SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se engloba dentro del sector de Ia tecnología de alimentos describiendo un nuevo procedimiento de refinación física basado en Ia neutralización de los ácidos grasos libres mediante destilaciones sucesivas a alta temperatura y vacío. Concretamente describe el procedimiento de obtención, a partir de un aceite de orujo de oliva de centrifugación o decantación, de un aceite comestible con una elevada concentración en ácidos triterpénicos con aplicación directa como constituyente en Ia alimentación. Adicionalmente es también objeto de Ia invención Ia recuperación de un concentrado rico en ácidos triterpénicos, así como de otros componentes funcionales presentes en el aceite crudo, a partir de los subproductos del proceso y que pueden ser destinados a sectores tan diversos como alimentación, cosmética, energético, como fuente de compuestos de interés para Ia industria química, y farmacéutico, como preparaciones medicinales y veterinarias.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El orujo es el residuo sólido obtenido en los molinos de aceite

(almazaras), una vez las aceitunas se han sometido al proceso primario de extracción de aceite de oliva por medios mecánicos. Está compuesto mayoritariamente por los residuos sólidos procedentes de Ia pulpa, el hollejo y el hueso o semilla de las aceitunas, por aceite retenido en dichos residuos sólidos (y que no ha podido extraerse por los procedimientos mecánicos convencionales) y por agua tanto de constitución (propia de Ia aceituna) como adicionada durante el proceso de extracción de aceite (Sánchez Moral y Ruiz Méndez, 2006). El proceso tradicional para extractar este aceite y producir el denominado "aceite de orujo crudo" es utilizando hexano, hidrocarburo ligero procedente del petróleo e inmiscible con el agua. El proceso consta de dos etapas, una etapa inicial de secado del orujo hasta aproximadamente el 8% de humedad y una etapa posterior de extracción con disolvente.

Sin embargo, los aceites de orujo extraídos siguiendo este método tradicional presentan dos claros inconvenientes. En primer lugar, los aceites extraídos presentan una mayor cantidad en fosfolípidos, ceras y una importante cantidad de compuestos anómalos como, jabones y esteres etílicos. Además, cuando en el proceso de obtención del aceite de oliva virgen se ha utilizado el sistema de dos fases, el secado posterior del orujo se tiene que realizar a temperaturas muy elevadas y, debido a las condiciones tan drásticas utilizadas, el aceite de orujo crudo obtenido presenta, adicionalmente, cantidades de Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (en adelante HPAs) inusualmente altas (400-200 ppb de benzo-alfa-pireno) (León Camacho et al., 2003).

Con Ia finalidad de evitar y/o reducir Ia presencia de todos estos componentes en el aceite de orujo de oliva, una alternativa al uso de disolventes, y que evita el inicial secado del orujo, fue presentada en Ia patente de invención ES 2 048 667 (Artacho, Oleícola El Tejar, 1994). En esta patente se dio a conocer un procedimiento completamente mecánico para Ia extracción de aceite de orujo de oliva sin Ia utilización de disolventes orgánicos. Mediante Ia utilización de este procedimiento alternativo, al orujo de dos fases aún se Ie consigue extraer entre un 40-60% del aceite retenido. El procedimiento consiste en una segunda centrifugación, posterior a Ia separación inicial del aceite de oliva virgen, en una centrífuga horizontal o "decanter", del aceite de orujo, fresco o almacenado, de partida, obteniéndose Io que se denomina "aceite de repaso". Este aceite, comercialmente clasificado como "aceite de orujo crudo", destaca por presentar una mínima cantidad de HPAs, no tiene lugar su formación debido a que no hay etapa de secado, y de fosfolípidos, debido a que no se usan disolventes en su proceso de obtención. Adicionalmente, y además de reducir significativamente Ia presencia de estos compuestos, Ia principal característica del aceite de orujo de oliva resultante de Ia extracción mecánica es que contiene muy elevadas cantidades de compuestos bioactivos y funcionales de enorme interés como son, por ejemplo, los ácidos triterpénicos.

Los ácidos triterpénicos son compuestos naturales presentes en plantas y en alimentos a los que se atribuyen propiedades beneficiosas para Ia salud y, por tanto, son objeto de demanda por parte de las industrias de Ia alimentación, cosmética y farmacológica. Entre las propiedades beneficiosas atribuidas a los ácidos triterpénicos destacan sus actividades antimicrobianas y anti- hiperglucémicas (Horiuchi et al, 2007, Sato et al, 2007), anti-inflamatorias y antitumorales (Márquez-Martín et al., 2006, Braga et al., 2007, Martín et al., 2007), son factores estimulantes del crecimiento si se utilizan en dietas de truchas (Fernández-Navarro et al., 2006), y presentan efecto como protector hepático (Liu et al., 1995).

