[0001] 本发明涉及工业生物技术领域， 尤其是涉及一种特基拉芽孢杆菌以及由其制备 而成的复合菌剂在水产养殖及废水治理中的应 用。

背景技术

[0002] 利用微生态制剂进行水质处理或改良， 维护良好生态环境， 是现代生物工程技 术与实际应用有效结合的一个典型。 但由于各种微生物的效用差别较大， 如何 用最有效和最少量的微生物来达到优异的处理 效果， 是各科研机构、 学校和企 业进行不断研究和幵发的方向。

[0003] 现在水产养殖中的残余饵料以及养殖对象的排 泄物对养殖环境造成严重影响， 许多城市的河道， 也因为人类的生活垃圾污水排放， 导致河道有机质富集， 最 终造成河水发黑等现象。 利用各种不同功效微生物的自身特性， 幵发有效的微 生物种群组合来对养殖水体以及城市河道中的 多余有机质进行处理， 对于未来 的水质改良和处理， 具有十分积极的意义。

技术问题

[0004] 针对现有技术存在的上述问题， 本申请人提供了一株高效底改芽孢杆菌及其制 成的复合底改菌剂和应用。 本发明所提供的特基拉芽孢杆菌具有高效水体 底部 净化能力， 能快速分解和降低池底污泥， 有效改善环境水体的黑水、 浑水现象 ， 可以用于水产养殖的水体环境处理和城市废水 治理中。

问题的解决方案

技术解决方案

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 本申请人提供了一株特基拉芽孢杆菌 Bacillus tequile is) ZSGD5 , 保藏编号 为 CCTCC NO: M 2014004 , 保藏日期为 2014年 1月 6日， 保藏地点为中国典型培 养物保藏中心， 中国， 武汉， 武汉大学。

[0007] 本申请人提供了一种复合微生态芽孢杆菌制剂 ， 由以下菌种组成复合菌剂： [0008] 特基拉芽孢杆菌、 第一类枯草芽孢杆菌、 第二类枯草芽孢杆菌、 第一类地衣芽 孢杆菌、 第二类地衣芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌；

[0009] 所述特基拉芽孢杆菌的保藏编号为 CCTCC NO: M 2014004、 第一类枯草芽孢 杆菌的保藏编号为 CCCTC NO: M

2011443、 第一类地衣芽孢杆菌的保藏编号为 CCTCC NO: M 2012458 , 保藏地 点均为中国典型培养物保藏中心； 其余菌种为市售产品。

[0010] 所述复合微生态芽孢杆菌制剂的有效活菌数为 5.0x10 ⁸ 〜2.0xl0 ¹⁰ cfu/g, 使用量 为每亩使用 20-100 g， 各菌种的组成如下：

[0011] 菌种 每克产品对应菌种活菌数， 单位为 cfu/g

[0012] 特基拉芽孢杆菌 1.0x10 ⁸ 〜5.0xl0 ⁹

[0013] 第一类枯草芽孢杆菌 1.0x10 ⁸ 〜5.0xl0 ⁹

[0014] 第二类枯草芽孢杆菌 1.0x10 ⁸ 〜5.0xl0 ⁹

[0015] 第一类地衣芽孢杆菌 5.0x10 ⁷ 〜1.0xl0 ⁹

[0016] 第二类地衣芽孢杆菌 0.8x10 ⁷ 〜5.0xl0 ⁸

[0017] 短小芽孢杆菌 0.2x10 ⁷ 〜1.0xl0 ⁸

[0018] 巨大芽孢杆菌 5.0x10 ⁷ 〜 1.0x10 ⁹

[0019] 总活菌数 5.0x10 ⁸ 〜2xl0 ¹⁰ 。

[0020] 本申请人提供了一种复合微生态芽孢杆菌制剂 的应用， 用于水产养殖对象的池 底水质底改中， 可以有效控制养殖水体中饵料残澄以及养殖对 象排泄物造成的 污染， 保持溶氧的增长、 抑制池底青苔， 降低氨氮、 亚硝酸盐、 硫化氢的量。

[0021] 本申请人提供了一种复合微生态芽孢杆菌制剂 的应用， 用于城市河道黑水、 浑 水的治理中， 可以改善河道死黑水的状态， 降低河道的河水 COD为 40%。

[0022] 特基拉芽孢杆菌的主要生物学特征为： 革兰氏阳性细菌， 杆状， 大小 0.7-0.8 umx2-3 urn, 无荚膜， 有鞭毛， 能运动。

[0023] 特基拉芽孢杆菌菌株的来源为水产养殖池塘的 底泥， 筛选方法为： 将从水产养 殖池塘中取得的底泥加入无菌生理盐水， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20 min， 吸取上清液， 加入其他污染河流底泥为基质的液体中， 振荡 6 hr， 将富集 液稀释 10000倍后， 用涂布棒涂布到该污染河流底泥为唯一基质的 固体平板中， 在 37°C恒温培养箱中培养 40~48 hr， 得到在平板上生长的菌株， 扩培后进行筛选 [0024] 特基拉芽孢杆菌菌株的培养方法为：

