CONJUGUE A UNE DIFFERENCE DE PRESSION

Introduction

Les méthodes de fïltration en matrice ou « dot plot » sont des méthodes classiques d'analyse d'une pluralité d'échantillons biologiques, tels que :

· extrait cellulaire,

• cellules en suspension,

• plasma sanguin,

• protéine et ou acide nucléique en suspension,

• molécule biologique en solution ou en suspension et

· plus généralement un matériel biologique, etc.

Ces techniques sont utilisées pour réaliser sur un support tel que membrane de nitro cellulose, de polyfluorure de vinyldene (PVDF), membrane micro ou nano structurée, membrane de polymère filtre, etc., une matrice de dépôts d'échantillons où chaque échantillon forme un spot, telle que chaque spot représente la capture de tout ou partie dudit échantillon.

La mise en œuvre de la fïltration dot plot, fait intervenir généralement des dispositifs comprenant une plaque percée de puits transversaux, tel qu'un échantillon biologique en solution ou suspension soit disposé dans chaque puits de la plaque, ladite plaque étant disposée de manière jointive sur une membrane de fïltration. Une différence de pression ΔΡ, appliquée de part et d'autre de la membrane, permet la fïltration de l'échantillon biologique au travers de ladite membrane de manière à retenir sur cette dernière des cibles d'intérêt des échantillons en même temps que d'autres éléments des échantillons, chaque échantillon formant un spot d'une matrice de spot de géométrie miroir à celle de la plaque à puits.

Les cibles d'intérêt de chaque spot seront alors analysées, par différentes méthodes d'analyse utilisées en biologie, telles que : • des méthodes d'imagerie de fluorescence, de chimioluminescence, colorimétrie, lorsque les cibles d'intérêt sont marquées avant, durant ou après la fïltration par un marqueur fluorescent, chimioluminescent ou colorimétrique, tel que par exemple le marqueur soit intégré à la structure de la cible ou interagit avec la structure de la cible, notamment par l'utilisation d'anticorps directement marqués ou marqués grâce à un anticorps secondaire ;

• des méthodes de spectroscopie telles que LIBS (spectroscopie sur plasma induit par laser), masse, infrarouge, etc. ; ou toute autre méthode permettant de quantifier ou d'identifier la ou les cibles d'intérêts.

L'utilisation des technologies de dot blots par fïltration est largement limitée par les méthodes de préparation de l'échantillon. En effet, l'ajout d'agents chaos-tropes tels que l'urée ou de détergents tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), le triton, etc., dans l'échantillon pour extraire les cibles d'intérêts, pénalise fortement la capture par les membranes de fïltration de nombreuses cibles acide nucléique ou protéique.

Ces limitations sont particulièrement observées dans l'analyse de protéines nucléaires notamment pour l'analyse par dot blot de certaines histones de certains types cellulaires. Par exemple, certains protocoles d'extraction d'histones quantitative de follicules pileux, telles que les histones γΗ2ΑΧ, ou H3 nécessite l'utilisation SDS, alors que le SDS est incompatible avec l'adsorption quantitative par fïltration desdites histones sur des membranes de nitro cellulose ou de PVDF. Nous pouvons également citer comme limitation dans l'utilisation des techniques de dot blot par fïltration :

• la géométrie des dispositifs classiquement utilisés pour la mise en œuvre de la fïltration par exemple :

0 pour permettre une meilleure sensibilité de détection, les puits des plaques de fïltration doivent disposer d'un certain volume minimal permettant la détection des cibles en fonction de la sensibilité de détection, ce qui entraîne une dispersion et/ou un écartement des spots sur la membrane de fïltration directement proportionnelle à la taille des puits de la plaque à puits. De ce fait la surface des membranes est importante par rapport au nombre de spots, et nécessite alors pour l'analyse des volumes importants de solutions de saturation et de révélation comportant des composés coûteux tels que des anticorps marqués, anticorps non marqués et anticorps secondaires marqués, etc. ;

