本发明属于生物技术领域， 涉及一种新的内切木聚糖酶， 其编码基因 和应用。 背景技术

木聚糖简介。 木聚糖， 由木糖分子（D Xylose )以 β -1， 4-糖苷键连结 成主链； 阿拉伯呋喃糖苷基、 葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。 木聚糖 是植物细胞壁中半纤维素的主要成份， 半纤维素是植物多糖中仅次于纤维 素的重要成份， 是自然界中除纤维素为含量最为丰富的可再生 植物多糖。

木聚糖的来源。 富含木聚糖的原料来源广泛， 包括硬木、 软木、 秸秆、 稻草、 麸皮等农、 林、 工业废弃物及城市固体垃圾等。 且不同植物所含木 聚糖的多少也有所差别， 硬材中所含木聚糖比软材中多， 硬材中能占到干 重的 15〜30%， 软材中一般占干重的 7〜12%。 而在一些一年生植物如小麦、 甘煎、 棉子壳中， 木聚糖含量则高达 30%以上。

木聚糖酶简介。 木聚糖酶是一系列能特异降解木聚糖的糖基水 解酶的 总称。 由于组成木聚糖单糖单元的差异、 键的类型不同、 以及木聚糖中存 在许多不同取代基的支链， 木聚糖的彻底降解需要多种酶参与， 包括： 内 切- 1， 4- β -木聚糖酶（endo- β - 1， 4- xylanase, EC 3. 2. 1. 8)， β -木糖 苷酶（ β - xylosidase, EC 3. 2. 1. 37)， α - L-阿拉伯呋喃糖苷酶（ α -L-arabinofuranosidase , Ε. C. 3· 2· 1· 39)、 β - D-葡萄糖醛酸苷酶（ β -D- glucuronidase， EC 3.2.1.39) 、 乙酰木聚糖酯酶（acetyl xylan esterases, E. C. 3.1.1.72)以及降解阿拉伯糖侧链残基与酚酸（如 阿魏酸 或香豆酸)形成的酉 ^键 酸酉 ^酉每 (ferulic or p-coumaric acid esterase, E.C. 3.2.1.73)等。 其中， 内切 -1， 4- β-木聚糖酶是降解木聚糖最主要的 酶。 该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的 β_1， 4-木糖苷键， 将大分 子多聚木糖水解为低聚木糖和少量木糖， 从而起始多聚糖的逐步降解

(Bernier R, Driguez H, Desrochers M Gene 26 : 59 - 65, 1983)

木聚糖酶在传统产业中的应用。 木聚糖酶被广泛应用于包括食品、 饲 料、 造纸、 纺织等各种工业部门中， 并在其中扮演重要的角色。 第一， 在 食品工业中， 木聚糖酶被用于水果、 蔬菜和植物加工， 以促进浸渍过程， 使汁液澄清， 提高产量和过滤效率； 被用于葡萄酒制造和酿造以促进葡萄 皮浸渍和降低成品的混浊度； 被用于培烤、 磨粉、 糕点、 糖果的加工中以 提高面团的弹性和强度， 改善面包质地； 被用于咖啡加工中， 以降低咖啡 提取物的粘度并改善了干燥 /冻干过程。 第二， 在造纸工业中， 木聚糖酶被 用于促进制浆处理和代替机械制浆， 不仅能有效降低能量消耗还可提高纸 浆的原纤维形成和透水性进而提高加工效率和 纸张强度。 第三， 在纺织工 业中， 木聚糖酶被用于纺织品（亚麻， 黄麻， 兰麻， 大麻等）的酶解中， 以 减少或替代化学混麻方法。 第四， 在农牧业中， 木聚糖酶被广泛应用于单 胃动物（如猪和家禽）以及反刍动物的饲料中 。 辅助动物有效降解木聚糖， 降低饲料中非淀粉多糖的含量， 以提高饲料的可消化性和营养价值同时减 少环境污染。

木聚糖酶在生物能源领域的作用。 尤为重要的是， 在全球化石资源日 益枯竭， 开发新型生物能源迫在眉睫的背景下， 木聚糖酶可与其他纤维素 酶、 半纤维素酶共同应用于将木质纤维素转化为燃 料乙醇的工业生产中。 一方面， 木聚糖酶通过降解木质纤维素中与木质素及纤 维素骨架链紧密交 联的半纤维素链， 大大提高纤维素酶接触并作用于纤维素链的频 率和效率， 从而间接提高纤维素的降解效率； 另一方面， 随着近年来五碳糖发酵途径 及菌株的研究、 开发， 利用细菌、 酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木 糖生产燃料乙醇的工艺日趋成熟。 两方面共同作用使木质纤维素的转化效 率大大提高， 从而有效降低燃料乙醇的生产成本。

木聚糖酶的研究历史。 由于木聚糖酶有着广泛的用途， 对木聚糖酶的 研究早在六十年代就已开始， 且己经从不同来源的微生物中分离到大量的 不同类型不同功能的木聚糖酶。 研究得较为清楚的有 Trichoderma eese (里氏木毒)、 Aspergillus niger (黑曲毒)、 Streptomyces li vidans (变铅青链霉菌） 、 Cellulo睡 as ffl (粪肥杆菌） 、 Clostridium ?ei ?7( ce wffl (热纤梭菌)、 Penicillium s ffl/^ c ss fflwffl (简青霉)等所产 生的木聚糖酶。 需要指出的是， 这些木聚糖酶基因大部分都是从纯培养的 微生物中分离出来的， 而自然界中可培养微生物的种类尚不足 1%， 获得的 木聚糖酶在理化特性、 催化效率、 产量等方面也远远不能满足现代工业生 产的需求。

鉴于现有技术中大部分木聚糖酶的活力较低， 在理化特性、 催化效率、 产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需 求， 有必要进一步扩大筛选 对象， 从中筛选出新的、 酶活性高的木聚糖酶， 以用于工业生产， 提高生 产效率。 发明内容

本发明的目的在于提供一种新型内切木聚糖酶 及其编码基因和应用。 本发明的目的在于提供包括内切木聚糖酶基因 的表达载体和宿主细 胞， 基因的表达和蛋白纯化方法， 以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。

在本发明的第一方面， 提供一种分离的多肽， 该多肽选自下组：

(a) 如 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；

(b) 由 SEQ ID N0:2的第 19一 272位氨基酸残基组成的多肽片段；

(c) 由 SEQ ID N0:2的第 19一 267位氨基酸残基组成的多肽片段； (d) 包含 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中第 19-267位氨基酸的多肽；

(e) 由 （a) 、 (b) 、 (c) 或 （d) 中所述的多肽经过一个或多个（如 1-20个， 较佳地 1-10个； 更佳地 1-5个； 更佳地 1-3个）氨基酸残基的取代、 缺失或添加后仍具有多肽 ) 功能的多肽；

(f) 在 （a) 、 (b) 、 (c) 、 (d) 或 （e) 所述多肽的 N或 C末端添 加标签序列或信号肽序列后形成的多肽；

(g) 包含 （a) 、 (b) 、 (c) 、 (d) 或 （e) 所述多肽的融合蛋白 在一个优选例中， 所述的多肽来源于高等食木非培菌黄球白蚁肠 道系 统的元基因组。

在一个具体实施例中， 所述 （a) 多肽的功能包括但不限于作为内切木 聚糖酶的功能。

在一优选实施例中， （e) 所述多肽除保留内切木聚糖酶功能外， 还相 对于野生型序列而言还具有提高的热稳定性。

在一个具体实施例中， 所述多肽选自：

(i) SEQ ID N0:2; 和

(ii) SEQ ID N0:2的至少含有其第 19-267位氨基酸的片段。

在一个具体实施例中， 所述片段为由 SEQ ID N0:2的第 19一 272位氨基 酸残基组成的片段。

在一个具体实施例中， （e) 所述多肽选自在 SEQ ID N0:2的至少一个 下述位点存在氨基酸取代的多肽： K32、 N37、 S42、 M80、 K205、 E219、 A221、 M222、 K223、 T228和 A386。

在一个具体实施例中， （e) 所述多肽至少在 SEQ ID N0:2的 K32和 K223 中存在取代。 在某些具体实施例中， 所述取代突变为 K32T与选自 K223M、 K223E、 K223T、 K223C、 K223S、 K223G和 K223L中的任一种突变的组合。

在一个具体实施例中， （e) 所述多肽至少在 223位上存在选自以下的 取代突变： K223M, K223E, K223T, K223C, K223S, K223G和 K223L。

