Domaine technique

La présente invention concerne une particule ayant un diamètre inférieur à 1 mm, utilisable indifféremment pour le marquage dans le cadre de nombreuses techniques d' imagerie (IRM, radiographie X, échographie, imagerie proche infrarouge) et 1 ' embolisation, caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice polymérique encapsulant au moins une nano- particule La présente invention concerne également des compositions comprenant ladite particule et les utilisations de la particule selon l'invention comme médicament, comme embole ou comme marqueur.

Technique antérieure

L' embolisation tumorale utilisant des particules submillimétrique consiste à bloquer le flux sanguin alimentant la masse tumorale en nutriment et oxygène afin de provoquer sa nécrose par mort cellulaire. De nombreux produits commerciaux existent depuis longtemps utilisant des polymères biocompatibles ou bio-résorbables (Gelfoam ^® , Curaspon ^® , Embospheres ^® , Embozeme ^® ...) . Cependant, de nos jours, afin d'améliorer les effets de 1 ' embolisation simple, les praticiens mélanges souvent aux sphères d' embolisation des agents anti-cancéreux comme la doxorubicine qui vont agir en synergie afin d'accroître l'efficacité des traitements (Hepasphere ^® , LC/LD Beads ^® ) . Dans ce but, on connaît des sphères d' embolisation hydrophile appelées Hepasphere ^® qui présentent la propriété d'être expansible lorsqu' après séchage par lyophilisation elles sont mises en contact avec un milieu aqueux. Lors de ce phénomène d'expansion, elles présentent alors la propriété de pouvoir incorporer des molécules thérapeutiques. Une fois injectée dans la masse tumorale, cette molécule thérapeutique peut être partiellement relarguée localement.

L'effet synergique de la chimiothérapie couplé à 1 ' embolisation (chimio-embolisation) semble maintenant attesté [Yï-Xiâng J. Wang & al. Chin J Cancer Res 2015;27(2) : 96-121] , mais reste limité et ne va pas sans effets secondaires consécutifs à la toxicité intrinsèque des agents de chimiothérapie utilisés.

Malgré la pertinence du concept, les traitements de chimio-embolisation ne sont pas totalement satisfaisants car il est très difficile d'emboliser totalement et de manière homogène l'ensemble de la masse tumorale. Ainsi, si certaines zones sont mal embolisées, la tumeur récidivera à partir de ces zones non traitées. Pour contrecarrer cet aspect négatif, le praticien a souvent recours à plusieurs lignes d' embolisation qui s'échelonnent sur plusieurs semaines. Cependant, malgré cette procédure itérative, longue, coûteuse et traumatisante pour le patient, les résultats ne sont pas encore totalement satisfaisants.

Un autre inconvénient des sphères d' embolisation polymériques , chargées ou non en agent anti-cancéreux, réside dans leur invisibilité aux principales technologies d'imagerie couramment utilisée dans le domaine médical (IRM, Scanner à rayons X, échographie, PET, SPECT etc..) . Il en résulte que le praticien ne voit pas où va le produit qu' il injecte et il n'observe les effets du traitement qu'a posteriori .

En conséquence, des recherches sont en cours pour rendre visible des sphères d' embolisation . On citera par exemple les travaux de [F. Langevin-J & al. Biomédical Science and Engineering, 2010, 3, 1093-1098] qui ont montré qu'il était possible de charger des Hepasphere ^® avec un agent d'imagerie IRM bien connu l'Endorem. D'autres comme [Cilliers R. & Magn Reson Med. 2008 Apr; 59 (4) : 898-902] ont greffé un agent d' imagerie IRM (DTPA-Gd) en surface des sphères d' embolisation . Ces solutions sont utilisables en recherche, mais peu en utilisation hospitalière car l'IR n'est jamais utilisée pour guider le geste chirurgical de 1 ' embolisation transartérielle (TARE). D'une utilisation plus aisée que l'IRM, la TARE est parfois réalisée sous guidage par radiographie X. En conséquence, il est souhaitable de rendre radio-opaque des sphères d' embolisation déjà existantes ou façonnées spécialement pour cette utilisation.

Enfin, la TARE étant souvent réalisée sous échographie, il est également souhaitable d'obtenir des sphères d' embolisation échogènes servant comme agent de contraste pour l'exploration ultrasonique et/ou comme emboles pour la détection ultrasonique. Cependant, dans la quasi-totalité des cas les particules proposées sont poreuses ou contenant un gaz piégé et présentent l'inconvénient d'être très instables et de posséder une durée de vie limitée.

La présente invention a donc pour but de répondre aux problèmes mentionnés précédemment en fournissant une sphère d' embolisation visible aux rayons X, en IRM et à 1 ' échographie et présentant une durée de vie compatible avec leurs utilisations . Résumé de 1 ¹ invention

Ainsi la présente invention concerne une particule ayant un diamètre inférieur à 1 mm, utilisable pour le marquage, aux rayons X, en IRM, à 1 ' échographie, en imagerie proche infra-rouge et 1 ' embolisation, caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice polymérique encapsulant au moins une nano-particule radio-opaque.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « matrice polymérique » fait référence à un matériau polymère qui constitue tout ou partie du poids sec de ladite particule (hors nano-particule encapsulée). Préférentiellement , ladite matrice polymérique constitue plus de 80%, encore plus préférentiellement plus de 90%, toujours plus préférentiellement 95% et tout à fait préférentiellement plus de 99% du poids sec (hors nano-particule encapsulée) de ladite particule .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite particule ne comprend pas et/ou n'encapsule pas de cœur métallique et/ou pas de particule métallique de taille supérieure à 1001 nm.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « nano- particule » fait référence à une particule de taille comprise entre 1 et 1000 nm. Par souci de clarté, il est précisé que le terme « nano-particule » ne fait pas référence aux atomes libres en suspension (par exemple aux atomes d'une solution d' iode) .