la fïltration n'est pas puits-indépendante, de ce fait lorsque les échantillons possèdent des viscosités différentes d'un puits à l'autre la vitesse de fïltration varie d'un puits à l'autre. Les conditions et la vitesse de fïltration n'est plus contrôlée dès qu'un puits de fïltration est vidé, puisque ΔΡ appliqué à la membrane chute dès que le premier puits de la plaque est vide. le manque d'ergonomie dans la mise en œuvre des procédés, d'une part pour la manipulation des dispositifs de fïltration existant, concernant notamment les méthodes de montage et de fixation utilisées (vis) ; la durée de mise en œuvre liée à la préparation des membranes de fïltration notamment pour les méthodes utilisant un marquage par anticorps fluorescent ou chimioluminescent après l'étape de fïltration ; · les problèmes d'affinité croisée qui peuvent survenir pour les marquages par anticorps par exemple dirigés contre certaines formes de phosphorylation de protéine. En effet, sur un spot de la membrane il peut coexister plusieurs types de protéine phosphorylé. Or la plupart des anticorps dirigés spécifiquement contre la forme phosphorylé d'une protéine, présentera une affinité non négligeable pour le groupement phosphore d'autres protéines. Lorsqu'une protéine d'intérêt est en faible quantité sur un spot comportant d'autres protéines phosphorylées en plus grande quantité, l'anticorps spécifique de la protéine d'intérêt donnera un fort signal non spécifique en reconnaissant les autres fonctions phosphate présentes sur le spot. Pour contourner ces problématiques limitantes, nous proposons un procédé et un dispositif de mise en œuvre faisant intervenir un champ électrique perpendiculaire au plan de la membrane et une fïltration simultanée ou consécutive à l'application du champ électrique, afin de réaliser une matrice de dépôts d'échantillons, ou spots, en présence d'agents chaos- tropes ou de détergent, tout en augmentant l'ergonomie de mise en œuvre, diminuant le temps de marquage et augmentant la spécificité de marquage pour certaines protéines phosphorylées. On entend par échantillon :

• un extrait cellulaire,

• des cellules en suspension,

• plasma sanguin,

• des protéines et/ou acide nucléique en suspension,

· des molécules biologiques en solution ou en suspension et

toute combinaison de ces éléments et plus généralement tout produit biologique.

On entend par membrane fixation, tous membrane ou substrat tels que :

• les membranes de nitro cellulose

· les membranes de PVDF,

• les membranes micro ou nano structurées,

• les membranes de polymère

• les filtres

plus généralement tout substrat de fixation d'échantillon biologique.

La présente invention concerne un procédé de fixation sur une membrane de fixation, en matrice de spots, de tout ou partie d'une pluralité d'échantillons biologiques tel que chaque échantillon est disposé dans un puits Figl .l d'une plaque à puits transversaux et débouchants F 1.2, et tel que soit positionnée sous ladite plaque à puits la membrane de fixation F 1.3, de manière à soumettre chaque échantillon à l'action simultanée ou séquentielle, d'un champ électrique Figl .4 et d'une pression Figl .5 tel que le champ électrique présente une direction perpendiculaire à la membrane de fixation, et un différentiel de potentiel entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 1 milivolt et 1 kilovolt (de préférence entre lOmV et 100V, et plus préférentiellement entre lOOmV et 10V), et tel que la pression présente un différentiel de pression ΔΡ entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 0,1 millibar et 100 bar (de préférence entre lmb et 10b, et plus préférentiellement entre lOmb et 10b). Dans ce mode de réalisation la fixation des molécules d'intérêt sur la membrane de fixation se fait par la double action du champ électrique et de la filtration. L'action du champ électrique permettant une meilleure fixation des cibles d'intérêts sur la membrane même en présence d'un détergent dans le milieu tel que le SDS, le triton ou d'autres agents chaos- trope, ou de toute combinaison de ces agents et détergents.

Dans certains modes de réalisation, le champ électrique est obtenu grâce à deux électrodes en matériaux conducteurs, tels que polymère conducteur, composite conducteur, métal, Or, platine, Tantale, etc., disposé au-dessus Figl .6 et en dessous Figl .7 de la plaque à puits, la membrane de fixation étant intercalée entre la face inférieure de la plaque à puits Fig2.14 et l'électrode inférieur Figl .7.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier au moins une des électrodes sera une feuille d'un conducteur d'électricité tel que or, platine, cuivre, tantale, etc., éventuellement déposé sur un polymère tel que kapton, silicone, PMMA, PLA ...

Dans d'autres modes de réalisation, la feuille de métal électrode comportera au moins une surface structurée collante, obtenue par exemple grâce à une colle de repositionnement, ou au moins une surface structurée jointive Figl .9, par exemple en caoutchouc, silicone, ou tout autre polymère, telle que la surface jointive au collante, laisse libres des surfaces de l'électrode en forme de spot Fifl .10 en vis-à-vis des puits de la plaque à puits, de manière à avoir une matrice d'électrodes métalliques apparentes. Les spots de l'électrode laissés libres par la surface jointive ou collante comporteront au moins pour l'électrode inférieure des pores permettant de laisser passer un liquide.

