Y REUTILIZABLE

D E S C R I P C I Ó N

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto principal de Ia presente invención es un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays que se puede limpiar y volver a utilizar más de una vez.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Desde su aparición a finales de Ia década de 1980, los biochips o microarrays han permitido llevar a cabo interpretaciones cuantitativas de muchos e importantes fenómenos biológicos. Un microarray es un conjunto de spots o puntos de ensayo de pequeñas dimensiones (desde pocos nm a pocos mm) sobre un soporte plano que permite realizar muchos ensayos en paralelo, aumentando enormemente Ia velocidad y Ia capacidad de análisis respecto a sistemas de análisis en serie.

Estos elementos están diseñados para analizar el contenido proteico, las interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína- ligando, Ia presencia de mutaciones del ADN, patrones de expresión de genes, etc., de muestras biológicas complejas. Los microarrays que utilizan anticuerpos como elemento de reconocimiento se basan en diferentes tipos de ensayo:

Tipo sandwich, cuando el analito es capturado por un anticuerpo inmovilizado en el soporte y cuantificado mediante un segundo anticuerpo marcado. Tipo competitivo cuando copias del analito se inmovilizan en los spots de Ia superficie del soporte y Ia cuantificación de dicho analito se realiza indirectamente a partir de los anticuerpos marcados que se unen a dichos spots en presencia de Ia muestra que se desea analizar.

Tipo fase inversa cuando Ia muestra se adsorbe directamente en Ia superficie del soporte y el analito es reconocido por anticuerpos marcados.

En todos ellos Ia cuantificación se realiza por medio de Ia detección de una marca, que está unida a un anticuerpo. En el caso de chips de

ADN Ia marca se une a los fragmentos de ADN o ARN a analizar. Las marcas pueden ser de tipo óptico (molécula fluorescente, punto quántico, enzima cuyo producto precipita), radioactivo (radioisótopos), o electroquímico (enzima cuyo producto es electroactivo o nanopartículas electroactivas). Este último tipo de marcas tienen Ia ventaja de que permiten una instrumentación de lectura puramente eléctrica, y por Io tanto más compacta, robusta y barata que Ia de las más ampliamente utilizadas marcas fluorescentes. Existen productos en el mercado que utilizan este tipo de lectura, como por ejemplo el lector Electrasense de COMBIMATRIX (WO2008051196). La empresa Nanoident Technologies, anuncia también sistemas compactos con lectura eléctrica de microarrays basados en una matriz de fotodiodos orgánicos impresos en el mismo soporte donde se realiza el ensayo (WO2006026796).

Sin embargo, para que el uso de microarrays se extienda de forma más amplia y se pueda utilizar en los lugares en que se necesita (junto a Ia cama del paciente en un hospital o en los centro de atención primaria), los equipos deben mejorar en términos de coste, robustez, sencillez y tamaño. Estos equipos analíticos constan básicamente de dos partes diferenciadas: los microarrays sobre los que se realiza el ensayo y el dispositivo con que se realiza Ia lectura del resultado de dicho ensayo. En algunos casos también se incluyen otros complementos en el sistema, como un brazo robótico para Ia deposición de componentes de reconocimiento o muestras sobre los spots o puntos de medida del microarray (spoter), o un equipo con componentes fluídicos y reactivos para realizar el ensayo automáticamente.

Los dispositivos de lectura de tipo eléctrico son los más robustos, sencillos y de menor tamaño. Sin embargo, presentan el inconveniente de requerir una matriz de dispositivos (electrodos o fotodiodos) formados sobre el propio soporte, Io cual obliga a utilizar un soporte nuevo y desechar el usado cada vez que se realiza el ensayo. El soporte, además, es un elemento complejo y costoso, ya que debe incluir transductores eléctricos, etc., en lugar de los soportes habitualmente utilizados en los sistemas ópticos, que consisten simplemente en un trozo de vidrio o plástico funcionalizado

