La présente invention a trait au domaine du suivi personnalisé de changements du métabolisme en fonction de paramètres extérieurs tels que l'alimentation ou l'exercice physique. L'invention concerne plus particulièrement des bandelettes électrochimiques de détection de la quantité de biomarqueurs du métabolisme des graisses, en particulier le glycérol.

La masse graisseuse corporelle d'un individu évolue en fonction de différents paramètres, notamment en fonction de son alimentation et de son activité physique. L'incidence de ces deux paramètres sur la masse graisseuse est aujourd'hui bien établie. Il apparaît donc intéressant pour un individu qui cherche à perdre de la masse graisseuse, de pouvoir évaluer l'incidence de ces paramètres. Une meilleure connaissance de son métabolisme va permettre à un individu d'identifier la meilleure combinaison alimentation/ exercice physique qui lui est propre en vue de perdre du poids.

Afin de connaître l'influence directe de paramètres extérieurs sur la quantité de graisse corporelle, il est possible de suivre l'évolution de biomarqueurs qui reflètent la dégradation de la graisse. Différents biomarqueurs ont été décrits comme étant associés à la lipolyse, comme les cétones, les acides gras libres et le glycérol.

Le glycérol est un marqueur d'intérêt puisque sa quantité dans le sang reflète directement la lipolyse. Ainsi, en analysant la quantité de glycérol circulant, on peut savoir, à tout moment, si l'organisme puise dans ses réserves de graisse ou pas, et évaluer le niveau de lipolyse. Le suivi de la quantité de glycérol circulant fournit une information en temps réel sur la dégradation des graisses par l'organisme. Ainsi, mesurer le niveau de lipolyse d'un individu souhaitant perdre du poids permet d'obtenir une information sur l'efficacité de ses efforts alimentaires et/ou physiques. L'analyse de la quantité de glycérol circulant permet également de détecter de manière précoce une cachexie (perte de poids non- réversible) et de suivre son évolution en cas de traitement, notamment chez des individus atteints de cancer ; en effet, chez ces patients, une lipolyse élevée est un marqueur de la cachéxie (Ebadi et Mazurak, 2015, Mediators of inflammation). Il serait donc particulièrement intéressant pour suivre l'évolution de la masse graisseuse, de disposer d'un moyen simple d'utilisation, fiable et accessible à tous. Etat de la technique

Un système de détection et de quantification de cétones dans le sang est décrit dans la demande WO2016/178823. Ce document décrit des bandelettes électrochimiques permettant de contrôler le niveau de cétones circulantes grâce à la présence d'hydroxybutyrate déhydrogenase et de NAD. Ces bandelettes ont la particularité de permettre la quantification simultanée des cétones et du glucose et sont adaptées au suivi des troubles de la glycémie chez les patients diabétiques.

Des bandelettes pour mesurer la perte graisseuse au cours d'un régime sont décrites dans la demande US2004/0043376. Ces bandelettes permettent un suivi de cétones circulantes dans un échantillon de plasma par colorimétrie. Toutefois, ce système n'est pas adapté à une analyse sur sang total. Le fait de devoir obtenir du plasma implique un traitement de l'échantillon au laboratoire. D'autre part, des bandelettes électrochimiques permettant de quantifier les cétones et donc de contrôler la cétonémie sont disponibles dans le commerce.

Des systèmes de détection du glucose sur sang total sont disponibles pour suivre la glycémie chez les personnes diabétiques. Ces systèmes sont basés sur l'utilisation de bandelettes électrochimiques et analyse de la quantité de glucose présente dans le sang par ampérométrie. De telles bandelettes sont bien connues et sont décrites par exemple dans les demandes de brevet EP2812444 et WO200042422.

Si la quantité de cétones est considérée comme indicative de la perte graisseuse, elle ne constitue pas un marqueur fiable. Il existe donc un besoin de disposer d'un système de suivi de la dégradation graisseuse qui repose sur un marqueur étroitement corrélé à la lipolyse. Avantages de l'invention

L'invention propose des bandelettes électrochimiques permettant la quantification du glycérol dans le sang.

Le glycérol circulant résulte directement de la dégradation des lipides et reflète le métabolisme de la dégradation de masse graisseuse corporelle. Il constitue donc un biomarqueur particulièrement pertinent pour suivre la dégradation graisseuse. Les bandelettes selon l'invention permettent à un individu de faire sa propre analyse sans équipement scientifique, en utilisant un dispositif portatif. L'analyse est réalisée sans connaissance particulière puisque le résultat est obtenu par simple lecture.

Grâce à l'invention, on peut ainsi établir simplement une corrélation entre les aliments consommés (le régime suivi) et leurs conséquences sur le métabolisme des graisses de manière personnalisée. De même, une corrélation peut être obtenue avec les activités sportives, par exemple en fonction de leur intensité et /ou de leur durée. Ainsi, l'invention fournit un moyen simple et innovant permettant d'identifier la meilleure combinaison régime alimentaire et activité physique pour perdre du poids et atteindre ses objectifs. Le dispositif peut être relié à une application disponible sur smartphone ou autre support informatique de sorte à faciliter l'enregistrement des données, leur analyse ainsi qu'un suivi au cours de temps. L'invention permet également de suivre la dégradation graisseuse dans le contexte du suivi de la cachexie associée à une maladie, notamment chez les patients atteints de cancer.

