CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una formulación fungicida natural del tipo emulsificado o microencapsulado en base a extractos de orujo de uva o pomasa para controlar la infestación por Botrytis cinérea, en plantas, partes de plantas o sus frutos, y su proceso de preparación.

ANTECEDENTES

La actividad agrícola en general y la fruticultura en particular deben hacer uso de un gran número de agentes químicos para combatir diferentes tipos de plagas (insecticida, nematicidas, herbicidas, fungicidas, etc.) . En la mayoría de los casos estos agentes son bastante efectivos, algunos de ellos muy seguros también, pero suelen presentar las siguientes debilidades. Por un lado, el uso repetitivo en el tiempo tiene a generar resistencia en los organismos blanco por adaptación a las moléculas activas presentes en esos plaguicidas. Por otro lado, un porcentaje no menor de ellos se acumulan en el ambiente y pueden provocar efectos no deseados en otros miembros de los ecosistemas agrícolas (animales, vegetales y/o insectos beneficiosos para el hombre) y, finalmente, ya sea a través del agua y/o el suelo, terminar en la cadena trófica del ser humano, con potenciales consecuencias para la salud de los miembros de aquellas poblaciones afectadas. Desde otro punto de vista, y a la par de una tendencia creciente hacia el consumo de alimentos más sanos y naturales, ha surgido un nicho de consumidores que están exigiendo productos orgánicos, y la agricultura orgánica implica el uso de estrategias muy diferentes de control de plagas que, entre otros aspectos, no permiten el uso de agentes químicos que no sean naturales. Entre los agentes naturales factibles de ser utilizados en agricultura orgánica, existen muy pocos principios activos actualmente presentes en fórmulas comerciales de fungicidas para agricultura orgánica. Uno de estos es el azufre elemental, que se ha utilizado por varios siglos en la agricultura orgánica convencional y que hoy en día se comercializa en diferentes formas (polvo, suspensión acuosa) . Otro agente muy utilizado por siglos y hasta el día de hoy es el aceite de neem, muy eficaz contra insectos y otras plagas. Uno de los más recientemente aparecidos son, los extractos de toronja, que se han venido incorporando en la agricultura orgánica durante las últimas décadas mostrándose particularmente eficaz contra las plagas de Botrytis cinérea .

Por lo tanto, en la situación actual solamente el azufre elemental y los fungicidas en base a extractos de toronja (como el BC-1000 comercial) son los únicos agentes eficaces contra el ataque de Botrytis cinérea factibles de ser utilizados en la agricultura orgánica y, por lo tanto, resulta necesario diversificar la oferta de agentes de control biológico que sean sanos, seguros y eficaces para el control de este hongo fitopatogeno. Entre los métodos tradiciones para el control de Botrytis cinérea, los fungicidas químicos, ya sean inorgánicos u orgánicos sintéticos, proporcionan el principal medio para controlar la descomposición por hongos en pre y post- cosecha de frutas y verduras (Tripathi & Dubey, 2004) . El uso continuo de estos fungicidas ha enfrentado principalmente dos obstáculos: la creciente preocupación pública por la contaminación del ecosistema y los riesgos que esto trae para la salud humana; y la proliferación de poblaciones resistentes.

