La presente invención se refiere a un nuevo material electroactivo que comprende un polielectrolito compuesto por un polímero cargado que posee grupos amino, en donde al menos un 1% de dichos grupos se encuentra derivatizado con un complejo formado por un metal de transición y un residuo glicosídico. De preferencia, dicho metal de transición se selecciona entre los metales de transición del grupo 8 y el residuo glicosídico se selecciona entre los carbohidratos que contienen residuos de glucosa, mañosa, galactosa, N-acetil glucosamina, N-acetil galactosamina y los oligosacáridos y polisacáridos que los comprenden. El material de la invención puede ser utilizado en la fabricación de electrodos. En una realización particular, el nuevo material electroactivo de la invención está compuesto por un polielectrolito constituido por una o más polialilaminas y un complejo de osmio que posee ligandos piridilos, el cual fue modificado mediante la adición del residuo glicosídico lactosa.

En realizaciones particulares de la invención, se revelan electrodos que comprenden a dicho material y que pueden ser utilizados para la adsorción de glicoenzimas redox, permitiendo la transferencia electrónica entre el electrodo y el sustrato de dicha enzima en forma eficiente. En otras realizaciones particulares, el material de la invención puede ser utilizado como una lengua electrónica para el reconocimiento de microrganismos o estar eléctricamente unido a microrganismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El funcionamiento de los biosensores enzimáticos amperométricos depende fuertemente de las características de la arquitectura interfacial y de la calidad de la asociación entre la enzima redox y la superficie del electrodo. Como consecuencia, la enzima es generalmente inmovilizada en medios artificiales, sometidos a interacciones diferentes a las encontradas en su medio natural. Por ello, además de mantener la conformación y retener la actividad biológica de la enzima, el procedimiento de inmovilización debe garantizar la accesibilidad del analito y de otras moléculas i involucradas en el evento de bioreconocimiento a su sitio activo. Así, la elección de la técnica de construcción del electrodo debe contemplar varios parámetros, incluyendo la estabilidad enzimática, reproducibilidad y aspectos cinéticos, entre otros [i]. Es sabido que muchas metodologías de inmovilización pueden inducir cambios conformacionales en la enzima, los cuales pueden estar acompañados por una significativa pérdida de actividad[2-3]. En este marco, el ensamblado biosupramolecular por reconocimiento directo surge como una interesante y atractiva alternativa debido a su simplicidad y versatilidad, sin introducir modificaciones químicas a la enzima. Este enfoque no covalente se basa en la notable selectividad de la interacción entre los bloques de construcción constitutivos[4-9], sin el requerimiento de pasos de modificaciones químicas[io]. En el caso de glicoenzimas, ha sido demostrado que esta metodología permite la rápida inmovilización de considerables cantidades de proteínas sobre superficies modificadas con lectinas[n]. Otra ventaja clave de esta estrategia es que al inmovilizar una glicoenzima a través de su molécula de carbohidrato, no se afecta su sitio prostético, ya que la región de carbohidrato está generalmente localizada en áreas que no están involucradas en la actividad enzimática y, entonces, la enzima puede retener la mayoría de sus funciones biológicas aún cuando sus regiones carbohidratadas están conjugadas o bloqueadas [4-5, 10-25].

Se ha demostrado que la formación del complejo polielectrolito-surfactante presenta interesantes propiedades para el desarrollo de nuevos materiales dedicados a la construcción de sensores y dispositivos bioelectrónicos. El polielectrolito puede aportar al complejo estabilidad mecánica y térmica, mientras que el surfactante introduce cierto ordenamiento formando estructuras estratificadas.

Los complejos de polielectrolito-surfactante son sistemas estables formados por cadenas poliméricas cargadas (polielectrolitos) y pequeñas moléculas anfifílicas de carga opuesta (surfactantes), las cuales consisten en una cabeza polar y una cola no polar. Varios tipos importantes de complejos de polielectrolito-tensioactivos se describen en la literatura. Algunos de ellos son preparados por la adsorción sucesiva de un tensioactivo y de un polielectrolito en un substrato sólido, dando por resultado películas de múltiples capas [26]. Por otra parte, en las últimas dos décadas se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo dedicado al uso de complejos de transición en la construcción de dispositivos moleculares que explotan las características redox y luminescentes de distintos complejos, principalmente del grupo 8 (hierro, rutenio y osmio). Del extenso conocimiento generado sobre estos complejos, es posible sintetizar complejos con el potencial de reducción deseado, a través de la elección adecuada de los ligandos. Posteriormente estos complejos se utilizan para la derivatización de los polielectrolitos, generando nuevos materiales con las características electroactivas deseadas. Entre ellos se encuentra la polialilamina derivatizada con un complejo de osmio (PAAOs), la cual fue extensivamente usada en la generación de estructuras autoensambladas [27].

La concanavalina A (ConA) es la más estudiada de las proteínas lectínicas, debido a su presencia en alta concentración en el poroto Canavalia ensiformis y a la simplicidad de su purificación. Además de su uso en el aislamiento y caracterización de varios glicoconjugados, ha sido empleada como ligando efectivo en la inmovilización de glicoenzimas. La ConA ha sido secuenciada, y su estructura tridimensional detallada se encuentra resuelta; existe como tetrámero de masa molecular de 104 kDa a pH neutro[28-3i] y cada monómero de ConA contiene un sitio de unión de ion calcio, un sitio de unión de un metal de transición y un sitio de unión de carbohidrato (específico para α-D-manosa y ot-D-glucosa), también conocido como sitio de combinación [32-33]. El sitio de unión de carbohidrato está cerca del sitio de unión del metal, pero ambos centros no se solapan [34-35]. Estas propiedades permiten a la ConA actuar como un puente de bioafinidad entre una superficie modificada con un azúcar y una glicoproteína. Esta clase de inmovilización orientada provee buena accesibilidad estérica, ya que los residuos carbohidrato están usualmente localizados lejos del sitio activo.

La peroxidasa de rábano picante (Horseradish peroxidase, HRP) es una glicoproteína muy utilizada en ensayos clínicos. Alrededor de 40 isoenzimas han sido detectadas a partir de preparaciones comerciales impuras. En términos prácticos, la mayor parte de los trabajos experimentales se centran en solo tres isoenzimas: isoenzima A (ácida); isoenzima C (neutra o ligeramente básica), y una HRP fuertemente básica. De estas tres isoenzimas, la más estudiada es la isoenzima C [36]. El hecho de que esta isoenzima sea prácticamente neutra y altamente soluble debido a la presencia de residuos glicosídicos en su parte externa representa un desafío para su incorporación en sistemas autoensamblados. Recientemente Pallarola et αΙ.{37λ han podido autoensamblar HRP-C a electrodos de oro mediante el uso de tioles conteniendo residuos mañosa y lectinas modificadas con complejos de osmio explotando la existencia de ocho cadenas laterales neutras de carbohidratos, observando un eficiente proceso de transferencia de carga.

