Natürliche Inhalts-, Aroma-und Wirkstoffe werden seit langer Zeit mittels verschiedener Extraktionstechniken aus vollstän- digen Pflanzen und deren Teilen, wie Blättern, Wurzeln, Früchten oder Rinde isoliert. Als einer der ersten Naturstof- fe wurde Betulin, der Stoff, welcher der Birkenrinde ihre weiße Farbe verleiht, im Jahre 1788 aus Pflanzenmaterial ge- wonnen (Lowitz, M., Chemische Analysen, Hrsg. Crell, L., Vol.

2, S. 312). An diese erste Isolierung schlossen sich wissen- schaftliche Studien einschließlich elementarer Analysen von Betulin an, die U. Hausmann 1876 publizierte (Hausmann, U., Annalen der Chemie, 182, S. 368).

Betulin-haltige Pflanzen sind im Pflanzenreich weit verbrei- tet. Sie gehören vorwiegend zu den Bedecktsamern (=Angio- sperme Pflanzen), wobei in einigen Spezies der Ordnung Faga- les (Buchenverwandte) und hier insbesondere in der Familie der Betulaceen (Birken) der Gehalt an Betulin in der äußeren Rinde kulminiert (Übersichtsartikel : Hayek, E. W. et al., (1989), A Bicentennial of Betulin, Phytochemistry, 28 (9), S.

2229-2242). Der weiße Teil der Birkenrinde, insbesondere der Spezies Betula pendula, Betula verrucosa und Betula papyfera kann mehr als 30 % Betulin enthalten. Genauere Untersuchungen liegen von Rainer Ekman aus dem Jahre 1983 vor, wonach aus

der trockenen äußeren Rinde von Betula verrucosa 21-40 % Triterpene bzw. 16,7-34 % Betulin extrahiert wurden (Ekman, R. (1983a), Holzforschung, 37, S. 205-211). Die innere Rin- de enthält dagegen nur Spuren von Triterpenen im Bereich von ca. 0,37-0,43 % (Ekman, R. (1983b), Finn. Chem. Letters, S.

162).

Betulin ist ein pentazyklisches Triterpen mit einem Lupan-Ge- rüst, das auch als Betulinol, Trochoton, Birkenkampher und (Coryli-) resinol bezeichnet wird. Das charakteristische Merk- mal der Lupan-Gruppe ist ein Ring mit fünf Kohlenstoffatomen innerhalb des pentazyklischen Systems, der eine a-Isopen- tenylgruppe an der Position C-19 besitzt. Betulin zeichnet sich weiterhin durch eine hohe thermische Stabilität aus, sein Schmelzpunkt liegt zwischen 250 und 261°C, wobei noch höhere Werte nach der Sublimation des rekristallisierten Pro- duktes erhalten werden. Sein Molekulargewicht beträgt 442,7, es ist löslich in Pyridin und Tetrahydrofuran, aber nur ge- ring löslich in Dichlormethan, Chloroform und kalten organi- schen Lösungsmitteln, wobei sich die Löslichkeit mit steigen- der Temperatur erheblich erhöht. In Wasser und kaltem Petrol- ether [Kohlenwasserstoffe mit 5 bis 8 C-Atomen (C5-C8 KW)] ist Betulin praktisch unlöslich. Kinetische Untersuchungen haben außerdem eine sehr geringe Reaktivität der Hydroxygrup- pen von Betulin gezeigt (Übersichtsartikel : Jääskeläinen, P.

(1981), Paperi ja Puu-Papper och Trä 10, S. 599-603).

Bereits im Jahre 1899 hat J. Wheeler die antiseptischen Ei- genschaften von Betulin nachgewiesen, es wurde daher für die Sterilisierung von Wundverbänden und Pflastern verwendet (Wheeler, J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, S. 353). In der Naturmedizin und in der Volksheilkunde wurden und werden noch heute Abkochungen von Birkenrinde gewonnen, wobei meist jedoch nur der innere Teil verwendet wird, der nur Reste der weißen Birkenrinde und wegen mangelnder Löslichkeit wohl kein Betulin enthält, da der Gehalt an Betulin der inneren Rinde < 0,5 % beträgt und Betulin in Wasser oder Wasser-Alkohol Gemi-

schen (bis 60 % Alkohol) unlöslich ist (Ekman, R. (1983b), supra).

Der so gewonnene Sud wird zur Behandlung von Wechselfieber, Wassersucht, Gicht und bei Hautkrankheiten sowie als Tinktur für Umschläge gegen Abszesse verwendet. Weiterhin wird Bir- kenrinde zur Herstellung des Birkenrindenöls, das auch zur Behandlung von Rheuma eingesetzt wurde und als Aromatikum verwendet (Hänsel, R. et al., (Hrsg.), (1994), Drogen A-D, Springer Verlag, Kapitel Betula, S. 502-511 ; Hayek, E. W. supra). Außerdem ist die Verwendung von Birkenextrakten als Badezusatz zur Behandlung speziell von Fußschweiß sowie als Zusatz zu Shampoos als Haarpflegemittel bekannt (Nowak, G.

A., (1966), Cosmetic and Medicinal Properties of the Birch, Amer. Perfumer Cosmet., 81, S. 37). Jedoch sind auch hier nur wäßrige Auszüge aus Birkenblättern verwendet worden, die praktisch kein Betulin enthalten.

Neuere Untersuchungen lassen eine medizinische Wirkung von Betulin und Betulinderivaten vermuten. Im Tierversuch inhi- bierte Betulinsäure die Replikation von Retroviren, insbeson- dere des humanen Immundefizienz Virus (HIV1). Die beschriebe- nen bakteriostatischen und bakteriziden Wirkungen von Betulin gegen das Darmbakterium Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri und Staphylococcus aureus lassen auf eine breitere medizinische Anwendung schließen (Chen Sun, J. et. al., (1998), Anti-AIDS Agents, 32, Synthesis and anti-HIV ac- tivity of Betulin derivates, Bioorganic & Medical Chemistry Letters 8, S. 1267-1272 ; Evers, M. et. al., (1996), Betulinic acid derivates : a new class of human immunodeficiency virus type 1 specific inhibitors with a new mode of action, J. Med.

Chem. 39, S. 1056-1068 ; Hayek, E. W. et. al., supra). Ferner konnte Betulin und Betulinderivaten eine entzündungshemmende, kortisonähnliche Wirkung ebenso wie eine zytostatische Wir- kung bei Verwendung verschiedener Tumorzellinien in vitro zu- gewiesen werden (Carmen Recio, M., et. al. (1995), Investiga- tions on the steroidal anti-inflammatory activity of triter- penoids from Diospyros leucomelas, Planta Med. 61, S. 9-12 ;

Yasukawa, K., et. al., (1991), Sterol and triterpene deri- vates from plants (...), Oncogene 48, S. 72-76).

Für die Gewinnung von Betulin aus Birkenrinde, insbesondere aus dem Birkenkork kommt neben der Sublimation (Lowitz, M., supra) vor allem die Extraktion in siedenden Lösungsmitteln in Betracht. Als Lösungsmittel werden dabei hauptsächlich Al- kohole und chlorierte Kohlenwasserstoffe verwendet (Ukkonen, K. und Erä, V., (1979), Kemia-Kemi 5, S. 217-220 ; Ekman, R.

(1983a), supra ; Eckermann, C. und Ekman, R. (1985), Paperi ja Puu-Papper och Trä 3, S. 100-106 ; O\'Connell, M. M. et al., (1988), Phytochemistry 7, S. 2175-2176 ; Hua, Y. et al., (1991), Journal of Wood Chemistry and Technology 11 (4), S.