在一个具体实施例中， （e)所述多肽的突变为取代突变， 所述取代突 变选自以下突变中的一个或多个： K32T、 N37D、 S42N、 M80I、 K205E、 E219D、 A221T、 M222L, K223M、 K223E、 K223T、 K223C、 K223S、 K223G、 K223L、 T228S、 和 A386S。

在一个具体实施例中， （e)所述多肽选自： （1)在对应于 SEQ ID N0:2 的下述位置上发生了如下所述取代的多肽： N37D; (2)在对应于 SEQ I誦： 2 的下述位置上发生了如下所述取代的多肽： S42N; (3)在对应于 SEQ I誦： 2 的下述位置上发生了如下所述取代的多肽： M80I; (4)在对应于 SEQ I誦： 2 的下述位置上发生了如下所述取代的多肽： R219D; (5) 在对应于 SRQ TD N0:2的下述位置上发生了如下所述示取代的多� �： A221T; (6) 在对应于 SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽� � M222L; (7) 在对 应于 SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽� � K223M; (8) 在对应于 SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽� � T228S; (9) 在对应于 SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽� � K205E、 K223T和 A386S; (10) 在对应于 SEQ ID NO: 2的下述位置上发生了 如下所述取代的多肽： K32T和 K223T; (11) 在对应于 SEQ ID N0:2的下述 位置上发生了如下所述取代的多肽： K205E和 K223T; (12)在对应于 SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽� � K223E、 K223T, K223C、 K223S、 K223G或 K223L; (13) 在对应于 SEQ ID NO: 2的下述位置上发生了 如下所述取代的多肽： K21T和 K223C; 和 （14) 在对应于 SEQ ID N0:2的下 述位置上发生了如下所述取代的多肽： K32T和 K223S。

在本发明的另一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 它包含一核苷酸序 列， 该核苷酸序列选自下组：

(1) 编码所述多肽的多核苷酸；

(2) 与多核苷酸（1)互补的多核苷酸。

在另一优选例中， 该多核苷酸编码如 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的 多肽。

在另一优选例中， 该多核苷酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。 在本发明的另一方面， 提供一种载体， 它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面， 提供一种遗传工程化的宿主细胞， 它含有所述 的载体， 或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面， 提供一种所述的多肽的制备方法， 该方法包含： (a) 培养所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面， 提供一种利用所述的多肽将木聚糖或含有木聚 糖的物质中的木聚糖降解为 低聚木糖或木寡糖或单糖的方法。

在另一优选例中， 所述的低聚木糖或木寡糖是： 木二糖、 木三糖或木 四糖。

在另一优选例中， 所述的多肽以内切形式水解底物， 所述的底物是： 木聚糖， 或含木聚糖的物质（如半纤维素）。

在另一优选例中， 所述的木聚糖是： 桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。 在本发明的另一方面， 提供一种组合物， 它含有安全有效量的所述的 多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的组合物还含有调节酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物 是提高酶活性的添加物； 较佳地选自： K ⁺ ， Μη ²⁺ 或在添加至底物后可水解形成 Κ ⁺ ， Μη ²⁺ 的物质； 或

所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添 加物；较佳地选自： Ni ²⁺ 、

Zn ²⁺ 、 Fe ³⁺ 和 EDTA; 或在添加至底物后可水解形成 Ni ²⁺ 、 Zn ²⁺ 或 Fe ³⁺ 的物质。

在一个优选例中， 所述的木聚糖是： 桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。 在另一优选例中，在 pH3- 12 (例如 3. 5-9. 5、 5- 10, pH4-9. 5、 pH5. 5-9. 5； 优选是 pH6. 0-9. 5 ; 更优选是 pH6. 0-8. 0 ; 最佳地是 pH7. 0) 条件下， 用所述 的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中， 在温度 15-9CTC (例如， 25-80 °C， 较佳地是 30-60

V 更佳地是 45-55 °C， 更进一步地， 50-55 Ό ) 条件下， 用所述的多肽处 理待水解的底物。

在另一优选例中， 用所述的多肽处理的同时， 还加入调节酶活性的添 加物。

在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物 是提高酶活性的添加物； 较佳地选自： K ⁺ ， Μη ²⁺ 或在添加至底物后可水解形成 Κ ⁺ ， Μη ²⁺ 的物质； 或

所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添 加物；较佳地选自： Ni ²⁺ 、 Zn ² Fe ³⁺ 和 EDTA; 或在添加至底物后可水解形成 Ni ²⁺ 、 Zn ²⁺ 或 Fe ³⁺ 的物质。

本发明还提供一种提高木聚糖酶的热稳定性方 法， 所述方法包括： 将木聚糖酶多肽中对应于 SEQ ID NO : 2第 32位和 /或第 223位的氨基酸 进行突变， 从而得到热稳定性提高的木聚糖酶。

在一具体实施例中，所述木聚糖酶多肽是本领 域已知的木聚糖酶多肽。 在其它实施例中， 所述木聚糖酶多肽是本发明的 SEQ ID N0 : 2或其活性 片段。

在其它实施例中， 所述突变还包括在该木聚糖酶的其它位置上进 行的 突变。 在优选实施例中， 所述其它位置包括下述位置中的一个或多个： 37、 42、 80、 205、 219、 221、 222、 228和 386， 所述位置编号对应于 SEQ ID NO： 2 的编号。 本发明还提供一种筛选热稳定性提高的木聚糖 酶的方法， 所述方法包 括：

(1) 构建含有 SEQ ID N0:2或其活性片段的突变体的文库； 和

(2) 对所述文库中的突变体进行热稳定性测试；

其中， 在相同的测试条件下， 若突变体测试后活力下降的程度低于对 照的下降程度至少 5% (优选低于至少 10%、 至少 20%、 至少 30%或更低）， 则筛选该该突变体为热稳定性提高的木聚糖酶 。

所述方法中， 对照可以是构建该突变体文库的出发多肽， 例如 SEQ ID NO: 2或其含有第 19到 267或 272位氨基酸的片段， 也可以是某些已确定具有 SEQ ID N0:2的内切木聚糖酶活性且其热稳定性与 SEQ ID N0:2或其含有第 19到 267或 272位氨基酸的片段相同或提高的突变体。

在一具体实施例中， 构建的突变体至少包括以下一个或几个位置中 的 取代突变： K32、 N37、 S42、 M80、 K205、 E219、 A22U M222、 K223、 T228 和 A386， 所述氨基酸编号以 SEQ ID N0:2的编号计。

在一具体实施例中，构建的突变体至少包括 K32和 /或 K223位上的突变。 在其它实施例中， 构建的突变体还可包括以下一个或几个位置中 的突变， 优选为取代突变： N37、 S42、 M80、 K205、 Ε219、 Α221、 Μ222、 Τ228和 Α386。 上述氨基酸编号对应于 SEQ ID N0:2的编号。

在一具体实施例中， 所述热稳定性测试包括在 pH为 3-12， 优选 5.5-10， 更优选约 7.0; 温度为 15-90°C， 优选为 30-60°C， 更优选为 50-55°C的条件 下测试突变体及对照的酶活， 测试的底物选自桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是 显而易见的。 附图说明

图 1为重组大肠杆菌 BL21 (DE3) ^^了28£1-^^7¾落？《？后的电泳图。图中 泳道 M为 DNA marker的电泳结果（片段由上到下依次是 23.1 kb、 9.4kb、 6.6 kp 、 4.4kp 、 2.3 kb 、 2. Okb 、 564bp) ， 1-5 为 大 肠 杆 菌 BL21 (DE3) /pET28a (+) -xyl75个单克隆菌落 PCR后的电泳图。 图 2为内切 -1， 4- β -木聚糖酶基因 ^ 7的表达和表达产物的纯化 SDS-PAGE图。 其中左图泳道 1为细胞裂解液上清中的蛋白， 泳道 2为 20mM咪 唑洗脱液， 泳道 3为 40mM咪唑洗脱液， 泳道 4为 60mM咪唑洗脱液， 泳道 5为 100 mM 咪唑洗脱液， 泳道 6为 200mM 咪唑洗脱液， 泳道 7为 500mM 咪唑洗脱 液， 泳道 M为蛋白 Marker (分子量由上到下依次为 200、 116、 97. 2、 66. 4、 44. 3、 29、 20. 1、 14. 3kDa ) 。

图 3为 Xyl7在不同 pH条件下的酶活力曲线。 其中， ♦表示 NaAc缓冲液中 的酶活力， 國表示 Na¾P0 ₄ 缓冲液中的酶活力， ▲表示 Tri s-HCl缓冲液中的 酶活力。