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable que está basado en Ia medida electroquímica (amperométrica, potenciométrica o impedimétrica) de Ia acumulación de productos de una reacción enzimática al entrar en contacto una superficie marcada por marcas enzimáticas y un sustrato químico. La novedad de este dispositivo reside en que los transductores encargados de realizar Ia medida se encuentran en una base diferente al soporte del microarray, de manera que el dispositivo de lectura se puede reutilizar para tantos análisis como se desee. Además el dispositivo de lectura puede funcionar con los soportes de bajo coste utilizados por los conocidos sistemas ópticos. El único requerimiento para el uso de este dispositivo de lectura es que Ia marca enzimática utilizada, al reaccionar con su substrato químico correspondiente, genere un producto que pueda ser detectado por los transductores, es decir, un producto que modifique alguna propiedad eléctrica o química del medio en que se produce Ia reacción. Los transductores de Ia invención, por tanto, transforman magnitudes eléctricas o químicas de un medio en magnitudes eléctricas.

En el caso de transductores impedimétricos, será necesario que el substrato químico sea una especie química con carga neta diferente a Ia de Ia suma de las cargas netas de los productos, de manera que al producirse Ia reacción enzimática cambie Ia concentración de especies cargadas, y por Io tanto cambie Ia conductividad del medio. Un ejemplo de ello es el enzima Ureasa, que al reaccionar con Ia urea (especie neutra) produce amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente dando lugar al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el dióxido de carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato (cargado negativamente).

En el caso de transductores amperométricos, Ia reacción enzimática debe producir especies electroactivas. Un ejemplo es el enzima fosfatasa alcalina, que en presencia de p-aminofenilfosfato produce p-aminofenol. El p-aminofenol se oxida a un potencial menor de 200 mV dando lugar a p- quinonaimina. Este sistema de enzima/substrato permite utilizar el redox cycling ya que Ia p-quinonaimina puede ser reducida a su vez a un potencial menor de -200 mV dando lugar nuevamente a p-aminofenol.

En el caso de transductores potenciometricos, Ia reacción enzimática debe producir iones que sean detectables en el transductor. El caso más simple seria una enzima que produzca un cambio de pH.

En el presente documento, diremos que un microarray está formado por un soporte plano, en una de cuyas superficies, que denominaremos "superficie de test", hay una matriz de spots con una marca enzimática. El soporte plano puede ser cualquiera de los soportes habitualmente utilizados con otros tipos de equipos de lectura, por ejemplo ópticos, y puede ser de materiales como vidrio o plástico, entre otros.

Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de Ia invención, se describe un dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable que comprende los siguientes elementos:

1 ) Una base, que comprende unos medios de apoyo para situar Ia superficie de test del microarray en paralelo a una superficie de lectura de Ia base.

Los medios de apoyo de Ia base deben ser tales que Ia superficie de test del microarray quede enfrentada en paralelo a Ia superficie de lectura de Ia base. Además, Ia distancia entre ambas superficies debe ser tal que permita que una gota de un medio acuoso toque simultáneamente ambas superficies, poniendo así en contacto el sustrato químico presente en el medio acuoso y Ia marca enzimática de los spots del microarray, y produciéndose así una reacción química que resulta en unos productos que afectan a propiedades eléctricas o químicas del medio acuoso.

2) Una matriz de transductores, dispuestos sobre Ia superficie de lectura de Ia base, que traducen una variación de una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud eléctrica.

Los transductores están fijados a Ia superficie de lectura de Ia base formando una matriz, de tal modo que, cuando el microarray se dispone sobre los medios de apoyo, cada transductor queda enfrentado a un spot.

Para poder efectuar Ia lectura, se debe aplicar una gota de medio acuoso que contenga el substrato químico correspondiente entre cada transductor y el respectivo spot enfrentado al mismo. Las gotas de medio acuoso pueden formarse de cualquier modo, siempre que todas sean del mismo tamaño, y que no se toquen unas con otras. Por ejemplo, se podría utilizar una micropipeta o un equipo tipo "spoter", aunque en una realización preferida de Ia invención, el dispositivo de lectura de microarrays de Ia invención comprende un medio de aplicación de gotas de medio acuoso.