Dans le cadre de la présente invention, le terme « radio-opaque » fait référence aux matériaux qui interagissent avec les rayons X et/ou le champ magnétique utilisé en IRM et/ou les rayonnements utilisés en échographie de sorte que leur présence est détectable par ces techniques.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite nano-particule est biocompatible.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « biocompatible » entend désigner les matériaux qui ne sont pas toxiques pour les cellules ou les tissus humains quand ils sont placés en contact intime avec ces derniers.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « encapsuler » entend préférentiellement signifier que ladite nano-particule est retenue dans l'espace définie par le volume de ladite particule. Par souci de clarté, il est précisé que le terme « encapsuler » exclu l'association covalente entre ladite nano-particule et ladite particule.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules ont une taille moyenne comprise entre 10 nm et 1000 nm.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, lesdites nano-particules ont une taille moyenne comprise entre 150 nm et 500 nm.

De nombreuses techniques sont disponibles pour mesurer la taille des nano-particules. On peut notamment citer les méthodes décrites dans "The ultimate characterization in desktop particle" (publishing house of Malvern instruments, 2003) et dans "Particle Size Measurement" (5th Edition, 1997, ISBN 0412729504). D'autres méthodes peuvent également être utilisées comme la "dynamic light scattering » (DLS) . Les résultats des différentes méthodes sont similaires et les différences éventuellement observables sont négligeables dans le cadre de la présente invention.

La forme des nano-particules peut être variée, car elle n'a pas grande influence sur les propriétés contrastantes en imagerie. Cependant de préférence, on choisit des nanoparticules sensiblement sphériques .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le poids desdites nano-particules représentent 50 à 97 % en poids de ladite particule à l'état sec. Par souci de clarté, il est précisé que le pourcentage exprimé correspond au ratio (poids des nanoparticules) / (poids de la particule hors nano- particules+poids de nanoparticules) .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont constituées d'au moins 50% en poids de matériaux de numéro atomique supérieur à 53.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont constituées d'au moins 80% en poids de matériaux de numéro atomique supérieur à 53.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont associées à une protéine facilitant leur endocytose par une cellule cancéreuse.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit matériau de numéro atomique supérieur à 53 est un lanthanide choisi parmi le gadolinium, le dysprosium, l'europium, le terbium, l'erbium, le néodyme, le thulium et 1 ' ytterbium .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont constituées en tout ou partie et préférentiellement intégralement de Gd202S, de Gd202S:Eu ou de Gd202S:Yb, Tm

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont fonctionnalisées par une molécule facilitant 1 ' internalisation cellulaire.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ladite molécule facilitant 1 ' internalisation cellulaire est la transferrine .

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites nano-particules sont constituées en tout ou partie et préférentiellement intégralement de Gd202S, de Gd202S:Eu ou de Gd202S:Yb, Tm fonctionnalisée avec de la transferrine .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite matrice polymérique est constituée d'un polymère biocompatible ou biorésorbable .

Dans le cadre de la présente invention le terme

« biorésorbable» entend désigner les matériaux qui se dégradent lorsqu'ils sont injectés chez l'homme. Préférentiellement , ladite dégradation est supérieure à 50% du poids initial du matériau, encore plus préférentiellement supérieure à 60% du poids et tout à fait préférentiellement supérieure à 70% du poids dans un délai de 30 jours après injection. Avantageusement, les produits de dégradations sont assimilés sans effet toxique par l'organisme ou excrétés par les voies naturelles. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite matrice polymérique est constituée d'une matière choisie dans le groupe comprenant le polystyrène (PS) , le poly-di-méthylacrylamide (PDMA) , la gélatine, les amidons solubles telles que les amidons prégélifiés et les amidons partiellement gélifiés, la gomme arabique, la gomme adragante, les polysaccharides tels que la dextrine et l'alginate de sodium, les polymères synthétiques tels que le polyvinylpyrrolidone (PVP) , le polyvinyl ether, le polyvinyl alcool (PVA) , les polymères de carboxyvinyl , les polymères de polyacrylique, l'acide polylactique , le polyethylene glycol , les éthers de cellulose tels que le méthylcellulose (MC) , 1 ' éthylcellulose (EC) , le carboxyméthylcellulose (CMC), le sodium de carboxyméthylcellulose, 1 ' hydroxyethylcellulose (HEC) , 1 ' hydroxypropylcellulose (HPC) , l'acétate de vinyle, le methylacrylate 1 ' hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) et la cellulose microcristalline.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite matrice polymérique est constituée en tout ou partie et encore plus préférentiellement intégralement de gélatine.

Les sphères d' embolisation disponibles commercialement sont également utilisables dans le cadre de la présente invention. Parmi celles-ci on peut notamment citer CELPHERE ^® (Asahi-Kasei Co. Ltd., Tokyo, Japan) , Embosphere ^® , EmboGold™, HepaSphere™ et QuadraSphere™ (Biosphère Médical™ Inc.).