503-516).

Nachteilig an der Sublimationstechnik ist die Tatsache, daß die Inhaltsstoffe nur mit sehr geringer Ausbeute erhalten werden, was den Einsatz von großen Ausgangsmengen erforder- lich macht. Besonders nachteilig an der Sublimationstechnik ist außerdem das gleichzeitige Auftreten teerartiger Zerset- zungsprodukte aus anderen Kork/Rindenbestandteilen, was ein mehrfaches Resublimieren oder Umkristallisieren erforderlich macht. Bei der Anwendung der Extraktionsmethode ist besonders nachteilig, daß Betulin in den genannten Lösungsmitteln rela- tiv schlecht löslich ist und die Extraktion nur mit hohem Zeitaufwand durchgeführt werden kann. Auch hier ist mehrfa- ches Umkristallisieren erforderlich. Die besten Ergebnisse werden dabei mit höher siedenden Kohlenwasserstoffen erzielt (Eckermann, C. und Ekman, R. (1985), supra). Diese sind aber im Hinblick auf Kosmetika und Arzneimittel wegen der unver- meidbaren Lösungsmittelreste im Präparat besonders nachtei- lig.

Lösungsmittel, in denen Betulin gut löslich ist, wie bei- spielsweise Pyridin und Tetrahydrofuran, werden allgemein als giftig eingestuft. Sie scheiden aufgrund der gesundheitlichen Risiken und der nicht unerheblichen Handhabungsgefahren für die Extraktion in großem Maßstab aus. Ein weiterer Nachteil

der genannten Lösungsmittel ist, daß erhebliche Mengen bräun- licher, unerwünschter Substanzen mit gelöst werden, deren spätere Abtrennung extrem aufwendig und unwirtschaftlich ist.

Damit steht bis heute kein effizientes Verfahren zur Gewin- nung von Betulin aus Birkenkork zur Verfügung, bei dem Betu- lin in großer Menge, mit einem hohen Reinheitsgrad und ohne Verwendung von stark gesundheitsgefährdenden Lösungsmitteln erhalten werden kann.

Im Stand der Technik sind weiterhin lediglich Verfahren zur Extraktion von lipophilen Naturstoffen unter hohem Druck und hoher Temperatur bekannt. Beispielsweise wird in der US 5,843,311 ein Verfahren zur Isolierung von organischen Stoffen mittels organischer Lösungsmittel beschrieben. Mit Hilfe dieses analytischen Verfahrens, das im kleinen Maßstab angewandt wird, können Proben auf Kontaminationen, Verunrei- nigungen oder Zusätze untersucht werden. Anwendung findet dieses Analyseverfahren vorwiegend zur Kontrolle in der Nah- rungs-und Genußmittelindustrie, in der pharmazeutischen In- dustrie und bei der Analyse von Bodenproben. Nachteilig an diesem Verfahren ist seine auf den analytischen Maßstab be- schränkte Anwendung.

In der US 5,647,976 ist ein Reaktionsgefäß beschrieben, das für die Extraktion von Inhaltsstoffen mittels Lösungsmittel unter erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur verwendet werden kann. Dieses Reaktionsgefäß zeichnet sich durch einen Ver- schluß aus, der es erlaubt, Lösungsmittel in das Reaktionsge- fäß einzuführen und aus ihm zu entfernen, ohne daß der Ver- schluß zerstört werden muß. Auf diese Weise werden Kontamina- tionen des Lösungsmittels wirkungsvoll verhindert. Ferner kann das Reaktionsgefäß einfach gehandhabt werden, so daß die Verwendung auch ungeschultem Personal offensteht. Die US 5,647,976 beschreibt lediglich das genannte Reaktionsge- fäß, jedoch ergeben sich aus ihr keine Hinweise für die Durchführung eines Extraktionsverfahrens. Sie enthält außer- dem keine Angaben über die Qualität und Reinheit der in dem Reaktionsgefäß isolierten Inhaltsstoffe. Die US 5,660,727 be-

schreibt die Verwendung des Reaktionsgefäßes aus der US 5,647,976 in einer automatischen Rotationseinheit, welche die gleichzeitige Analyse von mehreren Proben erlaubt. Das Volu- men der Reaktionsgefäße, die in die Rotationseinheit einge- setzt werden können, liegt zwischen 10 und 30 ml. Daher ist die Anwendung dieser Gegenstände auf den Analysemaßstab be- schränkt und nicht für den Einsatz im großtechnischen Rahmen geeignet.

In der US 5,785,856, die eine Teilanmeldung der US 5,660,727 darstellt, ist neben der Rotationseinheit auch ein Verfahren zur Extraktion von Inhaltsstoffen unter Verwendung von Lö- sungsmitteln beschrieben. Das Verfahren wird unter erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur durchgeführt. Hierfür wird das Reaktionsgefäß mit zu analysierendem Probenmaterial befüllt, in die Rotationseinheit eingesetzt und automatisch mit Lö- sungsmittel versetzt. Anschließend wird der Druck und die Temperatur auf vorgegebene Werte erhöht. Nach erfolgter Ex- traktion wird das Lösungsmittel in einen Aufnahmebehälter ab- geführt. Das Reaktionsgefäß einschließlich der Zuführ-und Abführleitungen kann mit einem inerten Gas wie beispielsweise Stickstoff zur Reinigung gespült werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist insbesondere, daß es sich zwar zum Nachweis von lösbaren Stoffen in einer Analyseprobe, aber nicht oder nur schlecht für die präparative Darstellung und Gewinnung von Inhaltsstoffen in großer Menge und Reinheit eignet, weil sich gerade hierbei Kontaminationen der Probe sehr störend auf den Reinheitsgrad des extrahierten Inhaltsstoffs auswirken. Fer- ner ist das in der US 5,785,856 beschriebene Verfahren auf- grund seiner Konzeption auf den analytischen Maßstab be- schränkt. Das Dokument enthält keine Angaben über erzielbare Reinheitsgrade und die Möglichkeit zum großtechnischen Ein- satz.

Alle im Stand der Technik beschriebenen Verfahren arbeiten diskontinuierlich, d. h. eine bestimmte Menge wird jeweils in einem zu befüllenden und anschließend zu entleerenden Gefäß extrahiert. Bisher ist kein kontinuierliches Verfahren ver-

wirklicht worden, bei dem das Pflanzenmaterial und das fri- sche Lösungsmittel kontinuierlich zugeführt, die Extraktion im Gegenstromverfahren durchgeführt und das extraktgesättigte Lösungsmittel sowie das vollständig extrahierte Pflanzenmate- rial gleichmäßig abgeführt werden.

Im Stand der Technik wurden außerdem bereits einige Versuche unternommen, die oberflächenaktiven Eigenschaften von Betulin zu modifizieren, um ein technisch anwendbares Produkt herzu- stellen. So hatte beispielsweise Pasich bereits in den 60er Jahren Betulin und seine Ester, wie Succinate, Phtalate und Tetrachlorphtalate als Emulgatoren für weiße Vaseline, Walt- ran und Erdnußöl untersucht und war zu dem Schluß gekommen, daß Betulin hinsichtlich seiner emulgierenden Eigenschaften, d. h. seiner Fähigkeit wäßrige und ölige Komponenten miteinan- der zu verbinden, mit bekannten technischen Emulgatoren ver- gleichbar war. Seine Betulin-haltigen Emulgatoren waren je- doch wenig stabil. Er verwendete umkristallisiertes Betulin und erreichte keine ausreichende Stabilität der Emulsionen.