图 4为 Xyl7 pH耐受性测定。 其中， ♦表示 Ph6. 5的 Na¾P0 ₄ 缓冲液中的酶 活力， ▲表示 pH7. 0的 Na¾P0 ₄ 缓冲液中的酶活力， *表示 pH7. 0的 Na¾P0 ₄ 缓冲 液中加入 7 OmM巯基乙醇的酶活力， X表示 pH7. 5的 Na¾P0 ₄ 缓冲液中的酶活 力。

图 5为 Xyl7在不同温度条件下的酶活力曲线。

图 6为 Xyl7对不同温度的耐受性检测结果。 其中， ♦表示 45 °C下的酶活 力， 國表示 50°C下的酶活力， ▲表示 55 °C下的酶活力， X表示 50°C下 Na P0 ₄ 缓冲液中加入 70mM巯基乙醇的酶活力。

图 7为 Xyl7对桦木木聚糖在不同作用条件下的水解底� �的 TLC分析。 其 中， 1 : 标准品： XI为木糖， X2为木二糖， X3为木三糖； 2 : 对照组 （未与 酶作用的 1%桦木木聚糖） ； 3 : 当作用时间为 10分钟时的水解产物； 4 : 当 作用时间为 1小时时的水解产物； 5 : 当作用时间为 4小时时的水解产物； 6: 当作用时间为 12小时时将其最终水解为木寡糖， 主要包括： 木二糖、 木三 糖、 木四糖。

图 8为 Xyl7在 pH8 和 pH9条件下， 在 55 °C、 60°C和 70°C分别放置两小时 后测得的剩余酶活。

图 9为 Xyl7在 pH4和 pH5下 37 °C温浴 15、 30、 45和 60分钟后的相对剩余酶 活。

图 10为 Xyl7定向进化第一轮随机突变文库筛选结果。

图 11为定向进化第一轮筛选到突变子的热稳定性� ��定结果。 图 12为第二轮随机突变文库筛选结果和第 223位点的饱和突变筛选结 果。

图 13为第 223位点组合突变子分别在 55度 （上） 和 60度 （下） 热稳定性 测定结果。

图 14为 Xyl 7第 19-272位氨基酸片段的表达和表达产物的纯化 SDS-PAGE 图。 其中泳道 1为细胞裂解后的总蛋白， 泳道 2为细胞裂解液沉淀， 泳道 3为 细胞裂解液上清， 泳道 4为 60mM 咪唑洗脱液， 泳道 5为 100 mM 咪唑洗脱液， 泳道 6为 200mM咪唑洗脱液，泳道 7为 500mM咪唑洗脱液，泳道 M为蛋白 Marker (分子量由上到下依次为 200、 1 16、 97. 2、 66. 4、 44. 3、 29、 20. 1、 14. 3kDa )。

图 15为 Xyl7第 19-272位氨基酸片段中第 223位点突变子分别在 55度

(上） 和 60度 （下） 的热稳定性测定结果。

图 16为 Xyl7第 19-267位的蛋白表达结果， 命名为 Xyl7R2。 泳道 1为细胞 裂解后的总蛋白， 泳道 2为细胞裂解液沉淀， 泳道 3为细胞裂解液上清， 泳 道 4为 60mM 咪唑洗脱液， 泳道 5为 100 mM 咪唑洗脱液， 泳道 6为 200mM 咪唑 洗脱液， 泳道 7为 500mM 咪唑洗脱液， 泳道 M为蛋白 Marker。 具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选， 首次从白蚁肠道的元基因组中分离得到 一种新的木聚糖酶（较佳地为内切 -1， 4- β -木聚糖酶）， 其酶活性高， 对温 度和 ρΗ具有较宽的作用范围， 可良好地应用于工业生产。 所述的木聚糖酶 的氨基酸序列与已知氨基酸序列的相似性最高 的为 69%， 证明其是一种新的 蛋白。 本发明的木聚糖酶具有很高的酶活性， 在 pH7. 0， 50°C下的比活力高 于 6340U/mg。

针对传统微生物学中基因筛选方面的缺陷，元 基因组学（Metagenomics) 技术异军突起。 通过直接从环境中抽提微生物核酸并构建元基 因组文库 (BAC， fosmi d或者质粒文库）， 可以有效克服由于微生物分离培养技术造成 的缺陷， 获得群落中所有种群的遗传信息， 这些遗传信息就包括了群落中 所欲参与生物转化的基因， 这些基因编码的酶在克隆宿主中的表达可以用 于各种与生物转化相关的酶的筛选， 从而有可能获得大量新的基因。 众所周知， 针对不同用途需要使用不同性质的木聚糖酶， 而不同性质 的木聚糖酶极有可能蕴藏于自然界不同生态环 境下的微生物基因组中。 白 蚁作为自然生态系统中木质纤维素的重要降解 者， 其肠道共生微生物群落 在纤维素物质转化过程中起到了关键作用。 鉴于白蚁肠道生态系统的高效 性、 独特性和复杂性， 本发明以白蚁作为木聚糖酶筛选的体系， 利用元基 因组学技术进行筛选， 对其基因和酶进行挖掘， 最终找到了本发明的木聚 糖酶。

本发明的木聚糖酶可作用于木聚糖长链分子的 内部， 以内切方式作用 于木聚糖主链内部的 β -1， 4-木糖苷键， 将大分子多聚木糖水解为简单糖 (如木寡糖）。

如本文所用， 术语 "本发明的多肽" 、 "本发明的蛋白" 、 "本发明 的木聚糖酶" 、 " Xyl7蛋白" 、 " Xyl7多肽" 或 "木聚糖酶 Xyl7 " 可互换 使用， 都指具有木聚糖酶 Xyl7氨基酸序列（SEQ ID NO : 2、 其片段或变异形 式或衍生物）的蛋白或多肽。它们包括含有或 不含起始甲硫氨酸的木聚糖酶 Xyl7 o

如本文所用， 术语 "本发明的基因" 、 " ^ 堪因" 、 " xyl 7" 指具 有木聚糖酶编码基因序列（SEQ ID NO : 1或其变异形式或衍生物）的多核苷 酸。

如本文所用， 所述的 "简单糖" 广义地指木聚糖链被切割后形成的一 类糖的总称， 其链长度低于被切割前。 例如， 所述的简单糖含有 1-50个木 糖， 较佳的， 含有 1-30个木糖； 更佳的， 含有 1-15个木糖； 更佳地含有 1-10 个木糖， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9个木糖。 所述的简单糖包括： 木寡糖、 木二糖、 木三糖、 木四糖等。 本发明中， 所述的简单糖又指： 低聚木糖、 少量木糖。

如本文所用， 所述的 "木糖" 指一种含有五个碳原子的单糖。 分子式

C ₄ H ₉ 0 ₄ CH0。 所述的 "木聚糖" 是 "木糖" 的聚合体。

如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（� ��果是天 然的物质， 原始环境即是天然环境）。 如活体细胞内的天然状态下的多聚核 苷酸和多肽是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态 中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化的。

如本文所用， "分离的 Xyl7蛋白或多肽" 是指 Xyl7多肽基本上不含天 然与其相关的其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用 标准的蛋白质纯化技术纯化 Xyl7蛋白。 基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰 胺凝胶上能产生单一的主带。 Xyl7多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 本发明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组 技术从原核或真核宿主（例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细 胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨 酸残 基。