La HRP-C contiene 308 residuos de aminoácidos. El extremo N-terminal está bloqueado por un residuo de pirrolidín carboxílico. El extremo C-terminal corresponde a un residuo de serina. El grupo prostético hemo (hierro-porfirina (ver Figura 17, donde (A) estructura del grupo hemo; (B) estructura tridimensional del nomómero de HRP) está unido a través de la posición de coordinación 5 del Fe(III) a la cadena lateral de imidazol de la histidina 70. Ambos, la histidina proximal y un residuo histidina distal situado dentro del entorno del enlace puente de H del ligando H ₂ 0, cumplen un rol fundamental en la actividad catalítica.

La enzima posee dos iones Ca ²⁺ por molécula, que contribuyen a la estabilidad estructural en la región del sitio activo [38] y si bien no participan en el mecanismo catalítico, su remoción causa una perturbación en la vecindad del hemo, lo cual produce una disminución de la actividad enzimática. Los residuos de aminoácidos poseen una masa de 33890 Da, el grupo hemo 550.5 Da, y los dos iones Ca ²⁺ 80 Da, resultando en una masa molecular de 34520 Da. La región oligosacárida corresponde al 18% de la enzima, resultando en una masa molecular total para la HRP-C de 42100 Da [36]. La enzima es estable a temperatura ambiente en un intervalo de pH entre 5 y 10.

Las peroxidasas catalizan la oxidación de un extenso número de sustratos orgánicos por peróxido de hidrógeno y por peróxidos orgánicos. El ciclo catalítico de la HRP se muestra en el esquema de la Figura 18.

Etox y E20X son los estados oxidados de la ferriperoxidasa nativa (E , usualmente denominados compuestos I y II, respectivamente. Q es el sustrato reductor y P es la contraparte oxidada. El primer paso de la catálisis corresponde a una rápida transferencia de un átomo de oxígeno del peróxido de hidrógeno (H ₂ 0 ₂ , sustrato de la enzima) a la porfirina férrica (Fe ¹¹¹ ) de la HRP, formalmente una oxidación que involucra 2e ^~ , para formar el intermediario catión π radical hemo oxiferril ([ e ^ív' =0] ^,+ ) Etox (con un estado de oxidación formal del hierro: +V) y agua. En ausencia de donores de e ^~ adecuados, Eiox se descompone lentamente. En el segundo paso, el catión radical de la porfirina del compuesto I se reduce por Q (proceso de ie ^~ ) para dar el intermediario oxiferril E ₂ ox (estado de oxidación formal del hierro: +rV) y el producto P. En el último paso, la enzima vuelve a su forma nativa {E) mediante un proceso que involucra ie ^~ y 2H ⁺ . E20X se reduce por una segunda molécula Q para dar un segundo equivalente de P y agua. Una concentración relativamente elevada de H ₂ 0 ₂ puede inhibir a la enzima a partir de la reacción de E ₂ ox con H ₂ 0 ₂ . Una discusión más completa puede encontrarse en la referencia [39]. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un nuevo material electroactivo que comprende un polielectrolito compuesto por un polímero cargado que posee grupos amino, derivatizados con un complejo formado por un metal de transición y un residuo glicosídico. De preferencia, dicho metal de transición se selecciona entre los metales de transición del grupo 8 y el residuo glicosídico se selecciona entre los carbohidratos que contienen residuos de glucosa, mañosa, galactosa, N-acetil glucosamina, N-acetil galactosamina y los oligosacáridos y polisacáridos que los comprenden. El material de la invención puede ser utilizado en la fabricación de electrodos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura i: Espectro de Ή RMN de Os-PA-lac en D ₂ 0.

Figura 2: Patrón de GISAXS correspondiente a Os-PA-lac+SDS.

Figura 3: Respuesta de la balanza de cristal de cuarzo (frecuencia) cuando se hace pasar una solución de ConA 1 μΜ y una solución de HRP, sobre un electrodo modificado Au/Os-PA-lac+SDS.

Figura 4: Esquema mostrando la construcción de los electrodos modificados. La superficie de oro es primero modificada con el glicopolielectrolito redox mediante la técnica de spin-coating y luego las siguientes capas son ensambladas incubando el electrodo en la solución correspondiente.

Figura 5: Voltametría cíclica para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP, obtenida en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ . Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ . Q = 8,5 μC crrr ² .

Figura 6: Voltametría cíclica para el sistema Au/Os-PA- lac+SDS/Os-ConA/HRP, obtenida en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ , en presencia de

250 μΜ de H2O2. Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ .

Figura 7: Voltametrías cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os-

PA-lac, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ , en ausencia de H ₂ 0 ₂ y en presencia de 250 y 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ . Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ .

Figura 8: Corrientes catalíticas medidas, en función de la concentración de sustrato, para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP (en negro) y Au/Os-

PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os-PA-lac (en azul), en buffer HEPES 50 mM H 7,4, 0,1 M KN0 ₃ .

Figura 9: Voltametría cíclica para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS (capa gruesa), obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ . Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ . Q = 111 μC crrr ² .

Figura 10: Voltametnas cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ , en ausencia de H2O2 y en presencia de 250 y 1000 μΜ de H ₂ 0 ₂ . Velocidad de barrido: 10 mV s ^"1 .

Figura 11: Voltametnas cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os- PA-lac/Os-ConA/HRP, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1

M KNO ₃ , en ausencia de H ₂ 0 ₂ y en presencia de 250 μΜ, i y 2 mM de

H ₂ 0 ₂ . Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ .

Figura 12: Corrientes catalíticas medidas, en función de la concentración de sustrato, para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP (en negro) y Au/Os- PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os-PA-lac/Os-ConA/HRP (en rojo), en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ .

Figura 13: Voltametnas cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/(Os-ConA/HRP)n, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ , en presencia de

250 μΜ de H ₂ 0 ₂ . Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ .

Figura 14: Voltametnas cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/HRP, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7.4, 0.1 M KN0 ₃ , en ausencia de H ₂ 0 ₂ , en presencia de 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ y en presencia de 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ +

[0s(bpy) ₂ ClpyC00H] ⁺ 20 μΜ. Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ .

Figura 15: Voltametnas cíclicas para el sistema Au/Os-PA-lac+SDS/ConA/HRP, obtenidas en buffer HEPES 50 mM pH 7.4, 0.1 M KN0 ₃ , en ausencia de

H ₂ 0 ₂ , en presencia de 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ y en presencia de 500 μΜ de

H ₂ 0 ₂ + [0s(bpy) ₂ ClpyC00H] ⁺ 20 μΜ. Velocidad de barrido: 10 mV s ¹ . Figura 16 - 17 - 18: Corresponden al Estado de la Técnica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un nuevo material electroactivo que comprende un polielectrolito compuesto por un polímero cargado que posee grupos amino, en donde al menos un 1% de dichos grupos se encuentra derivatizado con un complejo formado por un metal de transición y un residuo glicosídico. De preferencia, dicho metal de transición se selecciona entre los metales de transición del grupo 8 y el residuo glicosídico se selecciona entre los carbohidratos que contienen residuos de glucosa, mañosa, galactosa, N-acetil glucosamina, N-acetil galactosamina y los oligosacáridos y polisacáridos que los comprenden. El material de la invención puede ser utilizado en la fabricación de electrodos.

