ZHANG DONGZHU (CN)
ZHANG XUELI (CN)
ZHANG DONGZHU (CN)
| WO2008119009A2 | 2008-10-02 | |||
| WO2010059616A2 | 2010-05-27 |
| CN103045528A | 2013-04-17 | |||
| CN101974476A | 2011-02-16 | |||
| CN102329765A | 2012-01-25 |
北京纪凯知识产权代理有限公司 (CN)
| 权利要求 1、 一种生产 DL-丙氨酸的工程菌， 其特征在于： 是将出发细菌染色体 上的乳酸脱氢酶基因、 丙酮酸甲酸裂解酶基因、 乙醇脱氢酶基因、 乙酸激 酶基因、 富马酸还原酶基因、 丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因 灭活；且其染色体上整合了外源的 L-丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消 旋酶基因， 筛选得到生产 DL-丙氨酸的工程菌。 2、 根据权利要求 1 所述的工程菌， 其特征在于： 所述出发细菌为大 肠埃希氏菌（^cAer ^ a coli )； 所述灭活的方法为敲除、 插入突变、 或利用小 RNA干扰所述基因的表达。 3、 根据权利要求 1或 2所述的工程菌， 其特征在于： 所述外源的 L - 丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆菌； 所述外源的丙氨酸消旋酶 基因来自于枯草芽孢杆菌。 4、 根据权利要求 3 所述的工程菌， 其特征在于： 所述外源的丙氨酸 消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌 168 5、 根据权利要求 4所述的工程菌， 其特征在于： 生产 DL-丙氨酸工程 菌的构建方法包括以大肠埃希氏菌 coli ) XZ-A26 CGMCC No. 4036为出发菌株， 将外源的丙氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体的 甲基乙二醛合成酶基因位点， 并用人工调控元件 Ml- 93对外源的丙氨酸消 旋酶基因的表达进行调控； 所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表 中序列 14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列为自序列表中序列 15的 5 ' 端第 495-953位核苷酸； 所述人工调控元件 Ml- 93的序列为序列表中序列 17。 6、 根据权利要求 5所述的工程菌， 其特征在于： 该生产 DL-丙氨酸的 工程菌是通过以下操作步骤构建得到； 1 ) 构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA上游片段、 氯霉素 基因、 果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基因 mgsA下游片段组 成的 DNA片段 I， 将 DNA片段 I电激转化带有 pKD46质粒的大肠埃希氏菌 XZ-A26 CGMCC No. 4036, 筛选氯霉素抗性的菌落， 并用序列为 SEQ ID NO: 3的 DNA片段和序列 SEQ ID NO: 4的 DNA片段组成的引物对鉴定， 获得扩 增产物为 411 1bp的菌株， 命名为 XZ-A27 ; DNA片段 I的获得方法如下所 示： 将以大肠杆菌 ATCC 8739的基因组基因为模板， 以 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的引物对为引物扩增得到的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA 及其上下游片段， 将扩增得到的产物克隆至 pEASY- Blunt克隆载体上， 获 得卡那霉素抗性质粒 pXZ- A19; 用 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示的 DNA片段为引物以 pXZ- A19为模板扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖 蔗糖转移酶基因的 DNA片段连接得到质粒 pXZ- A20， 用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的 