Preferentemente, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso está integrado en el propio dispositivo de lectura de microarrays, y comprende un depósito de medio acuoso acoplado a Ia superficie de Ia base opuesta a Ia superficie de lectura, y una matriz de microcanales practicados en Ia propia base del dispositivo. Cada microcanal conecta el depósito de medio acuoso con el punto en el que está situado cada transductor, de modo que modificando Ia presión en el depósito se consigue una inyección controlada de medio acuoso, formándose así gotas de volumen uniforme encima de cada transductor. Además, el depósito de medio acuoso comprende una entrada y una salida de medio acuoso, de manera que se pueden inyectar con él diferentes líquidos.

En otra realización preferida, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso es un aplicador que comprende un depósito de medio acuoso y una matriz de microcanales practicados en una de sus paredes.

Al igual que el medio de aplicación de gotas de medio acuoso descrito en el párrafo anterior, situando correctamente el aplicador sobre Ia superficie de lectura de Ia base y modificando Ia presión en el depósito, se produce Ia inyección de fluido sobre cada transductor hasta que se forma una gota del volumen deseado. Esto se puede hacer formando directamente una gota única o depositando una multitud de pequeñas gotas expulsadas desde Ia boquilla del microcanal por algún mecanismo similar al utilizado por las impresoras de inyección de tinta, y que al irse uniendo sobre el transductor van formando Ia gota. Al tratarse de un aplicador que no está integrado en Ia base, es necesario posicionarlo de modo que cada microcanal quede enfrentado a un transductor. Para ello, se pueden utilizar los mismos medios de apoyo utilizados para colocar el microarray.

3) Unos medios de lectura, conectados a los transductores, que interpretan las señales eléctricas de los transductores.

Una vez las gotas están en contacto con los spots del microarray marcados enzimáticamente, Ia reacción enzimática empieza a tener lugar. En los spots donde exista mayor concentración de Ia marca enzimática, el transductor medirá un cambio mayor en Ia concentración de productos. Las gotas están separadas entre si y por Io tanto los productos se acumulan en el volumen de las mismas sin que se produzca interferencia entre diferentes puntos de Ia matriz. Por tanto, Ia matriz de transductores está conectada a unos circuitos electrónicos de medida capaces de adquirir y procesar Ia señal generada por cada uno de dichos transductores. La medida se puede realizar al final de un tiempo determinado o durante todo el tiempo que las gotas están en contacto con los spots. El segundo caso permite medir Ia dinámica de Ia reacción enzimática, Io cual puede dar mayor información analítica. Por ejemplo, puede permitir un mayor rango dinámico, ya que se puede detectar Ia evolución de las concentraciones de producto antes de que se llegue a un valor de saturación.

De acuerdo con un segundo aspecto de Ia invención, se describe un procedimiento de lectura eléctrica de un microarray utilizando el dispositivo de lectura descrito anteriormente, que comprende las siguientes operaciones:

a) Poner en contacto los spots del microarray con las gotas de medio acuoso, produciéndose en cada gota una reacción química que modifica una propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota. Esta operación se puede realizar de dos modos diferentes. De acuerdo con una realización particular, se pueden crear en primer lugar gotas de medio acuoso sobre los transductores, y a continuación colocar el microarray, con ayuda de unos medios de apoyo, en paralelo a Ia superficie de lectura de Ia base, y a una distancia tal que cada spot quede enfrentado a un transductor y Ia gota de medio acuoso los toque a ambos.