Los ácidos triterpénicos, constituyentes de Ia piel de Ia aceituna, pasan al aceite debido a los procesos hidrolíticos que tienen lugar en Ia aceituna y en el orujo. Así, no se encuentran cantidades apreciables de estos ácidos en los vírgenes extra pero sí en los aceites de orujo y en los aceites de oliva virgen con una acidez superior a 1 % (Pérez Camino y Cert., 1999). Además, está bien establecido que Ia concentración en ácidos triterpénicos aumenta con el tiempo de almacenamiento del orujo, pudiéndose alcanzar concentraciones superiores a 15 g/kg después de siete meses y siendo, oleanólico y maslínico los dos principales ácidos triterpénicos identificados. El contenido de ácido maslínico es mayor que el de ácido oleanólico en el aceite de orujo obtenido mediante centrifugación (García et al., 2008).

La idea general de que el aceite de orujo de oliva es considerado una magnifica fuente de este tipo de compuestos queda confirmada por los distintos procedimientos de obtención de ácidos triterpénicos, a partir tanto del propio orujo de oliva, sólido residual de Ia extracción del aceite de oliva (García Granados, 1998) como de los subproductos del procesamiento del aceite (Kuno, 2003) que han sido patentados recientemente.

Por otro lado, los aceites deben ser refinados para su uso como comestibles. La refinación de aceites es un proceso que tiene por objeto Ia eliminación de compuestos indeseables bien porque comunican características de color, olor y sabor no agradables al consumidor, o bien porque afectan a Ia estabilidad del producto. Estos compuestos pueden ser naturales en los aceites (como los fosfolípidos o Ia acidez libre), compuestos de degradación (peróxidos) o bien reactivos añadidos durante el proceso (sosa, tierras, etc.) (De Greyt y Kellens, 2000).

En Ia actualidad, el proceso convencional que se aplica de forma habitual al aceite de orujo de oliva es el denominado refinado químico que consta de las siguientes etapas: desgomado, neutralización, winterización, decoloración y desodorización (Antonopoulos et al., 2006). Brevemente, Ia etapa inicial del desgomado tiene como objetivo Ia eliminación de fosfolípidos mediante Ia adicción de agentes hidratantes. Posteriormente, el aceite desgomado se trata con una solución alcalina para precipitar los ácidos grasos libres como jabones y, al mismo tiempo, eliminar las trazas remanentes de fosfolípidos. Durante Ia etapa de winterización, y mediante enfriamiento y posterior filtración o centrifugación, se eliminan aquellos compuestos que precipitan a temperatura ambiente, principalmente las ceras y triglicéridos saturados presentes en el aceite neutro En Ia etapa de decoloración se eliminan pigmentos, productos de oxidación y trazas de metales. En Ia desodorización, última etapa de Ia refinación química, se eliminan los compuestos minoritarios presentes en los aceites responsables del olor y del sabor como son aldehidos, cetonas, alcoholes e hidrocarburos, obteniéndose, finalmente, un aceite con color y sabor aceptables para el consumo final (De Greyt y Kellens, 2000). El principal inconveniente que presenta Ia refinación clásica alcalina del aceite de orujo se encuentra en Ia etapa de neutralización donde el uso de sosa cáustica elimina, además de los ácidos grasos libres, los ácidos triterpénicos presentes en el aceite en forma de jabones (Servege, 1983). Métodos de neutralización alternativos, actualmente en estudio, están basados en Ia eliminación de ácidos grasos mediante Ia utilización de fluidos supercríticos (Bondioli, 1992) o bien mediante una etapa de destilación molecular (Lanzani et al., 1988).

Por todo ello, y como alternativa a Ia refinación clásica alcalina para poder obtener un aceite de orujo de oliva apto para el consumo y que además contenga todos los ácidos triterpénicos presentes inicialmente, en Ia presente invención se utiliza un procedimiento de refinación física en el que los ácidos grasos libres son, en este caso, eliminados en etapas sucesivas de destilación a vacío y a alta temperatura.