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite particule est une Hepasphere ^® .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite particule a un diamètre compris entre 0.05 et 1 mm.

Ladite particule est préférentiellement sphérique mais d'autres formes sont utilisables. Dans ce dernier cas, le terme « diamètre » entend désigner le diamètre de la sphère dans laquelle s'inscrit ladite particule. Le diamètre peut être homogène en taille même si une répartition bimodale (des petites avec des plus grosses) peut se révéler un choix judicieux pour un marquage tumorale plus homogène. L'homme de l'art saura choisir en fonction de ses besoins et de l'observation de la vascularisation de la masse tumorale à marquer la bonne taille de sphère d' embolisation à choisir.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ladite particule a un diamètre minimum de 0.05 mm, encore plus préfèrentiellement de 0.1 mm et tout à fait préfèrentiellement de 0.2 mm.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ladite particule a un diamètre compris entre 0.05 et 1 mm et tout à fait préférentiellement compris entre 0.2 et 0.4 mm.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite particule est expansible. En ce cas les tailles reportées s'entendent après expansion par du sérum physiologique (Nacl 0,9%)

Dans le cadre de la présente invention, le terme « expansible » entend désigner les particules dont le diamètre augmente, par rapport à leur diamètre lorsqu'elles sont mises en suspension aqueuse après séchage par lyophilisation. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention ladite augmentation est d'au moins 100%, préférentiellement d'au moins 200% et encore plus préférentiellement d'au moins 400%.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite particule encapsule en outre un agent anti-cancéreux .

Selon un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ledit agent anti-cancéreux est choisi dans le groupe comprenant les antimétabolites , les agents alkylants, les inhibiteurs de topoisomérases , les antibiotiques anti- tumoraux et les poisons du fuseau mitotique.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré ladite molécule anti-tumorale est un agent intercalant, inhibiteur de topoisomérases .

Selon un mode de réalisation tout à fait préféré ledit agent intercalant, inhibiteur de topoisomérases est une anthracycline et encore plus préférentiellement la doxorubicine .

Selon un autre mode de réalisation tout à fait préféré ledit agent anti -cancéreux est choisi dans le groupe des agents anticancéreux présentant des propriétés de radio- sensibilisation (e.g. témozolomide) .

Selon un autre mode de réalisation tout à fait préféré ledit agent anti-cancéreux est choisi dans le groupe des agents anti-angiogéniques (e.g. bévacizumab ou le sorafenib) .

Par ailleurs, ladite invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une particule selon l'invention et fluide porteur pharmaceutiquement acceptable.

L'homme du métier est apte à choisir le fluide porteur pharmaceutiquement acceptable adapté à la situation. Parmi les excipients utilisables, on peut notamment citer le sérum physiologique et le PBS .

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention destinée à être utilisé comme médicament.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée dans le traitement du cancer.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « cancer» entend notamment désigner les tumeurs de la cavité abdominale, par exemple les tumeurs du foie, du pancréas, des reins, de la prostate et les tumeurs de la cage thoracique telles que les tumeurs du poumon.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée dans le traitement du cancer dans un procédé de radiothérapie ou de radio-chirurgie. Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée dans un procédé de destruction tumoral physique nécessitant un guidage comme l'ablation radiofréquence ou micro-ondes, l'ablation laser, la cryo-destruction ou tout autre moyen physique extérieur nécessitant un guidage précis des rayonnements, ou des ondes, vers la cible tumorale.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée en tant qu'embole.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée en tant que médicament caractérisée en ce qu'elle est administrée par micro-cathétérisation .

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée en tant que médicament caractérisée en ce qu'elle est administrée à une dose de lOmg à 1000 mg, préfèrentiellement de 100 à 400mg.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée en tant que médicament caractérisée en ce qu'elle est administrée à une dose comprise entre 0,1 et 2% en poids, préfèrentiellement 0,3-0,8% en poids par rapport à la masse tumorale.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée en tant que médicament caractérisée en ce qu'elle est administrée directement dans la tumeur par voie percutanée .

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée dans une méthode de diagnostic « in vivo » du cancer . L'invention permet notamment la visualisation des tumeurs dites mobiles qui présentent une difficulté particulière de ciblage précis lors d'un traitement de radiothérapie guidée par l'imagerie ou par d'autres technologies utilisant un moyen physique extérieur de destruction tumorale nécessitant un ciblage précis.

Préférentiellement , les particules selon l'invention sont mises en œuvre pour la détection, la localisation et éventuellement la visualisation dynamique, en temps résolu, par imagerie médicale des tumeurs cancéreuses mobiles dans le cadre de procédés de destruction tumoral physique nécessitant un guidage comme la radiothérapie, l'ablation radiofréquence ou micro-ondes, l'ablation laser, la cryo- destruction ou tout autre moyen physique extérieur nécessitant un guidage précis des rayonnement, ou des ondes, vers la cible tumorale.

Cette détection et cette localisation sont préférentiellement réalisées à l'aide de moyens connus, tels que tomographie ou radiographie aux rayons X, mais aussi l'IRM, les ultrasons ou la fluorescence.

La détection, la localisation et la visualisation par imagerie médicale de la tumeur, via les particules selon l'invention, permettent un guidage plus précis des technologies de radiothérapie guidée par l'imagerie, ou des procédés de destruction des tumeurs cancéreuses utilisant également des moyens physiques extérieurs comme l'ablation radiofréquence ou micro-ondes, l'ablation laser, la cryothérapie .