DNA片段为引物， 以 pXZ- A20质粒 DNA为模板， 扩增 出 DNA片段 I； 其中， 含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的 DNA片 段的获得方法是以 PL0I4162为模板， 以 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8 所示的引物对为引物扩增得到的 DNA片段； 2 )构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA上游臂、7ac/基因、 ire启动子、 枯草芽孢杆菌 168的丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶 基因 mgsA下游臂组成的 DNA片段 I I； 将 DNA片段 I I电激转化带有 pKD46 质粒的 XZ-A27 , 用含有蔗糖不含氯化钠的 LB培养基培养， 并筛选用序列 为 SEQ ID NO: 3的 DNA片段和序列 SEQ ID NO: 4的 DNA片段组成的引物 对鉴定扩增产物为 4210bp的菌株； 命名为 XZ-A28; DNA片段 II的获得方 法如下所示： 以枯草芽孢杆菌 168为模板， 以 SEQ ID N0: 1和 SEQ ID N0: 2为引物扩增得到的丙氨酸消旋酶基因片段插入到扩 pTrc99A质粒的 Xbal 和 Sail酶切位点之间， 获得质粒 Trc99A-alaR; 用 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示的 DNA片段为引物以 pXZ- A19为模板扩增的产物与扩增序列 如 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10所示引物对扩增质粒 pTrc99A- alaR的 7^/基因和 trc 启动子以及丙氨酸消旋酶基因 alaR 连接得到质粒 PXZ-A21 , 用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的 DNA片段为引物， 以 pXZ- A21质粒 DNA为模板， 扩增出 DNA片段 I I； 3 )构建 DNA片段 II I ; DNA片段 III电激转化带有 pKD46质粒的 XZ- A28， 用序列为 SEQ ID NO: 11的 DNA片段和序列 SEQ ID NO: 13的 DNA片段组 成的引物对鉴定， 获得扩增产物为 1890bp的菌株， 即为生产 DL-丙氨酸的 工程菌； DNA片段 III的序列为序列表中序列 16。 7、 根据权利要求 6所述的工程菌， 其特征在于： 所述生产 DL-丙氨酸 的工程菌为大肠埃希氏菌（^sc^r c^ia coli ) XZ-A30, 其在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No. 6667。 8、权利要求 1-6中任意一项所述的工程菌在生产 DL-丙氨酸中的应用。 9、一种生产 DL-丙氨酸的方法， 是在厌氧或有氧培养条件下， 控制培 养温度为 30〜42°C， pH为 6. 5〜7. 5， 发酵培养权利要求 1-7中任意一项 所述的工程菌， 分离提取 DL-丙氨酸。 10、 根据权利要求 9所述的方法， 其特征在于： 发酵培养的培养基中 由糖类原料、氮源和微量无机盐组成， 其中， 糖类原料选自葡萄糖、蔗糖、 果糖、 木糖、 麦芽糖、 乳糖、 半乳糖、 木薯、 玉米、 甜菜、 木质纤维素或 其水解物和糖浆中的一种或两种以上任意组合； 氮源为无机含氮化合物， 选自氯化铵、 乙酸铵、 硫酸铵和磷酸铵中的一种或两种以上任意组合； 微 量无机盐选自可溶性的铁盐、 钴盐、 铜盐、 锌盐、 锰盐和钼酸盐中的一种 或两种以上任意组合。 11、 根据权利要求 10所述的方法， 其特征在于： 所述培养基优选由 葡萄糖 120g/L,氯化铵 4g/L, NaH2P045g/L, Na2HP045g/L, MgS04 ·7Η20 lg/L, CaCl2 2H20 0. lg/L和微量无机盐 ½1/L组成， 其中， 微量无机盐组成为： FeCl3 · 6H20 1. 5mg, CoCl2 · 6¾0 0. lmg， CuCl2 · 2H20 0. lmg， ZnCl2 0. lmg, Na2Mo04 · 2H20 0. lmg, MnCl2 · 4H202 0. 2mg , 蒸馏水定容至 1L, 过滤除菌。 12、 根据权利要求 9-11 中任意一项所述的方法， 其特征在于： 所述 发酵培养的时间为 40-60小时； 13、 根据权利要求 12 所述的方法， 其特征在于： 所述发酵培养前还 包括将所述工程菌进行种子培养， 所述种子培养的条件为 30°C， 摇床转速 为 50转 /分， 培养 18 小时。 |
