CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo técnico de la Biotecnología y Agricultura, ya que proporciona cepas bacterianas endófitas aislada de Vaccinium corymbosum (arándano azul), mezclas probióticas que comprenden a las cepas bacterianas, formulación y método, para estimular el crecimiento en plantas vegetales, mediante el uso de la formulación, la cual contiene a las cepas bacterianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 2019, SIAP reportó la cantidad de 3786.45 ha sembradas de arándano azul en México, principalmente en los estados de Jalisco, Michoacán, Sinaloa y Puebla, siendo el tratamiento convencional el de mayor superficie sembrada. Sin embargo, Jalisco se encuentra entre los estados que presentan mayor producción de arándano azul con tratamiento orgánico, tanto para nutrición como para control de plagas. Dicho tratamiento reporta mayor valor de producción comparado con el tratamiento convencional, además de que un tratamiento orgánico contribuye a disminuir la contaminación generada por el uso indiscriminado de fertilizantes y plaguicidas químicos.

El uso de microorganismo como biofertilizantes ha surgido como una alternativa no solo por ser amigable con el medio ambiente, sino también como una alternativa para incrementar el rendimiento del cultivo.

Tal es el caso del documento de patente WO2012161 160 (A1 ) que describe las cepas aisladas AT-332 y AT-79, depositadas con el número de depósito NITE BP-1095 y NITE BP-1094, respectivamente; donde dichas cepas corresponden al género Bacillus spp., con una tendencia a estar más relacionadas a B. amyloliquiefaciens. Estas cepas fueron efectivas para controlar una amplia gama de enfermedades y daños causados por nemátodos y son capaces de fomentar el crecimiento de plantas de interés. Por lo tanto, la invención también comprende un agente para el control de enfermedades en plantas; y un promotor del crecimiento del crecimiento de las plantas. Si bien es cierto que el documento

W02012161 160 (A1 ), ya propone el uso de cepas bacterianas aisladas de

Bacillus spp para la promoción del crecimiento vegetal pero se debe tomar en cuenta que estas dos cepas bacterianas fueron aisladas en una región del Japón, por lo qué, tales cepas bacterianas son diferentes a las cepas bacterianas aisladas que propone mi invención que fueron aislada en Jalisco, México. Para un experto en la materia sobre entiende que las características de crecimiento y de invasión de microorganismos están determinadas por su constitución genética y el medio ambiente (región geográfica) en donde desarrollan. Por lo tanto, las cepas bacterianas del documento WO2012161 160 (A1 ) no tendrán la misma efectividad de crecimiento, de invasión y fomento al crecimiento vegetal, si fueran utilizadas en regiones geográficas de México. Es por ello el gran interés en aislar, validar las posibles características antagonistas y de fomento del crecimiento vegetal, de cepas bacterianas endófitas en México, para garantizar una alta efectividad de dichas cepas aisladas.

El documento de patente EP3701796 (A1 ) divulga combinaciones de principios activos, en particular una composición fungicida, que comprenden: (A) fluoxapiprolina y (B) al menos, un agente de control biológico y/o (C) al menos, un compuesto seleccionado entre insecticidas, acañcidas y nematicidas. Las composiciones son útiles para controlar especialmente microorganismos dañinos, en particular oomicetos, en la protección de cultivos, para el control de plagas animales y como reguladores del crecimiento de las plantas. Entre los agentes de control biológico, estos pueden ser seleccionados de una gran cantidad de microorganismos, tales como agentes antibacteñanos y agentes de control biológico que tienen un efecto para mejorar el crecimiento y/o salud de las plantas; y estos pueden ser del género Bacillus spp., Pseudomonas spp., Rizobium spp., entre otros. Dichos agentes de control biológico ya se encuentran en el estado de la técnica y fueron aislados por terceros. Como se puede concluir sobre el documento EP3701796 (A1 ) es que no se trata de una propuesta de nuevas cepas bacterianas endófita, porque donde reside la invención es en la combinación de agentes de control biológico con un ingrediente químico y opcionalmente un agente fungicida. Además, las cepas de Bacillus spp.,

Pseudomonas spp Rizoblum spp. que se proponen son aislada en regiones geográficas fuera de México. Por lo tanto, al igual que las cepas bacterianas del documento W02012161 160 (A1 ) no tendrán la misma efectividad de crecimiento, de invasión y fomento al crecimiento vegetal, si fueran utilizadas en regiones geográficas de México. Es por ello el gran interés en aislar, validar las posibles características antagonistas y de fomento del crecimiento vegetal, de cepas bacterianas endófitas en México, para garantizar una alta efectividad de dichas cepas aisladas.