En Chile, se utiliza para controlar B. cinérea en vides, fungicidas tales como: hidroxianilidas , anilinopirimidinas , dicarboxamidas , benzimidazoles, estrobilurinas , etc. (Esterio, M., Muñoz, G., Ramos, C, Cofré, G., Estévez, R., Salinas, A., & Auger, J. (2011) . Characterization of Botrytis cinérea Isolates Present in Thompson Seedless. Plant Disease, 95, 683-690) . Pese a ello, ya se ha detectado en Chile y a nivel mundial la resistencia del hongo a muchos de estos fungicidas como las dicarboximidas y anilinopirimidinas, entre otros; más aún, han sido detectadas cepas resistentes a multidroga (MDR) . En el país se ha detectado en la VI Región, una mayor frecuencia de cepas MDR, lo que se ajusta a los programas de control más intensivos, debido a las características climáticas que favorecen el desarrollo de infecciones por Botrytis cinérea (Kretschmer, M., Leroch, M., Mosbach, A., Walker, A.-S., Fillinger, S., Mernke, D., Hahn, M. (2009) . Fungicide- Driven Evolution and Molecular Basis of Multidrug Resistance in Field Populations of the Grey Mould Fungus Botrytis cinérea. PLoS Pathogens, 1-13; Esterio, M., Muñoz, G., Ramos, C, Cofré, G., Estévez, R., Salinas, A.,& Auger, J. (2011) . Characterization of Botrytis cinérea Isolates Present in Thompson Seedless. Plant Disease, 95, 683-690) .

En las últimas décadas ha sido de gran interés científico la búsqueda de métodos alternativos para el control de Botrytis cinérea. Entre ellos se encuentran: agentes de control biológico, agentes antimicrobianos naturales, agentes descontaminantes tipo GRAS como ácido acético, etanol, ozono, etc.; métodos físicos como radiación UV, presión (tratamiento hiperbárico) , contenido de gas (CO ₂ ) ; entre otros (Romanazzi, G., Lichter, A., Gabler, F., & Smilanick, J. (2012) . Recent advances on the use of natural and safe alternatives to conventional . Postharvest Biology and Technology 63, 141-147) .

Uno de los más estudiados ha sido los agentes de control biológico (BCA) , donde se incorpora microorganismos capaces de combatir o disuadir al hongo fitopatogeno. Un ejemplo es el hongo Muscodor albus, un hongo que produce compuestos volátiles, ha demostrado ser eficaz en el control de la pudrición gris por Botrytis cinérea (Romanazzi, G., Lichter, A., Gabler, F., & Smilanick, J. (2012) . Recent advances on the use of natural and safe alternatives to conventional. Postharvest Biology and Technology 63, 141- 147) . También han sido estudiados hongos filamentosos como Trichhoderma , Ulacladium y Gliocladium; y bacterias de los géneros Bacillus y Pseudomonas (Jacometti, M., Wratten, S., & Walter, M. (2010) . Alternatives to synthetic fungicides for Botrytis cinérea. Australian Journal of Grape and Wine Research 16, 154-172) . Estos son principalmente utilizados como tratamientos preventivos y generalmente no son efectivos post infección, además deben aplicarse bajo condiciones climáticas propicias para la colonización de la vid por el BCA (Whipps, J., & Lumsden, R., 2001) . Commercial use of fungi as plant disease biological control agents: Status and prospects. En T. M. Butt, C. Jackson, & N. Magan, Fungi as biocontrol agents (páginas 9-22) . Wallingford, Oxon, UK : CABI) . Asimismo, los BCA son afectados por factores físicos como variaciones de temperatura, humedad y radiación solar, además de requerir de condiciones especiales para su almacenamiento y control. Por estas razones, es que se ha demorado la aceptación de estos biofungicidas por los agricultores (Jackson, R., 2008) . Vineyard practice: Disease, pest and weed control. En Wine Science: Principies and Applications (páginas 175- 212) . London: Academic Press) .