En una realización particular, el material electroactivo de la invención comprende una relación de alrededor de 3% de complejo/ 10% de residuo glicosídico, expresada como relación molar azúcar/unidad monomérica de polímero.

El material electroactivo de la invención es capaz de anclar proteínas lectinicas, en particular, lectinas y sus conjugados y, más particularmente aún, lectinas conjugadas con uno o más complejos de metales de transición. A modo de ejemplo, de acuerdo con la presente invención, las lectinas pueden ser seleccionadas entre, la concanavalina A, las lectinas provenientes de Artocarpus integrifolia, Arachis hypogaea, Galanthus nivalis, Phytolacca americana, Lens culinaris, Helix pomatia, Triticum vulgaris y Codium fragüe y los conjugados de las mismas.

En una realización particularmente preferida de la invención, el material electroactivo capaz de anclar proteínas lectinicas, comprende un polielectrolito constituido por una o más polialilaminas y un complejo de osmio que posee ligandos piridilos, el cual fue modificado mediante la adición del residuo glicosídico lactosa. Más preferentemente aún, el material de la invención comprende un polielectrolito constituido por una o más polialilaminas y un complejo de osmio que posee ligandos piridilos, el cual fue modificado mediante la adición del residuo glicosídico lactosa, en donde la relación de lactosa:alilamina es de alrededor de 1:10 y en donde la relación de complejo de osmio:alilamina es de alrededor de 1:35. El material electroactivo capaz de anclar proteínas lectinicas de acuerdo con la invención puede ser disuelto en solventes orgánicos, en particular en un solvente seleccionado entre dimetilsulfóxido, metanol, dimetilformamida o una mezcla de los mismos y ser aplicado sobre cualquier superficie conductora adecuada, en particular, sobre una superficie conductora seleccionada entre grafito, oro y platino. En realizaciones particulares de la invención el material electroactivo capaz de anclar proteínas lectinicas puede comprender una glicoenzima redox unida a la lectina y, más particularmente aún, una glicoenzima redox seleccionada entre la peroxidasa de rábano picante, la glucosa oxidasa y la lactato oxidasa.

La presente invención se refiere a un nuevo material compuesto, de aquí en más denominado como Os-PA-lac+SDS. El material del invención incorpora al disacárido lactosa a un polielectrolito redox, con el objeto de introducir un residuo glicosídico (glucosa) capaz de anclar proteínas lectínicas, las cuales reconocen específicamente a ciertos azúcares. Así, mediante esta estrategia, se obtiene un método universal para generar autoensamblados independientemente de la superficie conductora con la que se desee trabajar, utilizando más de un modo de reconocimiento molecular. El concepto se ilustra en la presente mediante el ejemplo no limitante de la utilización de concanavalina A modificada con un complejo de osmio (Os-ConA) autoensamblada con la glicoenzima HRP. Este procedimiento posibilitará la inmovilización de HRP por un método suave, permitiendo una eficiente transferencia electrónica entre el electrodo y la enzima redox, los resultados obtenidos se comparan con los recientemente publicados por Pallarola et al-,Í37 trabajo en el cual se ha podido autoensamblar HRP-C a electrodos de oro mediante el uso de tioles y Os-ConA. El material electroactivo de la invención es un polielectrolito constituido por polialilamina y un complejo de osmio que posee ligandos piridilos, el cual fue modificado mediante la adición del residuo glicosídico lactosa. La incorporación de este resto carbohidrato al polielectrolito introduce una nueva funcionalidad capaz de ser reconocida por las lectinas, mientras que este nuevo sistema completo mantiene su habilidad de formar un complejo polielectrolito surfactante auto ensamblable con el dodecil sulfato. El material de la invención puede ser disuelto en solventes orgánicos, en particular seleccionado entre DMSO y DMF, ser aplicado a prácticamente cualquier superficie y mantenerse firmemente adsorbido. La introducción de lactosa en el polielectrolito redox genera un material que preserva su capacidad de interaccionar con SDS y de ser aplicado a distintas superficies (por ejemplo, pero sin estar limitado por, grafito, oro o silicio) mostrando una excelente estabilidad. Los estudios por GISAXS muestran que el sistema mantiene un ordenamiento mesoporoso orientándose paralelamente al sustrato, como sucede para el sistema sin osmio, a lo que se suma la contribución de dominios lamelares multiorientados.

El polielectrolito así generado suma una nueva función, que es la habilidad de producir uniones por bioreconocimiento con proteínas del tipo de las lectinas tales como, por ejemplo, pero sin estar limitadas por, ConA y HRP. Si fuera necesario, el experto en la técnica sabrá adaptar el material de la invención para poder utilizarlo con las diferentes lectinas animales, vegetales y microbianas. No obstante, en la presente, el material y los procedimientos de la invención se ejemplifican para la ConAy la HRP.

Los estudios de balanza de cuarzo muestran un importante ensamblado de ConA, que corresponde a más de una monocapa, mientras que los moles de HRP incorporados son la quinta parte. Esto guarda relación con lo observado por Pallarola et al, [16] en donde la cantidad de moles de HRP incorporados es prácticamente un tercio de los correspondientes a ConA. Otra característica interesante de este sistema es el hecho de que la adición de ConA no produce una marcada disminución en la corriente observada en el polielectrolito redox, por lo cual los centros redox encuentran caminos alternativos para el intercambio de electrones ya que la corriente observada para el polielectrolito redox antes y después del agregado de ConA es prácticamente la misma. Sin embargo, no es posible el intercambio electrónico con HRP, lo que muestra que ConA actúa como una eficiente barrera aislante entre el polielectrolito redox y la HRP. Con el fin de disminuir el efecto aislante de la ConA se utilizó un conjugado de la misma con complejos de osmio. El uso de estos derivados ha sido previamente reportado en la literatura. [16] Los inventores de la presente han encontrado que la ConA conjugada con complejos de osmio (Os-ConA) mantiene su capacidad de unión a residuos mañosa o glucosa y se comporta como un eficiente mediador redox entre la superficie de un electrodo y la enzima HRP; para el anclaje de la Os-ConA se recurrió a dos pasos de modificación sobre la superficie de oro, primero con cistamina y luego con manosilpiranosilfenil isocianato, al cual la Os-ConA se une. En nuestro caso la modificación de la superficie de oro es más sencilla y la incorporación del conjugado Os- ConA y de la HRP se produce exitosamente. Para el electrodo Au/Os-PA-lac/Os- ConA/HRP el proceso de inhibición por sustrato se produce a la misma concentración que para el autoensamblado reportado en la referencia [16]; mientras que la corriente catalítica máxima observada es prácticamente el doble en este caso, 3,5 vs 2 uA crrr ² . Otro aspecto interesante a observar en el proceso catalítico es la forma de la señal en la Figura 6, donde se observa que la corriente en el barrido de retorno es mayor que en el de ida, sugiriendo que el sistema no entra rápidamente en este estado estacionario y que, por lo tanto, el proceso de transferencia electrónica en algún punto se hace relativamente lento.