Dans certains modes de réalisation au moins une des faces de la membrane de fixation Figl .3 comportera une surface structurée jointive ou collante 9 laissant libre une matrice de spots membrane de fixation Figl .l 1 en vis-à-vis de la matrice de puits. Dans certains modes de réalisation un papier poreux, formant un tampon Figl .8, par exemple de 0,1 à 5 mm d'épaisseur tel que papier wattman, papier de dessein vergé etc., est disposé contre au moins une des électrodes, de manière à faire un tampon entre l'électrode et la membrane, ou l'électrode et la plaque à puits. Dans certains modes de réalisation, au moins une face du papier sera structurée 9 par une colle ou un polymère jointif de manière à laisser libre une matrice de spot de papier Figl .12 en vis-à-vis de la matrice de puits de la plaque à puits.

Dans certains modes de réalisation, la plaque à puits est réalisée tel que, la face inférieure Fig2.14 de plaque à puits ainsi que le diamètre inférieur des puits (face de la plaque à puits recevant la membrane de fixation) sont réduits par exemple par une homothétie d'un facteur K et/ou k' par rapport à la taille de la face supérieure Figl .13 de la plaque à puits et du diamètre supérieur des puits. Cette réduction d'un facteur K et/ou k' permet de réduire la taille des spots d'un facteur de combinaison K et k' mais aussi, la distance entre les spots du même facteur de combinaison K+k' et permet de réaliser des membranes de fixation réduites du facteur K par rapport à la surface supérieure de la plaque à puits. Ceci permet de réduire le volume réactionnel pour les étapes de révélation par anticorps, ainsi que de réduire les surfaces à analyser pour les méthodes d'imagerie ou de spectroscopie. Dans certains modes de réalisation, la plaque à puits possède une électrode ionique liquide, gel ou éponge imbibée, reliant la face supérieure à la face inférieure de la plaque à puits. Cette électrode permet d'imposer une différence de potentiel entre les deux faces de la membrane quelle que soit le niveau d'échantillon dans les puits de la matrice. Dans certains modes de réalisation, l'électrode supérieure comprendra Figl .6, la face supérieure de la plaque à puits, et une partie de la surface des puits.

Dans certains modes de réalisation, une structure Fig2.15 formant une électrode telle que en croix ou tout autre forme connectée à l'électrode supérieure, sera disposée dans un plan transversal des puits de la plaque à puits.

Dans certains modes de réalisation, la différence de pression ΔΡ est obtenue par aspiration en dessous de la membrane de fixation au travers de l'électrode inférieure. L'empilement de tout ou partie des éléments décrits ci-dessus par exemple est disposé sur une grille d'aspiration Fig3.16 en dessous de laquelle est appliquée une dépression.

Dans un mode de réalisation encore plus préférentiel la grille Fig3.16 est structurée par une colle ou un matériau jointif, de manière à délimiter des spots étanches entre eux où ladite grille apparaît libre pour former une matrice de spots de grille en vis-à-vis des puits de la plaque à puits.

Dans certains modes de réalisation, la grille d'aspiration Fig3.16 et l'électrode inférieure sont confondues, la grille comprend alors au moins un élément conducteur électrique, permettant d'appliquer un champ électrique, dans chaque puits de la plaque à puits, au travers de la membrane de fixation. L'élément conducteur électrique pourra être un plaquage ou un dépôt métallique tel que Or, Cuivre, Tantale, Platine ...

Dans un mode de réalisation particulier, la différence de pression ΔΡ est obtenue par une pression appliquée au-dessus de la membrane au travers des puits de la plaque à puits et de l'électrode supérieure.

Dans certains modes de réalisation, les échantillons biologiques sont introduits dans les puits 1 de la plaque à puits grâce à une plaque de loges Fig3.18 formant une matrice de loges disposées de manière homologue au puits de la matrice de puits. Les échantillons sont introduits dans la plaque de loges maintenue horizontale, tel que par exemple un échantillon par loge. Puis la plaque à puits comprenant une combinaison quelconque des empilements décrits est clipsée Fig3.19 sur la plaque de loges restée horizontale, la face supérieure de la plaque à puits étant rapprochée des ouvertures de la plaque de loges.