Además, mientras que Ia refinación química convencional puede necesitar hasta de seis etapas, con continuas separaciones de fases que nunca se realizan con el 100% de eficacia, el procedimiento presentado de refinación física sólo requiere de tres. Por tanto, otra ventaja adicional del proceso presentado es que, al eliminar las etapas de desgomado, neutralización con álcali, lavados y winterización, se reducen las pérdidas de aceite neutro, se obtiene un mayor rendimiento final del proceso y, paralelamente, se reduce Ia polución debida a las aguas jabonosas.

Otra ventaja del procedimiento de refinación física presentado es que permite recuperar subproductos de gran calidad. Por una parte, Ia filtración inicial del aceite permite separar los ácidos triterpénicos insolubles en el aceite y obtener un concentrado con más de un 50% de pureza y por otra parte, los subproductos provenientes de las distintas destilaciones del proceso de refinación física constituyen, por si mismos, una buena materia prima para Ia obtención de compuestos de elevado valor añadido. Como ejemplo de estos subproductos, durante el proceso objeto de Ia patente además del aceite de orujo de oliva final, concentrado en ácidos triterpénicos, se obtienen no sólo los ácidos grasos libres sino también cantidades apreciables de fitosteroles, hidrocarburos y tocoferoles, que son objeto de una intensa actividad investigadora desde hace varias décadas.

Por tanto, Ia presente invención se basa en un nuevo procedimiento de refinación física donde, utilizando como materia prima de partida aceite de orujo de oliva obtenido mediante centrifugación o decantación, Ia disminución de los ácidos grasos libres se produce mediante etapas de destilación controladas evitando Ia utilización de compuestos químicos como el ácido fosfórico e hidróxido de sodio durante el proceso. Esto permite mantener en el aceite final los ácidos triterpénicos de menor volatilidad, obteniéndose de esta manera un aceite apto para el consumo enriquecido en los ácidos triterpénicos presentes en el orujo inicial y, adicionalmente, diversas fracciones y concentrados enriquecidos en ácidos triterpénicos, esteres metílicos y etílicos, esteróles o escualeno de enorme interés industrial y médico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Descripción breve

En Ia presente invención se describe un proceso de refinación que permite obtener, por primera vez, un aceite de orujo de oliva refinado, rico en ácidos triterpénicos propios del aceite y apto para el consumo. Para ello, se presenta un procedimiento de refinación física que, utilizando como partida el producto obtenido de filtrar un aceite de orujo de oliva obtenido mediante centrifugación o decantación, está basado en Ia eliminación de los ácidos grasos libres presentes mediante destilación, en etapas controladas, del aceite filtrado y decolorado. Adicionalmente, el procedimiento de refinación presentado, permite el aprovechamiento de todos los subproductos de alto valor añadido generados durante el proceso. Por tanto, un primer aspecto de Ia presente invención Io constituye el procedimiento de filtración, etapa a) de Ia figura 1 , de un aceite de orujo de oliva obtenido mediante centrifugación o decantación caracterizado porque Ia filtración del aceite de orujo de oliva crudo de partida se lleva a cabo a través de filtros de entre 20-0,1 mieras de luz, a temperaturas superiores a Ia ambiente e inferior a 70° C, preferentemente entre 35-45° C.

Un segundo aspecto de Ia invención Io constituye el proceso de refinación para eliminar los ácidos grasos libres presentes en el aceite de orujo de oliva filtrado obtenido en Ia etapa anterior que se lleva a cabo mediante sucesivas destilaciones controladas, no produciéndose las etapas de desgomado, neutralización alcalina, lavados y winterización establecidas en Ia refinación química tradicional, con Ia finalidad de mantener en el aceite final los ácidos triterpénicos, de menor volatilidad, presentes y que comprende las siguientes etapas (Figura 1 ):

b.- decoloración, mediante Ia adición de Ia cantidad adecuada de coadyuvantes tecnológicos, preferentemente tierra decolorante activada (0.5-2%), sílice amorfa (trisyl) (0.1-0.5%) y carbón activo (0.05 y 0.2%), del aceite filtrado obtenido en Ia etapa anterior (a). Para el proceso, el aceite filtrado de partida es desgasificado y calentado hasta Ia temperatura normal de decoloración, entre 80 y 120° C. A continuación se Ie adicionan los coadyuvantes tecnológicos necesarios manteniéndose en agitación durante un máximo de 30 minutos en unas condiciones de presión inferiores a 70 mbar, preferentemente 40 mbar. Finalmente, se realiza un proceso de filtración para retirar los coadyuvantes tecnológicos añadidos;