Cuando se agrega otra capa de Os-PA-lac se produce un aumento en la corriente debido a un crecimiento del número de centros redox, lo que indica que la Os-ConA todavía es capaz de reaccionar con otros centros glicosilados y consecuentemente facilita la interacción de más centros redox con la HRP presente. En presencia de peróxido de hidrógeno, se observa que la catálisis para bajas concentraciones (10 y 25 μΜ) no presenta grandes cambios, siendo la corriente aun un poco menor para la concentración más baja, indicando que el control difusional a bajas concentraciones es importante, fenómeno ya observado por Sáveant en su estudio sobre transferencia electrónica entre electrodos y HRP mediada por complejos de osmio [40]. A concentraciones mayores las corrientes aumentan y se observa que la máxima corriente catalítica se produce a una concentración de 250 uM, obteniéndose un valor de corriente de prácticamente 9 uA cnr ² . En este caso la corriente supera en más de 4 veces al valor obtenido por Pallarola et al. para una monocopa Os-ConA/HRP. Por su parte, el sistema de autoensamblado presentado en la referencia [16] permite el agregado de otra monocapa Os-ConA/HRP y se observa una corriente catalítica máxima a 100 μΜ y con un valor también de 9 uA cnr ² . En nuestro caso, el aumento de la corriente fue únicamente debido a la incorporación de osmio en el sistema produciendo una conexión más eficiente entre electrodo y enzima, ya que la cantidad de HRP inmovilizada no varió, y para una dada concentración de H2O2, por ejemplo para 100 uM, la corriente pasa de 3,5 a 5,7 uA crrr ² (Figura 8). Por otro lado, el efecto inhibitorio de H ₂ 0 ₂ se produce a una concentración mayor (500 uM), lo cual también puede atribuirse a que el número de centros redox cercanos a la HRP es mucho mayor evitando la formación de oxiperoxidasa, la forma electroquímicamente inactiva de la peroxidasa (E ₃ en el ciclo presentado en el Esquema de mas arriba).

En el caso de una película más gruesa, con una carga de osmio aproximadamente 10 veces mayor, se observa que a bajas concentraciones (menores que 100 uM) existe un efecto catalítico, pero que una importante cantidad de osmio no participa en dicho proceso evidenciado por el comportamiento mixto que presentan los voltagramas realizados en estas condiciones, donde se observa un incremento en la corriente catódica debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, pero también una corriente pico en el barrido de retorno debido a la oxidación del complejo que no ha participado en el ciclo catalítico de la HRP. Por otra parte cuando las concentraciones aumentan no se observa proceso de inhibición hasta una concentración de 1 mM. Esto es atribuible a la alta concentración de osmio rodeando a la peroxidasa, lo que evita la formación de oxiperoxidasa como se indicara previamente. Otro aspecto interesante es que cuando se agrega una segunda capa de Os-PA-lac, la corriente debida a la incorporación de centros de osmio prácticamente no cambia. Esto indica que en el caso de películas gruesas el complejo Os-ConA/HRP penetra en la estructura del glicopolielectrolito quedando eficientemente rodeado, y la adición de una segunda capa de Os-PA-lac no es efectiva. La adición de una nueva capa de Os-ConA/HRP mejora la señal catalítica a altas concentraciones, presentando una corriente máxima para una concentración de agua oxigenada de 2 mM. Esto sugiere que Os-ConA se une a la HRP ya presente en el electrodo y a su vez permite la incorporación de más HRP, sin embargo, este tema requiere una mayor exploración. En el caso de esta película gruesa, a bajas concentraciones de sustrato, la primera y la segunda capa de Os-ConA/HRP dan resultados similares (Figura 12) y por lo tanto el control difusional tiene un rol muy importante como ya se discutió previamente.

El sistema de la invención se puede aplicar prácticamente sobre cualquier superficie y muestra una gran estabilidad. Este polielectrolito, combinado con ConA conjugada con complejos de osmio, ha demostrado ser capaz de inmovilizar por un método suave la peroxidasa de rábano picante y ha demostrado ser un eficiente mediador redox. Asimismo, de los resultados obtenidos se desprende que controlando el espesor de la película se puede controlar el rango de sensibilidad del electrodo al peróxido. Una aplicación del sistema de la invención es el uso de microorganismos como parte de sensores o celdas de combustibles [41], lo que ha suscitado un gran interés en la comunidad científica. Las paredes celulares de las bacterias están compuestas de hidratos de carbono que podrían ser bioreconocidos por lectinas unidas a este glicopolielectrolito redox permitiendo de esta manera la conexión eléctrica de bacterias a la superficie de un electrodo. Por otra parte, la alta concentración local de estas lectinas en la superficie del electrodo permitiría generar lenguas electrónicas para el reconocimiento de dichos microorganismos a muy bajas concentraciones. [42]

Finalmente, existe un renovado interés en el uso de neuronas como elementos para biosensado, debido a que ellas utilizan señales eléctricas para el procesamiento de la información [43-44]. En muchos casos, la unión silicio-neurona se realiza utilizando ConA como adhesivo entre la célula y el sustrato [45]. En este contexto, la combinación de nuestro glicopolielectrolito, capaz de adherirse prácticamente a cualquier superficie con ConA, podría introducir una nueva variable para la comunicación eléctrica entre la célula y el transistor introduciendo nuevas perspectivas en el desarrollo de biosensores.

En la literatura se encuentra extensamente reportada la interacción electrostática entre polielectrolitos de distintas cargas [46] o con moléculas de carga contraria como enzimas [47, 48] o surfactantes [49] También es conocida la modificación de polielectrolitos con centros redox para generar una respuesta electroactiva [50] pero, en nuestra experiencia, la síntesis de un polielectrolito redox capaz de presentar dos tipos diferentes de interacciones para la construcción de sistemas autoensamblados no ha sido previamente reportada.

La estrategia utilizada en el desarrollo de la presente invención fue la introducción de moléculas de glucosa al polielectrolito redox de manera de permitir su posterior unión a proteínas del tipo lectina. Para llevar a cabo esta tarea se eligió la lactosa; este hidrato de carbono es un dimero formado por una galactosa y una glucosa encadenados a través de una unión glicosídica β 1-4.