Por lo tanto, con la finalidad de contribuir a la solución de los inconvenientes antes mencionados, se aislaron cepas bacterianas endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul), las cuales mostraron estimulación en el crecimiento vegetal; por lo que también se desarrollaron mezclas probióticas con dichas cepas endófitas, y formulaciones para estimular el crecimiento de plantas vegetales.

Los detalles característicos de la presente invención, se muestran claramente en la siguiente descripción, ejemplos y figuras, que se acompañan meramente con la finalidad de ¡lustrar algunas realizaciones de la invención, en donde:

La figura 1 es una gráfica donde se ¡lustra el análisis estadístico de la comparación de la desviación estándar de los tratamientos T1 , T14, T 4 y T8, donde se muestra que no hay una diferencia significativa entre estos 4 tratamientos.

La figura 2 es una gráfica que ¡lustra el comportamiento del número de brotes de plantas de Vaccinium corymbosum, (arándano azul), tratadas con una mezcla probiótica de las 4 bacterias endófitas aisladas en esta invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como objeto una cepa aislada de Bacillus mojavensis identificada como B13, la cual comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB191 .

La presente invención también tiene como objeto una cepa aislada de Pseudomonas monteilii identificada como B17, que comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB190.

La presente invención además tiene como objeto una cepa aislada de Rhizoblum radiobacteriden iticada como B37, que comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB189.

Un objeto más de la presente invención es una cepa aislada de Bacillus vallismortis identificada como B43, la cual comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB192.

Las cepas bacterianas, aisladas y depositadas: CM-CNRG TB191 (Bacillus mojavensis), CM-CNRG TB190 (Pseudomonas monteilii), CM-CNRG TB189 (fíhizobium radiobacter), y CM-CNRG TB192 (Bacillus vallismortis), donde dichas cepas bacterianas son endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul); y se encontró que dichas cepas bacterianas exhiben actividad estimulante en el crecimiento de plantas vegetales, por ejemplo en plantas vegetales de la familia Ericaceae, específicamente en plantas del género Vaccinium, y más específicamente en plantas que pertenecen a la especie Vaccinium corymbosum.

Otro objeto de la presente invención es una mezcla probiótica, la cual puede comprender, al menos, dos cepas bacterianas aisladas, de conformidad con las cepas bacterianas de la presente invención. Un objeto más de la invención en cuestión es una formulación para estimular el crecimiento en plantas vegetales, la cual puede comprender: al menos, una cepa bacteriana aislada, la cual es seleccionada del siguiente grupo de cepas depositadas: CM-CNRG TB191 (Bacillus mojavensis), CM-CNRG TB190 (Pseudomonas monteilii), CM-CNRG TB189 (fíhizobium radiobacter), y CM- CNRG TB192 (Bacillus vallismortis), y sus posibles mezclas entre ellas; al menos, una sustancia prebiótica; y al menos, un diluyente.

En una realización de la formulación para estimular el crecimiento en plantas vegetales, es cuando la cepa bacteriana, ya sea individual o mezclada está en una cantidad de 0.01 %, la sustancia prebiótica en un 4.99%, y el diluyente en un 95.0%, con respecto al volumen total de la formulación.

La presente invención también tiene como objeto un método para estimular el crecimiento de plantas vegetales, el cual comprende, aplicar a plantas vegetales, una cantidad suficiente de una formulación para estimular el crecimiento de plantas vegetales, de conformidad con la presente invención.

Una variante del método para estimular el crecimiento en plantas vegetales, es cuando la cantidad suficiente de la formulación es de 1 L por cada 4,166 plantas vegetales de la especie Vaccinium corymbosum.

Una realización más del método en cuestión, es cuando la aplicación de la formulación es en la etapa vegetativa de las plantas vegetales.