c- destilación de los ácidos grasos libres. En una primera destilación (d ), el aceite decolorado producto obtenido en el apartado (b) se somete a una destilación a temperatura inferior a 200° C y vacío inferior a 10 mbar, en un destilador tipo capa fina con o sin arrastre de vapor o nitrógeno, obteniéndose como subproducto se obtiene un destilado [2]. Mediante una segunda destilación (c2) a temperatura inferior a 250° C y vacío inferior a 5 mbar, se eliminan los ácidos grasos libres residuales en el aceite producto del tratamiento (d ), obteniéndose adicionalmente el destilado [3],

d.- desodorización y estabilización del aceite obtenido en el paso (c) mediante destilación a vacío inferior a 3 mbar y a baja temperatura, inferior a 220° C, con arrastre de vapor, obteniéndose un aceite [4] con un contenido en ácidos triterpénicos superior a 150 ppm apto para el consumo;

e.- obtención de una fracción más volátil [5] y un concentrado en materia insaponificable [6] como subproductos de destilación del producto obtenido en el apartado (c), destilado [3], mediante una tercera destilación, molecular o en recorrido corto de alto vacío (entre 0.1 y 0,001 mbar) y a temperatura inferior a 215 ⁰ C.

Un tercer aspecto de Ia invención Io constituye un procedimiento de extracción sólido-líquido, etapa f), con disolventes orgánicos, preferentemente hexano y etanol, del producto retenido en Ia etapa a) de filtración.

Un cuarto aspecto de Ia invención Io constituye un extracto concentrado

[1] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a) y f), y porque presenta una concentración de ácidos triterpénicos superior al 20%, normalmente superior al 50%, y donde Ia proporción de ácido maslínico es mayor que Ia de ácido oleanólico.

Un quinto aspecto de Ia invención Io constituye un destilado [2] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a), b) y d ), y porque presenta una concentración de ácidos grasos libres mayor del 60% y de esteres etílicos totales mayor del 10%.

Un sexto aspecto de Ia invención Io constituye un destilado [3] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a), b), d ) y c2), y porque presenta una concentración de ácidos grasos libres mayor del 30% y de esteres etílicos totales mayor del 5%.

Un séptimo aspecto de Ia invención Io constituye un aceite de orujo de oliva refinado [4] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a), b), d ), c2) y d), y porque presenta una concentración de ácidos triterpénicos, preferentemente maslínico y oleanólico, superior a 150 ppm.

Un séptimo aspecto de Ia invención Io constituye un destilado [5] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a), b), d ), c2) y e), y porque contiene, al menos, esteres de ácidos grasos con alcoholes lineales de cadena corta, escualeno y ácidos grasos libres.

Un octavo aspecto de Ia invención Io constituye un concentrado [6] caracterizado porque se obtiene por aplicación de las etapas a), b), d ), c2) y e), y porque presenta un contenido en materia insaponificable superior al 15%, constituida mayoritariamente por esteróles.

Descripción Detallada

La presente invención se enfrenta al problema de ofrecer un aceite de orujo refinado apto para el consumo, que conserve el máximo de los ácidos triterpénicos presentes de partida en el aceite de orujo de oliva obtenido mediante centrifugación. Éste aceite de orujo de oliva rico en ácidos triterpénicos se obtiene mediante un procedimiento de refinación física que evita Ia utilización de compuestos químicos como el ácido fosfórico e hidróxido de sodio durante el proceso.

El proceso presentado en esta patente comienza con una etapa inicial de filtración (a) del aceite de orujo de oliva obtenido mecánicamente. La filtración del aceite se lleva a cabo secuencialmente a través de filtros de 20 mieras, 10 mieras, 5 mieras, 1 miera y 0,1 miera, ya que el aceite de orujo obtenido mediante centrifugación contiene una cantidad importante de sólidos en suspensión y si Ia malla es pequeña inicialmente, los filtros se colapsan impidiendo el flujo de aceite, por Io que se colocan filtros en serie disminuyendo en cada uno el tamaño de luz. Los sólidos retenidos están constituidos mayoritariamente por ácidos triterpénicos insolubles en el aceite debido a su elevada concentración y baja solubilidad.

La filtración se realiza a temperaturas superiores a Ia ambiente e inferior a 70° C, para disminuir Ia viscosidad del aceite y aumentar su fluidez sin solubilizar los ácidos triterpénicos a separar. El residuo sólido en un subproducto rico en ácidos triterpénicos y el filtrado es un aceite de orujo transparente que se somete posteriormente al proceso de refinación que comienza con una etapa de decoloración.