La introducción de lactosa al polielectrolito redox se puede lograr mediante diversos procedimientos tal como ilustra la Figura 16. De preferencia, puede lograrse mediante un procedimiento que involucra la oxidación previa del alcohol primario perteneciente al residuo galactosa, generándose un grupo aldehido que reacciona fácilmente con los aminos primarios presentes en el polielectrolito redox. Para ello se oxida el fragmento galactosa con oxígeno y galactosa oxidasa. El producto se incuba con el polielectrolito redox en presencia de cianoborohidruro de sodio durante toda la noche. El producto de la reacción se purifica, se liofiliza y se analiza mediante RMN protónico.

La Figura 1 corresponde al espectro de Ή RMN de Os-PA-lac realizado en agua deuterada. La señales presentes entre 6,75 y 8,75 ppm corresponden a los ligandos piridínicos del complejo de osmio, mientras que las señales en la región entre 0,75 y 3,25 ppm corresponden al esqueleto del polielectrolito. Entre 3,25 y 4,65 ppm se observan las señales correspondientes a la lactosa, indicando la introducción del fragamento glicosídico en la estructura del polielectrolito. Por integración de las señales pudo calcularse una relación de lactosa: alilamina de 1:10 (una lactosa por cada 10 monómeros) y complejo de osmio:alilamina igual a 1:35.

La combinación de Os-PA-lac con SDS produce un precipitado que no puede solubilizarse en metanol o DMF. Evidentemente la incorporación del residuo glicosídico produce cambios en las características del complejo formado. Por lo tanto, para lograr solubilizarlo debe utilizarse un solvente o mezcla de solventes adecuados. De preferencia, en la presente invención se utiliza una mezcla de DMSO-DMF. El material así obtenido puede se aplicado a las diferentes superficies mediente técnicas conocidas por el experto en la técnica. Como ejemplo no limitante, puede aplicarse sobre las diferentes superficies mediante la técnica de spin-coating.

La solución del material compuesto puede ser fácilmente manipulada y aplicada sobre superficies de oro o silicio, produciendo una capa estable luego de la evaporación del solvente. Estudios de GISAXS para esta película muestran una región brillante (de mayor intensidad) en la dirección q _z (para q _y → o) y la presencia de un halo de intensidad apreciable (Figura 2). Esto indicaría que si bien existen dominios lamelares (d = 3.67 nm) orientados en dirección paralela al sustrato existe una fuerte contribución de dominios lamelares multi-orientados (dominios pequeños orientados aleatoriamente), lo que implica que la presencia de lactosa en el polielectrolito introduce cierto desorden en la estructura del sistema.

El ensamblado de ConA puede ser seguido también mediante microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). La Figura 3 representa los cambios en la frecuencia cuando el electrodo modificado se puso en contacto con un flujo de solución 1 μΜ de ConA en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo CaCl ₂ 0,5 mM y MnCl ₂ 0,5 mM. La exposición inicial a la solución de ConA condujo a una rápida disminución en la frecuencia, seguida por una ligera y constante disminución. Estos cambios de frecuencia pueden ser traducidos a masa mediante la ecuación de Sauerbrey.

Para las condiciones de crecimiento mostradas en la Figura 3 se observa un cambio de masa de 4,4 g crrr ² , que correspondería a 4,2 x 1er ¹¹ moles crrr ² si se considera que toda la masa ensamblada es debida a la proteína. Si bien este valor puede estar sobredimensionado, ya que también debe considerarse el agua atrapada en la película formada, corresponde a más de 20 veces el de una monocapa determinada por resonancia de plasmón superficial (1,8 x 10 ¹² moles crrr ² ) [37], lo que muestra que el polielectrolito en este caso presenta una estructura lo suficientemente abierta como para permitir la incorporación de una proteína de 104 kDa de peso molecular. Posteriormente, se hizo circular una solución de HRP, produciéndose un cambio de frecuencia equivalente a 0,36 g crrr ² , que correspondería a 8,5 x 10 ¹² moles crrr ² .

Los resultados obtenidos muestran que si bien ConA y HRP fueron incorporadas al electrodo, la ConA podría estar actuando como una barrera en el proceso de transferencia electrónica entre los centros de osmio del polielectrolito y la enzima. Por esta razón, todas las plataformas que se detallan a continuación involucran la incorporación de una concanavalina A con actividad redox (Os-ConA) como bloque de construcción bifuncional, que permite tanto el ensamblado directo de la HRP, como así también el proceso de transferencia electrónica desde el grupo prostético de la enzima hasta la superficie del electrodo.

Se llevo a cabo la modificación de electrodos de oro mediante la técnica de spin- coating tal como se describe en la sección correspondiente a ejemplos, generándose de esta manera una capa de espesor uniforme del material compuesto Os-PA-lac+SDS, la cual permite la posterior incorporación de Os-ConA, seguida de la incorporación de HRP. Luego, mediante un nuevo paso de ensamblado se incorpora una capa de Os-PA-lac, lo que sienta las bases para incorporar, de ser necesario, una nueva capa de Os-ConA y HRP.

Una de las ventajas de esta configuración es la facilidad con que se realiza su construcción, ya que, para obtener las distintas capas luego de la modificación con el complejo, tan sólo es necesario disolver el reactivo correspondiente en las condiciones adecuadas para promover el ensamblado. La Figura 4 muestra de manera esquemática el proceso de modificación de los electrodos.

Tal como se indicó antes, el primer paso de la construcción consiste en la incorporación de una capa de espesor uniforme de Os-PA-lac+SDS. Dado que este primer paso de modificación del electrodo de oro se lleva a cabo mediante la técnica de spin- coating, es posible variar el espesor de esta primer capa variando las condiciones de la técnica. A fin de analizar los efectos que diferentes espesores de la capa inicial pudieran tener sobre el proceso de transferencia electrónica, se examinaron dos casos: en primer lugar se estudió el comportamiento de un electrodo modificado sobre una capa inicial delgada de Os-PA-lac, y luego se realizó el mismo análisis para un electrodo modificado con una capa inicial gruesa del mismo material.

Sobre una capa inicial delgada del material compuesto se llevaron a cabo las etapas descriptas en la Sección correpondiente a ejemplos, obteniéndose la construcción Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP. La Figura 5 muestra la respuesta voltamétrica obtenida en buffer HEPES para dicho electrodo. La carga inicial de osmio observada en este caso es de 8.5 μθ cm ² . El comportamiento catalítico del electrodo modificado fue evaluado mediante voltametría cíclica en presencia de concentraciones crecientes de H ₂ 0 ₂ , desde 0,01 mM hasta 10 mM. En la Figura 6 se muestra la respuesta voltamétrica obtenida para el electrodo en presencia de 250 μΜ de H ₂ 0 ₂ , poniendo de manifiesto la actividad catalítica del ensamblado. Este resultado permite corroborar no sólo que la Os-ConA suministra la plataforma de bioafinidad necesaria para anclar a la HRP, sino que además permite la transferencia electrónica desde los centros hemo de la enzima hasta la superficie del electrodo. Con el objeto de constatar si esta respuesta catalítica podría ser mejorada, se ensambló una nueva capa de glicopolielectrolito redox sobre la HRP, como se describe en la Sección correspondiente a ejemplos, obteniéndose la construcción Au/Os-PA- lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os-PA-lac. Al analizar los resultados obtenidos para este nuevo paso de ensamblado, se observa un incremento de las corrientes catalíticas con respecto al electrodo sin esta nueva capa del polielectrolito; como ejemplo, en presencia de 250 μΜ de H2O2 se observa una corriente catalítica de 8,3 μΑ cm ² (Figura 7), contra 3,5 μΑ crrr ² obtenida para la misma concentración de sustrato en el caso anterior. Este incremento de las corrientes catalíticas puede ser atribuido a un incremento en la concentración de centros de osmio disponibles para conectar más eficientemente a la enzima con el electrodo.