本发明涉及 DL-丙氨酸生产领域， 具体涉及一种生产 DL-丙氨酸及利 用该工程菌生产 DL-丙氨酸的方法。
背景技术
DL-丙氨酸主要用于食品加工业， 用作营养增补剂及调味料， 具有良 好的鲜味， 可以增强调味料的调味效果。 其次用于医药工业， 用于合成一 些农药、 医药和医药中间体。
目前， DL-丙氨酸的生产主要是通过酶催化技术 （丙氨酸消旋酶） 或 化学消旋法来生产， 而化学消旋法因需要以有机酸为溶剂， 存在着污染环 境和收率偏低等缺点， 因此逐渐被淘汰。 酶催化技术是先将葡萄糖发酵生 成 L-丙氨酸， 再将 L-丙氨酸通过酶催化转化成 D-丙氨酸， 在该方案中， DL -丙氨酸积累量为 30〜50g/L， 产率偏低， 且生产周期长； 其次， 需要对 菌株进行高密度培养以分泌生产 DL-丙氨酸所需的丙氨酸消旋酶， 该过程 对氧气的需求量大； 另外， 由于丙氨酸消旋酶基因是克隆在质粒上进行高 表达的， 因此在菌株培养过程中， 需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传 复制。 因此该方案也不易实现工业化生产。
发明公开
本发明的首要目的是提供一种生产 DL-丙氨酸的工程菌， 该工程菌可 利用葡萄糖直接生产 DL-丙氨酸， 且生产周期短、 DL-丙氨酸的产率高。
为实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案： 该生产 DL-丙氨酸的 工程菌， 是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、 丙酮酸甲酸裂解酶基 因、 乙醇脱氢酶基因、 乙酸激酶基因、 富马酸还原酶基因、 丙氨酸消旋酶 基因、 甲基乙二醛合成酶基因灭活； 且其染色体上整合了外源的 L-丙氨酸 脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因， 筛选得到生产 DL-丙氨酸的工程 菌。 所述灭活的方法为敲除、 插入突变、 或利用小 RNA干扰所述基因的表 达。
由于细菌在代谢过程中进行 L-丙氨酸合成代谢，因此上述限定的方案 可在常用所有细菌中实现， 本身申请中优选选用大肠埃希氏菌 {Escherichia coli ) (统称大肠杆菌） 作为生产 DL-丙氨酸的工程菌的构 建细菌。
所述外源的 L-丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆 ；所述外 源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌， 优选来源于枯草芽孢杆菌 168； 丙氨酸消旋酶的失活主要是指大肠杆菌自身的 丙氨酸消旋酶 （DadX) 基因被敲除。
上述构建方案中直接将 alaR基因整合到生产 L-丙氨酸的大肠埃希氏 袁 Escherichia coli ) XZ- A26菌株 （CN 102329765 A) 内。 XZ- A26菌株 于 2010年 7月 26日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号， 中国 科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 其保藏号为 CGMCC No. 4036。 XZ-A26菌株中的乳酸脱氢酶、 丙酮酸甲酸裂 解酶、 乙醇脱氢酶、 乙酸激酶、 富马酸还原酶、 丙氨酸消旋酶均已被失活 且其染色体上已经整合了外源的 L-丙氨酸脱氢酶基因， 因此只需要在 XZ-A26菌株染色体上整合外源丙氨酸消旋酶基因 ，并敲除甲基乙二醛合成 酶基因即可。 若用原始的细菌构建本发明中生产 DL-丙氨酸工程菌， 可采 用敲除细菌自身染色体上的乳酸脱氢酶基因、 丙酮酸甲酸裂解酶基因、 乙 醇脱氢酶基因、 乙酸激酶基因、 富马酸还原酶基因、 丙氨酸消旋酶基因、 甲基乙二醛合成酶基因，并整合外源的 L-丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶基 因来达到相同效果， 敲除和整合上述基因的方法可按照名称为 "一种高产 L-丙氨酸的 XZ-A26菌株及构建方法与应用" （CN 102329765 A) 的中国 专利文件中所记载的技术方案进行实施。