Grâce aux bandelettes électrochimiques associées à un dispositif de lecture tel que celui décrit dans la demande brevet WO2016/097615, un individu peut obtenir en temps réel des informations relatives à la quantité de graisses brûlées. Cette analyse peut être effectuée immédiatement après un effort physique ou quelques heures après l'initiation d'un régime alimentaire. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne une bandelette électrochimique permettant la détection du glycérol dans un échantillon de fluide corporel comportant :

- une couche de substrat électriquement isolante

au moins deux électrodes, de sorte à avoir une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode, les fonctions de l'électrode de référence et de la contre-électrode étant assurées par une seule et même électrode dans la configuration d'une bandelette à deux électrodes

- au moins autant de pistes électriques que le nombre d'électrodes

une couche d'enzymes contenant des enzymes spécifiques du glycérol, choisies entre (i) la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase, ou (ii) la glycérol déshydrogénase, ladite couche d 'enzymes étant disposée sur les électrodes une couche de cofacteurs choisis entre (i) soit d'adénosine tri-phosphate (ATP) et chlorure de magnésium (MgC12) lorsque les enzymes sont la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase, (ii) soit le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD ⁺ ) lorsque l'enzyme est la glycérol déshydrogénase.

au moins une couche de membrane

une couche d'espacement située entre les électrodes et la couche supérieure, ladite couche d'espacement permettant de créer un espace définissant le volume de la chambre de mesure

une chambre de mesure destinée à recevoir l'échantillon, ladite chambre recouvrant au moins partiellement les électrodes et la couche d'enzymes une couche supérieure.

Le principe d'utilisation de cette bandelette est le suivant : un échantillon de fluide biologique est déposé dans la chambre de mesure soit directement dans l'espace situé entre la couche de substrat et la couche supérieure, soit via l'encoche aménagée sur la couche supérieure lorsque celle-ci est présente. La mise en contact de l'échantillon avec l'électrode de travail entraîne une réaction éleclToehimique grâce aux enzymes présentes in situ. En vue de son utilisation, la bandelette est préalablement insérée dans un lecteur spécifique disposant d'un ampèremètre ; ce dernier est relié à une application disponible par exemple sur téléphone portable de type smartphone, capable d'interpréter les signaux correspondant aux micro-courants générés par la réaction électrochimique, L'application fournit alors un résultat à l'utilisateur.

L'échantillon de fluide biologique peut être tout échantillon susceptible de contenir du glycérol, notamment un échantillon de salive, de sueur, de larme, de sang... Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon de fluide biologique est un échantillon sanguin. Le volume d'une goutte de sang à déposer sur la bandelette est généralement compris entre 0,3 et 5 microlitres.

La couche de substrat assure une fonction de support. Le matériau de la couche de substrat peut être choisi parmi les matériaux isolants électriques. Il peut s'agir d'une matière plastique telle que le polychlorure de vinyl, polycarbonate, polysulfone, polyester, polyimide, polyéthylène, polypropylène, polyéthylène téréphtalate..., mais également d'autres matériaux tels que métaux, céramiques, matériaux composites. Lorsque la couche de substrat n'est pas réalisée dans un matériau isolant, elle est recouverte d'une couche isolante. Une telle couche de substrat peut être en aluminium passivé. Ainsi, par « couche de substrat électriquement isolante », on entend au sens de l'invention, soit une couche de substrat en matériau électriquement isolant, soit, lorsque la couche de substrat n'est pas réalisée dans un matériau isolant, une couche de substrat recouverte d'un film électriquement isolant. La forme du substrat peut être variée, par exemple rectangulaire, triangulaire, de forme complexe avec encoche ou bout arrondi.

Classiquement, une bandelette électrochimique comporte 3 électrodes qui jouent chacune un rôle défini. La première électrode, dite « électrode de travail », permet de mesurer le produit de la réaction enzymatique, que le produit soit oxydé ou réduit. La 2ème électrode, dite « électrode de référence », sert à fixer le potentiel de référence (la différence de potentiel qui sert à réaliser la mesure est réalisée entre cette électrode et l'électrode de travail). La 3ème électrode, appelée « contre-électrode », sert à compenser les charges échangées entre la solution électrolytique (c'est-à-dire l'échantillon) et l'électrode de travail. Le courant mesuré pendant la mesure l'est entre l'électrode de travail et cette contre-électrode. Des électrodes supplémentaires peuvent être ajoutées pour supporter d'autres fonctionnalités telles que la détection de l'insertion de la bandelette dans le lecteur, la détection du remplissage de la chambre de mesure...