Am günstigsten waren noch die Phtalate und Tetrachlorphtala- te, die unter dem Aspekt besserer Wasserlöslichkeit herge- stellt wurden. Die Emulsionen schieden nach kurzer Zeit ölige Schichten ab, was auf eine ungenügende Stabilität hinweist.

Außerdem wurden die beschriebenen Emulsionen mit antimikro- biell wirksamen Konservierungsstoffen versetzt, wobei vorwie- gend Benzoesäurederivate verwendet wurde (Pasich, J., (1965), Triterpenoid emulsifiers of plant origin V. Emulsifying pro- perties of Betulin and certain of its esters. Farm. Polska 21, Nr. 17-18, S. 661-666).

Doch gerade der Zusatz von Konservierungsstoffen, die ihrer- seits allergene und toxische Wirkungen hervorrufen können, macht den positiven, therapeutischen Effekt des Betulins besonders auf geschädigter Haut vielfach zunichte, so daß die in der Literatur bekannten Präparationen von Betulin-haltigen Emulsionen nicht oder nur begrenzt in der modernen Hautpflege angewendet werden können.

Diese Nachteile im Stand der Technik haben trotz der in gro- ßen Mengen bei der Holzgewinnung als Abfallprodukt anfallen- den Birkenrinde bis heute zu keiner nennenswerten technischen Aufarbeitung, Nutzung oder Verwertung der im Birkenkork ent- haltenen Triterpene, insbesondere des in großen Mengen ent- haltenen Betulins geführt.

Die Mengen derzeit ungenutzten Betulins sind gewaltig. Allein in einer einzigen Zellstoffabrik in Finnland (UPM Kymmene, Lappeenranta, Finnland) wird eine extrahierbare Menge von ca.

4.000 bis 5.000 t Betulin pro Jahr verbrannt. In Schweden, Finnland, Rußland und Kanada sind zahlreiche Zellstoffabriken dieser Größenordnung tätig. Eine wirtschaftliche Nutzung die- ses nachwachsenden Rohstoffes steht und fällt mit einem wirt- schaftlichen Gewinnungsverfahren, das bisher nicht beschrie- ben ist und das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher zunächst die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzuschlagen, das unter vertretbarem Lösungsmittelverbrauch die Gewinnung von großen Mengen an Triterpenen mit hohem Reinheitsgrad sowohl im Chargenbetrieb als auch kontinuierlich erlaubt. Mit Hilfe des Verfahrens soll außerdem eine Möglichkeit eröffnet werden, die in der Zellstoffindustrie als Abfallprodukt anfallende Birkenrinde zu verwerten. Zudem soll das Verfahren einfach, kostengünstig und schnell durchführbar sein. Außerdem soll gewährleistet sein, daß die Restlösungsmittelmenge im Extrakt den Bestim- mungen des Europäischen Arzneibuches entspricht, hier insbe- sondere der Guideline for Residual Solvents" : ICH Q3C- Impurities (ICH = International Conference on Harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use). Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, eine Triterpen-haltige Emulsion zur Verfü- gung zu stellen, die pharmazeutisch aktive Komponenten auf- weist und gleichzeitig ohne den Zusatz von Konservierungs- stoffen über einen längeren Zeitraum ausreichend stabil ist.

Zudem soll die Emulsion auf einfache Weise hergestellt werden können.

Die erste Aufgabe wird dadurch gelöst, daß bei dem erfin- dungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von Triterpenen aus Pflanzen und/oder deren Bestandteilen die Pflanzenteile zu- nächst bei 20°C bis 70°C mit einem Lösungsmittel gewaschen werden, in dem die Triterpene nicht oder nur gering löslich sind.

Anschließend werden die Triterpene mit einem Lösungsmittel unter erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur extrahiert. Da- ran schließt sich die Abkühlung und gleichzeitige Entspannung der die Triterpene enthaltenden Lösung an, wobei die Triter- pene in dem Lösungsmittel in extrem kleinen Partikeln ausfal- len und weitere Triterpene bei fortschreitender Abkühlung an diesen Partikeln auskristallisieren. Um die Reinheit der Tri- terpene zusätzlich zu erhöhen, werden sie nach der Filtration bei Raumtemperatur mit einem frischen Lösungsmittel gewa- schen. Durch dieses Verfahren wird insbesondere erreicht, daß Triterpene auf einfache Weise im großtechnischen Maßstab ge- wonnen werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Waschen (...) in einem Lösungsmittel, in dem die Triterpene (...) nicht oder nur gering löslich sind", daß die Löslich- keit der Triterpene nicht mehr als 1 g/Liter beträgt. Durch diesen ersten Waschschritt werden vorteilhafterweise leichter lösliche Verunreinigungen entfernt.

Die Extraktion der Triterpene erfolgt mit einem Lösungsmittel unter erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur, gegebenenfalls im überkritischen Bereich. Hierfür können als Lösungsmittel beispielsweise überkritisches Kohlendioxid sowie Kohlenwas- serstoffe im überkritischen Bereich als auch flüssige Kohlen- wasserstoffe unter erhöhtem Druck oder Gemische verschiedener Kohlenwasserstoffe verwendet werden.

Vor dem Waschen [Schritt (e)] muß der Filterkuchen vorteil- hafterweise nicht in einem weiteren Verfahrensschritt ge- trocknet werden. Dadurch ist das Verfahren besonders einfach durchzuführen.

Das Waschen der Triterpene [Schritt (e)] selbst kann au- ßerdem, um das erfindungsgemäße Verfahren besonders wenig aufwendig und kostengünstig zu gestalten, unter Normalbe- dingungen durchgeführt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das er- findungsgemäße Verfahren kontinuierlich durchgeführt. Dazu wird das Pflanzenmaterial und kaltes Lösungsmittel durch Pum- pen in ein druckfestes Rohr gefördert und im Gegenstrom bei 20°C bis 70°C gewaschen. Durch ein zweites Pumpsystem wird das gewaschene Pflanzenmaterial in ein zweites, ebenfalls druckfestes und heizbares Rohr gefördert und im Gegenstrom mit frischem, überkritisch erhitztem oder flüssigem Lösungs- mittel extrahiert. Die Ausleitung der Wasch-und der Extrakt- lösung erfolgt jeweils über ein Filtersystem. Die Pflanzen- teile werden aufgrund ihres Dichteunterschiedes gegen den Lösungsmittelstrom geführt und am entgegengesetzten Ende vom Lösungsmittelauslaß ausgeschleust. Die Extraktlösung wird- unter Aufrechterhaltung des Druckes im Extraktionssystem- über ein Ventilsystem Sprühdüsen zugeführt und erst hier ent- spannt.

Birkenrinde steht als kostengünstiger Rohstoff insbesondere als Abfallprodukt der Zellstoffindustrie in großen Mengen zur Verfügung. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung werden die Triterpene aus Birkenrinde, vor- zugsweise aus dem weißen Teil der Birkenrinde, der auch als Birkenkork bezeichnet wird, gewonnen.

"Separierter Birkenkork"ist sowohl die von Hand abgezogene weiße äußere Schicht, die als Korkhaut die Stämme von Birken nach außen abschließt und daher außerhalb der eigentlichen Rinde liegt, als auch der nachträglich beispielsweise mit

Hilfe einer Hammermühle und eines Flotationsverfahrens von einer Gesamtschälung abgetrennte (= separierte) Birkenkork.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Triterpene in einem Reinheitsgrad von mindestens 80 %, vor- zugsweise 85 %, insbesondere 90 %, besonders bevorzugt von über 90 % erhalten.