Los agentes antimicrobianos naturales tienen un gran potencial para reemplazar los fungicidas sintéticos actuales. Entre estos se encuentran: jasmonatos, glucosinolatos , propóleo, fusapyrone y desoxyfusapyrone, quitosano, aceites esenciales y extractos de plantas (Tripathi, P., & Dubey, N., 2004) . Exploitation of natural products as an alternative strategy to. Postharvest Biology and Technology 32, 235-245) . Las frutas y verduras tienen un gran número de compuestos constitutivos o inducibles que son antimicrobianos, los cuales aún no se han explotado plenamente como agentes de control para las enfermedades postcosecha, como la pudrición gris (Culter, H., Steverson, R., Colé, P., Jackson, D., & Johnson, A., 1986) . Secondary Metabolites from Higher Plants. Their Possible Role as Biological Control Agents. ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, DC, 178-196) . Estos compuestos son considerados metabolitos secundarios, pudiéndose encontrar por ejemplo terpenos, compuestos fenólicos, alcaloides y compuestos alifáticos, los cuales presentan actividad antifúngica (Dixon, R., 2001) . Natural products and plant disease resistance. Nature, 411, 843- 847; Gurjar, M., Ali, S., Akhtar, M., & Singh, K. (2012) . Efficacy of plant extracts in plant disease management. Agricultural Sciences, 3, 425-433; Grayer, R., & Harborne, J. (1994) . A survey of antifungal compounds from higher plants. Phytochemistry , 37, 19-42) .

En Chile, los métodos alternativos para el control de B. cinérea han sido fungicidas orgánicos naturales a base de extractos cítricos como BC1000 y STATUSsulfo, y agentes de control biológico como Bacillus subtilis (Serenade) y Trichoderma spp (Trichodex) (Esterio, M. & Auger, J., 1997) . Control de Botrytis cinérea Pers . en vid (Vitis vinifera L.) utilizando fungicidas no convencionales: BC- 1000 y Trichodex. Aconex 54, 11-17.

En particular en el arte previo, US2014271950 enseña un fungicida natural en base a aceite de cebolla, romero, tomillo y canela para el control de hongo (Black Sigatoka) , útil en cultivos de bananas.

WO2014128321 enseña un método para tratar y controlar enfermedades de post-cosecha en frutos y vegetales con la aplicación inicial de una solución acuosa de una formulación acuosa o emulsión concentrada de un extracto de planta (plantas, frutos y vegetales, en general) , y subsecuentemente, la aplicación de una solución acuosa de una formulación que es una emulsión concentrada, liquida soluble o suspensión concentrada de una formulación para el fortalecimiento de plantas que comprende al menos una sal de fosfito o una formulación fungicida con al menos un fungicida sintético de la familia del fosfonato, preferentemente sales de etilo de ácido fosfónico, o una combinación de ambos. El extracto de planta de la primera formulación, en particular, es extracto de canela. También, se mencionan como posibles extractos, los extractos de clavo, cítricos y ajo.

CN103461401 divulga un fungicida natural eficaz para prevenir y tratar la enfermedad marchitamiento por gingko, y comprende hierba Siegesbeckiae, sealwort, granatum, hierba mosla china, Coptidis rizoma, hierba Fortuna eupatorium, menta, rosa laevigata Michx, folium ilicis purpurea y minerales compuestos, es decir, componentes puramente naturales, libre de toxinas y contaminación.

ES2429799 divulga la obtención, producción y uso de metabolitos con anti-Botrytis cinérea de extractos naturales de plantas chilenas. En particular, metabolitos de extracto de quillay cultivada in vitro {Quillaza saponaria Mol.) . Se enseña un procedimiento para obtener los extractos de quillay con actividad antifúngica contra Botrytis cinérea con un disolvente, desde plantas que han sido micropropagadas de yemas axilares de árboles adultos y yemas jóvenes de no más de 3 meses. La extracción es preferentemente del tipo etanólica. Luego, el extracto se filtra, concentra y seca. La formulación del extracto se aplica en forma liquida o sólida, lista para usar o preparar mediante suspensión, dilución, emulsión u otro procedimiento conocido en la técnica, y se aplica mediante aspersión, baño, inmersión como película u otras realizaciones habituales, y se aplica a la planta, fruto, ambiente, tierra, semillas o lugar de almacenamiento o depósito.