[0025] ( 1) 种子培养基配方： 蛋白胨 10 g/l， 氯化钠 10 g/l， 酵母粉 5 g/l， 用蒸馏水配 制， 全部溶解后调节 _P H 7.5~7.6， 固体培养基在调节 pH后在往培养基中添加 15 g/1琼脂粉， 上述配制好的溶液在 121°C下灭菌 20min。

[0026] (2) 从平板上挑取 1环芽孢杆菌移入灭菌的试管固体斜面培养基� �， 37°C培养 18~24hr。

[0027] (3) 将上述长好的菌株斜面在 95~100°C水浴中热处理 5~10min， 取出迅速冷却 至室温， 挑取 1环接种于装有 50ml液体培养基的 500ml三角瓶中， 在 37

°C下摇床 150 rpm培养 18~24 hr， 得到的菌液中活菌数为 1x10 ⁷ ~3xl0 ¹⁽⁾ 个 /ml。

[0028] (4) 该菌株能在以硝酸盐或亚硝酸盐为单一氮源的 培养基中良好生长， 单一 硝化培养基为： 葡萄糖 20 g/l， 硝酸钠 2 g/1 (或者亚硝酸钠 2 g/1) ， 磷酸二氢钾 2 g/1, 硫酸镁 0.5 g/1， pH 6.0 6.2。

[0029] 特基拉芽孢杆菌菌株的扩大培养方法为：

[0030] 扩大培养基配方： 葡萄糖 20 g/l， 酵母粉 10 g/l， 蛋白胨 15 g/l， 磷酸二氢钾 5 g/1 ， 硫酸镁 l g/l， pH 7.0。 扩大培养方法： 在液体发酵罐中进行液体发酵， 过程维 持通气量 l:2 vvm， 搅拌 200 rpm， 压力 l kg/m ²

， 用 NaOH或者 HC1溶液控制过程 pH 6.0。

[0031] 在上述条件下培养 24~48小吋后， 可以得到菌种的芽孢体， 芽孢占活菌总数的 9 5%以上， 发酵液中的总芽孢数可以达到 1χ10 ⁹ ~5χ10 ¹⁽ ^ήι/ηι1。 发酵液经过离心 、 板框过滤等手段收集菌体， 再将菌体经过喷雾干燥即可获得所需的芽孢。 将 获得的芽孢体菌种， 用作配制本发明中复合底改菌剂的菌种原料。

发明的有益效果

有益效果

[0032] 本发明有益的技术效果在于：

[0033] 本发明所制备的微生态复合菌剂， 经过高温造粒， 仍然能保持内部添加菌种的 高效性， 在不同的养殖水体和城市河道来源水体的试验 中， 该复合微生态菌剂 菌表现出了良好的功效性， 以及内部添加微生物菌剂的高存活性。

[0034] 本发明所制备的微生态制剂菌种， 能迅速分解处理对象水体底部的有机质 （养 殖水体的饵料、 粪便等） 使其彻底转化， 去除底部臭味； 防止池底发黑、 发臭 ； 控制池中的硫化氧、 氨氮等有毒有害物质； 预防黄泥水、 酱油水的发生、 红 水、 浓水、 浊水， 对青苔、 蓝藻等有害藻类的生长有明显的抑制作用， 使对象 水体维持良好的生态环境。

本发明的实施方式

[0035] 1、 高效底改菌种的筛选

[0036] 从水产养殖池塘的底泥及水体中分离得到适合 水质改良的微生物菌株， 通过对 菌株进行形态学观察、 生理生化实验、 16S rDNA分析等手段有效而准确的确定 菌种的属种。

[0037] 将从江苏泰州姜堰某螃蟹养殖池塘中取得的底 泥样品称取 2 g， 加入 98 ml无菌 生理盐水， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20 min， 吸取上清液 1 ml加入取自无 锡市某污染河底泥为基质的液体中， 振荡 6 hr， 将富集液稀释 10000倍后， 用涂 布棒涂布到该河流底泥为唯一基质的固体平板 中， 在 37°C恒温培养箱中培养 40~ 48 hr, 得到三株在平板上生长的菌株， 编号为 ZSGD-1 , ZSGD-5 , ZSGD-9 , 并 挑取单菌落进行扩陪， 后利用扩陪得到的菌体进行污染河水的处理测 试试验， 挑选出效果较好的其中一株菌种 ZSGD-5 , 经过 16S rDNA及生理生化性能的鉴定 和测试， 该菌种属于特基拉芽孢杆菌， 该芽孢杆菌能在低氧浓度下快速生长消 耗污染水体的营养物质。