Par exemple, couplé à un procédé de radiothérapie guidé par l'imagerie, 1 ' embolisation tumorale obtenue par les particules selon l'invention provoque une ischémie conduisant à une nécrose tumorale partielle. Effectué, environ 10 jours après 1 ' embolisation, les techniques d'imagerie ci-dessus évoqués, permettront de déterminer les zones correctement embolisées qui se nécrosent, des zones non, ou mal atteintes par les particules selon l'invention, qui constituent de possible foyer de récidive. Il conviendra alors à l'homme du métier (radio-oncologue) de déterminer les zones tumorales qui devront alors recevoir une dose accrue de radiation selon une procédure appelée IMRT (Intensity Modulated Radiation Therapy) ou encore « dose painting ». L'utilisation des effets combinés (synergie) de 1 ' embolisation causée par les particules selon l'invention et du « dose painting » en radiothérapie permet de réduire sensiblement la dose moyenne de rayonnement ionisant délivré, ou d'accroître l'efficacité à dose équivalente, préservant ainsi les tissus sains environnants et limitant les effets secondaires.

De même, ces effets synergiques de 1 ' embolisation couplée aux techniques d'ablation micro-ondes ou radiofréquence , permet à l'homme de l'art (radiologue interventionnel) de décider de ne traiter que les zones encore vivantes pour limiter les effets secondaires d' échauffement thermique .

Selon un mode préféré de l'invention, la détection, la localisation et la visualisation par imagerie médicale de la tumeur sont assurées de manière dynamique et résolue en temps, permettant ainsi un guidage en temps réel des technologies ci-dessus nommées.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention pour l'utilisation en tant qu'agent de marquage.

Les particules selon l'invention sont détectables par divers technologies d' imagerie médicale complémentaires comme la radiographie ou la tomographie aux rayons X, l'IRM, 1 ' échographie ou encore la fluorescence.

Par ailleurs, ladite invention concerne également une particule ou une composition selon l'invention, destinée à être utilisée dans une méthode de diagnostic « in vivo » du cancer via un procédé d' IRM, de tomographie ou de radiographie aux rayons X, d' échographie ou de fluorescence.

Par ailleurs, ladite invention concerne également un procédé de préparation d'une particule selon l'invention comprenant une étape consistant à mettre en contact une particule expansible, une nanoparticule et un solvant aqueux.

De façon surprenante, l'incorporation de nano- particules, même relativement grosses (>100nm) au sein des sphères d' embolisation expansibles de type Hepasphere ^® est aisée.

De façon surprenante, 100% des nano-particules , même relativement grosses (>100nm) sont confinées au sein des sphères d' embolisation expansibles de type Hepasphere ^® si la quantité de sérum physiologique utilisée est juste équivalente à la quantité nécessaire à l'expansion des Hepasphere ^® . Dans ces conditions ci -dessus décrites, le produit final obtenu, reste liquide et injectable avec des aiguilles ultrafines (27G) . Il contient 96% (sur l'extrait sec) de produit contrastant, ce qui est considérable et surprenant .

Partie expérimentale :

Exemple 1 : Hepasphere ^® chargées par des nano-particules de Gd202S: Eu

Les nano-particules suivantes ont été mises en œuvre : - Nano-particules (NPs) de Gd202S de 150 nm de taille moyenne, préparées selon le protocole décrit dans FR 2964665 et S.A. Osseni, et al. Nanoscale, 2014, 6, 555-564. Ces NPs possèdent des propriétés contrastantes au rayon X, en IRM et de fluorescence comme décrite dans les deux références ci- dessus citées.

L'incorporation de ces NPs de Gd202S: Eu 5% dans les microsphères de type Hepasphere ^® se fait de la manière suivante .

200 mg de NPs Gd202S sont mises en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,9% par sonification . Cette solution est ensuite rajoutée dans le flacon d'origine contenant 25mg d' Hepasphere ^® sèche de 50 à 100 μτη de diamètre (200-400 μπι après gonflement) . On laisse alors les Hepasphere ^® gonfler et s'imprégner des NPs pendant 20mn sous agitation constante à température ambiante. Les Hepasphere ^® chargées sont ensuite récupérées par filtration sur un tamis de 20 microns et lavées avec 30 ml de solution saline à 0,9%, puis éventuellement séchées à l'étuve à 40°C pour les analyses sur poudres sèches.

Une fraction de ces sphères chargées de NPs de Gd202S: Eu est ensuite prélevée pour dosage par Analyse Thermique Différentielle effectuée sous oxygène.

Après combustion (entre 100 et 800°C) sous oxygène de la matière organique (le polymère organique constituant les Hepasphere ^® ) il apparaît une perte de poids de 11% confirmant que 100% des NPs sont rentrées dans les Hepasphere ^® et que celles-ci sont chargées à 89% de NPs minérales.

L' incorporation de ces NPs de Gd202S dans les sphères de type Hepasphere ^® selon une procédure utilisant 10 ml de solution saline (au lieu de 5 ml) a donné les résultats suivant :

Après combustion sous oxygène de la matière organique

(le polymère organique constituant les Hepasphere ^® ) il apparaît une perte de poids de 15% montrant qu'environ 40% des NPs sont rentrées dans les Hepasphere ^® et que celles-ci sont chargées à 75% de NPs minérales.

Exemple 2 : Hepasphere ^® chargées par des nanoparticules Gd202S:Eu fonctionnalisées avec une protéine de transfert : la transférrine (Tf) .