Posteriormente, y durante Ia etapa de decoloración (b), se eliminan aquellos compuestos responsables del color de los aceites como son los pigmentos, clorofilas y carotenos principalmente, y compuestos de degradación que tienen grupos cromóforos como cadenas hidrocarbonadas con dobles enlaces conjugados. La decoloración se realiza adicionando tierras decolorantes (silicatos alumínico-magnésicos) activadas sobre cuyos centros activos se adsorben los compuestos de interés. Sustancias polares como los jabones y fosfolípidos colapsan los centros activos de las tierras y no les permite actuar eficazmente frente las clorofilas y demás compuestos cromóforos, por Io cual es de crucial importancia que se realice de manera eficaz Ia eliminación utilizando sílices amorfas como Trisyl (Grace) para lograr el objetivo de esta etapa y de las etapas de destilación posteriores. Durante esta etapa, se recomienda también Ia utilización de carbón activo para eliminar compuestos oxidados responsables del color pardo presente en el aceite de orujo, y contaminantes como los hidrocarburos aromáticos policíclicos.

El tratamiento se realiza a vacío inferior a 70 mbar siendo el procedimiento habitual el siguiente: el aceite se desgasifica y se calienta hasta Ia temperatura de trabajo, entre 80 y 120° C. A continuación se Ie adicionan los coadyuvantes tecnológicos necesarios y se mantiene con agitación un máximo de 30 minutos. Posteriormente, el aceite se filtra para retirar los coadyuvantes añadidos.

El aceite decolorado obtenido se somete a destilación (c) cuyo objetivo es eliminar los ácidos grasos libres del aceite, hasta que su contenido sea inferior a 0.5%. La destilación aprovecha las diferencias de volatilidad y puntos de ebullición de los componentes líquidos a separar y depende de variables como Ia temperatura, presión, composición de Ia mezcla y equilibrio liquido- vapor. Si disminuye Ia presión de operación aumenta Ia volatilidad de los compuestos y se produce Ia ebullición a temperaturas más bajas Io que evita que se degraden compuestos termolábiles.

Para el desarrollo del proceso descrito en esta patente se utilizan preferentemente destiladores de capa fina, muy adecuados para Ia eliminación de los ácidos grasos libres, que son en este caso los compuestos volátiles mayoritarios que se eliminan por Ia parte superior de Ia columna.

En Ia práctica las destilaciones se efectúan en varias etapas, variando Ia temperatura conforme varía Ia composición del líquido en ebullición. En este caso se han aplicado dos etapas de destilación. La primera destilación (d ) permite Ia obtención de un aceite de baja acidez (<3% expresada como ácido oleico) y de un destilado [2] que contiene como compuestos mayoritarios ácidos grasos libres, esteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta como son etílico y metílico y un bajo contenido en materia insaponificable, siendo susceptible de aplicación en el campo de Ia oleoquímica y bio-energía. La destilación se realiza a temperatura inferior a 200° C y vacío inferior a 10 mbar, en un destilador tipo capa fina obteniéndose un aceite con acidez todavía superior a 0.5% (expresada como porcentaje de ácido oleico). La segunda destilación (c2) del aceite tiene como objeto completar Ia separación de los ácidos grasos libres. El producto obtenido en el apartado (d ) se somete a destilación a temperatura de inferior a 250° C y vacío inferior a 5 mbar en un destilador tipo capa fina, con o sin arrastre de vapor o nitrógeno. En esta destilación se obtiene un aceite de baja acidez (<0.5%, expresada como ácido oleico) y un destilado [3] concentrado en ácidos grasos libres, esteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta, e insaponificables, particularmente escualeno y esteróles.

Finalmente, se completa el proceso con Ia etapa de desodorización clásica del proceso de refinación (d). Es un proceso de destilación a vacío y a alta temperatura, que se lleva a cabo con arrastre con vapor de agua, aunque como alternativa figura el uso del nitrógeno (Huesa y Dobarganes, 1990). Las temperaturas utilizadas para Ia desodorización se encuentran comprendidas entre 180° C y 270° C. Estos límites de temperatura vienen establecidos por las reacciones químicas de descomposición e hidrólisis que se producen durante esta etapa (Sjoberg, 1991 ).

El tiempo mínimo requerido depende normalmente del grado de decoloración térmica que se desea obtener. La cantidad de volátiles generados en esta etapa es inferior al 0.1 % de Ia cantidad de aceite sometida al tratamiento.