CN103109873 se refiere a un extracto fenólico de hoja de alcachofa Jerusalén y su método de preparación y aplicación. El método de preparación comprende secar las hojas de alcachofa y romperlas hasta obtener un polvo seco, el que se coloca en un dispositivo de extracción de reflujo de descompresión, y se agrega agua desionizada, para extraer a temperatura ambiente, luego el extracto se concentra o seca, y se agrega un solvente orgánico, en dicho solvente orgánico el material obtenido del paso anterior, se extrae mientras se refluye o descomprime y refluye, y se concentra y seca, y entonces, se extrae en solvente orgánico y luego en éter de petróleo, cloroformo, acetato de tilo y alcohol n-butílico, respectivamente, y finalmente, se concentra y seca para obtener el extracto fenólico. Este extracto pertenece a un pesticida de fuente vegetal que tiene efectos especialmente buenos en una pluralidad de bacterias patogénicas de planta tales como Botrytis cinérea, phytophthora capsici leonian , colletotrichum gloeosporicides, rhi zoctonia de cereal y gaeumannomyces graminis, y también puede ser usado como un fungicida de fuente de planta y un conservante de frutas y vegetales .

US2013109571 se refiere al uso de un extracto de orujo de uva para estimular las defensas en plantas y un método para estimular tal defensa, aplicándolo en las plantas. El extracto se prepara de orujo de uva roja a la que se agrega agua, y posteriormente, se centrifuga, para luego extraer en una mezcla etanol-agua (30% v/v etanol) , y luego, se concentra al vacio y atomiza para obtener un polvo. El proceso se realiza en presencia de SO ₂ sin agregar aditivos. Las plantas son principalmente seleccionadas del grupo de angioespermas y di- y monocotiledoneas , particularmente, tomate y maíz. El extracto permite reducir la cantidad de pesticida que se use en la planta, es decir, no reemplaza al pesticida.

US2011190123 divulga un fungicida natural para semillas o suelo, que comprende una formulación de extracto de quillay rico en saponina al que se agregan polímeros sintéticos (látex y resinas) para la liberación lenta del fungicida, en el suelo. Se probó particularmente, para hongos Gaeumannomyces graminis del trigo.

MX2009012494 revela un proceso para obtener un extracto de compuesto fenólico de orujo de uva roja Vitis vinífera a bajas temperaturas para aplicar en alimentos y bebidas destinados al consumo humano y animal.

WO2011057421 divulga el uso de un extracto fenólico de ulmo de miel unifloral {Eucryhia dordifolia) como desinfectante y sanitizante para uso sanitario y doméstico así como para la aplicación tópica y sistémica como bactericida o fungicida para seres vivos. La invención también comprende un método de preparación del extracto y de la composición desinfectante y sanitizante.

JP2005145847 revela una composición para el control de enfermedades en plantas que es efectiva contra Botrytis cinérea y Fusarium oxysporum, en pequeñas dosis y segura, que comprende al menos un ingrediente de aceite esencial seleccionado del grupo consistente de extractos de madera y aceites de Calitris spp como ingrediente activo.

JPH6475408 divulga un fungicida de extracto Reynoutria sachalinensis Nakai para controlar hongos incluyendo Botrytis cinérea. El extracto se prepara de hojas o una parte rizomática de la planta seca o ligeramente calentada, la que se muele para luego someterla a extracción etanólica .

CL 224-2011 enseña el uso de un extracto de Lessonia trabeculata para el control de infecciones producidas por Botrytis cinérea en plantas, el cual se asperja sobre la planta.

CL 3457-2005 divulga un método para prevenir, controlar, eliminar, provocar o repeler plagas de Botrytis cinérea plantas, aplicando una formulación liquida de ácido jasmónico, jasmonatos o sus derivados.

Entonces, persiste la necesidad de disponer una formulación fungicida natural para controlar una infestación por

Botrytis cinérea.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Diagrama de flujo para la fabricación del fungicida microencapsulado en base a extracto de orujo de uva .