Les mêmes NPs de Gd202S: Eu de 150 nm de diamètre moyen et fonctionnalisées par des aminés ont été mises en œuvre suivant le protocole décrit ci-dessous :

Mesurer 267 mL de propanol et les introduire dans un ballon monocol de 500 mL. Peser 100 mg de NPs et les introduire dans le ballon. Soniquer pendant lh les NPs dans un bain à ultrasons. Introduire un barreau aimanté dans le ballon et démarrer l'agitation à une vitesse de 600 rpm. Chauffage à 40°C. Prélever ensuite 25 mL d'eau, l'introduire dans le ballon. Prélever 30 mL de NH40H et l'introduire dans le ballon. Boucher le ballon et agiter pendant 15 min à 40°C pour homogénéiser. A l'aide d'une micropipette, prélever 40 \iL de TEOS (Tetra Ethyl Ortho Silicate) et les introduire goutte à goutte dans le ballon. Boucher le ballon et agiter 2h à 40°C. A l'aide de la micropipette 100-1000 ih, prélever 333 uL d'APTMS et les introduire goutte à goutte dans le ballon. Boucher le ballon et agiter encore lh à 40°C.

Centrifuger ensuite la suspension, enlever le surnageant. Introduire 5 mL d'éthanol dans les tubes et soniquer pendant 5 min. Centrifuger à nouveau la suspension et récupérer les nanoparticules . Répéter cette opération de lavage 3 fois. Sécher les NPs à l'étuve à 85 °C pendant une nuit .

Ces aminés sont ensuite converties en carboxylate suivant le protocole suivant :

Peser 30 mg de NPs aminées et les introduire dans un ballon. Prélever 20ml de DMF à l'aide de la seringue et l'introduire dans le ballon. Introduire un barreau aimanté, fermer le ballon et soniquer les NPs au bain à ultrason pendant 15 min. Agiter la suspension pendant 10 min supplémentaires. Peser 605 mg d'anhydride succinique et les introduire dans le ballon. Purger le ballon par un courant d'argon durant 30 minutes environ. Agiter le mélange pendant 8H sous argon statique. Centrifuger la suspension afin de récupérer les NPs. Introduire 5 mL d'eau dans les tubes de centrifugation et les soniquer pendant 5 min. Centrifuger à nouveau. Répéter ces étapes de centrifugation 3 fois de suite au total .

Les NPs carboxylatées sont maintenant prêtes pour effectuer le greffage de la transferrine selon le protocole suivant :

Préparer une solution de MES en en dissolvant 1,95 g de MES solide dans 200 mL d'eau. Transférer les NPs dans un ballon et ajouter 15 ml de solution de MES. Soniquer pendant 15 min. Peser 30mg de transferrine et les introduire dans un récipient adapté. Prélever 15 mL de MES les ajouter à la transferrine. Agiter jusqu'à dissolution totale. Ajouter ensuite cette solution de transferrine goutte à goutte à la solution de NPs. Agiter 10 min à 37°C. Rajouter ensuite 30mg d'EDAC (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride et agiter encore 2h à 37°C. Peser et ajouter ensuite 60mg de glycine, agiter 10 min supplémentaire à 37 °C.

Faire 3 cycles de centrifugation-lavage au PBS . Sécher les NPs sous vide ou lyophiliser.

L'incorporation de ces NPs de Gd202S: Eu fonctionnalisée avec la transferrine dans les microsphères de type Hepasphere ^® selon le protocole déjà décrit dans l'exemple 1 a donné les résultats suivants :

Après combustion sous oxygène de la matière organique (le polymère organique constituant les Hepasphere ^® ) il apparaît une perte de poids de 12% confirmant que pratiquement 100% des NPs sont rentrées dans les Hepasphere ^® et que celles- ci sont chargées à environ 90% de NPs minérales. Exemple 3 : Cinétique de relargage des NPs encapsulées dans les Hepasphere ^® .

On observe ensuite la cinétique de relargage des NPs incorporées dans les Hepasphere ^® dans une solution de sérum physiologique suivant le protocole qui suit: 25mg d' Hepasphere ^® chargées de 200 mg de NPs (exemple 1 et 2 avec 5 ml de sérum physiologique) sont remises en suspension dans 20ml de sérum physiologique sous agitation lente. Apres 6h, 24h et 1 semaine un prélèvement de 2ml est effectué. Les Hepasphere ^® sont séparées du surnageant contenant les NPs relarguées par filtration et lavage puis séchées à l'étuve à 40 °C. La quantité de NPs encore présentes dans les Hepasphere ^® est à nouveau dosée par Analyse Thermique Différentielle comme déjà exposé et reporté dans le tableau suivant .

Tableau 2 : Cinétique de relargage des NPs incorporées dans les Hepasphere ^® .

On observe sur ce tableau que les NPs ont relâché lentement et partiellement des Hepasphere ^® . La cinétique de relargage est sensiblement plus rapide avec des NPs fonctionnalisées avec de la transferrine

Exemple 4 : Internalisation par endocytose de NPs Gd202S:Eu, fonctionnalisées ou non, par des cellules cancéreuses.

Afin de garantir une localisation des NPs de Gd202S:Eu après relargage par les Hepasphere ^® au sein même de la masse tumorale sans risquer leur dissémination à l'extérieur il est important d'évaluer leur capacité à être rapidement captée et internalisée (par endocytose) par les cellules cancéreuses .