本发明还包括 Xyl7蛋白的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片段" 、 "衍生物" 和 "类似物" 是指基本上保持本发明的天然 Xyl7蛋 白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物 可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基� ��残基（优选保守性氨基酸残 基）被取代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是 由遗传密 码编码的，或（i i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的� ��肽，或（i i i) 成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰 期的化合物， 例如聚乙二醇） 融合所形成的多肽， 或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而 形成的 多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多 肽的序列或蛋白原序列， 或与 抗原 IgG片段的形成的融合蛋白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中， 术语 " Xyl7多肽" 指具有 Xyl7蛋白活性的 SEQ ID NO : 2 序列的多肽或活性片段和活性衍生物。 在一优选实施例中， 所述活性片段 可以是含有 SRQ TD N0 : 2的保守功能域 （第 32-256位氨基酸） 的片段。 例如， 所述片段可以是含有 SEQ ID N0 : 2的第 19-267位氨基酸残基的片段。 在其它 实施例中， 所述活性片段可以是含有 SEQ ID N0 : 2的第 19-272位氨基酸残基 的片段。 例如， 所述片段可以为 SEQ ID NO : 2的第 19-450位氨基酸序列、 第 19-300位氨基酸序列不等， 优选 SEQ ID NO : 2的第 19-267位氨基酸序列 以及 SEQ ID NO : 2的第 19-272位氨基酸序列。 又例如， 变异可以发生在 SEQ ID N0 : 2的保守功能域 （第 32-256位氨基酸） 之外； 在一优选实施例中， 变 异发生在例如 SEQ ID NO : 2的第 19-267或 272位氨基酸序列之外。 变异可以 是 1-20个、 例如 1-10个、 优选 1一 5或 1一 3个氨基酸缺失、 取代和插入。 该 术语还包括具有与 Xyl7蛋白相同功能的、 SEQ ID NO : 2序列或 SEQ ID NO : 2 的第 19-272位氨基酸序列或第 19-267位氨基酸序列的变异形式。 这些变异 形式包括（但并不限于）： 一个或多个（通常为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳 地 1-20个， 更佳地 1-10个， 最佳地 1-5个）氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加或缺失一个或数个（通常为 20个以内， 较佳地 为 10个以内， 更佳地为 5个以内）氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近 或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 比如， 在 c末端 和 /或 N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不� �改变蛋白质的功能； 又比如， 仅表达该蛋白的催化结构域， 而不表达碳水化合物结合结构域也 能获得和完整蛋白同样的催化功能。 该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导突变体、 在高或低的严紧 度条件下能与 杂交的 DNA所编码的蛋白、 以及利用抗 Xyl7多肽的抗 体获得的多肽或蛋白。 本发明还提供了其他多肽， 如包含 Xyl7多肽或其片 段的融合蛋白。 除了几乎全长的多肽外， 本发明还包括了 Xyl7多肽的可溶 性片段。 通常， 该片段具有 Xyl7多肽序列的至少约 10个连续氨基酸， 通常 至少约 30个连续氨基酸， 较佳地至少约 50个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨基酸， 最佳地至少约 100个连续氨基酸。

本发明 SEQ ID NO : 2序列或 SEQ ID NO : 2的第 19-272位氨基酸序列或 SEQ ID NO : 2的第 19-267位氨基酸序列的变异形式包括但不限于发 生在 SEQ ID NO : 2序列或相对于该序列相同位点的第 32位、 第 37位、 第 42位、 第 80 位、 第 205位、 第 219位、 第 221位、 第 222位、 第 223位、 第 228位、 第 386位 中的一个或多个位置上的取代突变。 用来取代的氨基酸并无特别限制。 在 某些实施例中， 本发明的变异序列可包含以下取代中的一个或 多个： K32T、 N37D、 S42N、 M80I、 K205E、 E219D、 A221T、 M222L、 K223M、 K223E、 K223T、 K223C、 K223S、 K223G、 K223L、 T228S、 和 A386S。 在一些实施方式中， 本发明的变异形式的多肽包括但不限于 SEQ ID NO : 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27和 29中所示的序列。 本发明也包括这 些变异多肽的编码序列， 其编码序列的例子包括 SEQ ID N0 : 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26和 28所示的序列。

发明还提供 Xyl7蛋白或多肽的类似物。 这些类似物与天然 Xyl7多肽的 差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异， 或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体 可以通过各种技术得到， 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还 可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技 术。 类似物还包括具有不同 于天然 L-氨基酸的残基（如 D-氨基酸）的类似物， 以及具有非天然存在的或 合成的氨基酸（如 β、 Υ -氨基酸）的类似物。 应理解， 本发明的多肽并不限 于上述例举的代表性的多肽。 修饰（通常不改变一级结构）形式包括： 体内 或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基 化。 修饰还包括糖基化， 如 那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤 中进行糖基化修饰而产生的 多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖 基化的酶（如哺乳动物的糖基 化酶或去糖基化酶）而完成。 修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷 酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸）的序列。 还包括被修饰从而提高了其 抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中， " Xyl7蛋白保守性变异多肽" 指与 SEQ ID NO : 2或 SEQ ID NO : 2的第 19-267或 272位的氨基酸序列相比， 有至多 20个， 较佳地至多 10 个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所 替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表 1进行氨基酸替换而产 生。 本发明的 Xyl7蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多� �多肽片段， 作为蛋白标签。 任何合适的标签都可以用于本发明。 例如， 所述的标签可 以是 FLAG, HA, HA1， c- Myc， Poly -His , Poly-Arg, Strep- Tagil， AU1， EE, T7， 4A6， ε , B， gE以及 Tyl。 这些标签可用于对蛋白进行纯化。 表 2 列出了其中的一些标签及其序列。 表 2

标签 残基数 序列 SEQ ID NO :

Poly-Arg 5-6个（通常 5个） RRRRR 5

Poly- Hi s 2-10个（通常 6个） HHHHHH 6

FLAG 8个 DYKDDDDK 7

Strep-Tagi l 8个 WSHPQFEK 8

C-myc 10个 WQKLISEEDL 9 为了使翻译的蛋白分泌表达（如分泌到细胞外 ）， 还可在所述 Xyl7的末 端添加上信号肽序列， 如 pelB信号肽等。 信号肽在多肽从细胞内分泌出来 的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基因 组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链 或非编码链。 编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO : 1所示的编码 区序列相同或者是简并的变异体。 如本文所用， "简并的变异体" 在本发 明中是指编码具有 SEQ ID NO : 2的蛋白质， 但与 SEQ ID NO : 1所示的编码 区序列有差别的核酸序列。

编码 SEQ ID NO : 2的成熟多肽的多核苷酸包括： 只编码成熟多肽的编 码序列； 成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列 (和任选的附加编码序列）以及非编码序列。

术语 "编码多肽的多核苷酸" 可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也 可以是还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基 酸序列的多肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以 是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异 体。 这些核苷酸变异体包括 取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是 一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插 入， 但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之 间具有至少 50%，较佳地 至少 70%， 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件 (或严紧条件）下与本发明所述多核苷酸可杂� �的多核苷酸。 在本发明中， "严格条件"是指： （1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗� ��， 如 0. 2 X SSC， 0. 1%SDS， 60°C _; 或（2)杂交时加有变性剂， 如 50% (v/v)甲酰胺， 0. 1% 小牛血清 /0. l% Fi col l， 42 °C等； 或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90%以上， 更好是 95%以上时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸编码的 多肽与 SEQ ID NO : 2或 SEQ ID NO : 2的第 19-267位氨基酸序列所示的成熟 多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片 段" 的长度至少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个 核苷酸，最好是至少 100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增 技术（如 PCR)以确定和 /或分离编码 Xyl7蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式 提供， 更佳地被纯化至 均质。

本发明的^^ ¾苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷 酸序列， 尤其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领 域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR扩增， 然后再将各次扩增出的 片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿 主细胞中分离得到有关序列。

此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短 时。 通常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片 段。

目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 蛋白（或其片段， 或其衍生物）的 DNA序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有 的 DNA分子（或如载体）和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发 明蛋白序列中。

应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。 特别 是很难从文库中得到全长的 cDNA时， 可优选使用 RACE法（RACE-cDNA末端快 速扩增法）， 用于 PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信 息适当地 选择， 并可用常规方法合成。 可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩 增的 DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 Xyl7蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞� � 以及经重组技术产生本发 明所述多肽的方法。

通过常规的重组 DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用 来表达 或生产重组的 Xyl7多肽。 一般来说有以下步骤：

(1) .用本发明的编码 Xyl7多肽的多核苷酸（或变异体）， 或用含有该多 核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主 细胞；

(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。

本发明中， 多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 术语 "重组 表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒或其他载体。 只要能在宿主体内 复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通常 含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 Xyl7编码 DNA序列和合适 的转录 /翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合 成技术、 体内重组技术等。 所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当 启动子上， 以指导 mRNA合成。 这些启动子的代表性例子有： 大肠杆菌的 lac 或 trp启动子； λ噬菌体 PL启动子； 真核启动子包括 CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、 早期和晚期 SV40启动子、 反转录病毒的 LTRs和其他一 些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病 毒中表达的启动子。 表达载 体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录 终止子。

此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基 因， 以提供用于 选择转化的宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以及绿色荧光蛋白（GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉 素抗性。

包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用 于转化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母 细胞； 或是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属； 鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 果 蝇 S2或 Sf9的昆虫细胞； CH0、 COS, 293细胞、 或 Bowes黑素瘤细胞的动物细 胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强 子序列时将会使转录得到增强。 增强子是 DNA的顺式作用因子， 通常大约有 10到 300个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。 可举的例子包括在复 制起始点晚期一侧的 100到 270个碱基对的 SV40增强子、 在复制起始点晚期 —侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载 体、 启动子、 增强子和 宿主细胞。