[0038] n-1的分类命名为特基拉芽孢杆菌 Bacillus tequilemis) ， 于 2014年 1月 6日保 藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2014004。

[0039] 2、 菌株扩大培养及产品收集

[0040] 按照前面所述菌株的培养和扩大培养方法， 将斜面的特基拉芽孢杆菌 CCTCC M 2014004进行扩培， 得到一定浓度的枯草芽孢杆菌的孢子液， 再将其经过离心 和喷雾干燥等手段， 得到芽孢粉剂产品。

[0041] 3、 复合底改菌剂 （即复合微生态芽孢杆菌制剂） 制作方法 [0042] 将筛选到的特基拉芽孢杆菌以及其它有效菌株 按照各自固体菌粉的活菌数配比 比例混合， 其中各个有效菌株固体菌粉的活菌添加比例 （按照占产品的总活菌 数计算） 如下：

[0043] 菌种 每克产品对应菌种活菌数 （cfu/g)

[0044] 特基拉芽孢杆菌 （CCCTC M 2014004) 1.0x10 ⁹

[0045] 第一类枯草芽孢杆菌 （CCCTC M 2011443) 1.0x10 ⁹

[0046] 第二类枯草芽孢杆菌 1.0x10 ⁹

[0047] 第一类地衣芽孢杆菌 （CCTCC M 2012458) 1.0x10 ⁸

[0048] 第二类地衣芽孢杆菌 0.8xl0 ⁸

[0049] 短小芽孢杆菌 0.2xl0 ⁸

[0050] 巨大芽孢杆菌 1.0x10 ⁸

[0051] 总活菌数 5.0X10 ⁹

[0052] 上述保藏编号均为中国典型培养物保藏中心保 藏， 而第二类枯草芽孢杆菌、 第 二类地衣芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌均是由泰州绿圣元生物科技 有限公司提供。

[0053] 上述各菌粉按照既定比例混合均匀后， 添加载体 （麸皮粉、 葡萄糖、 玉米粉、 米糠粉， 沸石粉、 硅藻土， 活性炭、 绢云母粉） 中的一种或者几种补充到总重 量的 100% (以芽孢杆菌作为有效成分， 加入载体使产品总重量满足最终的活菌 数达到 5.0x10 9 _C f _u /g) ， 并进行造粒， 得到菌剂颗粒， 然后投入使用。

[0054] 各个有效单菌粉按照上述方法严格配制， 即可得到本发明所述的复合微生物底 改菌剂， 又称为复合微生态芽孢杆菌制剂。 该产品用于对各种有机质污染水体 进行有效底改， 使底泥从黑变黄， 可以降低养殖水体池底残饵、 粪便， 有效去 除池底的氨氮、 亚硝酸盐、 硫化氢等物质。

[0055] 上述整个加工过程应保证操作环境的清洁， 避免污染。 控制环境湿度在 70%以 下， 各原料水分含量低于 15%， 该产品制成后常温下保存 18个月， -18°C下保存 期限可以达到 36个月， 保质期内活菌数稳定。

[0056] 4、 检测例 1 : 复合微生态芽孢杆菌制剂用于鲫鱼养殖水体的 改性。

[0057] 水样取样： 苏州太仓某养殖池塘， 离岸 1.5m， 水面下 30cm水样， 按照 《海洋监 测规范》 进行处理。 测试吋养殖水温为 22-27°C， 对照池为不添加本复合底改菌 剂的结果。 每亩 ·米池塘中撒入 500g菌剂颗粒， 处理结果如表 1所示。

[0058] 表 1

[0059]

[XXXX

[0060] 从表 1的数据可以看到， 使用本复合菌剂， 可以有效降低水体的氨氮、 亚硝酸 盐、 总无机氮、 磷酸盐， 同吋增加水体溶解氧含量。

[0061] 5、 检测例 2: 复合微生态芽孢杆菌制剂用于河道黑水处理。

[0062] 取自无锡某河道不同位置的污染水体 2份， 分别使用本菌剂进行处理试验， 对 照组为不进行处理， 试验规模为 5L， 按照国标检测 COD。 按照重量每亩 ·米水体 加入 500g菌剂颗粒， 处理结果如表 2所示。

[0063] 表 2

[XXXX

[0064] 从表 2的数据可以看到， 使用本菌剂处理河道污水， 可以有效降低河道污水的 C

OD。