorio mostrado por la solución de T y 1.4 veces superior con respecto a la dispersión de NQo y solución mezcla QoLMW-T.

Cuando se ensayaron los activos en diluciones al 25% v/v, la dispersión de NQoT logro inhibir en un 100% la proliferación del hongo transcurrido el tiempo de ensayo (6 días), mientras que cuando T estuvo presente en el medio de cultivo, se observó un crecimiento radial del micelio de 6,8 ± 0,8 cm ² (20% de inhibición). Las NQo en esta dilución, permitieron el desarrollo de Botrytis en un área de 3,8 ± 0,7 cm ² de la placa, logrando una inhibición del 55,2% con respecto al control de viabilidad. La solución mezcla QoLMW-T permitió la propagación del hongo por 1,9 ± 0,4 cm ² de la placa lo que fue equivalente a un 77,6%. Este resultado permitió establecer que una concentración de 1 ,1 mg/ml (diluidas al 25%) es suficientemente efectiva para generar un efecto fungicida frente al hongo B. cinérea.

Adicionalmente, estos resultados revelaron, el efecto sinérgico entre QoLMW y T el cual es incrementado cuando las soluciones son nanoparticuladas, concordando con lo observado previamente en los ensayos bacteriológicos.

Finalmente, todas las soluciones y dispersiones diluidas al 50% inhiben un 00% el desarrollo del micelar del hongo filamentoso.

Estos hallazgos indican que el uso de la nanotecnología imprimible puede mejorar la funcionalidad de películas elaboradas a partir de biopolímeros renovables lo que puede contribuir en el desarrollo de nuevos materiales de envasado con aplicaciones en la industria alimentaria, enfocado en extender la vida útil de frutas frescas de bajo pH y permitir la seguridad alimentaria de los consumidores. El bioenvase se fabrica a partir de películas bioactivas comestibles que se compone de quitosano de alto peso molecular o una mezcla de quitosano de alto peso molecular y extracto acuoso de proteínas de quínoa. Posteriormente, una de las caras del envase se recubre mediante impresión con una mezcla de una suspensión imprimible de nanopartículas de quitosano y quitosano timol dispersas en glicerol.

El procedimiento comprende obtener la película bioactiva comestible como una hoja de papel, el cual comprende una solución de quitosano de alto peso molecular o mezclar la solución de quitosano de alto peso molecular con el extracto acuoso de proteínas de quínoa a pH 11 , ajustar el pH a 3,5, secar a 50° C hasta peso constante. Paralelamente, se prepara una suspensión a base de nanopartículas de quitosano (de baja viscosidad) y nanopartículas de quitosano timol dispersas en glicerol, para obtener una "tinta para impresión". Finalmente, mediante sistema de inyección térmica de tinta (ITT) se imprime con dicha suspensión una cara de la hoja de papel de la película antes dicha.

Se describe en detalle el procedimiento antes indicado:

1. - El material de la matriz (o base) que compone este envase está compuesto por quitosano de alto peso molecular o una mezcla de quitosano de alto peso molecular y extracto acuoso de proteínas de quínoa extraídas a pH 11, obteniendo un material como una hoja de papel.

2. - En paralelo se preparan nanopartículas de quitosano (de bajo peso molecular) y timol con tripolifosfato de sodio dispersa en glicerol; estas nanopartículas son el ingrediente fundamental de lo que constituye una "tinta para impresión", y es a su vez constituida en forma separada del film mencionado en el punto 1. Una vez obtenida esta suspensión imprimible de nanopartículas de quitosano y quitosano timol dispersas en glicerol, se continúa a una etapa 3.

3. - Se utiliza una impresora Hewlett-Packard, modelo 4000k210 (Hewlett- Packard Inc.), la cual utiliza tecnología "drop-on-demand" (DOD), mediante sistema de inyección térmica de tinta (ITT). Para el proceso de impresión se utilizó solo cartuchos de tinta negra modificado (HP 675, cn690A), cortando la parte superior y fueron cargados con 20 mi de cada dispersión de tinta de las nanopartículas obtenidas en la etapa 2. 4.- Para la impresión de tinta nanoparticulada antimicrobíana obtenida en etapa 2 sobre las películas de Qo y Qo/EPQ (obtenida en etapa 1), se usó un cuadrado de estos films de 8,8 x 8,8 cm, sobre el cual fueron impresas las nanopartículas preparadas en la etapa 2 y cargadas en los cartuchos de impresión. El procedimiento de formación de bioenvases, comprende doblar las películas biodegradables comestibles descritas anteriormente, dejando la cara imprimible con nanopartículas hacia el interior, sellarlas y formar una bolsa. REFERENCIAS:

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