En otra realización particular, es posible disponer en primer lugar el microarray sobre los medios de apoyo y, a continuación, inyectar el medio acuoso sobre los transductores hasta formar gotas de un tamaño suficiente como para que cada una de ellas esté en contacto simultáneamente con el transductor y con el spot enfrentado al mismo.

b) Leer, mediante unos medios de lectura, Ia señal eléctrica generada por cada uno de los transductores en respuesta a Ia modificación de una propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota.

Una vez una gota de medio acuoso entra en contacto con un spot marcado enzimáticamente, comienza Ia reacción química entre el sustrato químico incluido en el medio acuoso y Ia marca enzimática del spot, formándose como resultado de Ia reacción unos productos que modifican alguna propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota. La subsiguiente operación de lectura se puede realizar, bien simultáneamente sobre todos los transductores de Ia matriz, o bien secuencialmente por filas, columnas o individualmente.

c) Lavar Ia superficie de lectura del dispositivo y reutilizarlo para nuevas pruebas.

Es importante que, una vez realizada Ia lectura y antes de realizar una nueva lectura, se limpien los transductores y Ia superficie de lectura de

Ia base del dispositivo para que no queden restos de los productos de Ia reacción enzimática ni de enzimas que se puedan haber desprendido del microarray. En este sentido, Ia solución o soluciones de limpieza deben tener Ia capacidad de disolver los productos de Ia reacción enzimática y desnaturalizar los enzimas para que pierdan por completo su actividad. La limpieza puede acabar con un enjuagado en agua desionizada.

Esta limpieza se puede hacer de modo tradicional o bien, de acuerdo con una realización particular de Ia invención, succionando las gotas de medio acuoso generadas e inyectando a continuación una solución de limpieza, mediante el medio de aplicación de gotas de medio acuoso. Para llevar a cabo esta operación del procedimiento, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso debe ser capaz de crear presiones negativas en el depósito al que están conectados los microcanales y de sustituir el medio acuoso del depósito por una solución de limpieza adecuada.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar Ia descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de Ia invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de Ia misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado Io siguiente:

Figura 1.- Muestra un esquema de un microarray de soporte plano, con las diferentes partes que Io componen.

Figuras 2.- Muestra un esquema de un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo con Ia invención. Figuras 3 y A - Muestran dos realizaciones particulares de medios de aplicación de gotas de medio acuoso.

Figuras 5 y 6.- Muestra las primeras operaciones del procedimiento de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo con una realización particular de Ia invención.

Figura 7.- Muestra una realización particular de los medios de lectura de acuerdo con Ia presente invención.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

La Figura 1 muestra un microarray (6) formado por un soporte plano (9), sobre cuya superficie de test (7) se dispone una matriz de puntos de medida o spots (8), que son marcados con una marca enzimática.

La Figura 2 muestra de forma esquemática el dispositivo (1 ) de lectura de microarrays de acuerdo con Ia presente invención. Se observa que está formado por una base (2), sobre cuya superficie de lectura (4) hay una matriz de transductores (5) que reaccionan ante un cambio en una propiedad eléctrica o química del medio acuoso.

El dispositivo (1 ) de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable del ejemplo comprende además, en los laterales de Ia base (2), unos medios de apoyo (3), que sirven para apoyar el microarray (6) de forma que cada spot (8) de Ia matriz quede enfrentado a un transductor

(5). En este ejemplo, los medios de apoyo (3) comprenden básicamente un reborde que sirve de apoyo al microarray (6) durante el proceso de lectura. Aunque no se observa en las figuras, en Ia superficie opuesta a Ia superficie de lectura (4) se encuentran los medios de lectura (10), que se han representado en Ia Fig. 7.