用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。当 宿主为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后 收获， 用 CaCl ₂ 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl ₂ 。 如果需要， 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可 选用如下的 DNA转染方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电 穿孔、 脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发 明的基因所编码的多肽。 根据所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适 于宿主细胞生长的条件下进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导 选择的启动子， 将细胞再培养 一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌 到细胞外。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离 方法分离和纯化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些 方法的例子包括但并不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方 法）、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层 析、 离子交换层析、 高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术� ��这些 方法的结合。

重组的 Xyl7的用途包括（但不限于）： 水解木聚糖， 将木聚糖长链切割 为短链， 或形成简单糖。 大部分已知木聚糖酶的活力都低于本发明的 Xyl7 的酶活力， 预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高 Xyl7的酶活力、 或扩大 Xyl7适用的 ra值范围、 温度范围及热稳定性， 因此其应用前景良好。 一些蛋白的分子改造技术是本领域人员熟知的 ， 因此采用这些技术改造 Xyl7后生成的木聚糖酶也包含在本发明中。

用表达的重组 Xyl7蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的� �抑制或 剌激 Xyl7蛋白功能的多肽分子。

另一方面， 本发明还包括对^ 7 0^或是其片段编码的多肽具有特异 性的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 这里， "特异性" 是 指抗体能结合于 堪因产物或片段。 较佳地， 指那些能与 堪因产物 或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原 分子的抗体。 本发明中抗体 包括那些能够结合并抑制 Xyl7蛋白的分子， 也包括那些并不影响 Xyl7蛋白 功能的抗体。 本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的 Xyl7基因产物 结合的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知 的各种技术进行制备。 例如， 纯化的 因产物或者其具有抗原性的片段， 可被施用于动物以 诱导多克隆抗体的产生。 与之相似的， 表达 Xyl7蛋白或其具有抗原性的片 段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明 的抗体也可以是单克隆抗体。 此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备（ 见 Kohler等人， Nature 256 ; 495, 1975 ; Kohler等人， Eur. J. Immunol . 6： 511， 1976 ; Kohler等 人， Eur. J. Immunol . 6： 292, 1976； Hammerl ing等人， In Monoclonal Antibodi es and T Cel l Hybri domas, Elsevier, N. Y.， 1981)。 抗 Xyl7蛋 白的抗体可用于检测样本中的 Xyl7蛋白。

利用本发明蛋白， 通过各种常规筛选方法， 可筛选出与 Xyl7蛋白发生 相互作用的物质， 如抑制剂、 激动剂或拮抗剂等。

本发明还提供了一种组合物， 它含有有效量的本发明的 Xyl7多肽以及 食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。 这类载体包括（但并不限于）： 水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 本领域技术人员可根 据组合物的实际用途确定组合物中 Xyl7多肽的有效量。

所述的组合物中还可添加调节本发明的 Xyl7酶活性的物质。 任何具有 提高酶活性功能的物质均是可用的。 较佳地， 所述的提高本发明的 Xyl7酶 活性的物质选自： K ⁺ ， Μη ²⁺ 或在添加至底物后可水解形成 Κ ⁺ ， Μη ²⁺ 的物质， 如 氯化钾、 硫酸锰。 此外， 一些物质可以降低酶活性， 选自： Ni ²⁺ 、 Zn ²⁺ 、 Fe ³⁺ 和 EDTA; 或在添加至底物后可水解形成 Ni ²⁺ 、 Zn ²⁺ 或 Fe ³⁺ 的物质。

在获得了本发明的 Xyl7酶后， 根据本发明的提示， 本领域人员可以方 便地应用该酶来发挥水解底物（特别是木聚糖 ）的作用。 作为本发明的优选 方式， 还提供了一种形成简单糖的方法， 该方法包含： 用本发明所述的 Xyl7 酶处理待水解的底物， 所述的底物包括桦木木聚糖和山毛榉木聚糖等 。 通 常， 在 pH3. 5-10条件下， 用所述的 Xyl7酶处理待水解的底物。 通常， 在温 度 30-8CTC条件下， 用所述的 Xyl7酶处理待水解的底物。 较佳地， 用所述的 Xyl7酶处理的同时， 还加入 K ⁺ ， Μη ²⁺ 或在添加至底物后可水解形成 Κ ⁺ ， Μη ²⁺ 的物质。

在本发明的一个实例中， 提供了一种分离的多核苷酸， 它编码具有 SEQ ID NO : 2所示氨基酸序列的多肽。 本发明的多核苷酸是从白蚁肠道系统构 建的 Fosmid文库中分离出的。 其序列如 SEQ ID NO : 1所示， 它包含的多核 苷酸序列全长为 1518个碱基， 编码全长为 505个氨基酸的 Xyl7蛋白（SEQ ID NO : 2)。 所述的 Xy1 7蛋白 (SRQ TD NO : 2) 序列中， 自氨基端的第 32-256 位氨基酸为糖基水解酶第 1 1家族 （Glycosyl Hydrolase Fami ly 1 1) 保守 功能域。 所述的 Xyl7蛋白与已知氨基酸序列的相似性为 69%， 证明是一种新 的内切 -1， 4- β -木聚糖酶。

实验证明本发明的内切 -1， 4- β -木聚糖酶具有很高的木聚糖酶活性、 很广的 pH适用范围及较广的温度适用范围， 因而具有巨大的应用前景。 本发明同时提供一种热稳定性提高的多肽， 该多肽衍生自原始多肽， 具有木聚糖酶活力的同时其热稳定性大幅提高 。 原始多肽优选为 SEQ ID N0 : 2所示氨基酸序列的多肽或其含有第 19-267或 272位氨基酸残基的片段。 该热稳定性提高的多肽优选至少具有相对于 SEQ ID N0 : 2序列中第 32位或第 223位氨基酸的取代突变。优选的突变氨基酸为 ： K32T , K223E , K223C , K223S , 或其组合， 更佳的优选为 K32T与 K223C的组合， 或 K32T与 K223S的组合。

本发明同时还提供一种提高多肽热稳定性的方 法， 包括将木聚糖酶多 肽中对应于 SEQ ID NO : 2第 32位和 /或第 223位的氨基酸进行突变， 从而得 到热稳定性提高的木聚糖酶。 所述木聚糖酶可以是当前已知的其它木聚糖 酶。 在某些实施例中， 所述木聚糖酶为本申请所公开的木聚糖酶。 具体而 言， 所述方法包括将 SEQ ID N0 : 2序列或其活性片段中第 32位或第 223位氨 基酸的位点进行突变。

本文中， 热稳定性的提高指的是在一定温度下， 例如 15-90 °C， 优选为 30-60 °C， 更优选为 50-55 °C， 例如 50 °C或 55 °C， 经过一段时间后， 相对于 在该温度处理之前， 其活力下降的程度与野生型 （出发多肽） 经过同样处 理后的下降程度相比较低， 即处理后保留的活力较高。 热稳定性处理时使 用的底物可以是该木聚糖酶的特异性底物。 在本发明中， 底物可以是例如 桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。 处理时的 pH值通常在 3-12的范围内， 优选 5. 5-10， 更优选约 7. 0。

此外应理解，上述的热稳定性提高的多肽和提 高多肽热稳定性的方法， 本领域人员可在一定范围内进行改动， 在除相对于 SEQ ID N0 : 2序列中第 32 位或第 223位氨基酸之外进行氨基酸的增加， 减少或缺失， 或添加信号肽， 这些改动均不影响本发明的权利要求。 如果改动涉及到相对于 SEQ I 2 序列中第 32位或第 223位氨基酸的位点， 则落在本发明的说明书和权利要求 之内。

下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件 的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室指南 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989) 中所述的条 件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按 重量计算。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员 所熟悉的意义相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 实施例 1、 内切 -1，4-β-木聚糖酶及其编码基因的分离

利用元基因组技术， 通过常规方法从白蚁肠道元基因组系统中筛选 到 木聚糖酶阳性克隆， 提取该克隆的质粒 DNA进行 454高通量测序， 序列拼接 后可以获得完整的 Fosmid序列。 用 DNAStar软件寻找 0RF， 用 NCBI的 BlastP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 搜寻 GenBank数据库， 得到一个新的内切 -1，4-β -木聚糖酶的编码基因， 该基因具有 SEQ ID NO: 1的核苷酸序列， 命名为 7。 自 SEQ ID N0: 1的 5' 端第 1-1518位核苷酸为 y 7的开放阅读 框（Open Reading Frame, 0RF)， 自 SEQ ID NO: 1的 5' 端的第 1-3位核苷酸 为 ^ 因的起始密码子 ATG， 自 SEQ ID NO: 1的 5' 端的第 1516-1518位核 苷酸为 ^ 因的终止密码子 TAA。