Der Hauptbestandteil der extrahierten Triterpene ist in einer weiteren Ausführungsform Betulin, wobei sein Gehalt mindes- tens 80 %, vorzugsweise 85 %, insbesondere 90 %, besonders bevorzugt über 90 % beträgt.

Es ist außerdem vorteilhaft, für den ersten Waschschritt, für die eigentliche Extraktion und für den abschließenden Wasch- schritt das gleiche Lösungsmittel zu verwenden. Auf diese Weise können die besten Reinheitswerte erzielt werden. Zudem ist das Verfahren bei Verwendung nur eines Lösungsmittels be- sonders einfach durchzuführen.

Als Lösungsmittel eignet sich besonders ein niedrig siedender Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch, das einen niedrig sieden- den Kohlenwasserstoff aufweist, weil ein niedrig siedender Kohlenwasserstoff anschließend sehr einfach entfernt werden kann. Der Siedepunkt des verwendeten Kohlenwasserstoffs, bzw. des Gemisches liegt dabei vorzugsweise unter 100°C. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von n-Pentan, n-Hexan oder n- Heptan, die alle kostengünstig sind, keine speziellen gesund- heitlichen Risiken bergen und in ausreichenden Mengen in gu- ter Qualität zur Verfügung stehen.

Es hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, für den ersten Waschschritt das Lösungsmittel zu verwenden, das als Filtrat nach der Hauptextraktion anfällt. Auf diese Weise werden grobe Verunreinigungen des Ausgangsmaterials vorab wirksam entfernt, ohne zusätzlich frisches Lösungsmittel ein- setzen zu müssen. Diese Kontaminationen oder Nebenbestandtei- le würden bei der Extraktion den Reinheitsgrad negativ beein- flussen. Um den Reinheitsgrad weiter zu steigern, können die

extrahierten Inhaltsstoffe ferner durch frisches Lösungsmit- tel abschließend nachgewaschen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der erste Wasch- schritt unter einem Druck von 1 bis 300 bar, vorzugsweise 10 bis 35 bar, besonders bevorzugt 25 bar durchgeführt. Die ei- gentliche Extraktion erfolgt vorteilhafterweise bei einer Temperatur von 50 bis 200°C, vorzugsweise 140 bis 160 °C, be- sonders bevorzugt 150°C und unter einem Druck von 1 bis 300 bar, vorzugsweise 10 bis 35 bar, besonders bevorzugt 25 bar.

Bei diesen Extraktionsbedingungen werden große Mengen an reinen Triterpenen, insbesondere reines Betulin erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich als besonders vor- teilhaft erwiesen, wenn die Auskristallisierung der Triterpe- ne als Mikrokristallisation mit einer durchschnittlichen Korngröße von < 40 Mm, insbesondere von 2 bis 32 ym, erfolgt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Emulsion, deren wäßrige und fettige Phase durch einen Pflan- zenextrakt emulgiert wird, wobei der Pflanzenextrakt wenigs- tens ein Triterpen und/oder wenigstens ein Derivat eines Tri- terpens und die Emulsion weiterhin wenigstens ein Öl und/oder Fett und Wasser aufweist.

Das Triterpen und/oder sein Derivat konserviert und emulgiert die Emulsion. Es ist zudem pharmazeutisch aktiv. Dadurch wird insbesondere erreicht, daß die Emulsion keine zusätzlichen Konservierungsstoffe aufweist, wodurch sie einen besonders hohen Reinheitsgrad und eine gute Verträglichkeit vor allem bei problematischen Applikationen auf geschädigter Haut be- sitzt.

Der Pflanzenextrakt ist dabei ein Extrakt aus Birkenrinde, vorzugsweise aus dem weißen Teil der Birkenrinde, die auch als Birkenkork bezeichnet wird.

In einer weiteren Ausführungsform enthält der Pflanzenextrakt wenigstens eine der Substanzen Betulin, Betulinsäure, Lupeol,

Erythrodiol, Allobetulin, Phellonsäure, Hydroxylakton, Betu- linaldehyd, ß-Amyrin, Oleanolsäure, Ursolsäure, verestertes Betulin und/oder ß-Sitosterol. Diese Pflanzeninhaltsstoffe können sowohl einzeln als auch miteinander in verschiedenen Kombinationen in der erfindungsgemäßen Emulsion verwendet werden. Eine besonders geeignete Kombination besteht aus Be- tulin > 80 %, Betulinsäure < 10 %, Lupeol < 3 %, Oleanolsäure < 4 %, Erythrodiol < 4 % und Wasser < 1 %.

Die Emulsion enthält das Triterpen und/oder sein Derivat vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 10 %. In Ab- hängigkeit von der gewünschten Konsistenz kann der Anteil des Triterpens und/oder seines Derivates im genannten Konzentra- tionsbereich variiert werden. Für die Verwendung in einer flüssigeren Lotion weist die Emulsion beispielsweise eine Konzentration des Triterpens und/oder seines Derivates von 2 bis 3,5 % auf. Wird die Emulsion in einer Creme verwendet, beträgt die Konzentration des Triterpens und/oder seines Derivates vorzugsweise zwischen 3,5 und 10 %.

Der ölige und/oder fettige Bestandteil der Emulsion kann aus allen in der Dermatologie und Kosmetik bekannten Ölen und Fetten ausgewählt werden. Es eignen sich besonders tierische und pflanzliche Fette wie Jojobaöl, Erdnußöl und Olivenöl.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Avocado und/oder Mandelöl.

Um die erfindungsgemäße Emulsion in ihrer Konsistenz zu regu- lieren, können herkömmliche Feuchthalte-und/oder Verdi- ckungs-und Festigungsmittel zugesetzt werden. Als Feuchthal- temittel können insbesondere Glycerin und Harnstoff verwendet werden. Dabei eignen sich vor allem Konzentrationen von je- weils 3 bis 10 % Glycerin und/oder Harnstoff bezogen auf die Menge der Emulsion. Als Verdickungsmittel kann beispielsweise ein Polysaccharid verwendet werden, das in einer Konzentrati- on von 0,2 bis 2 %, vorzugsweise 0,5 %, bezogen auf die Menge des eingesetzten Wassers, hinzugefügt wird. Natürliche Poly- saccharide sowie weitere Zuckerverbindungen und ihre Derivate

eignen sich besonders gut, weil sie nicht mit den weiteren Komponenten der Emulsion reagieren, sie insbesondere nicht verändern und damit chemisch inert sind.

Daher kann das Polysaccharid Agar Agar sehr gut verwendet werden. Agar Agar ist ein Gemisch aus Agarose und Agaropec- tin, das aus Rotalgen gewonnen wird und den Vorteil besitzt, daß es von den meisten Mikroorganismen nicht abgebaut werden kann. Alternativ dazu kann das Polysaccharid Carrageenan ver- wendet werden, das natürlicherweise in der Zellwand von Rot- und einigen Braunalgen vorkommt und die gleichen Vorteile wie Agar Agar besitzt.

In einer weiteren Ausführungsform weist die Emulsion 2 bis 10 % Extrakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde, 20 bis 30 % Avocadoöl, 10 bis 20 % Mandelöl und 40 bis 68 % Wasser auf.

Die am meisten bevorzugten Konzentrationen betragen 4 % Ex- trakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde, 29,3 % Avocadoöl, 14,7 % Mandelöl und 52 % Wasser.