Une bandelette selon l'invention comporte au minimum 2 électrodes, mais peut en contenir également 3, 4, 5 ou plus, en fonction de la configuration de la bandelette et des fonctions qu'elle assure. Lorsque la bandelette ne présente que deux électrodes, les fonctions de l'électrode de référence et de la contre-électrode sont assurées par une seule et même électrode. Lorsque la bandelette comporte 3 électrodes, celles-ci correspondent de préférence à l'électrode de travail, l'électrode de référence et la contre-électrode.

La forme des électrodes n'est pas contraignante ; elles peuvent par exemple être rectangulaires et présenter une surface de contact avec l'échantillon de fluide biologique comprise entre 0,5 et 2 mm ² . L'électrode de travail est de préférence en carbone ou en platine, mais peut également être réalisée avec d'autres métaux, alliages métalliques ou polymères conducteurs.

Dans un mode de réalisation particulier, l'électrode de travail est en platine. De préférence, une telle électrode n'est pas fonctionnalisée.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'électrode de travail est en carbone et est fonctionnalisée par ajout de bleu de Prusse. D'autres catalyseurs peuvent alternativement être appliqués sur l'électrode de travail tels que des ions ferri/ferrocyanure, des complexes d'osmium, du ferrocène ou l'un de ses dérivés tel que le ferrocène-méthanol, un polymère rédox (de type polyaniline, polypyrrole, poly-ferrocène), du tétramethylbenzidine. Dans un mode de réalisation préféré, l'électrode est carbone et est fonctionnalisée par ajout de ferrocène-méthanol.

L'électrode de référence contient de préférence de l'argent ou du chlorure d'argent, mais peut également être réalisée avec d'autres oxydes ou sels métalliques, notamment d'argent, voire avec un polymère redox, notamment un poly-ferrocène.

La contre-électrode peut être en tout matériau conducteur approprié tel que du carbone, du platine, de l'argent ou tout autre métal ou autre matériau conducteur.

La bandelette comporte un nombre de pistes électriques au moins identique au nombre d'électrodes, à savoir au moins deux. La bandelette peut comporter des pistes non reliées aux électrodes ; une piste non reliée à une électrode peut par exemple être utilisée pour permettre la détection de la bandelette par le lecteur. Les pistes électriques sont préférentiellement en carbone mais peuvent également être en métal tel que l'argent ou le cuivre. Leur largeur peut être comprise entre 0,1 et 1 mm, et leur longueur doit être suffisante pour relier les connectiques aux électrodes.

La couche d'enzymes présente sur la bandelette doit être spécifique du biomarqueur à détecter, à savoir le glycérol. Une fois en contact avec le glycérol, l'enzyme (ou les enzymes) le modifie(nt), grâce à ses (leurs) propriétés catalytiques. Cette modification permet de révéler la présence de glycérol modifié ou de coproduits du glycérol par la détection de micro-courants au niveau des électrodes, mais également de quantifier le glycérol présent dans l'échantillon. La couche d'enzyme est appliquée au minimum sur l'électrode de travail, mais peut également être appliquée sur toute la surface des électrodes

Dans un premier mode de mise en œuvre, les enzymes choisies pour révéler la présence du glycérol sont la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase. De manière optionnelle, la bandelette peut également contenir la peroxydase. Dans un mode de réalisation particulier, la couche d'enzymes contenant la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase contient également la péroxydase. Dans un autre mode de réalisation particulier, la péroxydase peut être contenue dans une couche distincte. Dans un second mode de mise en œuvre, l'enzyme choisie pour révéler la présence du glycérol est la glycérol déshydrogénase. De manière optionnelle, la bandelette contient également la diaphorase.

Dans un mode de réalisation particulier, la couche d'enzymes contenant la glycérol déshydrogénase contient également la diaphorase. Dans un autre mode réalisation particulier, la diaphorase peut être contenue dans une couche distincte.

La bandelette contient également des cofacteurs fonctionnant avec l'enzyme spécifique du glycérol choisie.

Lorsque les enzymes sont la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase, les cofacteurs sont l'adénosine triphosphate (ATP) et le chlorure de magnésium (MgC12). Lorsque l'enzyme est la glycérol déshydrogénase, le cofacteur est le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD ⁺ ). L'empilement de la couche d'enzyme(s) et de cofacteur(s) sur l'électrode de travail constitue la « couche sensible ». Cette couche sensible permet la détection du glycérol. Elle se trouve nécessairement entre la couche de substrat et la couche supérieure mais son agencement interne peut varier. En particulier l'ordre des couches d'enzyme(s) et de cofacteur(s) peut varier. D'autre part, les couches d'enzyme(s) et de cofacteur(s) peuvent être distinctes ou comprises dans une même couche comme cela a été mentionné précédemment. La couche sensible peut être appliquée uniquement sur l'électrode de travail ou être de la même taille que la chambre de mesure sans que cela affecte le fonctionnement de la bandelette. La couche sensible ne comprend pas l'électrode de travail. Toutefois, lorsqu'elle est fonctionnalisée, l'électrode de travail participe à la réaction et peut donc être considérée comme appartenant à la couche sensible. La couche sensible selon l'invention contient également une couche de membrane. Cette couche de membrane peut avoir des fonctions différentes telles que maintenir les autres constituants près de l'électrode, bloquer les interférents (filtrage), enrichir la couche en oxygène, ... et l'on peut ajouter plusieurs couches de membrane dans une même couche sensible. Une telle couche peut être réalisée en différents matériaux en fonction de la fonction recherchée. Une couche de membrane en chitosan sera préférentiellement ajoutée, notamment pour maintenir les enzymes en surface, mais on peut aussi choisir une couche de membrane en Nafion®, hydroxyméthyl cellulose, hydroxypropyl méthyl cellulose, acétate de cellulose, poly (4-vinylpyridine) ...