本发明生产 DL-丙氨酸工程菌的构建方法具体包括以大肠埃 希氏菌 (Escherichia coli ) XZ-A26 CGMCC No. 4036为出发菌株， 并将外源的丙 氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体上的甲基 乙二醛合成酶基因位点。 所 述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表中 序列 14，所述甲基乙二醛合 成酶基因的序列为自序列表中序列 15的 5 ' 端第 495-953位核苷酸；所述 人工调控元件 M1-93的序列为序列表中序列 17。
本发明生产 DL-丙氨酸的工程菌是通过以下操作步骤构建得 到； ( a ) 丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合： 1 ) 构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA上游臂、 氯霉素基 因、 果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基 因 mgsA下游臂组成的 DNA片段 I，将 DNA片段 I电激转化带有 pKD46质粒的大肠埃希氏菌 XZ- A26 CGMCC No. 4036, 筛选氯霉素抗性的菌落， 并用序列为 SEQ ID NO: 3的 DNA 片段和序列 SEQ ID NO: 4的 DNA片段组成的引物对鉴定， 获得扩增产物 为 4111bp的菌株， 命名为 XZ-A27;
2 )构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA上游臂、7^/基因、 ire启动子、枯草芽孢杆菌 168的丙氨酸消旋酶基因 a A "和甲基乙二醛合 成酶基因 mgsA下游臂组成的 DNA片段 II； 将 DNA片段 I I 电激转化带有 pKD46质粒的 XZ-A27, 用含有蔗糖不含氯化钠的 LB培养基培养， 并筛选 用序列为 SEQ ID NO: 3的 DNA片段和序列 SEQ ID NO: 4的 DNA片段组成 的引物对鉴定扩增产物为 4210bp的菌株； 命名为 XZ-A28;
(b) 丙氨酸消旋酶基因 alaR的调控-
3 )构建 DNA片段 III ; DNA片段 III电激转化带有 pKD46质粒的 XZ- A28， 用序列为 SEQ ID NO: 11的 DNA片段和序列 SEQ ID NO: 13的 DNA片段组 成的引物对鉴定， 获得扩增产物为 1890bp的菌株， 即为生产 DL-丙氨酸的 工程菌；
其中，更具体的， DNA片段 I的获得方法如下所示：将以大肠杆菌 ATCC 8739的基因组 DNA为模板， 以 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的引物 对为引物扩增得到的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA及其上下游片段， 将扩 增得到的产物克隆至 pEASY- Blunt 克隆载体上， 获得卡那霉素抗性质粒 pXZ- A19;用 SEQ ID N0: 5和 SEQ ID NO: 6所示的 DNA片段为引物以 pXZ- A19 为模板扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖 蔗糖转移酶基因的 DNA片段 连接得到质粒 pXZ- A20, 用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的 DNA片 段为引物， 以 pXZ- A20质粒 DNA为模板， 扩增出 DNA片段 I； 其中， 含有 氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的 DNA片段的获得方法是以 PL0I4162 质粒为模板， 以 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8所示的引物对为引物扩增 得到的 DNA片段；