Se obtiene un aceite [4] con un contenido en ácidos triterpénicos superior a 150 ppm apto para el consumo, objeto de esta patente.

Aprovechamiento de los subproductos

1 -Aprovechamiento de los subproductos de Ia filtración: obtención del concentrado de ácidos triterpénicos Para separar el concentrado [1] de los medios filtrantes sólidos, se procede a una extracción sólido-líquido, etapa f) de Ia figura 1. El procedimiento se puede realizar tanto en continuo como en discontinuo, o bien por enriquecimiento progresivo de Ia miscela en sistemas combinados [ej. extractores sólidos discontinuos y sistema continuo de enriquecimiento del disolvente].

Cuando los medios filtrantes utilizados son fabricados en celulosa, se requieren disolventes orgánicos no polares que no solubilizan los ácidos triterpénicos, preferentemente hexano, para retirar el aceite ocluido en los filtros, fundamentalmente triglicéridos y ceras, y a continuación un disolvente polar, preferentemente etanol a 60-80° C para solubilizar y separar los ácidos triterpénicos.

Si los filtros utilizados son metálicos o de porcelana basta este paso de extracción de ácidos triterpénicos con etanol, ya que no queda aceite retenido.

A continuación se procede a Ia clarificación, mediante filtración o centrifugación, de los extractos y posteriormente a Ia concentración del clarificado mediante evaporación a vacío del disolvente, hasta conseguir un volumen del extracto bruto comprendido entre el 20 % y el 50 % del volumen de macerado inicial. Por último, también se puede proceder a un secado a vacío del extracto hasta obtenerlo en forma de polvo.

Siempre se obtiene mayor proporción de ácido maslínico por ser más insoluble en el aceite.

2-Aprovechamiento de los subproductos de Ia destilación: obtención del concentrado bioactivo

Del destilado [3] obtenido en Ia etapa (c2) y mediante una tercera destilación se obtiene Ia fracción más volátil [5] y un concentrado en materia insaponificable [6]. En este proceso se utiliza una destilación en recorrido corto de alto vacío (0.1-0,001 mbar), o una destilación molecular, con temperaturas de trabajo inferiores a 215° C, obteniéndose fracciones que están enriquecidas en determinados compuestos bioactivos. Las condiciones de operación se ajustan según Ia calidad del destilado [3] obtenido.

a) Ia fracción más volátil, denominada destilado [5], se caracteriza por un contenido en esteres de ácidos grasos con alcoholes lineales de cadena corta, escualeno y ácidos grasos libres, en proporciones variables.

b) Ia fracción menos volátil, denominada concentrado [6], tiene un contenido en materia insaponificable superior al 15%, constituida mayoritariamente por escualeno y esteróles, y Presenta un gran potencial industrial, con aplicación inmediata en alimentación humana y animal, así como en farmacología y cosmética, sea en su forma integra, o concentrado o diluido en su totalidad o fracciones, o eliminando fracciones, que serán objeto de reivindicaciones en Ia formulación de Ia patente.

Ambas fracciones pueden ser sometidas posteriormente a tratamientos para el aislamiento de los distintos compuestos.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Las principales características del proceso pueden materializarse de varias formas, sin que ello menoscabe el alcance de Ia invención

Etapa 1.- Obtención de aceite de orujo de oliva con alto contenido en ácidos triterpénicos apto para el consumo.

1.1 Filtración. En primer lugar, se llevó a cabo Ia filtración del aceite de orujo de oliva crudo obtenido por centrifugación. La filtración se realizó a 4O ⁰ C usando secuencialmente filtros de celulosa de diámetro de poro desdecendente: 20 mieras, 10 mieras, 5 mieras, 1 miera y 0,1 mieras. La Tabla 1 resume las características del aceite inicial y el aceite filtrado.

Tabla 1- Características del aceite inicial y después de ser sometido a filtración

1.2 Decoloración. Al aceite filtrado obtenido, se añadió un 2% en peso de tierra decolorante, que contiene un 0.2% de carbón activo (Tonsil 4121 FF, SüdChemie, Alemania), y 0,1 % TRISYL (GRACE, EEUU), y se elevó Ia temperatura hasta 110° C, manteniéndose en estas condiciones 20 minutos a vacío de 40 mbar. Seguidamente, el aceite se filtró en un filtro prensa de laboratorio con placas de Teflón de 10x10 cm y filtro de papel.