Dans un mode de réalisation préféré, la couche sensible comprend, outre les enzymes et les cofacteurs, une membrane en chitosan contenant du glutaraldéhyde.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la couche sensible comprend, outre les enzymes et les cofacteurs, une membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose.

Dans un mode de réalisation particulier, la couche sensible peut contenir un surfactant. Celui-ci peut être ajouté à différents niveaux. Des surfactants peuvent être utilisés dans le but de modifier les propriétés de tension de surface de l'électrode ou du substrat, pour guider l'échantillon sur l'électrode ou de manière plus générale pour améliorer les procédés de dépôt. Ils peuvent aussi être utilisés pour améliorer la solubilité des constituants lors des dépôts. A titre d'exemple, de tels surfactants peuvent être choisis parmi le dodécyl sulfate de sodium (SDS), Triton X-100... Dans un mode de réalisation préféré, la couche sensible contient un surfactant. Un surfactant particulièrement préféré est le triton X-100.

Dans un mode de réalisation tout à fait préféré, la couche sensible comprend des enzymes à savoir la glycérol kinase, la glycérol-phosphate oxydase et la péroxydase, des cofacteurs à savoir ΑΤΡ et le MgC12, de l'hydroxypropyl méthyl cellulose, du ferrocène-méthanol et un surfactant. Cette couche sensible peut être déposée en seule couche contenant l'ensemble des composants de la couche sensible. Dans un autre mode de réalisation particulier, la couche sensible peut contenir des agents réticulants (permettant un « cross-linking »). Ceux-ci sont préférentiellement ajoutés dans la couche de membrane au moment de son dépôt. Ils peuvent également être appliqués avec la couche d'enzyme(s) ou de cofacteur(s), ou entre ces deux couches, ainsi qu'entre les couches d'enzymes et de cofacteurs ou entre la couche d'enzyme ou la membrane en fonction de l'effet recherché. Un agent réticulant préféré est le glutaraldéhyde, mais d'autres tels que le PEDGE (poly éthylène glycol diglycidyl éther), EDC/NHS (l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide hydrochloré / N- hydroxysuccinimide), ou autres peuvent être utilisés.

La couche sensible peut donc contenir en plus des enzymes, des cofacteurs, et de la couche de membrane, et d'un surfactant, au moins un agent réticulant.

Dans un mode de réalisation particulier, la couche sensible comprend du bleu de Prusse, les enzymes glycérol kinase et glycérol phosphate oxydase, les cofacteurs ATP et MgCl ₂ , une couche de membrane en chitosan et du glutaraldéhyde en tant que réticulant.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la couche sensible ne contient pas de bleu de Prusse, mais contient les enzymes glycérol kinase et glycérol phosphate oxydase, les cofacteurs ATP et MgCl ₂ et une couche de membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose. Elle peut en outre contenir de la peroxydase, du ferrocène-méthanol et un surfactant.

La Figure 3 illustre un exemple d'empilement des différentes couches constituant une couche sensible, en d'autres termes un agencement fonctionnel des couches permettant la détection de la présence du glycérol au niveau de la chambre de mesure.

Une couche d'espacement est appliquée entre les électrodes et la couche supérieure, ladite couche d'espacement permettant de créer un espace définissant le volume de la chambre de mesure. De plus, cette couche d'espacement isole les électrodes.

Dans un mode de réalisation particulier, la surface des électrodes qui est exposée à l'échantillon peut être délimitée par une couche fine isolante additionnelle disposée entre les électrodes et la couche d'espacement. Cette couche d'espacement peut être constituée d'un matériau isolant électrique tel qu'un plastique ou une céramique ou d'une matière non isolante recouverte d'une couche fine isolante. Sa forme sera globalement identique à celle de la couche de substrat moins la portion correspondant à la chambre de mesure. Dans un mode de réalisation particulier un canal peut être aménagé entre le bord de la bandelette et la chambre de mesure pour permettre le déplacement de l'échantillon par capillarité vers la chambre de mesure.