内切 -1， 4- β -木聚糖酶基因 y 7编码一个含有 505个氨基酸的蛋白质 Xyl7， 具有 SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列， 用软件预测到该蛋白质的理 论分子量大小为 51.9kDa， 等电点 pi为 8.87。 自 SEQ ID N0: 2的氨基端的第 32-256位氨基酸为糖基水解酶第 11家族 （Glycosyl Hydrolase Family 11) 保守功能域。

经鉴定， Xyl7能够高效地以内切方式作用于桦木木聚糖� �山毛榉木聚 糖主链内部的 β -1， 4-木糖苷键， 当作用时间较短（10分钟）时， 将大分子 多聚木糖初步水解为低聚木聚糖； 当作用时间较长（12小时）时， 将其最终 水解为木寡糖， 主要包括： 木二糖、 木三糖、 木四糖。

经比对， Xyl7同已知序列的内切木聚糖酶的同源性最高� � 69%， 表明该 内切 -1，4-β -木聚糖酶为新酶。 实施例 2、 ^难大肠杆菌中的表达

1. 重组表达载体的构建

通过 PCR从上述筛选到的木聚糖酶阳性克隆中扩增预 测到的内切 -1， 4- β -木聚糖酶 ORF编码基因，所用正向引物为：5' GAGACTCCATATGCAAGGTCCCAC ATGGACT 3' (SEQ ID NO: 3 )， 其 5' 端添加 Nde I识别位点： CATATG; 反 向引物为： 5' CGGAATTCTTACCTCACCATAACCCT 3' (SEQ ID NO: 4) , 其 5' 端添加 EcoR I识别位点： GAATTC。

将 PCR产物纯化后用 Nde I和 EcoR I酶切， 应用 Axgen PCR产物柱回收试 剂盒回收酶切的 DNA片段， 将该 DNA片段和经同样双酶切的回收的载体 pET-28a (Novagen公司）用 T4 DNA 连接酶在 16°C下连接过夜， 得到重组表 达载体 pET 28a-Xyl7 ₀ 表达产物的 N末端有一个由表达载体提供的 His标签 (6XHis-Tag)， 便于后续纯化。

2. 堪因在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达及表达产物纯化

(1) 7的表达

将上述构建好的质粒 pET 28a- j ^ 化入大肠杆菌 BL21 (DE3)中， 将得 到的 BL21(DE3)/pET28a- j ^ 化子随机挑取 5个单克隆， 接种于含有氨苄 青霉素的 LB培养液中， 摇床上经过短期培养后， 以菌液直接作为模板， 通 过载体上的 T7启动子引物 （cat. no. 69348-3)和 T7终止子引物 （cat. no. 69337-3)PCR鉴定阳性克隆。 结果如图 1所示， 5个单克隆中均有目的片段扩 出。

接种 coli BL21 (DE3)/pET28a- j^7于 5 ml含有 100 g/ml 氨苄青 霉素的 LB培养液中， 37°C 200 rpm培养过夜。 取 1 ml培养液到 100ml LB培 养液中， 37°C 200 rpm培养至 00 ₆ 。。为0.6-0.8。 冷却后加入 80 μΜ IPTG， 于 24 °C 200 rpm继续培养 16个小时，离心收集菌体。用裂解液 （lysi s buffer: NaH ₂ P0 ₄ 50 mmol/L, NaCl 300 mmol/L, pH7.4) 悬浮收集的菌体， 超声波 破碎细胞后离心收集上清液即为粗酶液。

用购自 Qiagen公司的 Ni柱 （Ni-NTA Column) 纯化粗酶液， 纯化时所用 洗涤液 (wash buf er)： NaH ₂ P0 ₄ 50 mmol/L, NaCI 300 mmol/L, pH7.0； 不同咪唑浓度 （20、 40、 60、 100、 200、 500 ) 的洗脱液（elut i on buf er)： NaH ₂ P0 ₄ 50 mmol/L, NaCl 300 mmol/L, inidazole 20-500mmol/L , pH 7. 0。 用 5μ1洗脱液进行蛋白 SDS-PAGE电泳检测， 如图 2所示。 其中泳道 1为细胞裂 解上清液， 泳道 2为 20mM咪唑洗脱液， 泳道 3为 40mM咪唑洗脱液， 泳道 4为 60 mM 咪唑洗脱液， 泳道 5为 100 mM 咪唑洗脱液， 泳道 6为 200 mM 咪唑洗 脱液， 泳道 7为 500 mM咪唑洗脱液。 从图中可见， 200mM咪唑洗脱时目的蛋 白大量洗脱， 电泳后可以看到单条带， 说明此时已经得到高纯度的目的蛋 白， 将所有含有目的蛋白的洗脱液合并， 用 GE公司 10 Kd截留的 vivaspine 超滤管浓缩透析， 同时用 20 mM pH7. 4 Na¾P0 ₄ 的置换缓冲液， 以去除咪唑。 实施例 3. 重组 Xyl7蛋白酶学性质的分析

内切 -1，4- β -木聚糖酶的酶活测定采用 DNS法， 具体操作如下：

(1) DNS配制

称取 10克 Na0H， 溶解于大约 400ml dd 0中， 再称取 10g二硝基水杨酸、 2g苯酚、 0. 5g无水亚硫酸钠、 200g四水酒石酸钾钠， 将其溶解于大约 300 ml dd 0中， 两种溶液混合， 定容到 1升， 避光保存。

(2) 标准曲线制备

取 9支薄壁离心管， 按表 3中所述的木糖母液体积和纯水体积配制木糖 标样， 木糖母液浓度为 10mg/ml。

表 3

上表每份标样加 DNS 100 μ1， 沸水浴 5 min显色， 酶标仪测 540 nm 光 吸收，标样 1为空白对照。各样品吸光值减空白对照吸光� �后制备标准曲线。 (3) 标准酶活测定

在 ΙΟΟ μ Ι反应体系中， 加入终浓度为 l% (w/w)的桦木木聚糖， 终浓度为 100 mM 的 pH7. 0 Na ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 缓冲液， 然后加入用该缓冲液稀释至一定 稀释度的适量酶液 50°C反应 10分钟， 再加入 100 μΐ DNS终止反应， 对照为 在上述反应体系中先加入 100 μΐ DNS后再加酶液。沸水浴中反应 5分钟显色， 用酶标仪测 540 nm光吸收值， 样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶 活单位 (U)。

酶活单位（U)定义： 1 U为每分钟催化水解木聚糖产生 1 μηιοΐ木糖所需 的酶量。

比活力单位的定义： 每毫克蛋白质所含的酶活力（U/mg)。

结果表明 Xyl7对山毛榉木聚糖在 pH7. 0， 50°C下的比活力为 6340U/mg。

(4) Xyl7最适 pH测定

pH范围为 3. 5-10，每 0. 5个单位为一个梯度，不同 pH值的缓冲液配制为： pH 3. 5〜6. 0用终浓度为 100 mM的 NaAc ; pH 6. 0〜 8. 0用终浓度为 lOOmM Na ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ ; pH 8. 0〜pH 10用终浓度为 100 mM Tri s- HC1。 将酶液加入 各 pH缓冲液的体系中， 按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。 在 50°C反 应条件下， Xyl7在 pH7. 0的 N _¾ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 缓冲液中的比活力最高， 以此为 参照值， 其相对活力定义为 100%， 各 pH值下酶的相对活力为各 pH下酶的比 活力与参照值的比值。

结果如图 3所示， Xyl7最适 pH为 7. 0， 且在 pH 5. 5〜 10之间均具有 50% 以上的相对活力， 说明 Xyl7的反应 pH范围较宽， 能够适应的酸碱范围较广。

(5) Xyl7 pH耐受性测定

将酶液在不同 pH ( 6. 5、 7. 0、 7. 5 ) 的缓冲液或在 PH7. 0时加入 70mM巯 基乙醇中，于 50°C下分别保持不同时间 (15min、 30min、 45min、 60min、 75min) 后，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活（ 在 pH7. 0， 50 °C下，反应 10 min, 测定酶活力） 。 以 Xyl7在 pH7. 0， 50°C中保存 0 min， 在 50°C反应 10 min的 比活力为参照值， 其相对活力定义为 100%， Xyl7在各 pH值缓冲液中保存不 同时间后的相对活力为各种处理后的酶的比活 力与参照值的比值。