Dans certains modes de réalisation, les deux plaques de loges et plaques à puits peuvent êtres guidées et maintenues l'une contre l'autre par des systèmes d'aimant et de platine magnétique ou ferreux, introduits par exemple aux quatre coins des plaques. Dans un mode de réalisation particulier, la plaque à loges comporte dans chaque loge un piston mobile Fig3.20, par exemple en polymère souple tel que silicone, caoutchouc etc. Derrière chaque piston est disposée dans la plaque de loges, un pore Fig3.21 permettant, par le déplacement du piston, de compenser la pression ou d'appliquer la pression, selon que le dispositif soit utiliser en surpression ou en dépression. Le piston mobile garantit une application homogène de la pression ou de la dépression, durant le processus dès qu'un puits est vidé il est obstrué par son piston ce qui prévient la chute de ΔΡ.

Dans un mode de réalisation particulier les différentes électrodes et membranes utilisées dans le dispositif, comporterons des languettes 22 permettant une récupération rapide de la membrane de fixation et les différentes surfaces des plaques à puits, plaque de loges, électrode, tampon papier etc. sont structurés 9 par un matériau collant, jointif pour définir une matrice de spots à l'image de la matrice de puits telle que chaque spot soit isolé des autres spots par ledit matériau.

Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif comportera un kit de révélation rapide. Le kit comprendra pour chaque membrane de fixation, un sac de complexation en matière plastique de taille suffisante pour recevoir la membrane, le sac sera muni d'un dispositif de fermeture rapide telle que glissière de fermeture ou curseur de fermeture. L'une des faces du sac comportera un dispositif de fixation rapide à un support, par exemple la partie velours d'une fixation ou bande auto-agrippante, la partie crochet de ladite bande étant disposée sur le support recevant le sac par exemple dans un four d'incubation. Le sac sera préférentiellement opaque protégeant de la lumière, par exemple de couleur noire et opaque aux ultra-violets, de manière à ce que la lumière ne puisse altérer les propriétés des réactifs et du matériel biologique disposé dans ledit sac. Le sac sera pré -rempli par une solution ou par une poudre permettant de réaliser une solution de saturation de la membrane. Par exemple, le sac contiendra de 0,1 à 10g de lait en poudre lyophilisé. Le kit comprendra égalisant pour chaque membrane de fixation une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide, en aluminium, matière plastique etc., contenant les réactifs lyophilisées de marquage tels que des anticorps lyophilisés et des éléments de saturation comme du lait lyophilisé. Le contenu de la capsule sera préférentiellement compressé de manière à obtenir un corps agrégé. Le kit comprendra également un four à agitation thermostaté entre 4°C et 50°C préférentiellement 37°C, le four comportera des éléments pour fixer le sac de révélation et permettre son agitation. Le kit pourra être formé par une combinaison de toute ou partie des éléments précités.

Dans un mode de réalisation particulier, le système d'agitation du four pourra par exemple comprendre un axe tournant d'un diamètre compris entre 0,5 cm et 60 cm, ledit axe disposant de moyens pour fixer le sac de révélation, par exemple la partie crochet d'une bande auto-agrippante.

Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée a ouverture rapide comportera, au moins un anticorps dirigé contre une cible d'intérêt, ledit anticorps étant marqué par au moins un fluorophore, chromophore, un agent bioluminescent ou de chimioluminescent, tel que chaque anticorps dirigé contre une cible donnée soit marqué par un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent donné. Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée a ouverture rapide comportera, au moins un anticorps primaire dirigé contre une cible d'intérêt et un anticorps secondaire dirigé contre le au moins un anticorps primaire tel que l'anticorps secondaire soit marqué par au moins un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent.

Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comportera, au moins un anticorps de saturation non marqué, ni directement, ni par un anticorps secondaire, permettant de concurrencer les liaisons aspécifïques parasites d'un anticorps primaire donné pour d'autres cibles que sa cible d'intérêt. Par exemple la capsule comportera des anticorps primaires marqués, directement ou par un anticorps secondaire, dirigés contre des protéines d'intérêt phosphorylé telles que histone γΗ2ΑΧ, Phospho KU 70, phospho ATM, etc., et au moins un des anticorps de saturation non marqués dirigés contre les phospho serine, phospho tréonine, phosphothyrosine etc., tel que la fixation aspécifïque des anticorps primaires sur des cibles phosphorylées différentes de leur cible d'intérêt soit concurrencée par la fixation des anticorps de saturation.

La mise en œuvre du kit comprendra six étapes principales :

• Solubilisation de l'agent de saturation contenu dans le sac de complexation par l'ajout d'une dose de tampon par exemple du 50 ml de TBS pour 2,5g de lait.