Enfin, une couche supérieure vient recouvrir la bandelette. Elle délimite la partie supérieure de la chambre de mesure et protège l'ensemble des couches constituant la bandelette. Elle peut disposer d'une ouverture ou encoche facilitant le dépôt de l'échantillon. Elle peut également contenir un évent. Elle peut être réalisée dans n'importe quel matériau approprié tel qu'un polymère et aura préférentiellement une épaisseur de l'ordre de quelques dizaines de μιη. La figure 4 illustre un exemple de représentation schématique d'une bandelette conforme à l'invention.

A titre indicatif, la taille d'une bandelette électrochimique est habituellement de l'ordre de 0,5 à 1 cm de large, 3 à 5 cm de long, 0,05 à 0,5 mm d'épaisseur. Elle doit être suffisamment rigide pour être insérée dans le lecteur.

Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une bandelette électrochimique selon l'invention comprenant les étapes de dépôts des éléments suivants :

- une couche de substrat électriquement isolante

au moins deux électrodes

au moins autant de pistes électriques que d'électrodes

une couche d'enzymes contenant des enzymes spécifiques du glycérol,

o soit la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase,

o soit la glycérol déshydrogénase, ladite couche d'enzymes étant déposée sur les électrodes

une couche contenant des cofacteurs choisis entre o soit l'adénosine triphosphate (ATP) et MgCl ₂ lorsque les enzymes sont la glycérol kinase et la glycérol-phosphate oxydase,

o soit le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD ⁺ ) lorsque l'enzyme est la glycérol déshydrogénase

- au moins une couche de membrane

une couche d'espacement située entre les électrodes et la couche supérieure une couche supérieure, ladite couche supérieure pouvant être percée d'une encoche pour faciliter le dépôt de l'échantillon. Dans un mode de réalisation préféré, les pistes électriques sont déposées par sérigraphie. Elles peuvent également être déposées par gravure, photolithographie ou toute autre technique connue de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulier, les couches d'enzymes, de cofacteurs et de membrane sont déposées (dropcasting) puis séchées, mais elles peuvent aussi être appliquées par impression jet d'encre, par spray, par trempage-retrait, ... Les enzymes et les cofacteurs peuvent être déposés en deux couches distinctes ou simultanément en une seule couche. Dans un mode de réalisation préféré de la bandelette, les enzymes, les cofacteurs et la membrane sont contenus dans une seule et même couche. Lorsque l'électrode de carbone est fonctionnalisée par ajout de ferrocène-méthanol, le ferrocène- méthanol peut être ajouté directement sur l'électrode de travail avant le dépôt de la couche sensible. Toutefois, dans un mode de réalisation préféré, lorsque tous les composants de la couche sensible sont déposés simultanément en une seule couche, il peut être ajoutés en même temps, par ajout à la solution de la couche sensible. Ainsi, tous les composants à déposer sur l'électrode le sont dans une seule et même couche.

Le procédé de préparation des bandelettes selon l'invention peut également comprendre le dépôt d'une couche d'une enzyme additionnelle. Ces enzymes additionnelles peuvent être déposées en une seule couche avec l'enzyme spécifique du glycérol ou dans une couche séparée. Lorsque la couche sensible comprend une enzyme additionnelle, les enzymes (totales) peuvent être déposées ensemble, l'une après l'autre ou en déposant la couche de cofacteur entre les enzymes (de base) et les enzymes additionnelles. Dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme additionnelle est déposée en premier directement sur l'électrode. Toutefois, lorsque la couche sensible est déposée en une seule fois et qu'elle comprend tous les composants, l'enzyme additionnelle est ajoutée en même temps que les autres composants. Lorsque les enzymes spécifiques du glycérol sont la glycérol kinase et la glycérol- phosphate oxydase, l'enzyme additionnelle est la péroxydase.

Lorsque l'enzyme spécifique du glycérol est la glycérol déshydrogénase, l'enzyme additionnelle est la diaphorase. Lorsque l'électrode de travail est en carbone, elle peut être fonctionnalisée par ajout d'une solution choisie par exemple parmi le bleu de Prusse, des ions ferri/ferrocyanure, des complexes d'osmium, du ferrocène ou l'un de ses dérivés tel que le ferrocène-méthanol, un polymère rédox (de type polyaniline, polypyrrole, poly-ferrocène), du tetramethylbenzidine. Par exemple, lorsque l'électrode est fonctionnalisée par ajout d'une solution de bleu de Prusse, cette solution est alors déposée puis activée à température élevée, par exemple comprise entre 80°C et 100°C, puis rincée avec une solution telle que l'eau, un solvant organique ou une solution tampon, puis séchée. Lorsque l'électrode est fonctionnalisée par ajout d'une solution de ferrocène ou l'un de ses dérivés, cette solution est déposée puis séchée à 40°C pendant 5 min. D'autres techniques connues de l'homme du métier peuvent aussi être employées, incluant des techniques sans rinçage, ou d'autres techniques comme l'impression jet d'encre, spray, électro-dépôt...