1.3 Primera destilación. El aceite decolorado se sometió a una primera destilación de esteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta y ácidos grasos libres, a temperatura de inferior a 190° C y vacío de 4.5 mbar en un destilador tipo capa fina sin arrastre de vapor o nitrógeno. Se obtuvo un aceite con acidez 2.6% de ácido oléico y un destilado [2].

1.4 Segunda destilación. Se procedió a una segunda destilación del aceite producto del tratamiento anterior para separar los restantes ácidos grasos libres, a temperatura de 230° C y vacío de 0.5 mbar en un destilador tipo capa fina sin arrastre de vapor o nitrógeno. (Tabla 2). Se obtuvo un aceite de baja acidez, 0.5% de ácido oleico, y un destilado [3] concentrado en ácidos grasos libres, esteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta, y materia insaponificable, particularmente escualeno y esteróles.

Tabla 2.- Principales características del aceite antes y después de ser sometidos a sucesivas destilaciones

Principales características físico -químicas de los aceites

Acidez Insaponificable Rancimat Tocoferol

Cond. Operación (% ác. oleico) (%) (h) (ppm)

Decolorado 10.15 2.45 20.0 339 1 ^a DESTILACIÓN 19O ⁰ C, 4.5 mbar 2.60 1.58 19.3 153

2 ^a DESTILACIÓN 23O ⁰ C, 0.5 mbar 0.45 1.50 23.5 156 1.5 Desodorización y estabilización. Se llevó a cabo Ia desodorización y estabilización del aceite obtenido en el tratamiento anterior mediante destilación a vacío de 2 mbar y a una temperatura de 215° C, con arrastre de vapor. Se obtuvo un aceite [4] con un contenido en ácidos triterpénicos de 900 ppm y apto para el consumo, cuyas características se muestran en Ia siguiente Tabla 3.

Tabla 3. Características del aceite de orujo de oliva con alto contenido en ácidos triterpénicos apto para el consumo

Etapa 2.- Aprovechamiento de los subproductos

2.1. Proceso de obtención del concentrado en ácidos triterpénicos.

El proceso de obtención del concentrado de ácidos triterpénicos se realizó utilizando para Ia extracción sólido-líquido un extractor sohxlet de 2kg de capacidad del recipiente de sólidos y 20 I de capacidad del matraz de líquidos.

En primer lugar, los filtros de celulosa de 10 mieras, 5 mieras, 1 miera y 0.1 mieras se introdujeron en el recipiente para sólidos y se sometió primero a una extracción con hexano de los compuestos no polares, durante 4 horas. El extracto obtenido arrastraba compuestos insolubles en hexano por Io que a continuación se procedió a Ia clarificación, mediante filtración o centrifugación del extracto, y se consiguió un sólido que se une al concentrado obtenido en el siguiente paso

A continuación, los compuestos retenidos en los filtros se extrajeron con etanol durante 8 horas y el extracto obtenido se sometió a un secado a vacío hasta obtener un concentrado en forma de polvo.

Se obtuvo un concentrado [1] con un 60 % de ácidos terpénicos, correspondiendo el 40% al ácido maslínico y el 20% al ácido oleanólico.

2.2. Proceso de obtención del concentrado bioactivo.

Los destilados obtenidos se caracterizaron por su contenido elevado en esteres no glicerídicos de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta como son etílico y metílico superior al 10% y un contenido en ácidos grasos libres próximo al 50%. La fracción Destilado [2] se compone principalmente de ácidos grasos libres (73,33 %), y esteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena corta (16,85 %), y una pequeña proporción de materia Insaponificable (0,88 %).

Del destilado [3] se obtuvo Ia fracción más volátil, destilado [5], y una fracción menos volátil, concentrado en materia insaponificable [6]. En este proceso se utilizó una destilación en recorrido corto de alto vacío (0.01 mbar) a 210° C obteniéndose dos fracciones que están enriquecidas en determinados principios activos (Tabla 4). La fracción insaponificable presente en Ia fracción más volátil está constituida fundamental mente por escualeno mientras que Ia menos volátil está enriquecida en esteróles.

Tabla 4. Composición del destilado (3) y de las fracciones obtenidas del mismo

Referencias

- Antonopoulos, K., Valet, N., Spiratos,D., Siragakis, G. (2006) Procesado de aceite de oliva y aceite de orujo. Grasas y Aceites 57, 56-67.

- Artacho, A (1994) Procedimiento para Ia extracción de aceite de orujo de oliva sin utilización de disolventes orgánicos. Patente N ⁰ ES2048667.