Eine andere erfindungsgemäße Emulsion enthält 2 bis 10 % Ex- trakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde, 20 bis 30 % Avoca- doöl, 10 bis 20 % Mandelöl, 5 bis 10 % Feuchthaltemittel und 30 bis 63 % Wasser. Hierbei werden die Konzentrationen 4 % Extrakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde, 29,3 % Avocado- öl, 14,7 % Mandelöl, 5 % Glycerin und/oder 5 % Harnstoff und 42 bis 47 % Wasser am meisten bevorzugt.

Der Extrakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde, der in allen Emulsionen enthalten ist, weist mindestens 80 % Betulin, ma- ximal 10 % Betulinsäure, maximal 3 % Lupeol und maximal 4 % Oleanolsäure auf.

Die Emulsion eignet sich aufgrund ihrer Zusammensetzung und der nachgewiesenen Ungiftigkeit hervorragend als Salbengrund- lage zum Einrühren aller dem Fachmann bekannten Duft-, Kosme- tik-und Arzneistoffe.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Emulsion, wo- bei das Verfahren die Schritte umfaßt : (a) Dispergieren des Triterpens in einem Öl und/oder Fett ; (b) Emulgieren von Wasser ; (c) Homogenisieren der Emulsion bis zur erforderlichen Konsistenz.

Dabei erfolgt das Dispergieren und Homogenisieren vorteil- hafterweise in einem Homogenisiermischer, weil das Verfahren auf diese Weise besonders einfach durchgeführt werden kann.

Ferner können auch kleine Mengen an Emulsion für die indivi- duelle Verwendung zubereitet werden.

In einer besonderen Ausführungsform wird dem Wasser, das bei dem Emulgieren verwendet wird, ein Feuchthaltemittel, insbe- sondere Glycerin und/oder Harnstoff, oder ein Verdickungsmit- tel, insbesondere ein Polysaccharid zugesetzt. Dadurch kann eine besonders cremige Konsistenz erreicht werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Triterpene zur Herstellung eines Kosmetikums, vorzugsweise in Form einer Salbe, einer Lotion, einer Creme, eines Gels, eines Gelees, einer Tinktur, eines Shampoos, ei- nes Puders und/oder eines Pulvers, insbesondere zum Auftragen auf die Haut, die Kopfhaut und/oder zum Inhalieren. Aufgrund ihrer chemischen Verwandtschaft mit Sterolen eignen sich die Triterpene, insbesondere das gewonnene Betulin zur Haut-und Kopfhautpflege. Es beruhigt und glättet die Haut, mindert den Wasserverlust und beugt Reizungen und Rötungen vor. So kann das Kosmetikum gut zur Feuchthaltung und Glättung der Haut sowie zur Verminderung von Altersflecken und bei schuppender Haut eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil ist die Wasser- unlöslichkeit der Triterpene, so daß Haut, die stark und lan- ge dem Wasser ausgesetzt ist, besonders gut geschützt wird.

Aufgrund der antibakteriellen Wirkung ist die Verwendung als

Desodorant besonders vorteilhaft. Hinzu kommt eine Verminde- rung der Transpiration aufgrund eines wirksamen Verschließens der Schweißdrüsen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Triterpene zur Herstellung eines Arzneimit- tels, vorzugsweise in Form einer Salbe, einer Lotion, einer Creme, eines Gels, eines Gelees, einer Tinktur, eines Sham- poos, eines Puders und/oder eines Pulvers, insbesondere zum Auftragen auf die Haut, die Kopfhaut und/oder zum Inhalieren, besonders bevorzugt bei dermatologischen Veränderungen der Haut und/oder der Kopfhaut, vor allem bei Neurodermitis, Pso- riasis, seborrhoischem Ekzem, Melanodermie, Präcancerosen der Haut sowie zum Inhalieren bei asthmatischen Anfällen und/oder zur Substitution von Glucocorticoiden. Ebenfalls aufgrund der großen Reinheit sind die gewonnenen Triterpene, insbesondere das gewonnene Betulin für den therapeutischen Einsatz bei vorgeschädigter Haut geeignet.

Die erfindungsgemäßen Emulsionen sind für den oben genannten Einsatz so gut geeignet, weil der Extrakt aus dem weißen Teil der Birkenrinde keine mutagenen Eigenschaften aufweist. Topi- sche Toxizitätstests wurden ebenfalls durchgeführt, wobei sich keinerlei sensibilisierende Eigenschaften zeigten.

Die nachfolgend beschriebenen Beispiele dienen der Erläute- rung und dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung, sie sollen diese aber nicht einschränken.

BEISPIELE I. Anwendungsbeobachtungen Es wurden verschiedene Anwendungsbeobachtungen dermatologi- scher Hautveränderungen von niedergelassenen Ärzten sowie Klinikärzten durchgeführt. Nach der Diagnose durch die Ärzte erfolgte eine Behandlung der Patienten mit der erfindungsge- mäßen Emulsion, die nach dem beschriebenen Verfahren herge- stellt worden war.

Beispiel 1 : Patient : männlich, 68 Jahre Diagnose : schwere, generalisierte Psoriasis vulgaris Vorbehandlung : mittelstarke Kortisonsalbe Anwendung : Gesicht Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Auftreten von Psoriasiseffloreszenzen nach Absetzen der Kortisonsalbe wurden durch die Anwendung der erfindungsgemäßen Emulsion verhindert.

Beispiel 2 : Patient : männlich, 48 Jahre Diagnose : leichte Psoriasis vulgaris Vorbehandlung : mittelstarke Kortisonsalbe

Anwendung : Kopf Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Abheilung der ca. 5 DM-Stück großen prästernalen entzündlichen Herde am Kopf bei Anwendung der erfindungsgemäßen Emulsion innerhalb von 14 Tagen ; Wiederaufflammen der Entzündung (=Rezidiv) nach Absetzen der Emulsion ; erneute deutliche Besserung bei Wiederaufnahme der Behandlung.

Beispiel 3 : Patient : weiblich, 5 Monate Diagnose : Neurodermitis, hyperkerakotische, vorgealter- te, rissig-schrundige Haut Anwendung : Körper Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Sehr deutliche Besserung, hervorragende Wirksamkeit bei gleichzeitiger guter Verträglichkeit.

Beispiel 4 : Patient : weiblich, 10 Jahre Diagnose : Neurodermitis, hyperkeratotische, vorgealter- te, rissig-schrundige Haut

Anwendung : Körper Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Sehr deutliche Besserung, hervorragende Wirksamkeit bei gleichzeitiger guter Verträglichkeit.

Beispiel 5 : Patient : männlich, 5 Monate Diagnose : Neurodermitis, hyperkeratotische, vorgealter- te, rissig-schrundige Haut Anwendung : Körper Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Sehr deutliche Besserung, hervorragende Wirksamkeit bei gleichzeitiger guter Verträglichkeit.

Beispiel 6 : Patient : weiblich, 28 Jahre Diagnose : Neurodermitis, neurodermitische Effloreszenzen Anwendung : Ellenbeugen, Gesicht, Dekollete Vorbehandlung : Dermatodoron, Stibium metallicum-Salbe, Top- Isolon-Bartel-Salbe, Mesembryanthemum-Salbe ; unter Anwendung dieser Salben kam es zu keiner

durchgreifenden Besserung der neurodermiti- schen Stellen.

Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Deutliche Reduktion der Neurodermitis Beispiel 7 : Patient : weiblich, 79 Jahre Diagnose : Seborrhoisches Ekzem Anwendung : Kopf Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Reduktion der Schorfbildung im Schädelbereich, rötliche Areale verblassten etwas langsamer.