Lorsque des agents réticulants sont ajoutés aux couches de la bandelette, ils sont préférentiellement ajoutés à la couche de membrane au moment de son dépôt. Toutefois, des agents réticulants peuvent aussi être appliqués avec la couche d'enzyme ou de cofacteur, ou entre ces deux couches. Lorsque les enzymes, cofacteurs et membrane sont ajoutés en une seule couche, les agents réticulants peuvent être déposés simultanément. Le dépôt d'une couche d'enzymes, d'une couche de cofacteurs et d'une couche de membrane constitue la couche sensible de la bandelette. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, des couches additionnelles peuvent être ajoutées à la couche sensible telles qu'une couche d'enzyme additionnelle, au moins un réticulant et au moins un surfactant. L'aménagement de ces couches entre elles ainsi que la possibilité de déposer simultanément plusieurs composants au sein d'une même couche ont été décrits précédemment et s'appliquent au présent procédé de préparation. Dans un mode de réalisation préféré du procédé de préparation des bandelettes selon l'invention, le dépôt des éléments de la couche sensible est réalisé en une seule étape. Ainsi, peuvent être ajoutés simultanément :

les enzymes glycérol kinase et glycérol phosphate oxydase, les cofacteurs ATP et MgCl ₂ et une couche de membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose ;

- les enzymes glycérol kinase et glycérol phosphate oxydase, les cofacteurs ATP et

MgCl ₂ , une couche de membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose et un surfactant ;

les enzymes glycérol kinase, glycérol phosphate oxydase et peroxydase, les cofacteurs ATP et MgCl ₂ , une membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose ; - les enzymes glycérol kinase, glycérol phosphate oxydase et peroxydase, les cofacteurs ATP et MgCl ₂ , une membrane en hydroxypropyl méthyl cellulose, du ferrocène-méthanol.

Un troisième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une bandelette électrochimique selon l'invention pour évaluer la lipolyse chez un individu à partir d'un échantillon de fluide biologique.

En effet, les bandelettes électrochimiques selon l'invention contiennent des enzymes permettant de détecter et de quantifier le glycérol présent dans un échantillon de sang.

Un quatrième objet de l'invention concerne une méthode d'évaluation de la dégradation graisseuse chez un individu consistant à :

introduire la bandelette dans un lecteur à ampèremètre

prélever une goutte de goutte de sang

- déposer ladite goutte de sang sur bandelette électrochimique selon l'invention attendre que le lecteur à ampèremètre effectue la mesure électrochimique lire le résultat affiché soit directement sur le lecteur, soit à distance sur un appareil connecté audit lecteur. Cette méthode d'évaluation de la dégradation graisseuse peut comprendre en outre une étape d'optimisation de la perte de masse graisseuse chez un individu consistant à corréler la dégradation graisseuse mesurée avec les nutriments ingérés et/ou le type d'exercice physique pratiqué. Ainsi, l'utilisateur peut déduire l'impact des aliments ingérés et/ ou de l'exercice physique pratiqué sur la dégradation de la masse graisseuse et ceci lui permet d'adapter son comportement en fonction des résultats obtenus. Ce type d'information peut également être traité à l'aide d'une application adaptée qui guidera l'utilisateur vers les comportements alimentaires et/ou le type d'exercice physique qui lui sont le plus profitable pour obtenir une dégradation graisseuse.

Cette méthode d'évaluation permet également de suivre la cachéxie, notamment chez les patients atteints de cancer.

Un lecteur approprié pour ce type de méthode est un appareil comprenant un ampèremètre, capable de récupérer le signal électrochimique émis par la bandelette et de le transmettre pour interprétation soit à un système interne ou lecteur, soit à une appareil connecté à distance.

Un exemple de lecteur adapté à une telle utilisation ainsi qu'une méthode de suivi de l'évolution de la masse graisseuse corporelle sont décrits dans la demande de brevet W02016/097615.

Pour la réalisation des bandelettes selon l'invention, les différents modes de réalisation peuvent être combinés entre eux, notamment les modes de réalisation préférés.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. FIGURES

Figure 1 : La figure 1 est une représentation schématique des réactions enzymatiques permettant la quantification du glycérol impliquant la glycérol kinase et la glycérol- phosphate oxydase, et de manière optionnelle la péroxydase.

Figure 2 : La figure 2 est une représentation schématique de la réaction enzymatique permettant la quantification du glycérol impliquant la glycérol déshydrogénase, et de manière optionnelle la diaphorase.

Figure 3 : La figure 3 est une représentation d'un empilement d'une couche sensible positionnée dans la chambre de mesure et appropriée pour quantifier la lipolyse.

Figure 4 : La figure 4 est une représentation d'une bandelette électrochimique permettant la détection du glycérol.

Figure 5 : La figure 5 est une représentation graphique des résultats de mesures ampérométriques réalisées sur des échantillons sanguins dans lesquels ont été ajoutés du glycérol à différentes concentrations (carré : ΟμΜ ; rond : 150μΜ ; triangle : 300μΜ ; croix : 500μΜ ; diamant : 700μΜ, soit en lisant du haut vers le bas)

Figure 6 : La figure 6 est une représentation graphique du courant obtenu à partir des mesures présentées sur la figure 5 en fonction de la concentration en glycérol ajoutée dans les échantillons. La droite de calibration obtenue par régression linéaire est également représentée.