- Bondioli, P.; Mariani, C; Lanzani, A.; Fedeli, E.; Mossa, A.; Muller, A. (1992) Lampante olive oil refining with supercritical carbón dioxide. J. Am. OiI Chem. Soc. 69, 477-480. - Braga, F.; Ayres-Saraiva, D.; Gatas, C. R.; Capella, M. A. M. (2007) Oleanolic acid inhibits the activity of the multidrug resistance protein ABCC1 (MRP1 ) but not of the ABCB1 (p-glycoprotein): Posible use in cáncer therapy. Cáncer Letters 248, 147-152.

- De Greyt, W.; Kellens, M. (2000) Refining Practice. In Edible oil Processing. W. Hamm and R. J. Hamilton (Editors). - Sheffield Academic Press, Sheffield, Inglaterra pp. 90-105.

- Fernández-Navarro, M.; Peragón, J.; Esteban, F. J.; Higuera, M.; Lupiáñez, A. (2006) Maslinic acid as a feed additive to stimulate growth and hepatic protein-turnover rates in rainbow trout (Onchorhynchus mykiss). Comparative Biochem. Physiol. Part C. 144, 130-140.

- García, A.; Brenes, M.; Dobarganes, C; Romero, C; Ruiz-Méndez, M.V. (2008) "Enrichment of pomace olive oil in triterpenic acids during storage of "Alpeorujo" olive paste" Eur. J. Lipid Sci. Tech.,. Aceptado para su publicación

- García-Granados, A.; Martínez, A.; Parra, A.; Rivas, F. (1998) PCT Int. Appl. WO 043331/1998 (Chem. Abstr. 1998, 128, 179706).

- Horiuchi, K.; Shiota, S.; Hatano, T.; Yoshida, T.; Kuroda, T.; Tsuchiya, T. (2007) Antimicrobial activity of oleanolic acid from Salvia officinalis and related compounds on vancomycin-resistant enterococci (VRE). Biol. Pharm. BuII. 30, 1147-1149.

- Huesa, J.; Dobarganes, M.C. (1990) Patente ES 2.013.206. Chem. Abstr., 113, 1744-1764. - Kuno, N.; Shinohara, G. (2003) Method for the preparation of oleanolic acid and/or maslinic acid. Patente N ⁰ US 0171613 Al

- Lanzani, A.; Bondioli P.; Allevi C; Baretteau P.; Bertini CG. (1988) Un impianto di distillazione con caratteristiche innovative nella tecnología di raffinazione di olio di sansa Riv. Ital. Sostanze Grasse 65, 439-443

- León-Camacho, M.; Viera-Alcaide, I.; Ruiz-Méndez, M.V. (2003) Elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons by bleaching of olive pomace oil. Eur. J. Lipid Sci. Tech. 105, 9-16

- Liu, J.; Liu, Y.; Parkinson, A.; Klaassen C. D. (1995) Effect of oleanolic acid on hepatic toxicant-activating and detoxifying systems in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 257, 768-

- Márquez-Martín, A.; Puerta, R.; Fernández-Arche, A.; Ruiz-Gutiérrez, V.; Yaqoob P. (2006). Modulation of cytokine secretion by pentacyclic triterpenes from olive pomace oil in human mononuclear cells. Cytokine 36, 211-217.

- Martín, R.; Carvalho, J.; Ibeas, E.; Hernández, M.; Ruiz-Gutiérrez, V.; Nieto, M. L. (2007) Acidic triterpenes compromise growth and survival of astrocytoma cell lines by regulating reactive oxygen species accumulation. Cáncer Res. 67, 3741-3751.

- Pérez-Camino, M. C; Cert, A. (1999) Quantitative determination of hydroxyl pentacyclic triterpene acids in vegetable oil. J. Agrie. Food Chem. 47, 1558- 1562. - Sánchez-Moral, P.; Ruiz-Méndez M.V. (2006) Obtención de aceite de orujo. Grasas y Aceites 57, 47-55.

- Sato, H.; Genet, C; Strehle, A.; Thomas, C; Lobstein, A.; Wagner, A.; Mioskowski, C; Auwerx, J.; Saladin, R. (2007) Anti-hyperglycemic activity of a

TGR5 agonist isolated from Olea europaea. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 362, 793-798.

- Servege, A. (1983) Difficulties in Physical Refining of Olive oil due to presence of Triterpene "oleanolic acid. J Am OiI Chem Soc. 60, 584-587.

- Sjoberg, P. (1991 ) Deodorization technology. Lipid Technol., 3, 52-57.