Beispiel 8 : Patient : weiblich, 55 Jahre Diagnose : stark juckendes, schuppendes, nässendes Ekzem Anwendung : Gesicht, Kopf Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : Sichtbare Besserung der behandelten Stellen

Beispiel 9 : Patient : weiblich, 33 Jahre Diagnose : trockenes, juckendes, lichenifiziertes, schor- figes Ekzem Anwendung : Unterschenkel Behandlung : Mehrmaliges tägliches Auftragen der erfin- dungsgemäßen Emulsion als Salbenpräparat auf die betroffenen Hautstellen.

Resultat : noch nicht bewertet II. Herstellung des Pflanzenextraktes Ausgangsmaterial : Birkenkork A) Beschreibung und Qualitätssicherung Der Birkenkork wird geliefert von : l. der wood pulp company Kaukas" (UPM-Kymmene Lappeenranta, Finnland).

Kaukas trennt die Rinde mechanisch von dem Birkenholz und auch der Kork wird mechanisch von der inneren Rinde ge- löst.

2. durch eigene Mitarbeiter, die den Kork von Hand schnei- den.

In einem ersten Schritt werden der mechanisch getrennte und der handgeschnittene Kork bezüglich seiner Identität analysiert. Zu diesem Zweck wird der Kork mikroskopisch untersucht, wobei sich mehrere individuelle Korkschichten

und Lentizellen, die für Birke typisch sind, zeigen. Zu- sätzlich wird die extrahierbare Menge an Triterpenen mit n-Hexan bei 140 bis 160°C unter steigendendem Druck un- tersucht. Die extrahierbare Menge an Triterpenen mit dem Hauptbestandteil Betulin übersteigt 10 %, weil nur im Kork von Birken mit weißen Rinden solche Mengen vorkom- men. Die Reinheitskontrollen des Materials schließen eine Analyse hinsichtlich Aflatoxinen, Schwermetallen, Herbi-. ziden und Pestiziden gemäß europäischen Standards ein.

B) Zerkleinern des Korks Der Kork wird in einer Schneidmühle gemahlen (Firma Retsch) und durch ein Sieb mit einer Porengröße von 1 mm Durchmesser aus der Maschine abgesaugt. Für die weitere Extraktion werden nur Partikel mit einer Korngröße < 1 mm verwendet.

Extraktion der Triterpene : Für die Extraktion wird das Phänomen ausgenutzt, daß Triter- pene aus Birkenkork in kaltem n-Hexan praktisch unlöslich sind, sich aber in heißem n-Hexan (140 bis 160°C) unter Druck gut lösen. Dieses Verfahren wird in 2 Schritten durchgeführt : 1. Der Kork wird in einem Soxhlet Apparat nach dem Soxhlet Verfahren mit n-Hexan gereinigt (heiß, < Siedepunkt 69°C) bis die n-Hexan Lösung nicht mehr gelblich ist.

2. Der aktive Bestandteil wird aus den vorgewaschenen Kork- granulaten mit n-Hexan bei 140 bis 160°C unter erhöhtem Druck extrahiert. (Extraktion mittels Dionex ASE 300 mit 100 ml Gefäßen). Durch die Freisetzung der überhitzten Lösung enthaltend n-Hexan und Triterpene, erfolgt eine unmittelbare Kristallisation, so daß ein mikrokristalli-

nes Pulver aus Triterpenen direkt in kaltem n-Hexan er- halten wird. Dieses Pulver wird gefiltert und zweimal in. kaltem n-Hexan gewaschen. Die Triterpene werden bei 80 bis 100°C getrocknet.

Bestimmung der Reinheit des Extraktes : Die Reinheit des Extraktes wird mittels Gaschromatographie (GC) überprüft. Die Ergebnisse sind in der Übersicht gemäß Anlage 1 dargestellt.

Folgende Werte wurden gemessen : Betulin : minimal 80 % Betulinsäure : maximal 10 % Lupeol : maximal 3 % Oleanolsäure : maximal 4 % Die Übersicht zeigt ein typisches Chromatogramm mit Werten von 84 bis 86 % Betulin, 4 bis 5 % Betulinsäure, ca. 1 % Lu- peol und ca. 1 % Oleanolsäure.

Gemäß den Bestimmungen der ICH muß die restliche Menge des Lösungsmittels n-Hexan < 7,250 mg/kg Extrakt betragen, weil eine Creme enthaltend 4% Birkenkorkextrakt nicht mehr als 290 mg/kg n-Hexan aufweisen darf. Typische Werte betragen 1,500 mg/kg n-Hexan im trockenen Extrakt, was ca. 60 mg/kg in der Birkencreme entspricht.

Endkontrolle : Jede Charge wird gemäß den europäischen Bestimmungen hin- sichtlich der Säurewerte (< 5) und der Zahl der Peroxide (< 15) mittels eines standardisierten Verfahrens untersucht.

Der Gehalt an Birkenkorkextrakt wird mittels GC analysiert.

Es erfolgt weiterhin eine Untersuchung bezüglich Keimen (< 100/g), außerdem dürfen keine pathogenen Keime enthalten sein.

III. Erfindungsgemäße Formulierungen (Birkencreme) : Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind in der Tabelle 1 (Tab. 1) zusammengefaßt. Sie weisen folgende Zusammensetzung auf : Tab. 1 : Zusammensetzungen der Formulierungen Aktiver Bestandteil in allen Extrakt aus Birkenkork Formulierungen 40 4 mg/g Creme (4 %) Formulierung Bestandteile in in % Birkencreme A 29.3 Avocadoöl 14.7 Mandelöl 52 Wasser Birkencreme G 29.3 Avocadoöl 14.7 Mandelöl 5 Glycerin 47 Wasser Birkencreme H 29.3 Avocadoöl 14.7 Mandelöl 5 Harnstoff 47 Wasser Alle drei Formulierungen enthalten dieselbe Menge an aktivem Bestandteil (Birkenkorkextrakt) sowie Avocado-und Mandelöl.

Sie unterscheiden sich lediglich hinsichtlich der Bestandtei- le Harnstoff (nur in der Birkencreme H) sowie Glycerin (nur in der Birkencreme G), Birkencreme A ist frei von diesen bei- den Bestandteilen.

Stabilitätstest : Die Birkencreme kann bei 500 x g zentrifugiert werden und ist dabei stabil.

IV. Toxikologische Untersuchungen : 1. Akute Toxizität Die akute Toxizität des Birkenkorkextraktes wurde durch intraperitoneale und subkutane Verabreichung an Mäusen und Ratten bestimmt.

Mäuse : Einzelne Dosen des Birkenkorkextraktes (Chargen-Nummer : Bet.

001) in Methocel als Trägerstoff wurden fünf männlichen und fünf weiblichen CD-1 Mäusen subkutan verabreicht. Die Tiere wurden mit einer Dosis von 2000 mg/kg bezogen auf das Körper- gewicht behandelt.

Die Sterblichkeitsrate wurde 14 Tage nach der Gabe einer ein- zelnen Dosis zur Festlegung der durchschnittlichen letalen Dosis LD50 bestimmt. Im gleichen Zeitraum wurden die Tiere be- obachtet, um Anzeichen einer Toxizität festzustellen. Als solche kommen lokale und systemische Intoleranz-Reaktionen sowie Veränderungen des Körpergewichts in Frage. Die Tiere wurden am Ende des Versuchszeitraums geopfert und makrosko- pisch untersucht. Der akute Toxizitätstest beruhte auf der EC Richtlinie L 383 A : Bl.