Por otra parte, si se comparan las respuestas catalíticas de ambos sistemas a concentraciones crecientes de sustrato, se evidencia que la saturación de la enzima ocurre a una concentración mayor al agregar una nueva capa de Os-PA-lac sobre la HRP (Figura 8), mostrando que además los nuevos sitios de osmio agregados permiten regenerar a la enzima postergando su inhibición a más altas concentraciones de sustrato. Por otro lado, siguiendo el mismo protocolo descripto para la construcción del electrodo descrito anteriormente, pero variando las condiciones de spin-coating, puede obtenerse una capa inicial más gruesa de Os-PA-lac+SDS sobre la superficie de oro. Al modificar el electrodo con esta primera capa se observa en este caso una carga inicial de osmio de 111 cm ² , más de diez veces mayor a la carga de osmio inicial observada para el electrodo de capa delgada. La Figura 9 muestra el voltagrama obtenido en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, 0,1 M KN0 ₃ .

Sobre esta capa inicial gruesa se llevaron a cabo los etapas descritas anteriormente, obteniéndose nuevamente la construcción Au/Os-PA-lac+SDS/Os- ConA/HRP. Cuando se realizan las medidas en presencia de sustrato, se observa un marcado incremento en la respuesta catalítica de este electrodo con respecto al electrodo de capa delgada, mostrando, por ejemplo, un incremento de 15 veces en la catálisis a 250 μΜ de H2O2 (Figura 10, voltagrama en rojo). Si se analiza el aspecto del voltamograma correspondiente a una concentración de 250 μΜ, se observa que la corriente de reducción es mayor que la de oxidación, atribuible a la catálisis de reoxidación parcial del osmio presente en la película. Cuando la concentración aumenta a 1 mM, el aspecto del voltamograma es típico de un proceso EC' [5i] donde no se observa la oxidación electroquímica del complejo de osmio (Figura 10, voltagrama en azul).

En el siguiente paso, al agregar la nueva capa del glicopolielectrolito redox sobre la HRP, se observa una importante diferencia con el electrodo de capa delgada, ya que en este caso las corrientes catalíticas obtenidas no aumentan, sino que incluso disminuyen cuando las concentraciones de sustrato superan los 250 μΜ.

Con el objeto de mejorar la sensibilidad del electrodo se ensayó la incorporación de una nueva capa de la enzima, mediante la construcción Au/Os-PA-lac+SDS/Os- ConA/HRP/Os-PA-lac/Os-ConA/HRP. En la Figura 11 puede observarse cómo las corrientes catalíticas aumentan significativamente, lo que indica que no sólo se ha logrado incorporar más HRP sino que además ésta se halla muy bien conectada. Estos resultados indican que la introducción de una segunda capa de Os-PA-lac permite obtener sobre el electrodo una mayor superficie a la cual ensamblar una nueva capa de Os-ConA y, en consecuencia, más HRP. Además puede observarse que con esta segunda capa el control difusional es aún mayor. Compárese la corriente obtenida para una concentración 1 mM de H ₂ 0 ₂ en la Figura 10 y en la Figura 11. Para la primera se observa un plateau con muy poca histéresis, mientras que para la segunda se observa una corriente pico cuyo valor es un 50% mayor que la obtenida en el caso anterior y una importante disminución de la corriente luego de haber llegado a su máximo, indicativo de un fuerte consumo local del sustrato y la imposibilidad de recuperar su concentración original por difusión [52]. En lo que respecta a la inhibición por concentración, en este último sistema se observa que la máxima corriente se obtiene a una concentración de 2 mM, y que ese valor también coincide con un comportamiento catalítico típico de un sistema EC [51].

En la Figura 12 se comparan las respuestas catalíticas medidas para ambos sistemas, Au/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP (en negro) y Au/Os-PA-lac+SDS/Os- ConA/HRP/ Os-PA-lac/Os-ConA/HRP (en rojo), a concentraciones crecientes de sustrato.

Por último otro posible mecanismo de ensamblado es utilizar el complejo glicopolielectrolito redox+SDS como sistema de anclaje a la superficie y luego crecer alternativamente capas de Os-ConA y HRP, de manera de generar un sistema Au/Os-PA- lac+SDS/ (Os-ConA/HRP) _n . En la Figura 13 se muestra la respuesta catalítica para una concentración de 250 μΜ de H ₂ 0 ₂ utilizando electrodos con n = 1, 2 y 3. Puede verse que este tipo de ensamblado no presenta una mejora significativa en las corrientes catalíticas al agregar una segunda o tercer capa de HRP, ratificando la necesidad de intercalar una capa de glicopolielectrolito redox. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Reactivos

Dodecilsulfato de sodio (SDS) fue provisto por Kodak. Concanavalina A (ConA, extraída del poroto Canavalia ensiformis), peroxidasa de rábano picante (HRP, tipo VI; RZ = 3.1), lactosa, galactosa oxidasa (obtenida de Dactylium dendroides) y buffer HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-i-piperazina etanosulfónico) fueron provistos por Sigma. Peróxido de hidrógeno 30% (H ₂ 0 ₂ ) fue provisto por Cario Erba y su concentración fue determinada mediante titulación con permanganato de potasio. Las membranas de diálisis de celulosa regenerada (RC Spectra/Por) de corte molecular 3500 se obtuvieron de Spectrum® Laboratories. Dimetilsulfóxido (DMSO) fue provisto por Mallinckrodt y dimetilformamida (DMF) fue provista por Cario Erba. El resto de los reactivos utilizados fueron de calidad analítica. Las soluciones stock de H ₂ 0 ₂ se prepararon, inmediatamente antes de ser utilizadas, en concentración 13 mM en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo KNO ₃ 0,1 M.