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención se relaciona con una formulación fungicida del tipo emulsificado o microencapsulado que comprende extractos de orujo de uva o pomasa para controlar una infestación por Botrytis cinérea, en plantas, partes de plantas o sus frutos, y su proceso de preparación.

La formulación fungicida del tipo microencapsulado comprende como principio activo, un extracto orgánico obtenido desde orujos de uva.

La formulación se prepara por el siguiente método en dos partes :

a) obtener un extracto de orujo de uva mediante una extracción controlada, con solventes orgánicos, de los residuos (orujos o pomasa) provenientes de la industria vitivinícola, al que, posteriormente se le remueve el solvente y se termina con un material viscoso, de color purpura similar a una pasta, que contiene los principios activos con actividad antifúngicas , y posteriormente, este extracto rico en principios activos, se disuelve en una fase oleosa que consiste en monoglicerido y goma éster en caliente. b) Por otra parte, hay que preparar una fase acuosa compuesta de surfactantes seleccionados de goma arábica y tween 20, la que también se calienta para facilitar la homogenización posterior. Luego las fases acuosa y oleosa anteriormente descritas, se mezclan en un equipo homogeneizador de alta velocidad, para generar una suspensión de microcápsulas con tamaños que se encuentra entre los 10 y 30 pm, y cuyo núcleo oleoso contienen el principio activo. Este núcleo oleoso queda cubierto por una película de goma arábica que actúa como cubierta protectora contra la acción de la luz y el oxígeno y como barrera de difusión que permite la liberación lenta de los principios activos hacia sus sitios de acción en los micelios y/o esporas del hongo fitopatógeno que se deposita sobre la superficie de las hojas y/o frutos del vegetal que se desea proteger. La figura 1 corresponde al diagrama de flujo de las etapas involucradas y su secuencia en el proceso de fabricación.

La presente invención se relaciona con un fungicida natural, en que el principio activo se obtiene desde orujos de uva, y se prepara como emulsificado (EW) o microencapsulado (M) en un sistema de dos fases, una fase oleosa y otra fase acuosa, que se mezclan en sistemas de alta velocidad, y en que cada una de esas fases puede estar presente en proporciones que pueden fluctuar entre 2 y 90% p/p del peso total de la mezcla:

La fase oleosa consiste de:

Extracto concentrado de polifenoles de orujo de uva en una concentración que puede variar entre 1-5.000 ppm, según la aplicación. Por ejemplo, para el caso particular del tratamiento de uvas viníferas, se utiliza una fórmula de fungicida emulsificado o microencapsulado en que la cantidad de principio activo fue de 1500 ppm.

Un solvente oleoso del extracto de orujo seleccionado del grupo consiste de uno o más de los siguientes componentes: monoglicéridos , diglicéridos , aceites vegetales comestibles (soya, maravilla, colza, cañóla, algodón u otros), aceites de frutos secos (nuez, maní, almendra y similares) aceites esenciales provenientes de plantas y/o semillas, aceites de origen marino, vaselina liquida u otros aceites minerales y/o vegetales, en una proporción comprendida dentro de un rango que puede variar de 0 a 99,8% (p/p) de la fase oleosa .

La fase acuosa consiste de:

Uno o más agentes encapsulantes seleccionados del grupo consistente de entre los siguientes componentes: goma arábica, goma éster, propil celulosa, butilcelulosa, capsul, purity gum 2000, purity gum ultra, purity gum Be, y similares, disueltos en la fase acuosa, a una concentración que puede variar entre 1 y 20% p/p de la fase acuosa.