En conséquence le protocole expérimental suivant a été testé. Des cellules cancéreuses de type NIH3T3 ont été incubées à une concentration de 0,lmg/ml de NPs Gd202S:Eu nues ou fonctionnalisées par de la transferrine . Les cellules sont ensuite rincées pour éliminer les NPs non internalisées , décollées des plaques, puis récupérées par centrifugation . On dose ensuite par ICP le gadolinium présent à l'intérieur des cellules. Les principaux résultats sont regroupés dans le tableau suivant.

Tableau 3 : Cinétique D' internalisation des NPsGd202S:

Eu.

Il ressort de ces essais que les NPs fonctionnalisées avec la transferrines s ' internalisent beaucoup plus facilement et plus rapidement dans les cellules tumorales.

Exemple 5 : Sphères d' embolisation en gélatine chargée en NPs Gd202S:Eu

Selon un autre mode de réalisation possible, les microsphères d' embolisation sont non poreuses et non expansibles et les nano-particules minérales sont incorporées directement lors du processus de synthèse de ces dernières. Avantageusement ces microsphères d' embolisation sont constituées d'un biopolymère résorbable capable de libérer les NPs durant leur dégradation.

Parmi les nombreux choix possibles la gélatine constitue une solution intéressante car la gélatine est un sous-produit de l'industrie alimentaire, bon marché, biocompatible, non irritant, non allergène, non immunogène, largement accessible et déjà largement utilisé par l'industrie pharmaceutique [KM-Gattaz-Asfura 2005 et A.I. Van de Bulke 2000] . La gélatine peut être également réticulée en utilisant différents agents de réticulation (formaldéhyde, glutaraldéhyde , polyépoxy, carbodiimide , lumière UV etc..) [ref 21 à 29 de l'article Curcio 2010] . En maîtrisant ce degré de réticulation on peut contrôler la vitesse de dégradation in vivo qui va de quelques heures pour la gélatine non réticulée à complètement non résorbable comme par exemple pour les sphères en trisacryl gélatine [A. Laurent 1996] .

L'exemple suivant montre la préparation de sphère en gélatine partiellement réticulée chargées de NPs Gd202S:Eu nue. Le protocole expérimental utilisé est dérivé des travaux de [Tabata 1989]

250 mg de Span 80 (sorbital monoleate) sont ajoutés dans un ballon contenant déjà 2,5 ml de toluène, 2,5 ml de chloroforme et 50 mg de NPs. 100 mg de gélatine préalablement dissoute dans 2,5 ml d'eau sont alors ajoutés à la solution sous très forte agitation afin de réaliser l'émulsion. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes à 30°C. L'émulsion ainsi obtenue est alors rapidement ajoutée à une solution de 40ml composée de 75% de toluène (30 ml) et 25% de chloroforme (10 ml) contenant 2g de Span 80.

L'émulsion de gélatine est alors réticulée (si nécessaire) par une solution de glutaraldéhyde dans le toluène (10 mg/10 ml; quantité ajustable en fonction du degré de polymérisation souhaité). La réticulation s'effectue en bain de glace pendant 4h (temps ajustable en fonction du degré de polymérisation souhaité) .

Les microsphères sont alors récupérées par filtration puis lavées avec une solution de toluène et de chloroforme (25/75) puis avec une solution de PBS . Elles sont finalement stockées dans une solution de PBS.

Dans les conditions ci-dessus décrites les microsphères de gélatine chargées contiennent uniquement 10% en masse de NPs G202S:Eu (dosage ATG) . Leur taille est variable (entre 30 et 300 μπι) . Cependant, il est assez facile de les trier en taille par tamisage si le besoin s'en fait sentir.

Exemple 6 : Hepasphere ^® chargée en nanoparticules Gd202S:Eu pour l'imagerie par radiographie et tomographie au rayon X sur phantom (maquette) .

Dans l'expérience suivante une caisse en plastique de 32 cm x 24 cm x 15 cm est remplie de gélatine permettant ainsi de mimer les conditions d'absorption des rayons X par un abdomen humain. Dans cette masse de gélatine sont introduit quatre tumeurs simulées de taille croissante de respectivement 1,7 ; 3,3 ; 5 , 1 et 8 , 3 cm de diamètre. Chacune de ces tumeurs simulées, de forme cylindrique (longueur égale au diamètre) est constituées de gélatine chargée en Hepasphere ^® chargées elles même de nanoparticules Gd202S:Eu comme décrit dans l'exemple 1 (200mg de NPs pour 25 mg Hepasphere ^® ) .

Les caractéristiques de ce phantom (maquette) sont reportées sur le tableau suivant.

* La concentration surfacique en NPs est égale à la concentration en NPs rapportée à la surface projetée de la tumeur qui intercepte de faisceau de rayon X. Cette surface projetée est égale à : π x d ² /4 ou 1 x d suivant que l'on observe selon l'axe du cylindre ou perpendiculairement à celui-ci. La concentration surfacique en NPs est réglée à une valeur constante de 30mg/cm2 aux incertitudes de mesure près.

Tableau 4 : Données synthétiques caractéristiques des tumeurs simulées testées en radiographie et tomographie X.