Síntesis del glicopolielectrolito redox Os-PA-lac

36 mg de lactosa fueron disueltos en 2 mL de buffer HEPES 100 mM, pH 6,5; la solución se saturó con oxígeno y se mantuvo bajo agitación. Se agregaron 200 U de galactosa oxidasa. La mezcla de reacción se incubó por 48 horas a 37 °C con agitación y bajo atmósfera de oxígeno [53]. Finalizada la reacción, se enfrió la solución a temperatura ambiente y la mezcla fue centrifugada con el fin de separar las impurezas que acompañan a la enzima. La lactosa modificada presente en el sobrenadante fue purificada cromatográficamente a temperatura ambiente utilizando dos columnas de desalado Hitrap en serie (GE Healthcare de 5 mL de capacidad cada una). A tal efecto se empleó un sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) Modelo ÁKTA Explorer 10 (GE Amersham). El buffer de elución empleado fue buffer HEPES 15 mM pH 7,4, conteniendo NaCl 15 mM. La columna fue equilibrada con al menos 2 volúmenes de columna de buffer de elución. La muestra fue inyectada y eluída isocráticamente a un flujo de 5 mL min ¹ , colectando fracciones de 3 mL. El seguimiento de la corrida cromatográfica se realizó registrando cambios de conductividad respecto al valor que presenta el buffer de elución. Finalmente, las fracciones fueron agrupadas y liofilizadas. La lactosa modificada, purificada y liofilizada se conservó a -20 °C hasta su utilización.

La fracción de lactosa modificada y liofilizada, fue disuelta en 1.5 mL de buffer HEPES 50 mM pH 7,4. Por otro lado, a 2 mL de solución de Os-PA 0,2 mM en agua Milli-Q se les agregó un exceso de cianoborohidruro de sodio y sobre esta solución se adicionó la solución de lactosa en buffer HEPES. La mezcla resultante se dejó reaccionar durante toda la noche a temperatura ambiente y con agitación, y finalmente, bajo constante agitación, se le adicionó una solución de borohidruro de sodio en agua y se dejó reaccionar 1 hora a temperatura ambiente.

El producto fue dializado contra agua Milli-Q durante 48 horas usando tubos de corte molecular 3500 Da, y liofilizado. Caracterización de Os-PA-lac

El glicopolielectrolito redox obtenido, Os-PA-lac, fue caracterizado mediante espectroscopia RMN Ή empleando un espectrómetro Broker Avance 500 MHz. La señales presentes entre 6,75 y 8,75 ppm corresponden a los ligandos piridínicos del complejo de osmio, mientras que las señales en la región entre 0,75 y 3,25 ppm corresponden al esqueleto del polielectrolito. Entre 3,25 y 4,65 ppm se observan las señales correspondientes a la lactosa, indicando la introducción del fragmento glicosídico en la estructura del polielectrolito. Por integración de las señales pudo calcularse una relación de lactosa:alilamina de 1:10 (una lactosa por cada 10 monómeros) y complejo de osmio:alilamina igual a 1:35.

El producto de la reacción también fue caracterizado por análisis elemental de CHNS empleando un equipo Cario Erba EA 1108. Cálculos estequiométricos a partir de los resultados de análisis elemental permitieron obtener una relación lactosa: alilamina de 1:10, confirmando el resultado anterior. Síntesis del material compuesto Os-PA-lac+SDS

A partir de Os-PA-lac liofilizado se preparó una solución 0.2 mM en agua Milli-Q. 200 μΐ, de dicha solución se mezclaron con 400 μΐ, de una solución 1% de SDS en agua; la mezcla generó de manera inmediata un precipitado, que fue separado fácilmente mediante centrifugación. Este precipitado es parcialmente soluble en dimetilformamida (DMF), por tal motivo se añadieron 500 μΐ, de DMSO y se sónico durante 15 minutos para favorecer la total disolución. El DMSO fue parcialmente evaporado y se completó el volumen de 500 μΐ, con DMF, a fin de permitir una más rápida evaporación del solvente durante la modificación de los electrodos.

Construcción de electrodos modificados

Se emplearon como electrodos de trabajo láminas planas de silicio recubiertas con oro. Se verificó la limpieza del oro por voltametría cíclica en H ₂ S0 ₄ 1,8 M. Posteriormente, los electrodos fueron sometidos a modificación.

Modificación con el material compuesto ÍAu/Os-PA-lac+SDS) El primer paso de modificación de los electrodos consistió siempre en la aplicación de una capa de espesor uniforme, mediante la técnica de spin-coating, de la solución de Os-PA-lac+SDS en DMSO/DMF. Para ello, 10 μΐ, de la solución se colocaron sobre la superficie de oro limpia, la cual se rotó de manera de distribuir el material homogéneamente. Los electrodos se dejaron 1 hora a temperatura ambiente, a fin de permitir la completa evaporación del solvente y finalmente fueron enjuagados con agua Milli-Q y secados con N ₂ .

Conjugación de ConA con complejos de osmio ÍOs-ConA) La concanavalina A modificada con un complejo de Osmio (Os-ConA) fue previamente sintetizadasegún [183]. Brevemente, la ConA fue marcada con [0s(bpy) ₂ ClpyCH0] ⁺ mediante el uso de un espaciador de polientilenglicol (PEG) de 336 Da conteniendo un grupo amino y un grupo carboxilato como grupos funcionales terminales; la elección de este linker se basa en su habilidad para exponer los centros redox a la solución circundante, facilitando su conexión a la enzima y para inhibir interacciones inespecíficas con el medio biológico debido a su carácter hidrofílico. Se incorporaron 12 sondas redox. Controles

Para los experimentos control, sobre electrodos modificados como se describe en el ejemplo anterior se realizaron los siguientes pasos de modificación:

Modificación con HRP ÍAu/Os-PA-lac+SDS/HRP)

Un electrodo modificado se incubó en una solución de HRP i μΜ en buffer HEPES 50 mM pH 7.4, conteniendo CaCl ₂ (0,5 mM) y MnCl ₂ (0,5 mM) durante 1 hora. El mismo buffer se utilizó para enjuagar el electrodo, una vez finalizado el tiempo de incubación.

Modificación con ConAy HRP ÍAu/Os-PA-lac+SDS/ConA/HRP)

Para el segundo experimento control, otro electrodo modificado ÍAu/Os-PA- lac+SDS) se incubó en una solución de ConA 1 μΜ en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo CaCl ₂ (0,5 mM) y MnCl ₂ (0,5 mM) durante 1 hora. El mismo buffer se utilizó para enjuagar el electrodo, una vez finalizado el tiempo de incubación. La modificación con una capa de HRP sobre la capa de ConA se llevó a cabo repitiendo el paso correspondiente a la sección Modificación con HRP

Electrodos de trabajo Sobre electrodos modificados según lo descripto en el ejemplo anterior, se realizaron los siguientes pasos de modificación: a) Modificación con Os-ConA ÍAu/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA) El electrodo modificado se incubó en una solución de Os-ConA 1 μΜ en buffer

HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo CaCl ₂ (0,5 mM) y MnCl ₂ (0,5 mM) durante 1 hora. El mismo buffer se utilizó para enjuagar el electrodo, una vez finalizado el tiempo de incubación. b) Modificación con HRP ÍAu/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP)