Figure 7 : La figure 7 présente deux exemples de visuels des résultats qui peuvent être affichés à l'utilisateur. Sur le visuel de la figure 7 (A), le résultat de la mesure immédiatement réalisée est affiché ainsi qu'un commentaire corrélé à ce résultat. Sur le visuel de la figure 7 (B), un classement des différents types d'activités physiques en fonction des résultats de la mesure et/ou des mesures précédentes réalisées par l'utilisateur est affiché. EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation d'une bandelette électrochimique permettant la détection du glycérol a. Bandelette réalisée par dépôts successif des différentes couches de composants de la couche sensible

Sur une couche de substrat en polyimide prétraitée 15 minutes aux UV en présence d'ozone, une première couche est sérigraphiée avec une encre de carbone afin de déposer l'électrode de travail ainsi que 2 pistes électriques, l'électrode de travail étant contiguë à l'une des pistes électriques. La bandelette et ensuite séchée au four à 120°C pendant 10 minutes.

Une seconde couche est ensuite sérigraphiée avec une encre d'argent pour déposer l'électrode de référence (assurant également le rôle de contre électrode), qui est contiguë à la seconde piste électrique. La bandelette et ensuite séchée au four à 120°C pendant 10 minutes.

Une troisième couche est ensuite sérigraphiée avec une encre isolante afin de recouvrir partiellement les pistes électriques et les électrodes en laissant libre une partie des pistes électriques pour que la bandelette puisse être connectée au lecteur ainsi qu'une partie de chaque électrode afin que la partie de l'électrode de travail non recouverte ait une aire de 1,25mm ² et la partie non recouverte de l'électrode de référence ait une aire de 1mm ² . La bandelette et ensuite séché au four à 120°C pendant 10 minutes

Les dépôts qui suivent ne sont appliqués que sur la partie non recouverte de l'électrode de travail.

Premièrement, 1 μΐ de bleu de Prusse à 0,2 g/L dans un mélange éthanol/eau (30/70 en volume) est déposé sur l'électrode puis la bandelette est séchée au four à 100°C pendant 5 minutes.

Un test électrochimique consistant à appliquer une différence de potentiel de -0,2V entre l'électrode de travail et la seconde électrode pendant 30s avec une goutte de solution de tampon phosphate est ensuite réalisé et permet de réduire le bleu de Prusse en blanc de Prusse tout en contrôlant la qualité de la bandelette via la valeur de courant mesurée après 30 secondes (valeur seuil -200nA). Puis 1 μΐ d'un mélange ATP à 9 mM (Adénosine triphosphate) et de MgCl ₂ à 9 mM (chlorure de magnésium) est déposé sur l'électrode (soit 9 nmol de chaque composé) puis l'électrode est séchée 5 minutes à 40°C dans un incubateur à convection forcée.

Puis 1 μΐ d'un mélange de Glycérol Kinase (GK) à 1,5 U/μί et de Glycerol-Phosphate Oxydase (GPO) à 0,5 U/μί est déposée sur l'électrode (soit 1,5U de GK + 0,5U de GPO) puis l'électrode est séchée 3 minutes et 30 secondes à 40°C dans un incubateur à convection forcée.

Puis 1 μΐ d'un mélange de chitosan à 0,5% et de glutaraldéhyde à 0,0025% dans l'acide acétique à 0,5% est déposé sur l'électrode puis l'électrode est séchée 4 minutes à 40°C dans un incubateur à convection forcée.

L'ensemble bleu de Prusse, cofacteurs (ATP+MgCl ₂ ), enzymes (GK+GPO), couche de membrane (chitosan) et réticulant (glutaraldéhyde) constitue la couche sensible.

Une couche d'adhésif double-face est appliqué par pression sur l'ensemble de la couche isolante précédemment sérigraphiée (la recouvrant intégralement). Cette couche a une épaisseur de 0,25mm. L'espace laissé non recouvert par cette couche au niveau des électrodes constitue la chambre de mesure (qui contient donc les 2 électrodes non recouvertes par le film isolant).

Une couche de film protecteur en polyéthylène téréphtalate (PET) est ensuite apposée par pression sur la bandelette et a pour rôle la couche supérieure. Elle recouvre intégralement la couche d'adhésif double-face ainsi que l'espace formé par la chambre de mesure (sans être en contact avec les électrodes).

La bandelette ainsi fabriquée est ensuite stockée dans le noir à 4°C. b. Bandelette réalisée par dépôt en une seule couche des différents composants de la couche sensible

Sur une couche de substrat en polyimide prétraitée 15 minutes aux UV en présence d'ozone, une première couche est sérigraphiée avec une encre de carbone afin de déposer l'électrode de travail ainsi que 2 pistes électriques, l'électrode de travail étant contiguë à l'une des pistes électriques. La bandelette et ensuite séchée au four à 120°C pendant 10 minutes.