Les résultats d'imagerie réalisée en tomographie X (CB- CT 110 kv) et radiographie KV plane (85 Kv ; 15 mAs sont reportés dans le tableau suivant :

Tableau 5: Résultats quantifiés du contraste obtenu sur les tumeurs simulées testées en radiographie et tomographie X. Ces résultats montrent qu'en utilisant un appareil de radiographie plane KV le contraste obtenu sur les images est sensiblement constant avec la concentration surfacique en NPs quel que soit la taille de la tumeur simulée. Avec une concentration en NPs réglée à 30mg/cm2 de surface projetée, le contraste est suffisant pour réaliser du tracking tumorale par radiographie au rayon X.

En revanche, en tomographie X, qui réalise des images en coupe, et non plus en projection le contraste exprimé en unité Hounsfield est proportionnel à la concentration volumique (ou pondérale) en NPs.

L'homme du métier considère qu'en tomographie X un contraste de l'ordre de 30 à 50 unités Hounsfield est suffisant pour détecter un processus pathologique ou une tumeur marquée ce qui renvoi à des quantités insérée de NPs faible, de l'ordre de 3mg/cm3 (0,3% pondérale). Cependant, la majorité des procédés de guidage utilisent des systèmes d' imagerie plane qui sont beaucoup moins sensibles que les appareils de tomographie . En conséquence, nous retiendrons la valeur de 30mg/cm2 de surface projeté comme valeur limite inférieure. Pour des tailles de tumeurs s ' échelonnant entre 1,5 et 8cm cela revient à incorporer au minimum entre 2% et 0,3% en masse de NPs .

Sur les images de tomographie CB-CT obtenues on observe un contraste moins important pour les tumeurs simulées de grande taille car la concentration volumique en nanoparticules diminue.

Sur les images de radiographie plane (KV) obtenues on observe bien un contraste globalement beaucoup moins fort qu'en tomographie CB-CT. Cependant, ce contraste est sensiblement constant quelle que soit la taille des tumeurs car la concentration surfacique en nanoparticules est également constante.

Exemple 7 : Hepasphere ^® chargée en nanoparticules Gd202S:Eu pour le guidage de la radiothérapie sur phantom (maquette) mobile .

L'expérience a consisté à utiliser un phantom abdominal mobile mimant les mouvements de la respiration d'un patient afin de réaliser une expérience de tracking tumorale dynamique en conditions réelles d'utilisation sur un appareil de radiothérapie Cyberknife guidé par deux imageur plan KV croisés.

Dans cette expérience, la tumeur simulée en gélatine à une forme cylindrique de 1,5 cm de diamètre et 1,5cm de longueur représentant un volume tumorale de 2,64 cm3 (surface projetée 1,76 cm2) . Cette tumeur est chargée avec 53 mg de NPs (la masse des Hepasphere ^® est négligée considérant que leur propriété contrastante est nulle) . Cette quantité représente une concentration surfacique de 30mg/cm2.

Cette tumeur simulée est ensuite introduite dans un cylindre en plastique mobile de densité exactement égale à celle de l'eau. Ce cylindre en plastique est lui-même introduit dans une masse constitué de la même matière plastique de dimension et de forme simulant l'absorption d'un abdomen humain. Ce cylindre bouge (à l'aide d'un vérin) selon un mouvement qui simule un cycle respiratoire humain (amplitude du mouvement 3cm) .

Dans ces conditions, l'appareil de radiothérapie Cyberknife est parvenu à suivre les mouvements de la tumeur simulée sans difficulté.

L'expérience a été renouvelée avec une tumeur simulée en gélatine d'une forme cubique de 3,2 cm de coté représentant un volume tumorale de 32 cm3 (surface projetée 10,24 cm2) . Cette tumeur est chargée avec 324 mg de NPs . Cette quantité représente une concentration surfacique de 31 mg/cm2. Dans ces conditions, l'appareil de radiothérapie Cyberknife est parvenu à suivre les mouvements de la tumeur simulée sans difficulté .

Exemple 8 : Hepasphere ^® chargées en nanoparticules Gd202S:Eu pour 1 ' échographie .

Selon un mode avantageux et surprenant de l'invention les NPs confinées dans les microsphères d' embolisation présentent des propriétés contrastantes très marquées en échographie .

Ainsi l'expérimentation a consisté à utiliser des

Hepasphère ^® chargée en NPs selon l'exemple 1 (25mg Hepasphere ^® , 200mg NPs-150nm, 5ml de sérum physiologique) . Des tumeurs simulées ont ensuite été réalisées selon le même procédé que précédemment décrit dans une masse de gélatine pour des concentrations croissantes en NPs: 1, 2, 5 et 10mg/ml .

Les images obtenues en échographie permettent d'observer que les tumeurs simulées comportant une quantité de lmg/ml (0,l%p) de NPs sont facilement détectables (la quantité présente d' Hepasphere ^® est jugée négligeable car non échogène) .

Pour les faibles teneurs en NPs (<2mg/ml) l'interface tumeur/médium est plus fortement contrastée.

Cette constatation est corroborée par une autre série de clichés réalisée sur d'autres phantoms comportant une quantité constante de NPs (53mg) répartis dans des tumeurs simulées de taille croissante.

On constate que pour une teneur en NPs inférieure à 0,5 mg/ml l'interface apparaît visiblement.

Afin de se rapprocher plus encore des conditions physiologiques 1ml de sérum physiologique chargé en quantité croissante d' Hepasphere ^® chargées en NPs (toujours réalisée selon l'exemple 1) a été injecté dans un foie de porc.

Dans ces conditions, le spot constitué par une charge en nanoparticules inférieure à lmg/ml devient très difficilement détectable.