El electrodo modificado se incubó en una solución de HRP 1 μΜ en buffer HEPES 50 mM H 7,4, conteniendo CaCl ₂ (0,5 mM) y MnCl ₂ (0,5 mM) durante 1 hora. El mismo buffer se utilizó para enjuagar el electrodo, una vez finalizado el tiempo de incubación. c) Modificación ÍAu/Os-PA-lac+SDS/Os-ConA/HRP/Os-PA-lac)

Una nueva capa de glicopolielectrolito fue ensamblada sobre el electrodo modificado incubándolo durante 1 hora en una solución de Os-PA-lac 0,2 mM en buffer HEPES 50 mM pH 7,4. El mismo buffer se utilizó para enjuagar el electrodo, una vez finalizado el tiempo de incubación. d) Medidas de XRR y GISAXS

Para las medidas de XRR y GISAXS como sustrato de apoyo se utilizaron obleas de Si(ioo); 50 μΐ, de la solución Os-PA-lac+SDS se colocaron sobre la superficie limpia, la cual se rotó de manera de distribuir el material homogéneamente. e) Medidas electroquímicas

Las medidas electroquímicas se realizaron empleando un sistema estándar de tres electrodos junto con un potenciostato (TEQ-02). El sistema consistió en un electrodo de trabajo, una malla de platino como contraelectrodo y un electrodo de Ag/AgCl como electrodo de referencia. Los electrodos de trabajo se prepararon el mismo día de su implementación. Todos los experimentos electroquímicos se realizaron a temperatura ambiente, en una celda de teflón diseñada para exponer 0,196 cm ² de la superficie del electrodo a la solución. f) Medidas voltamétricas

Los electrodos funcionalizados fueron medidos inmediatamente luego de su preparación. Para todos los ensayos descriptos, los electrodos se enjuagaron e introdujeron en la celda electroquímica. Las soluciones fueron desoxigenadas con N ₂ puro durante 2 minutos antes de realizar las medidas voltamétricas. Los experimentos electroquímicos se llevaron a cabo en buffer HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo KN0 ₃ 0,1 M. Los electrodos modificados se conectaron al potenciostato, dejando equilibrar con la solución. Se realizó una primera voltametría en buffer y luego se agregaron cantidades crecientes de la solución stock de peróxido de hidrógeno descripta en 6.2.1, de tal manera de obtener concentraciones de 0,01 mM hasta 10 mM. g) Microgravimetria

Para estudiar las masas de ConA y HRP incorporadas al electrodo se realizaron mediciones en Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM). El área geométrica del electrodo de trabajo es de 1.33 cm ² . La superficie de oro del electrodo fue modificada con Os-PA-lac+SDS mediante spin-coating.

El experimento se realizó utilizando una celda de flujo de 150 μΐ, de volumen fabricada en teflón, conectada a una válvula selectora, la cual permitía el cambio de soluciones durante el experimento. Se trabajó a un flujo de 3 mL h ¹ durante todo el experimento. Como buffer de corrida se utilizó buffer HEPES 50 mM pH 7,4, conteniendo CaCl ₂ (0,5 mM) y MnCl ₂ (0,5 mM). Las soluciones de ConA y HRP fueron preparadas en el mismo buffer. En primer lugar se hizo circular por la celda un flujo del buffer. Una vez estabilizado el sistema se cambió la posición de la válvula permitiendo el paso de una solución 1 μΜ de ConA y se registraron las variaciones de frecuencia y resistencia. A fin de definir de manera precisa la masa de ConA firmemente unida sobre el polielectrolito, se hizo circular nuevamente un flujo del buffer, con el objeto de lavar exhaustivamente el electrodo. A continuación, se pasó un flujo de solución 1 μΜ de HRP y finalmente se repitió el paso de lavado.

Entre otras, una de las ventajas del material compuesto polielectrolito-surfactante es la facilidad con la que permite modificar una superficie independientemente de su composición química. Con el objeto de comprobar que no es viable una construcción más sencilla, se realizaron dos experimentos control. Para ello, sobre electrodos de orodel tipo Au/ Os-PA-lac+SDS y Au/Os-PA-lac+SDS/ConA, se realizaron las siguientes modificaciones:

Configuración Au/Os-PA-lac+SDS/HRP

El intercambio de electrones entre HRP y Os-PA ha sido previamente reportado. [54] En ese caso, el polielectrolito y la enzima se mantienen unidos a la superficie del electrodo mediante entrecruzamiento con polietilendiglicidileter. Por otro lado, el autoensamblado de esta enzima con el polielectrolito no es posible y lo que se informa en la literatura es el autoensamblado de este polielectrolito con peroxidasa proveniente de poroto de soja [27]. A fin de corroborar que la HRP no puede ser ensamblada de manera directa al glicopoli electrolito, en primer lugar se ensayó un ensamblado Au/Os-PA-lac+SDS/HRP. Una vez obtenida la configuración deseada, y con el objeto de ensayar la misma, se realizaron voltametrías cíclicas en buffer HEPES 50 mM pH 7,4 conteniendo KN0 ₃ 0,1 M, en ausencia de sustrato y en presencia de concentraciones crecientes del mismo, desde 0.01 mM hasta 10 mM. La Figura 14 muestra los voltagramas obtenidos para esta construcción, en ausencia de sustrato, en presencia de 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ , y agregando luego 20 μΜ de [0s(bpy) ₂ ClpyC00H] ⁺ . Se observa la ausencia de respuesta catalítica en presencia de sustrato, aún utilizando un mediador soluble, lo que indica la ausencia de la HRP en el electrodo, y por lo tanto, la necesidad de utilizar un elemento adicional para mantener a la enzima unida al glicopolielectrolito.

Configuración Au/Os-PA-lac+SDS/ConA/HRP En base al resultado anterior, el siguiente control consistió en ensayar la ConA como linker específico para la unión de la enzima al glicopolielectrolito redox resultanado en un electrodo constituido por Au/Os-PA-lac+SDS/ConA/HRP. A fin de evaluar el funcionamiento de este electrodo, se realizaron voltametrías cíclicas en ausencia de H ₂ 0 ₂ y en presencia de concentraciones crecientes del sustrato. La Figura 15 muestra los voltagramas obtenidos para esta construcción, observándose que no hay cambios significativos entre las medidas realizadas a o y 500 μΜ de H ₂ 0 ₂ . (voltagramas en negro y rojo, respectivamente).

Con el propósito de demostrar la presencia de la enzima redox inmovilizada sobre la superficie del electrodo, se evaluó la respuesta catalítica amperométrica de la enzima con un mediador redox presente en solución; el agregado del mediador redox soluble [0s(bpy) ₂ ClpyC00H] ⁺ permite poner de manifiesto la respuesta catalítica, probando que si bien la enzima está ensamblada, no presenta una adecuada conexión con la superficie del electrodo (Figura 15, voltagrama en azul).

Todas las publicaciones mencionadas se incorporan a la presente, como referencia, en su totalidad. REFERENCIAS

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