Unter den gegebenen Testbedingungen (2000 mg Birkenkorkex- trakt/kg Körpergewicht) wurden keine Intoleranzreaktionen be- obachtet. Die Tiere zeigten während des Versuchszeitraums die erwartete Gewichtszunahme. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tab. 2 : Akute Toxizität in Mäusen Durchschnittliches Körpergewicht während des Ver- suchszeitraums Durchschnittl. Körpergewicht (g) Männlich weiblich Beginn 22.8 19.8 Tag 7 27.0 22.2 Tag 14 31.2 23.6 Bei der makroskopischen Untersuchung wurden in drei männli- chen und drei weiblichen Tieren lediglich Veränderungen fest- gestellt, die auf das angewandte technische Untersuchungsver- fahren zurückzuführen sind.

In diesem Toxizitätstest liegen der Bereich der ersten Into- leranzreaktion, der niedrigste letale Wert sowie der LD50Wert über 2000 mg Birkenkorkextrakt/kg Körpergewicht.

Bei intraperitonealer Verabreichung des Birkenkorkextraktes an Mäuse wurden toxische Symptome oberhalb von 500 mg/kg Kör- pergewicht beobachtet. Es wurden nur leichte toxische Reakti- onen, wie reduziertes passives Bewegungsvermögen, Bewegungs- koordinationsstörungen und reduzierter Muskeldehnungswider- stand beobachtet. Hieraus wurde geschlossen, daß die toxi- schen Symptome auf eine Bauchfellentzündung (Peritonitis) zu- rückzuführen sind, die durch die Extraktlösung hervorgerufen wurde. Ein LD50 Wert konnte nicht festgestellt werden, so daß er über den Beobachtungszeitraum vom 14 Tagen oberhalb von 2000 mg/kg Körpergewicht liegt.

Ratten : Einzelne Dosen des Birkenkorkextraktes (Chargen-Nummer : Bet.

001) in Methocel als Trägerstoff wurden fünf männlichen und fünf weiblichen Sprague-Dawley Ratten subkutan verabreicht.

Die Tiere wurden mit einer Dosis von 2000 mg/kg bezogen auf das Körpergewicht behandelt.

Die Sterblichkeitsrate und die toxischen Symptome wurden 14 Tage nach der Gabe einer einzelnen Dosis bestimmt. Die Tiere wurden am Ende des Versuchszeitraums geopfert und makrosko- pisch untersucht. Der akute Toxizitätstest beruhte auf der EC Richtlinie L 383 A : Bl.

Unter den gegebenen Testbedingungen (2000 mg Birkenkorkex- trakt/kg Körpergewicht) wurden keine Intoleranzreaktion oder Sterblichkeit beobachtet. Die Tiere zeigten während des Ver- suchszeitraums die erwartete Gewichtszunahme.

Bei der makroskopischen Untersuchung wurden in einem männli- chen und drei weiblichen Tieren lediglich Veränderungen fest- gestellt, die auf das angewandte technische Untersuchungsver- fahren zurückzuführen sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 (Tab. 3) zusammengefasst.

Tab. 3 : Akute Toxizität in Ratten Symptome/Kriterien Sprague-Dawley Ratten (n=5/Geschlecht) Birkenkorkextrakt 2000 mg/kg Kör- pergewicht männlich weiblich Lokale Intoleranz-Keine keine reaktionen Systemische Intoleranz-Keine keine reaktionen Sterblichkeit innerhalb von 6/24 h Keine keine in 7/14 Tagen Durchschnittl. Körperge- wicht (g) Beginn 187.6 174.4 Tag 7 239.8 203.8 Tag 14 280.8 218.0 Hemmung des Körperge-keine keine wichts Makroskopischer Befund 1/5 3/5

In diesem Toxizitätstest liegen der Bereich der ersten Into- leranzreaktionen, der niedrigste letale Wert sowie der LD50 Wert über 2000 mg Birkenkorkextrakt/kg Körpergewicht.

Bei intraperitonealer Verabreichung des Birkenkorkextraktes an Ratten wurden toxische Symptome oberhalb von 500 mg/kg Körpergewicht beobachtet. Es wurden nur leichte toxische Re- aktionen wie reduziertes passives Bewegungsvermögen, Bewe- gungskoordinationsstörungen und reduzierter Muskeldehnungswi- derstand beobachtet. Hieraus wurde geschlossen, daß die toxi- schen Symptome auf eine Bauchfellentzündung (Peritonitis) zu- rückzuführen sind, die durch die Extraktlösung hervorgerufen wurde. Ein LD50 Wert konnte nicht festgestellt werden, so daß

er über den Beobachtungszeitraum vom 14 Tagen oberhalb von 2000 mg/kg Körpergewicht liegt.

Schlußfolgerung : Die OECD Richtlinien legen fest, daß keine weiteren Versuche nötig sind, wenn über einen Zeitraum von 14 Tagen bei einer Verabreichung von 2000 mg/kg Körpergewicht an Mäuse und Rat- ten (je fünf Tiere/Geschlecht) keine durch das getestete Pro- dukt begründete Sterblichkeit vorliegt.

Chemikalien werden nach ihrer relativen Toxizität eingeord- net. Sie werden als toxisch bezeichnet, wenn der LD50 Wert zwischen 50 und 500 mg/kg Körpergewicht liegt. Bei einem LD50 Wert von 5000 bis 15000 mg/kg Körpergewicht wird praktisch von keiner Toxizität ausgegangen.

Im vorliegenden Fall wird von einem LDsoWert > 2000 mg/kg Körpergewicht ausgegangen wird, der wahrscheinlich auch > 5000 mg/kg Körpergewicht liegt, weil selbst bei dem hohen Wert von 2000 mg/kg Körpergewicht keine toxischen Symptome beobachtet wurden. Wie aus den Versuchsergebnissen ersicht- lich ist, kann der Birkenkorkextrakt als nicht toxisch be- zeichnet werden.

2. Subakute Toxizität Ratten, intraperitoneal (i. p.) Birkenkorkextrakt (Chargen-Nummer : Bet. 009) wurde Versuchs- ratten (Sprague-Dawley/Crl : CD BR) mittels intraperitonealer Injektion über 14 Tage im Rahmen einer subakuten Toxizitäts-

untersuchung verabreicht. Das Versuchsprotokoll ist in Tabel- le 4 (Tab. 4) zusammengefaßt.

Tab. 4 : Versuchsprotokoll einer subakuten Toxizitätsbestim- mung (Ratten, i. p.) Tiere : 40 (20 männliche, 20 weibliche) Sprague-Dawley Crl : CD BR Ratten Tiergruppen : Gruppe 1-5 5 männliche/5 weibliche Tiere je Gruppe Zusätzliche 4 (2 männliche, 2 weibliche) Reservetiere, für den möglichen Austausch während der Anpassungspha- se Untersuchungsprodukt*) : Birkenkorkextrakt (= Bestandteil von Birkencreme) Chargennummer : Bet. 009 Trägerstoff : Sesamöl Dosisbereich : Gruppe l : 20 ml Trägerstoff/kg Körpergewicht/Tag Gruppe 2 : 500 mg/kg Körpergewicht/Tag Gruppe 3 : 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag Gruppe 4 : 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag Verabreichungsvolumen : 20 ml/kg Körpergewicht/Tag Zahl der Dosen : 1 Verabreichungszeitraum : 14 Tage (Tage 1-14) Versuchszeitraum : 15 Tage (Tage 1-15) *\'Die Triterpene in dem Birkenextrakt sind in dem Träger- stoff unlöslich und liegen als homogen verteilte Partikel (mikrokristallines Pulver) vor Diese subakute Toxizitätsuntersuchung wurde für die Ermitt- lung der Dosis verwendet, die in einer vierwöchigen subchro- nischen Toxizitätsuntersuchung eingesetzt wurde. Die Ergeb- nisse der Toxizitätsuntersuchung sind in Tabelle 5 (Tab. 5) gezeigt.