Il n'en demeure pas moins, que de manière très surprenante, la sensibilité de détection des sphères d' embolisation de la présente invention, par échographie est remarquable. La sensibilité de 1 ' échographie (lmg/ml soit 0,l%p) est a minima aussi bonne que pour la tomographie X (0,3%p) ou l'IRM (0,2%, voir exemple 9) et bien meilleure qu'en radiographie plane.

Enfin, nous avons réalisé une expérience similaire dans un foie de chien récemment euthanasié. Nous avons injecté 2ml (2cm ³ ) d' Hepasphere ^® chargées à 40mg/ml de NPs (préparées selon l'exemple 1: 200mg de NPs pour 25 mg Hepasphere ^® , 5ml sérum physiologique) . Le spot obtenu est clairement visible tant en échographie qu'en tomographie X ou sur les images de radiographie plane.

Exemple 9 : Hepasphere ^® chargées en nanoparticules Gd202S:Eu pour l'IRM. Le même foie de porc injecté utilisé pour les expériences d' échographie de l'exemple 8 a été visualisé en IRM (imagerie T2) .

Les spots constitués par une charge en nanoparticules supérieure à 2 mg/ml sont facilement détectables.

Des phantoms (cylindre de 1cm x 1cm) ont été préparés pour une concentration de 0,5 mg/ml en NPs dans la gélatine. Dans le premier phantom, les NPs sont libres et bien dispersées dans l'ensemble de la masse de gélatine. Dans le second phantom, ces NPs ont auparavant été incorporées dans des Hepasphere ^® selon l'exemple 1 (25mg Hepasphere ^® , 200mg NPs, 5ml de sérum physiologique) .

L'analyse par imagerie IRM montre que le contraste est sensiblement amélioré pour le phantom contenant les Hepasphere ^® chargées en NPs. L'effet de contraste en IRM des NPs incorporées dans des Hepasphere ^® est augmenté comparativement à des NPs libres.

Exemple 10 : Hepasphere ^® chargées en nanoparticules Gd202S:Yb,Tm pour l'imagerie proche infra-rouge.

L'imagerie optique proche infra-rouge n'est guère utilisée pour des applications humaines car la lumière proche infra-rouge (650-1000nm) ne pénètre guère plus d'un centimètre de tissu biologique. En revanche, elle est très utilisée pour des études précliniques sur petit animal.

L'exemple qui suit démontre que des sphères d' embolisation chargées en NPs émettant dans le proche infrarouge pourront être très utiles pour étudier les phénomènes d' embolisation par imagerie photonique. Les NPs précédemment utilisées à base de Gd202S: Eu5%, bien que fluorescente, ne sont pas bien adaptée pour l'imagerie in vivo car elle s'excite dans 1 ' UV qui ne pénètre pas la peau d'un animal. En conséquence, nous avons changé le dopant fluorescent Eu par le couple Yb, Tm plus adapté à l'imagerie dans l'infra- rouge .

Des Nano-particules (NPs) de Gd202S: Yb8% Erl%, de 130 nm de taille moyenne, sont préparées selon le protocole décrit dans FR 2964665 et S.A. Osseni, et al. (Nanoscale, 2014, 6, 555-564). Seule, l'agent dopant Eu de l'exemple 1 est replacé par deux autres lanthanide, l'ytterbium et l'erbium afin de présenter des propriétés de de fluorescence remarquable (émission 650-670 nm) après une excitation située dans le proche infra-rouge (excitation 980nm) . L'homme de l'art connaît les propriétés de fluorescence de ce type de matériaux. Les propriétés d'absorption des rayons X et d'agent de contraste pour l'IRM sont sensiblement équivalentes au NPs de composition voisine Gd202S: Eu5%.

L'incorporation de ces NPs Gd202S: Yb8% Erl% se fait de manière identique à l'exemple 1. Cependant, afin de tester la sensibilité de cette technique d'imagerie la quantité de NPs incorporée dans les Hepasphere ^® a été très fortement réduite (lOmg NPs, 25 mg Hepasphere ^® , 10ml de sérum physiologique) . 10ml de sérum physiologique ont été utilisés (au lieu de 5) afin de garantir l'obtention d'une suspension très fluide injectable avec les micro-seringues utilisées pour cette expérience. L'obtention d'une suspension chargée à 0,5 mg/ml de NPs se fait ensuite par dilution de la suspension mère.

20 microlitres de suspension d' Hepasphere ^® chargées en

NPs sont ensuite injectés directement dans le rein d'un rat. Le rein a été choisi comme organe test pour cet essai car c'est un organe particulièrement bien vascularisé et très chargé en hémoglobine, absorbant fortement la lumière. En conséquence, cela constitue un cas difficile pour la visualisation de composés luminescents.

Les résultats obtenues montre que dans ces conditions, avec une excitation à 980nm, la fluorescence rouge des Hepasphere ^® chargées en NPs est très aisément détectable à travers le corps entier de l'animal.

20 microlitre d'une suspension injectée à 0,5 mg/ml de NPs représente seulement 10 microgrammes de NPs (25 microgrammes d' Hepasphere ^® sèches). En conséquence, et de manière surprenante, la sensibilité de cette technique d' imagerie dans le proche infra-rouge utilisant des Hepasphere ^® chargées en NPs est supérieure d'environ trois ordres de grandeurs aux autres techniques d' imagerie reportées dans ce document (quantités injectées de l'ordre de la dizaine de mg) .