La fabricación de Ia base (2) y Ia matriz de transductores (5) se realiza a partir de obleas de vidrio tipo pyrex de 100 mm de diámetro. El proceso empieza con Ia deposición de una tricapa metálica de titanio, níquel y oro (el titanio se deposita sobre el pyrex con un grosor de 20 nm, el níquel sobre el titanio con un grosor de 50 nm y el oro sobre el níquel con un grosor de 50 nm). Los tres metales se despositan por pulverización catódica. A continuación se realiza un proceso de fotolitografía estándar con una máscara que contiene los motivos para definir una matriz de pares de electrodos interdigitados. Cada par de electrodos interdigitados tiene 14 dedos (siete en cada electrodo) de 20 μm de ancho, separados 20 μm y con una longitud de Ia zona interdigitada de 500 μm. Con Ia misma máscara se definen las pistas de conexión que van desde cada electrodo hasta el borde del chip, donde se define una área para su conexión a un circuito impreso mediante soldadura de hilo. Los transductores forman una matriz rectangular de 4x9 elementos y están separados 6 mm entre ellos. En una oblea de 100 mm caben dos matrices de transductores (5) como Ia descrita. El ataque de los metales posterior a Ia fotolitografía se realiza en diferentes soluciones de ataque. Para el oro se utiliza una mezcla de 5700 mi de H ₂ O, 435 g de Kl y 250 g de I ₂ . Para el níquel se utiliza una mezcla 1 :4 de HNO3 al 70% : H ₂ O. Para el titanio se utiliza una mezcla 1 :10:33 de HF 49% : H ₂ O : 1 ,2-Propanodiol.

Una vez definidos los electrodos Ia oblea se pasa por una sierra mecánica para separar las dos matrices de transductores (5). Las matrices se unen a un circuito impreso en el que se han definido las áreas necesarias para Ia conexión mediante soldadura por hilo y que tiene un conector para conectar eléctricamente los electrodos a Ia instrumentación. Tras realizar Ia soldadura con hilo de todos los electrodos se protegen los hilos mediante un polímero termocurable (Epotek H77). El medio de apoyo (3) se fabrica con Polidimetilsyloxano a partir de un molde, y se suelda a Ia matriz de transductores mediante activación con plasma de oxigeno.

Las Figuras 3 y 4, por su parte, muestran respectivamente dos realizaciones preferidas de medios de aplicación de medio acuoso. En Ia figura 3, éstos están integrados en Ia base (2'), de modo que un depósito

(11') de medio acuoso formado en Ia superficie opuesta a Ia superficie de lectura (4) inyecta el medio acuoso a través de una matriz de microcanales

(12') que atraviesan Ia base (2') hasta el lugar en el que está situado cada transductor (5'). En este ejemplo, los transductores (5') tienen un orificio central donde está Ia boquilla de cada microcanal.

En Ia Figura 4, los medios de aplicación de medio acuoso constituyen un aplicador formado por un depósito (11 ") de medio acuoso en una de cuyas paredes hay unos microcanales (12"), a través de los cuales se inyecta el medio acuoso sobre los transductores (5"). Para que cada microcanal quede enfrentado a un tranductor (5"), los medios de apoyo (3") comprenden además un segundo reborde sobre el que se apoya el aplicador de medio acuoso.

Las Figuras 5 y 6 muestran algunas operaciones de una realización preferida del procedimiento de Ia invención. En particular, Ia Figura 5 muestra el micrroarray (6) y el dispositivo de lectura (1 ), donde previamente se ha llevado a cabo Ia operación de inyectar una gota de medio acuoso sobre cada transductor (5). El microarray (6) está ya preparado para ser apoyado en los medios de apoyo (3), momento que se recoge en Ia Figura 6, en Ia que cada gota de medio acuoso ya están en contacto con un spot (8), y por Io tanto ha comenzado ya Ia reacción química entre Ia marca enzimática y el sustrato.