Une seconde couche est ensuite sérigraphiée avec une encre d'argent pour déposer l'électrode de référence (assurant également le rôle de contre électrode), qui est contiguë à la seconde piste électrique. La bandelette et ensuite séchée au four à 120°C pendant 10 minutes.

Une troisième couche est ensuite sérigraphiée avec une encre isolante afin de recouvrir partiellement les pistes électriques et les électrodes en laissant libre une partie des pistes électriques pour que la bandelette puisse être connectée au lecteur ainsi qu'une partie de chaque électrode afin que la partie de l'électrode de travail non recouverte ait une aire de 1,25mm ² et la partie non recouverte de l'électrode de référence ait une aire de 1mm ² . La bandelette et ensuite séché au four à 120°C pendant 10 minutes

Le dépôt suivant n'est appliqué que sur la partie non recouverte de l'électrode de travail. 1,5 μΐ d'une solution aqueuse contenant 1,5 mM de Ferrocène-méthanol, 1 U/μί de glycérol kinase, 0,33 U/μί de glycérol-phosphate-oxydase, 1 U/μί de péroxydase, 27 mM d'ATP, 27 mM de MgCl ₂ , 0,25 % d'hydroxypropyl méthyl cellulose, 0,1 % de Triton X-100 et lx de PBS est déposé sur l'électrode puis la bandelette est séchée au four à 40°C pendant 5 minutes.

Une couche d'adhésif double-face est appliqué par pression sur l'ensemble de la couche isolante précédemment sérigraphiée (la recouvrant intégralement). Cette couche a une épaisseur de 0,25mm. L'espace laissé non recouvert par cette couche au niveau des électrodes constitue la chambre de mesure (qui contient donc les 2 électrodes non recouvertes par le film isolant).

Une couche de film protecteur en polyéthylène téréphtalate (PET) est ensuite apposée par pression sur la bandelette et a pour rôle la couche supérieure. Elle recouvre intégralement la couche d'adhésif double-face ainsi que l'espace formé par la chambre de mesure (sans être en contact avec les électrodes).

La bandelette ainsi fabriquée est ensuite stockée dans le noir à 4°C.

Exemple 2 : Mesure de la quantité de glycérol par ampérométrie

Une goutte de sang d'environ 3 μΐ est déposée sur la bandelette au niveau de l'encoche aménagée sur la couche supérieure. a. Protocole de détection de la quantité de glycérol présent dans l'échantillon de sang Ce protocole est adapté à l'utilisation d'une bandelette telle que décrite à l'Exemple 1 a. L'échantillon est incubé dans la chambre de mesure pendant 3 secondes.

Ensuite une différence de potentiel électrique de -0,2V est appliqué entre l'électrode de travail et l'électrode de référence.

La valeur de courant est relevée 30 secondes après le début de l'application de la différence de potentiel. b. Utilisation des données pour quantifier la lipolyse i. Construction d'une droite de calibration à l'aide de mesures à plusieurs concentrations

Comme illustré à la figure 5, du glycérol à concentration connue a été ajouté à des échantillons de sang veineux prélevés sur un volontaire de façon à obtenir des échantillons sanguins à différentes concentrations en glycérol ajouté. Ces échantillons sont analysés par la technique décrite ci-dessus et le courant 30 secondes après application du potentiel est noté puis rapporté à la concentration en glycérol de l'échantillon pour construire une droite de calibration. ii. Extraction du coefficient directeur de la droite pour relier courant et concentration.

La droite de calibration telle que représentée à la figure 6 est ensuite obtenue par régression linéaire des données précédemment enregistrées et le couple coefficient directeur et ordonnée à l'origine de cette droite de calibration est déterminé. Ces deux paramètres sont préenregistrés dans l'application qui interprète les mesures réalisées par l'utilisateur et permettent d'interpréter les valeurs de courant mesurées lors des tests de mesure de la dégradation de la masse graisseuse en termes de concentration de glycérol produit par la lipolyse.

Exemple 3 : Utilisation des données par un utilisateur

L'utilisateur met en marche le lecteur et y insère une bandelette. Il génère ensuite une goutte de sang capillaire au bout d'un doigt à l'aide d'un stylo auto-piqueur et la dépose dans l'encoche de la bandelette prévue à cet effet. Le lecteur effectue la mesure ampérométrique comme décrit précédemment et transmet le résultat à un second appareil connecté pouvant être le smartphone de l'utilisateur. Ledit appareil utilise les données de calibration préenregistrées et traduit la valeur de courant en quantité de masse graisseuse dégradée. Cette quantité est ensuite affichée à l'utilisateur via un écran du second l'appareil. Cette quantité peut également être analysée par l'appareil, comme par exemple une comparaison avec les précédentes mesures de l'utilisateur ou une interprétation de la mesure par rapport aux facteurs externes que l'utilisateur a entrés dans l'application, à savoir le type d'exercice physique ou les nutriments ingérés.