• Introduction de la membrane de fixation dans le sac de complexation et fermeture du sac.

• Incubation du sac de complexation entre 4 et 40°C dans le four à agitation thermostaté par accrochage sur l'axe tournant du four grâce aux bandes auto agrippantes.

• récupération du sac du four et ajout du contenue d'une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide dans le sac de complexation dilué à la concentration attendue par un tampon par exemple par du TBS. • Incubation du sac entre 4 et 40°C dans le four à agitation thermostaté.

• récupération du sac du four rinçage de la membrane et lecture de la membrane.

Exemples :

Fig4.23 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des cellules HEK, par différents tampons d'extraction 25, 26, 27, 28, en dot-blot fïltration puis marquage par un anticorps primaire anti-histone γΗ2ΑΧ et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire.

Fig4.24 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des follicules pileux, par différents tampons d'extraction 25, 26, 27, 28, en dot-blot fïltration puis marquage par un anticorps primaire anti-histone γΗ2ΑΧ et un anticorps secondaire chimioluminescent dirigé contre l'anticorps primaire.

Fig4.29 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des cellules HEK, par un tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone γΗ2ΑΧ et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire, les produits de marquage étant lyophilisés dans une capsule aluminium.

Fig4.30 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des follicules pileux, par un tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone γΗ2ΑΧ et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire, les produits de marquage étant lyophilisés dans une capsule aluminium du lait écrémé lyophilisé.

Fig4.31 Exemple d'extraction du matériel biologique pour des cellule HEK, par un tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone γΗ2ΑΧ marqué par un fluorophore à 667 nm et un anticorps primaire anti- histone H2AX marqué par un fluorophore à 488 nm, les produits de marquage étant lyophilisés dans une capsule aluminium contenant du lait écrémé lyophilisé. Comme évoqué dans ce qui précède, l'invention concerne un procédé de fixation sur une membrane de fixation, en matrice de spots, de tout ou partie d'une pluralité d'échantillons biologiques tel que chaque échantillon est disposé dans un puits (1 ) d'une plaque à puits (2) transversaux et débouchants et tel que soit positionnée sous ladite plaque à puits la membrane de fixation (3), caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre chaque échantillon à l'action simultanée, séquentielle, d'un champ électrique (4) et d'une pression (5) tel que le champ électrique présente une direction perpendiculaire à la membrane de fixation, et un différentiel de potentiel entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 1 milivolt et 1 kilovolt, et tel que la pression présente un différentiel de pression ΔΡ entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 0,1 millibar et 100 bar. L'invention concerne également un dispositif pour mettre en œuvre le procédé ci- dessus comprenant la plaque à puits (2) transversaux et débouchants ainsi que la membrane de fixation, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de soumission de chaque échantillon à l'action simultanée, séquentielle, d'un champ électrique (4) et d'une pression, ces moyens comportant deux électrodes fournissant le champ électrique, lesdites électrodes étant composées de matériaux conducteurs, tels que par exemple un polymère conducteur, un composé conducteur, de l'Or, du platine, ou du Tantale, disposées au-dessus (6) et en dessous (7) de la plaque à puits (2), la membrane de fixation étant intercalée entre la face inférieure de la plaque à puits et l'électrode inférieure.

Le dispositif peut comprendre une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :

- au moins une des électrodes est une feuille d'un conducteur d'électricité, qui comporte au moins une surface structurée collante (9), jointive, la surface structurée laissant libre des surfaces de l'électrode en forme de spot (10) en vis-à- vis des puits de la plaque de puits, de manière à avoir une matrice d'électrodes métalliques apparentes, les spots (10) de l'électrode laissés libres par la surface jointive ou collante comportant au moins pour l'électrode inférieure des pores permettant de laisser passer un liquide ;

- un papier poreux formant un tampon (8) de 0,1 à 3 mm d'épaisseur, tel que par exemple un papier wattman, ou un papier de dessin vergé, est disposé contre au moins une des électrodes et que au moins une face du papier est structurée (9) par une colle ou un polymère jointif de manière à laisser libre une matrice de spot de papier (12) en vis-à-vis de la matrice de puits de la plaque à puits ; - la face inférieure (14) de la plaque à puits ainsi que le diamètre inférieur des puits, définis comme la face de la plaque à puits recevant la membrane de fixation, sont de taille réduite par une homothétie, tel qu'une homothétie de facteur K, d'une combinaison de facteur K et k' par rapport à la taille de la face supérieure (13) de la plaque à puits et du diamètre supérieur des puits, ladite réduction permettant de réduire d'autant la taille des spots et la distance entre les spots sur la membrane de fixation ;