Una realización más de dicho método para estimular el crecimiento en plantas vegetales, es cuando las plantas vegetales son de la familia Ericaceae, preferentemente del género Vaccinium; y más preferentemente de la especie Vaccinium corymbosum. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen con única finalidad de demostrar la concepción de la presente invención y de algunas realizaciones preferentes, por lo que no deberán ser considerados como una limitante para los alcances de protección de la presente invención.

Ejemplo 1 . Aislamientos de cepas bactrianas endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul).

Se estableció un estudio de simbiosis en diferentes regiones del estado de Jalisco, entre los meses de septiembre de 2020 a julio del 2021 , con la finalidad de evaluar el potencial de cepas bacterianas en la fijación de N2, producción de amonio y producción de auxinas. Las cepas se aislaron de Vaccinium corymbosum, (arándano azul) utilizando el método de extracción de endófitos, los tejidos de donde se aislaron las cepas fueron en hojas, tallo, raíz, flor y fruto debido a que en la literatura se ha encontrado que estas cepas se concentran ahí.

Se seleccionaron un total de 4 cepas que correspondieron los géneros Bacillus (2 cepas), Pseudomonas (1 cepa) y Rhizobium (1 cepa) de un total de 145 cepas aisladas, porque estas 4 cepas mostraron mayor fijación de N, producción de amonio, más obtención de micronuthentes como el Fe, además de la mayor producción de hormonas de crecimiento vegetal como auxinas, funciones de anti-estrés mediante la producción de las enzimas Catalasas, Oxidasas y la síntesis de Amino Ciclopropano Carboxílico desaminasa (ACCd), funciones de antagonismo contra hongo fitopatógenos, gracias a la capacidad de las cepas de producir ácido cianhídrico (precursor de moléculas antifúngicas), así como producir proteasas y quitinasas, enzimas que atacan la pared celular fúngica.

Específicamente, las 4 cepas bacterianas fueron seleccionadas porque presentaron las siguientes actividades: - Bacillus mojavensis B13 (Firmicutes), fue seleccionada porque fija nitrógeno, síntesis de Amino Ciclopropano Carboxílico desaminasa (ACCd), produce sideróforos, auxinas, catalasas, oxidasas, ácido cianhídrico, amilasas, proteasas y quitinasas.

- Pseudomonas monteilü B17 (Proteobacteria), fue seleccionada porque mostró ser capaz de fijar nitrógeno, síntesis de Amino Ciclopropano Carboxílico desaminasa (ACCd), produce sideróforos, oxidasas, catalasas, amonio y quitinasas.

- Rhizoblum radiobacter B37 (Proteobacteria) fue seleccionada porque por su habilidad de fijar nitrógeno, síntesis de Amino Ciclopropano Carboxílico desaminasa (ACCd), produce sideróforos, oxidasas, ácido cianhídrico, quitinasas y de todas es la que produce mayor cantidad de auxinas.

- Bacillus vallismortis B43 (Firmicutes), fue seleccionada porque fija nitrógeno, síntesis de Amino Ciclopropano Carboxílico desaminasa (ACCd), produce sideróforos, produce oxidasas, catalasas, ácido cianhídrico, amilasas, quitinasas y es la que produce mayor cantidad de proteasas.

Ejemplo 2. Evaluación agronómica de las cepas endófitas aisladas y seleccionadas en combinanción de diferentes tratamientos.

Para determinar la eficacia de las 4 cepas aislada y seleccionadas, se realizó un experimento en campo en el cual se probaron los siguientes tratamientos, que se muestran en la tabla 1 .

Cada tratamiento fue probado en un túnel que tiene alrededor de 100 plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul), a cada planta fue inoculada con 100 mL de su respectivo tratamiento que se depositó en la base de la planta. En total se realizaron 3 aplicaciones de dichos tratamientos en un periodo de tres semanas, es decir, se realizó una aplicación por semana. Se marcaron 10 plantas al azar por cada tratamiento, a las cuales se les contaron el número de brotes antes de iniciar la aplicación del tratamiento y una semana después de terminar las 3 aplicación de los tratamientos. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2.

Tabla 1 . Tratamientos utilizados.