Finalmente, Ia Figura 7 muestra Ia instrumentación de medida en el caso de que el producto de Ia reacción química entre Ia marca enzimática y el sustrato químico provoque cambios en Ia impedancia del medio acuoso de Ia gota. La instrumentación comprende fuentes de excitación de tensión alterna (15) y circuitos de medida (16) de corriente alterna, que combinados son capaces de medir Ia impedancia vista en terminales de los electrodos (17) interdigitados. En Ia figura se observa conexión de dichas fuentes (15) y circuitos medidores(16) con los electrodos (17). Como se puede apreciar, los transductores impedimétricos permiten un conexionado tipo fila-columna. Esto hace que sea práctica Ia realización de matrices de gran número de elementos. Por ejemplo, para una matriz de 1024 elementos bastaría con 32 fuentes de excitación alterna (15) y 32 circuitos de medida (16) de Ia corriente. De hecho, con una multiplexación adecuada es suficiente una sola fuente de excitación (15) y un solo circuito de medida (16) de Ia corriente. En el caso de que el número de elementos de Ia matriz sea muy elevado, el número de soldaduras por hilo que se necesitarían también Io seria. Para solventar este problema se puede utilizar una tecnología de fabricación con dos niveles de metal y conectar los electrodos (17) a nivel de oblea por filas y columnas como se muestra en Ia Figura 7. De esta manera, el número de soldaduras por hilo que se necesitan para encapsular una matriz de transductores de (n x m) es tan solo de (n + m). En el ejemplo que aquí se describe, las fuentes de excitación son las salidas analógicas de una tarjeta Nl USB-6259 de National Instruments. Los circuitos de medida (16) de corriente se han implementado en el ejemplo con amplificadores operacionales AD8674, con una resistencia de realimentación de precisión de 100 kΩ. El registro de los valores de tensión a Ia salida de los amplificadores operacionales se ha realizado mediante las entradas analógicas de Ia misma tarjeta. Un programa en LabView sirve para controlar el proceso de adquisición, procesar las señales adquiridas y obtener los valores de impedancia que presentan los transductores (5) a Io largo del tiempo de lectura. El proceso de adquisición se desarrolla según Ia siguiente secuencia: Primero se excita una fila de transductores (5) con una tensión alterna de 50 mV de amplitud y 2 kHz de frecuencia durante 25 ms. El resto de fuentes (15) de excitación se mantiene a OV. Durante este tiempo se adquiere Ia señal con las entradas analógicas conectadas a cada una de las columnas de transductores (5). A continuación se procedería de igual forma con Ia siguiente fila y así hasta que todas las filas de transductores hubieran sido leídas.

Se describe a continuación un ejemplo de uso de un dispositivo (1 ) de lectura de microarrays (6) de tipo eléctrico y reutilizable basado en transductores (5) impedimétricos para medir los resultados en un microarray (6) que utiliza Ia ureasa como marca enzimática.

La Ureasa, en presencia de urea (neutra) produce amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente dando lugar al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el dióxido de carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato (cargado negativamente). Por Io tanto, Ia reacción enzimática hace aumentar Ia conductividad del tampón original. El tampón original está formado por una solución acuosa de urea 0.1 M y glicina 0.25 M, con una conductividad aproximada de 16 μS/cm. En este ejemplo, las gotas de tampón, de 1 μl de volumen se depositaron sobre los transductores (5) manualmente utilizando una micropipeta. En Ia preparación del microarray, se empleó como analito modelo a detectar una inmunoglobulina G de conejo y se aplicó un ensayo de tipo fase inversa. Este consistió en realizar diluciones sucesivas de una solución madre de dicho analito modelo. Se depositaron microgotas de 1 μl_ de volumen, de cada una de las diluciones preparadas en el soporte (9) del microarray (6) (portaobjetos de vidrio previamente silanizado). Una vez inmovilizado el analito, el microarray (6) se incubó con una disolución de un anticuerpo de cabra, anti-inmunoglobulina G de conejo marcado con ureasa durante una hora, tiempo durante el cual tuvo lugar Ia interacción específica entre el analito y el anticuerpo marcado. Tras lavar el microarray (6) con agua desionizada y secar en corriente de nitrógeno, se procedió a Ia lectura del mismo con Ia matriz de transductores (5) impedimétricos.