Uno o más agentes emulsificantes factibles de ser elegidos del grupo consistente de: monoestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, laurato de sorbitán, monooleato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monolaurato de polioxietilén (20) sorbitán, monooleato de polioxietilén (20) sorbitán, monopalmitato de polioxietilén (20) sorbitán, monoestearato de polioxietilén (20) sorbitán, triestarato de polioxietilén (20) sorbitán, y/o lecitinas, en concentraciones que puede variar entre 0,1 y 20% p/p de la fase acuosa. Uno o más agentes estabilizantes seleccionados dentro del grupo de: goma xantano, carboximetilcelulosa, almidones modificados, maltodextrinas , alginato, carragenanos , pectina, quitosano u otros carbohidratos hidrosolubles , en un concentración que puede variar entre 0 y 20% p/p de la fase acuosa.

Agua desmineralizada en una proporción que puede variar entre 20 y 99,9 % (p/p) de la fase acuosa.

Formulas microencapsulada y emulsificada fueron probadas frente al patógeno Botrytis cinérea en condiciones de laboratorio y campo, comparando el comportamiento con un fungicida natural de amplio uso en el mercado nacional (BC- 1000) . Los resultados obtenidos en las pruebas de campo fueron los siguientes:

La validación en terreno se realizó con una fórmula que contenia 1500 ppm de principio activo en dos tipos de fórmulas diferentes, una microencapsulada y la otra emulsificada .

La composición de cada una de las fórmulas utilizadas fue la siguiente:

Tabla 1. Composición de las fases acuosas y oleosas de los dos fungicidas: Emulsificado y microencapsulado, desarrollados en este estudio.

Fases Componentes Composición (g/100 g de mezcla)

Emulsificado (EW) Microencapsulado

(M)

Por cada Respecto Por cada Respecto fase del fase del total total

Agua 89,7 64, 6 77,3 60,1

Fase Tween 20 8,3 6 5,7 4,4 acuosa Goma arábica 0,0 0 17, 0 13,2

Quitosano 1, 9 1,4 0,0 0

Principio

0,043 0, 012 0, 054 0, 012

Fase activo

oleosa Monoglicerido 99, 96 28 75,2 16,7

Goma ester 0 0 24,8 5,5

Para su aplicación en terreno, las fórmulas de fungicida fueron diluidas en agua potable en una proporción de 14 g de fungicida por cada llitro de agua.

Las suspensiones asi obtenidas de cada uno de los dos tipos de fungicida fueron aplicadas en floración, pinta y pre cosecha en hileras de vides diferentes, y en una tercera hilera, se aplicó el control comparativo, correspondiente al fungicida natural comercial BC 1000. En cada una de estas hileras se asperjaron con un aspersor manual, 479 racimos y, posteriormente, se verificó la cantidad de racimos infectados con Botrytis . Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Eficacia del fungicida emulsificado y microencapsulado para prevenir infección por Botrytis cinérea, comparada con un control comercial, BC1000 en vides de uva vitivinícola.

Total Eficacia del fungicida (

Fungicida Racimos Racimos infectados con

Tratados Botrytis cinérea) 11/ Febrero 17/Febrero

Emulsificados (EW) 479 iiiiiiiiiiiiiiiiii liliiii! 1, )¡¡

Microencapsulado (M) 479 1,46 , ^' 87

Control (BC1000) 479 ¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡I !!!!!!!!!!!!!!!!!!!^ll 11¡

Los resultados de la tabla 2, muestran que las fórmulas que motivan esta patente presentan igual o mejor capacidad de inhibir el crecimiento de Botrytis cinérea que el producto comercial BC 1000 y, por lo tanto, se podría utilizar en reemplazo de este fungicida comercial u otros de similar espectro de acción.

La suspensión de microcápsulas de la presente invención se comporta como una pasta viscosa que se puede envasar ya sea en frascos de boca ancha de plástico u otro material o, en su defecto, en bolsas selladas de PET- metalizado de uso habitual en el envasado de alimentos, productos químicos y otros .

Para su aplicación en terreno, esta suspensión de microcápsulas se debe dispersar en agua. Para su aplicación en terreno se puede aplicar cualquier tipo de aspersor convencional ya sea de tipo manual o mecánico.