结果如图 4所示， Xyl7具有较广的 pH耐受性： 在 pH6. 5、 7. 0、 7. 5的缓 冲液中保持 45min后， 均能够保持最高活力的 50%以上。 (6) Xyl7最适温度测定

在 pH7. 0条件下， 在温度范围为 25-8CTC之间， 按如前所述标准酶活测 定方法步骤测定酶活。 结果如图 5所示， Xyl7的最适温度为 50〜55 °C， 50°C 活力略高于 55 °C， 故以此温度下的酶的比活力为参照值， 其相对活力定义 为 100%， 各个温度下的酶的相对活力为各个温度下酶的 比活力与参照值的 比值。 Xyl7在 30-6CTC的温度范围内可保持最高活力 50%以上的活力， 说明 Xyl7的反应温度范围较宽。

(7) Xyl7温度耐受性测定

将 Xyl7酶液保存于最适 pH7. 0缓冲液中， 在不同温度（55 °C、 50°C、 45 °C )或在 50°C时加入 70mM巯基乙醇下保持不同时间（15min、 30min、 45min、 60min、75min)后，按如前所述标准酶活测定步骤� ��定酶活（在 pH7. 0， 50 V， 下， 反应 10 min， 测定酶活力） 。 其对照是未热处理的酶液在 pH7. 0， 50 °C 下所测定的比活力， 以此为参照值， 其相对活力定义为 100%; 处理组的相 对活力为在不同温度下保温不同时间 （处理条件） 后测得的相对活力与参 照值的比值。 结果如图 6所示， Xyl7在 55 °C下保存 15min时， 活力迅速下降 到最大活力的 50%以下； 在 50°C、 45 °C下保持时酶活力下降较慢， 保持 45min 时酶活力才下降到最大酶活力的 50%以下； 当加入 70mM巯基乙醇后， 酶活力 的下降速度进一步减慢。 (8) 不同化学试剂及金属离子对 Xyl 7酶活的影响

在反应体系中加入各种化合物 （终浓度为 10 mmol/L) , 然后按如前所 述标准酶活测定步骤测定酶活， 以未加任何化学试剂及金属离子的酶的比 活力为参照值， 其相对活力定义为 100%。 不同化学试剂或金属离子对 Xyl7 酶活的影响用相对活力表示， 相对活力为各种化学试剂或金属离子环境下 的酶的比活力与参照值的比值。结果如表 4所示， K ⁺ 、 Mn ² \ Cu ²⁺ 和 Co ²⁺ 对 Xyl7 有激活作用， 其中 K ⁺ 和 Mn ²⁺ 可使酶活力提高近 20%; Ni ²⁺ 、 Zn ²⁺ 、 Fe ²⁺ 和 EDTA 对 Xyl7有显著的抑制作用， 均可使酶丧失 70%以上活力； Mg ²⁺ 对 Xyl7没有显 著作用。

表 4

金属离子或化学试剂 相对活力 0%)

(lOmM )

PC 100±1.29 κ ⁺ 125.6±11· 98

Mg ²⁺ 101.53±3.02

Ca 90.1±12.82

Fe ²⁺ 25.33±0· 46

Cu 108.69±2.99

Zn ²⁺ 64.88±1· 36

Co ²⁺ 109.14±3· 45

Ni ²⁺ 44.25±4· 98

Mn ²⁺ 125.73±7· 8

Ba ²⁺ 90.71±1· 94

Al ³⁺ 77.68±2· 32

Fe ³⁺ 90.41 + 3.36

EDTA 88.65±1· 62

(9) Xyl7对不同底物的水解情况

将各种底物 （终浓度为 2%(w/w)) 与适量酶在 pH7.0及 50°C下作用 10 min， 按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活力。 结果如表 5所示： Xyl7的 底物特异性较强， 仅对桦木木聚糖及山毛榉木聚糖具有显著酶活 ， 对于其 他测定底物则没有检测到酶活， 这与 GH1 1家族木聚糖酶的高底物特异性能 较好吻合。 表 5 底物 比活力 （U/mg) 山毛榉木聚糖 6340 ± 48 桦木木聚糖 4700 ± 57 微晶粉末纤维素 0 羧甲基纤维素纳 0 海带淀粉 0 大麦葡聚糖 0 槐树豆胶 0

(10) Xyl7对桦木木聚糖水解底物的 TLC分析

将 l% (w/w)桦木木聚糖与 15U Xyl7在 ρΗ7· 0、 50°C下分别作用 10min、 lh、 4h、 12h获得水解产物。 将 5 μ 1上述两种产物用 TLC进行鉴定， 其中标准样 品为木糖、木二糖和木三糖；展开剂为：乙酸 乙酯：乙酸：水 2 : 1 : 1 ( V/V/V)； 显色剂为 1 mL苯胺、 1 g二苯胺、 5 mL 85%磷酸溶于 50 mL丙酮中。

结果如图 7所示， 当作用时间较短时， Xyl7将大分子多聚木糖初步水解 为低聚木聚糖； 当作用时间较长时， 将其水解为木寡糖， 主要包括： 木二 糖、 木三糖、 木四糖； 在酶过量的情况下最终的水解产物是木糖。 证明 Xyl7 是以内切方式作用于木聚糖主链内部的 β _1， 4-木糖苷键。

(11) Xyl7在纸浆漂白中的应用

纸浆漂白需要木聚糖酶没有纤维素酶活性， 而且可以在中高温 （如 50-70度） 、 碱性环境 （如 pH8-9 ) 下， 在 1-2小时内保持酶活性。 因此， 将 Xyl7在 pH8和 pH9条件下， 在 55 °C、 60°C和 70°C分别放置两小时后， 按如前 所述标准酶活测定步骤测定酶活 （在 pH7. 0， 50 °C下， 反应 10min， 测定酶 比活力） ， 其对照是未处理的酶液在 pH7. 0， 50 °C下所测定的比活力， 以 此为参照值， 其相对活力定义为 100%， 并计算剩余酶活， 剩余酶活为各处 理后的酶的比活力与参照值的比值。

结果如图 8所示，可见 Xyl7即使在 50-70度的高温、 pH8-9的碱性环境中， 仍能在 1-2小时内保持足够高的酶活性， 因此可用于纸浆漂白。 (12) Xyl7作为饲料添加剂的应用

作为饲料添加剂， 由于猪等畜类胃内酸性环境， 需要木聚糖酶在 ra4 左右的环境下保持酶活性， 对于鸡消化道内的弱酸环境， 需要木聚糖酶在

PH6左右的环境下保持酶活性。 因此， 将 Xyl7在 pH4和 pH5下于 37 °C温浴 15、 30、 45和 60分钟后测定并计算剩余酶活， 剩余酶活为各处理后的酶的比活 力与没有处理的酶的比活力的比值。

结果如图 9所示， 可见 Xyl7即使在 pH4-5的酸性环境中仍能保持足够高 的酶活性， 因此可用作饲料调节剂。

实施例 4. Xyl7第 19-272位氨基酸片段特性研究

使用正向引物： 5' TGAGACTCCATATGCAAGGTCCCACATGGACT 3 ' (SEQ ID NO : 10 ) (其 5 ' 端添加 Nde I识别位点： CATATG ) 以及反向引物： 5' GCGGAATTCTTATGGCGTAGGCGTGGTGCC 3 ' (SEQ ID NO : 11) (其 5 ' 端添力 flEcoR I识别位点： GAATTC ) ， 通过与实施例 2同样的方法， 扩增内切 -1，4- β -木 聚糖酶 0RF编码基因中的 58〜801碱基片段 （对应于内切 -1， 4- β -木聚糖酶 的第 19-272位氨基酸） ， 将其克隆到重组表达载体 pET 28a , 在大肠杆菌 BL21 (DE3)中的表达并纯化表达产物 （以下将该表达产物称为 Xyl7R3 ) ， 通 过与实施例 3同样的方法评价 Xyl7R3的酶活性。

如图 14所示 Xyl7第 19-272位氨基酸片段 （Xyl7R3 ) 的表达量明显高于 Xyl7的表达量， 且能获得高纯度的目的蛋白。 另外， 采用实施例 3标准酶活 测定步骤测定 Xyl7R3的酶活性， 结果比活性为 8775U/mg， 说明其仍然具有 与全长蛋白相当的活性， 且 Xyl7R3与 Xyl7的最适温度和温度耐受性几乎完 全一致。 实施例 5. Xyl7的定向进化