A las bacterias de los tratamientos T1 a T14, de la tabla 1 , se mezclaron con 29 mL de un medio prebiótico, y se diluyeron en 14.970 mL de agua.

Como se puede observar en los resultados obtenidos, el tratamiento que presento el mayor número de brotes fue el tratamiento T1 (1 mL de la cepa bacteriana B13), por lo que se puede decir que fue la de mayor eficacia con un total de 25.7 brotes nuevos en promedio; seguido del tratamiento T4 (1 mL de B43) y el tratamiento T8 (B17:B37) con un total de 21.8 y 15.3 brotes promedio. Los peores tratamientos fueron el tratamiento 5 y el tratamiento 15 con un total de 4.2 brotes promedio en ambos casos. Si bien, el tratamiento que corresponde a la mezcla de las cuatro cepas (tratamiento 14) no fue el mejor (13 brotes nuevos en promedio), sin embargo está dentro de los cuatro mejores tratamientos.

Tabla 2. Número de brotes promedio iniciales, finales y totales de cada tratamiento.

Además al correr un análisis estadístico de los mejores tratamientos (T1 , T4 y T8) contra el tratamiento 14, se observa que no presenta una diferencia significativa entre ellos, como se muestra en la figura 1 .

A continuación, en las figuras de la 3 a la 17, se muestran las imágenes del antes y después de las plantas que fueron tratadas con todos los tratamientos.

Ejemplo 3. Pruebas de inducción de crecimiento ex vitro de la mezcla de las cuatro cepas. Con la finalidad averiguar el comportamiento real de la mezcla de las cuatro cepas endófitas aislada se realizó una prueba de inducción de crecimiento ex vitro entre la mezcla de las cuatro cepas y el testigo. Para ello se preparó una mezcla de las cepas B13:B17:B37:B43 y se mezclaron en una relación 1 :0.5:0.5:1 y se mezclaron con 29 mL de un medio prebiótico, y se diluyeron en 14,970 mL de agua. Se realizaron 3 aplicaciones del producto en un periodo de 3 semanas dividiendo el predio mediante distribución de túneles. Donde a los túneles 1 y 2 no se les aplicó tratamiento; y los túneles 5 y 6 sí se les aplicó el tratamiento de la mezcla de las bacterias.

Se realizaron 2 muéstreos de 10 plantas por túnel y se procedió a medir el número de brotes nuevos de las plantas antes y después de la aplicación de nuestra formulación. Como control, se dejaron 20 plantas separadas en 2 túneles (túnel 1 y 2), donde no hubo aplicación de producto, dejando únicamente los tratamientos convencionales utilizados normalmente.

En la figura 2 se puede observar que las plantas tratadas con la mezcla probiótica tuvieron un incremento del número de brotes después de dos semanas de aplicar el tratamiento convencional en las plantas. En promedio, hay un incremento de 12.35 brotes por planta, lo cual es un resultado similar a arrojado en el ejemplo 2.

DEPÓSITO DE LAS CEPAS BACTERIANAS AISLADAS

Al ver que las cepas bacterianas aisladas Bacillus mojavensis identificada como B13, Pseudomonas monteilii identificada como B17, Rhizobium radiobacter identificada como B37, y Bacillus vallismortis identificada como B43, tienen potencial agronómico, se procedió a depositarlas el 21 de enero de 2022, en la Colección de Microorganismos del Centro Nacional de recursos Genéticos que pertenece al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, con número de registro ante la World Federation of Culture Collection 1006 (CM-CNRG) y Autoridad Depositaría Internacional con notificación 308 con fines de procedimiento de patente conforme al Tratado de Budapest; y que tiene su domicilio en Boulevard de la Biodiversidad 400, C. P. 47600. Tepatitlán de Morelos, Jalisco, México. La cepa bacteriana Bacillus mojavensis identificada como B13 le correspondió el número de depósito CM-CNRG TB191 , la cepa Pseudomonas monteilii identificada como B17 fue depositada con el número CM- CNRG TB190, la cepa Rhizoblum radiobacteridentificada como B37 depositada con el acceso CM-CNRG TB189, y la cepa Bacillus vallismortis identificada como B43 se depositó con el número CM-CNRG TB192.