Tab. 5 : Subakute Toxizitätsuntersuchungen in Ratten 1 2 3 4 Sterblichkeit keine keine keine N = 8 Klinischer Be-in allen Tieren fund : mäßig keine in eini->Tag 10 >Tag 7 vergrößertes gen2) Tie- Abdomen ren >Tag 13 Raues Fell nein nein bei allen Tieren >Tag 10 >Tag 7 Verlust von nein in allen männlichen bei beiden Körpergewicht Tieren Geschlech- >Woche 1 : tern - 18 % *,-14 >Woche 1 : Ende der Woche 2 :-15 % * -15 %-12 % (männlich) - 12 % (weiblich) Veränderungen keine keine keine Verminde- bei der Futter-rung in aufnahme Testwoche 1 : männlich: - 29 % weiblich :- 31 % Hämatologische keine keine Unterschiede zur Kon- Veränderungen (siehe (siehe trollgruppe Tab. 6) Tab. 6) (siehe Tab. 6) Veränderungen keine Harnstoff Harnstoff Harnstoff in der klini-ASAT ASAT ASAT schen Biochemie LDH LDH und alle weiteren (siehe Tab. 6) Parameter in den weiblichen Tieren und nahezu alle weite- ren Parame- ter in den männlichen Tieren

Erläuterungen zu Tab. 5 : *) p < 0.01 gegenüber der Kontrollgruppe 1) 4 männliche, 4 weibliche Tiere (Tage 11-15) 2) 4 von 5 weiblichen, 2 von 5 männlichen Tieren Die Veränderungen in der klinischen Biochemie (Tab. 5) sind nur gegenüber der Kontrollgruppe in den Gruppen 3 und 4 sig- nifikant (p zu 0.01) ; in Gruppe 3 hinsichtlich der ASAT Akti- vität (+ 113/+132 %), in Gruppe 4 nur bei weiblichen Tieren hinsichtlich der Parameter : Gesamtprotein, Harnstoff im Blut, Calcium, Kalium und LDH Aktivität.

Tab. 6 : Hämatologische Veränderungen in der subakuten Toxi- zitätsuntersuchung (Ratten, i. p.)-Definitionen der Gruppen 3 und 4 vgl. Tab. 5 Parameter Gruppe 3 4 Veränderung in % Veränderung in % männlich weiblich männlich weiblich Plättchenzäh-_ + 47**) + 80 + 54** lung Retikulozy-+ 64 + 36**) tenzählung Leukozyten--4 zählung Erläuterungen zu Tab. 6 : **) p # 0. 01 gegenüber der Kontrollgruppe Die äußerliche Untersuchung vor der nekroskopischen Untersu- chung zeigte eine mäßige bis schwere Vergrößerung des Abdo- mens in allen Gruppen, mit Ausnahme der Kontrollgruppe, in der das Abdomen bei allen Tieren nur gering vergrößert war.

Die Ergebnisse der makroskopischen post mortem Untersuchung sind in Tabelle 7 (Tab. 7) gezeigt.

Tab. 7 : Nekroskopischer Befund in der subakuten Toxizitäts- untersuchung-Definitionen der Gruppen vgl. Tab. 4. Gruppe 1 2 3 4 Weiß-gelbliche Flüssig-+ + + + keit im abdominalen Raum\') Weiße Ablagerungen oder keine + + + Schichten auf der Schei- dewand (Zwerchfell) oder auf den abdominalen Orga- nen Bauchfellentzündung keine keine keine + Abdominaler Raum gefüllt nein nein nein + mit weißen pulpartigen/ca. 30 öligen Inhalten ml Erläuterungen zu Tab. 7 : ) in 4 Tieren In dieser zweiwöchigen Untersuchung zur Bestimmung des Dosis- bereichs lag der Bereich ohne Effekt < 500 mg Birkenex- trakt/kg Körpergewicht. Mäßig bis stark vergrößerte Abdomen wurden bei 500 mg/kg Körpergewicht und höher beobachtet. Sig- nifikante Reduktionen des Körpergewichts wurden in allen be- handelten Gruppen festgestellt, jedoch nur bei den männlichen Tieren. Raues Fell wurde bei 1000 mg/kg Körpergewicht und hö- her beobachtet. Einige hämatologische und/oder biochemische Parameter waren signifikant bei 1000 mg/kg Körpergewicht und höher verändert. Die nekroskopische Untersuchung zeigte weiß- liche Ablagerungen auf dem Zwerchfell oder auf den abdomina- len Organen, die teilweise von Adhäsionen begleitet wurden bei 500 mg/kg Körpergewicht und höher. Bei allen Gruppen war der abdominale Raum mit einer öligen/wäßrigen Flüssigkeit ge- füllt, was auf den Trägerstoff Sesamöl zurückzuführen ist.

Bei 2000 mg/kg Körpergewicht starben 8 von 10 Tieren. Die

nekroskopische Untersuchung ergab : 1) Bauchfellentzündung in 4 der vorzeitig verstorbenen Tiere ; 2) in allen Tieren war der abdominale Raum mit pulpartigen/öligen Inhalten gefüllt.

Für die subchronische Toxizitätsuntersuchung wurde ein Be- reich von 60 bis 540 mg/kg Körpergewicht ausgewählt.

Hunde (Beagle), i. p.

Eine subakute Toxizitätsuntersuchung wurde über zwei Wochen mit Beagle als Dosisbestimmungs-Versuch über 4 Wochen als subchronische Toxizitätsuntersuchung durchgeführt. Der Bir- kenkorkextrakt (Chargennummer : Bet. 009) wurde mit Sesamöl als Trägerstoff intraperitoneal verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 (Tab. 8) zusammengefaßt.

Tab. 8 : Subakute Toxizitätsuntersuchungen in Hunden (Bea- gle), i. p.

Dosisbereich : 1. MTD*) Zeitraum 50,150,250,500 mg/kg Körpergewicht/Tag 2. Fester Dosiszeitraum 100,300 mg/kg Körpergewicht/Tag Tiere : 8 Beagle 2 Beagles pro Geschlecht und Gruppe Erläuterungen zu Tab. 8 : *) MTD : maximale Toleranz-Dosis

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 (Tab. 9) gezeigt.

Tab. 9 : Subakute Toxizitätsuntersuchungen in Hunden (Bea- gle), i. p.

Kein Effekt : < 50 mg/kg Körpergewicht/Tag während des MTD Zeitraums Letale Dosis : 500 mg/kg Körpergewicht/Tag Toxische Anzeichen während des festen Dosiszeitraums : (100,300 mg/kg Körpergewicht/Tag) Reduziertes Körpergewicht reduzierte Futteraufnahme Veränderungen in hämatopoetischen und biochemischen Parame- tern Schwere Bauchfellentzündung in 3 von 8 Tieren*

Erläuterungen zu Tab. 9 : *\'Diese Tiere wurden eine Woche nach der letzten Gabe auf- grund ihrer schlechten Verfassung getötet