1. xyl7随机突变文库的构建

利用易错 PCR (error-prone PCR)技术构建随机突变文库， 易错 PCR采用 试剂盒 GeneMorph II Random Mutagenesi s Kit , 并按照试剂盒中提供的方 法进行。 并依照试剂盒中的方法在易错 PCR时加入模版 DNA500ng， 调整突变 率至 1个突变位点 /kb。 采用两轮易错 PCR构建突变文库， 每次库容量大概为 4万。 每次对筛选到的突变子都进行复筛， 并对得到的部分突变位点进行点 饱和突变。 2. Xyl7热稳定性提高突变子的筛选和热稳定性测� �

用无菌牙签挑取转化子到含有抗生素和终浓度 ImM IPTG的 LB液体培养 基的 96孔培养板中， 37 °C， 200rpm, 培养过夜后， 离心收集菌体， 加入最 适反应 pH缓冲液 lOOul重悬菌体， 各孔对应的克隆分对照组和处理组各 50ul， 对照组置 4°C保存， 处理组于适宜温度水浴锅处理 2小时， 后每孔加 入 2%木聚糖（xylan)后于 37 °C反应 1小时， DNS法检测酶活， 处理后野生型处 理组约保留对照组的酶活的 10%~20%左右， 此时可对其它克隆进行筛选， 得 到热稳定性相对野生型有增加的突变子。 随后按照实施例 3中的方法对最终 筛选到的突变子进行热稳定性测定。 剩余酶活的计算是指将过夜菌体重悬 后分为两组， 一为对照组， 另一部分为处理组， 前者置 4°C冰箱后者在特定 温度条件下各处理 2h后， 检测后者的酶活， 与对照组相比其酶活力占对照组 酶活力的百分比记为处理组的剩余酶活。

在对野生型进行热稳定性实验后， 发现野生型样品在 52. 5 °C水浴处理 2h后， 处理组酶活约保留对照组酶活的 10%~20%， 符合筛选要求， 在此条件 下对文库中的约 10000个克隆进行筛选后， 得到了 17个经热处理后处理组酶 活仍可保留约为对照组酶活 80%以上的转化子。 为进一步验证这些阳性转化 子对温度的稳定性能力， 对这些克隆又做了两次复筛实验： 一是， 在保持 热处理温度保持 52. 5 °C不变条件下， 将处理时间从 2小时延长至 8小时； 二 是， 热处理时间 2小时不变， 将处理温度从 52. 5 °C提高到 55 °C。 处理后结果 如图 10所示， 从初步筛选得到的 17个阳性克隆中， 进一步得到两个编号为 1-6D7和 1-8B10的克隆， 复筛条件下， 这两个克隆相对野生型和其他阳性克 隆， 在温度稳定性上有明显优势。 突变子 1-6D7在氨基酸序列 223位发生了 突变 K223E ; 突变子 1-8B10在氨基酸序列上 3个位置发生了突变， 分别为 K205E、 K223T和 A386S。

研究这几个突变位点各自对该酶温度稳定性的 影响， 分别构建了各位 点的单突变共 4个克隆， 表达并纯化蛋白后， 对各突变子做热稳定性检测， 如图 11所示，木聚糖酶基因 xyl7突变子 1-6D7 (K223E)、 1-8B10和单突变 K223T克隆在 55 °C保温条件下热稳定性相对野生型及另外两个 单突变克隆 有明显增强， 在 60°C保温条件下有同样的趋势 （结果未显示） ， 观察稳定 性增强的 3个突变子， 发现均在氨基酸序列 223位有突变， 并以突变子 K223T 稳定性增强最明显， 说明氨基酸序列 223位与木聚糖酶 xyl7的酶活稳定性有 重要关系， 对 223位点做了饱和突变， 同时以单突变克隆 K223T为母本做第 二轮易错 PCR， 构建随机突变文库。 对构建的木聚糖酶基因 xyl7的第二轮随 机突变文库和 223K位点饱和突变子建立筛选条件， 以 58°C热处理 2小时为基 础， 随机突变文库筛选了 10000多克隆， 得到了约 20个经 58°C热处理后相对 出发菌株 (K223T)稳定性明显增强的突变子， 这些突变子温度处理后处理组 酶活仍可保持在未经温度处理的对照组的 80%以上。对 xyl7基因氨基酸序列 223K饱和突变克隆进行筛选， 与 223K野生型相比， 亦得到几个热稳定性增 强的突变子， 同第一轮筛选复筛类似， 对这些突变子进行复筛， 分别为 58 °C处理 8小时和 6CTC处理 2小时， 结果可见随机突变文库中筛选到 2个热稳定 性相对出发菌株 xyl7-K223T有明显增强的突变子， 标记为 2-8F12和 2-6B2 ; xyl7-223K饱和突变文库筛选到突变子 xyl7-K223C和 xyl7-K223S热稳定性 相对 xyl7-K223T有明显增强 （图 12 ) 。 以上数据中计算突变子高温处理后 的剩余相对活力是用处理组经温度处理后保留 的相对于未经温度处理的突 变子的相对活力； 饱和突变筛选突变子时则是以构建突变子库的 出发菌株 为对照， 经过同样条件的处理， 若突变子处理后保留的相对活力明显高于 同样处理的出发菌株 （野生型） ， 则认为该突变子相对野生型酶活或热稳 定性有明显提高。

对突变子 2-8F12和 2-6B2测序后发现其除均含有出发亲本的 K223T突变 夕卜， 前者在氨基酸序列 32位有一个 K32T突变， 后者在氨基酸序列 219位有一 个 E219D突变。 对得到突变子的各阳性位点 K32T、 E219D、 K223C和 K223S进 行组合， 构建双突变和三突变的突变子克隆， 并对各克隆蛋白诱导表达和 纯化， 测定木聚糖酶 xyl7野生型及各突变蛋白在 55 °C和 60°C的热稳定性， 得到两个稳定性相对野生型及其它突变克隆有 明显增强的突变子 xyl7-K32T/K223C和 xyl7-K32T/K223S， 从数据可以看出这两个突变子的木 聚糖酶蛋白在 55 °C的半衰期由野生型的约 15分钟左右， 大幅提高到 42小时 以上， 约提高了 250倍， 而在 60°C的半衰期也由 10分钟不到提高到了 150分 钟以上 （图 13 ) 。

此外， 在 Xyl7R3的氨基酸序列上构建了野生型 Xyl7定向进化筛选到的 对酶的稳定性有明显增强作用的几个定点突变 ， 突变子分别命名为 R3-TC (K32T/K223C)和 R3-TS (K32T/K223S)， 如图 15所示这两个突变子在 55 °C的半衰期由野生型的约 10分钟左右， 大幅提高到约 60小时， 约提高了 360 倍， 而在 60°C的半衰期也由 10分钟不到提高到了 120分钟。

在 Xyl7第 19-272位氨基酸片段基础上， 将相对于 SEQ ID NO : 2序列上 第 37位、 第 42位、 第 80位、 第 205位、 第 219位、 第 221位、 第 222位、 第 223 位、 第 228位、 第 386位氨基酸的位点进行取代突变， 相应的突变位点对应 于 SEQ ID NO : 2序列的以上突变位点编号。 突变位点包含以下取代中的一 个或多个： N37D、 S42N, M80I、 K205E, E219D, A221T, M22L, K223M或 K223T、 T228S以及 A386S。 结果显示， 这些突变仍然保留有该酶活性。

在 Xyl7第 19-272位氨基酸片段基础上， 将相对于 SEQ ID NO : 2序列上 第 32位或第 223位氨基酸的位点进行取代突变， 包括单位点突变的 K32T、 K223E、 K223C、 K223S、 K223T, 以及双位点突变的 K32T+K223C、 K32T+K223S。 结果显示， 同 SEQ ID NO : 2序列类似， Xyl7第 19-272位氨基酸片段在进行 这些突变后同样显示出了热稳定性增强的特性 。 实施例 6. Xyl7截短氨基酸片段特性研究

在 Xyl7氨基酸序列 SEQ ID NO : 2基础上， 设计了相对于 SEQ ID NO : 2的 第 19-272氨基酸更短的序列进行表达， 表达序列为 SEQ ID NO： 2的第 19-267 氨基酸，命名为 Xyl7R2。按照实施例 3的"（3)标准酶活测定 "方法测得 Xyl7R2 的酶活为 8560U/mg。 结果表明， R2能检测到活性， 且蛋白表达量很高 （图 16 ) 。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇 文献被单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授 内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改， 这些等价形 式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。