- la plaque à puits possède une électrode ionique liquide, gel ou éponge imbibée, reliant la face supérieure à la face inférieure de la plaque à puits ;

- l'électrode supérieure comprend, la face supérieure de la plaque à puits, une partie de la surface des puits, et éventuellement une structure (15) disposée dans un plan transversal des puits de la plaque à puits ; - une grille d'aspiration (16) et l'électrode inférieure (7) sont confondues, telle que ladite grille comprend au moins un élément conducteur électrique, permettant d'appliquer un champ électrique, dans chaque puits de la plaque à puits, au travers de la membrane de fixation ; - la différence de pression ΔΡ est obtenue par aspiration (17) en dessous de la membrane de fixation au travers de l'électrode inférieure de la grille d'aspiration en dessous de laquelle est appliquée une dépression ; - la différence de pression ΔΡ est obtenue par une pression appliquée au-dessus de la membrane au travers des puits de la plaque à puits et de l'électrode supérieure ; - une plaque de loges (18) formant une matrice de loges disposées de manière homologue aux puits de la matrice à puits, soit utilisée pour introduire les échantillons biologiques dans les puits de la plaque à puits, et comporte dans chaque loge un piston mobile (20) de préférence en polymère souple, tel que par exemple silicone caoutchouc, de manière que derrière chaque piston est disposé dans la plaque de loges, un pore (21 ) permettant de compenser une pression par le déplacement du piston ;

- les électrodes, membranes, papiers-tampons utilisés du dispositif, comporteront des languettes (22) permettant une récupération rapide de la membrane de fixation et que les différentes surfaces des plaques à puits, plaques de loges, électrodes, papiers-tampons sont structurés par un matériau collant, jointif définissant une matrice de spots à l'image de la matrice de puits telles que chaque spot soit isolé des autres spots par ledit matériau ; La présente invention concerne en outre un kit de révélation rapide comportant le dispositif.

- le kit de révélation rapide comprend pour chaque membrane de fixation, un sac de complexation en matière plastique de taille suffisante pour recevoir la membrane, ledit sac est muni d'un dispositif de fermeture rapide telle que par exemple une glissière, ou un curseur, l'une des faces du sac comporte un dispositif de fixation rapide à un support, tel que par exemple la partie velours d'une bande auto-agrippante, ledit sac est préférentiellement opaque protégeant de la lumière et est pré-rempli d'une poudre permettant de réaliser une solution de saturation de la membrane de fixation tel que 0.1 à 10g de lait en poudre lyophilisé, le kit comprend également pour chaque membrane de fixation une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide, en aluminium, matière plastique, qui contient des réactifs lyophilisé de marquage et de saturation tel que des anticorps , éléments de saturation de la membrane de fixation, fluorophore, chromophore, agent bioluminescent chimioluminescent, le contenu de la capsule étant préférentiellement compressé de manière à obtenir un corps agrégé ;

- un système d'agitation d'un four de complexation comprend un axe tournant d'un diamètre compris entre 0.5 cm et 60 cm, ledit axe disposant de moyens pour fixer le sac de révélation, tel que par exemple des crochets d'une bande auto- agrippante ;

- la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comporte, au moins un anticorps primaire dirigé contre une cible d'intérêt et au moins un anticorps secondaire dirigé contre le au moins un anticorps primaire tel que ledit anticorps secondaire soit marqué par au moins un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent ; - la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comporte, au moins un anticorps de saturation, permettant de concurrencer les liaisons aspécifiques parasites d'un anticorps primaire pour d'autres cibles que sa cible d'intérêt.

LEGENDES DE L'ENSEMBLE DES FIGURES

puits

plaque à puits transversaux et débouchants

membrane de fixation

4) champ électrique

gradient de pression

électrode supérieure

électrode inférieure

papier poreux, formant un tampon

9) surface structurée jointive ou collante

électrode en forme de spot

spot membrane fixation

spot papier tampon

face supérieure plaque à puits

face inférieure plaque à puits

électrode dans un plan transversal des puits

grille d'aspiration

aspiration

plaque de loges

clips

piston mobile

pore

languettes

Cellule HEK dot blot

Follicule pileux dot blot

Extraction tampon de lyse basic

Extraction SDS 10%

Extraction SDS 1%

Extraction tampon RIPA

Cellule HEK électrodot

Follicule pileux électrodot

Cellule HEK électrodot extraction SDS 5%