DNA片段 II的获得方法如下所示：以枯草芽孢杆菌 168基因组 DNA为 模板， 以 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO : 2为引物扩增得到的丙氨酸消旋酶 基因片段插入到 P Trc99A质粒的 Xbal 和 Sai l 酶切位点之间， 获得质粒 P Trc99A-alaR ; 用 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示的 DNA片段为引物 以 pXZ- A19为模板扩增的产物与以 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10所示 引物以 P Trc99A- alaR为模板扩增的产物连接得到质粒 pXZ-A21，用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示的 DNA片段为引物， 以 pXZ-A21质粒 DNA为模 板， 扩增出 DNA片段 I I；
DNA片段 I I I的获得方法如下所示： 以重组大肠杆菌菌株 Ml- 93 的基 因组 DNA为模板， 以序列如 SEQ ID NO: 1 1和 SEQ ID NO : 12所示的 DNA 片段为引物， 扩增得到 DNA片段 I I I (序列如序列表中序列 16所示） 。
更为具体的方案为， 该生产 DL-丙氨酸的工程菌为大肠埃希氏菌 ( Escherichia coli) XZ-A30菌株， 已于 2012年 10月 12日保藏在位于 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所的中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC) ， 保藏编号为： CGMCC No. 6667。 其具有发酵产生高浓度 DL-丙氨酸的能力， 且 D-丙氨酸和 L-丙 氨酸的光学纯度比例是 50: 50。
如图 1所示， 本申请中， 通过在工程菌染色体上整合了外源的 L-丙氨 酸脱氢酶基因， 从而将糖酵解的中间物丙酮酸转化为 L-丙氨酸； 再进一步 的整合外源丙氨酸消旋酶基因， 将部分 L-丙氨酸转化为 D-丙氨酸。 从而 实现由糖原料一步生产 DL-丙氨酸， 减小 DL-丙氨酸的生产周期； 同时对 工程菌自身的乳酸脱氢酶、 甲基乙二醛合成酶、 丙酮酸甲酸裂解酶、 乙醇 脱氢酶、 乙酸激酶、 富马酸还原酶均被失活， 避免代谢过程中副产物乳酸、 甲酸、 乙醇、 乙酸、 丁二酸的合成， 使得原料糖按照限定的途径进行代谢 合成 DL-丙氨酸， 提高 DL-丙氨酸的产率。 这里所指的 DL-丙氨酸是指 D - 丙氨酸和 L-丙氨酸。 引入外源丙氨酸消旋酶基因主要是保证生成 L-丙氨 酸能够有一半转化为 D-丙氨酸， 使得发酵得到的产物中 L-丙氨酸与 D -丙 氨酸光学纯度比为 50: 50， 以满足产品的生产需求。
本发明的另一个目的是提供一种利用该工程菌 生产 DL-丙氨酸的方 法， 其釆取的方案为：
一种生产 DL-丙氨酸的方法，在厌氧 /有氧培养条件，培养温度为 30〜 42°C， 控制 pH在 6. 5〜7. 5， 发酵培养上述构建的生产 DL-丙氨酸的工程 菌菌株， 分离提取 DL-丙氨酸。
发酵培养的培养基中由糖类原料、 氮源和微量无机盐组成， 其中， 糖 类原料选自葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 木糖、 麦芽糖、 乳糖、 半乳糖、 木薯、 玉米、甜菜、木质纤维素或其水解物和糖浆中 的一种或两种以上任意组合; 氮源为无机含氮化合物， 选自氯化铵、 乙酸铵、 硫酸铵和磷酸铵中的一种 或两种以上任意组合； 微量无机盐选自可溶性的铁盐、 钴盐、铜盐、锌盐、 锰盐和钼酸盐中的一种或两种以上任意组合； 所述培养基优选由葡萄糖 120g/L， 氯化铵 4g/L， Na¾P0 4 5g/L， Na 2 HP0 4 5g/L， MgS0 4 · 7H 2 0 lg/L, CaCl 2 2H 2 0 0. lg/L和微量无机盐 ½1/L组成， 其中， 微量无机盐组成为： FeCl 3 · 6H 2 0 1. 5mg， CoCl 2 · 6H 2 0 0. lmg， CuCl 2 · 2H 2 0 0. lrag, ZnCl 2 0. lmg, Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 0. lmg, MnCl 2 · 4H 2 0 2 0. 2mg, 蒸馏水定容至 1L， 过滤除菌。
所述发酵培养的时间为 40- 60小时； 所述发酵培养前还包括将所述工 程菌进行种子培养，所述种子培养的条件为 30°C ,摇床转速为 50r/min ( 50 转 /分） ， 培养 18 h。
附图说明
图 1为生产 DL-丙氨酸的工程菌代谢途径。
图 2为质粒 PXZ-A19的示意图。
图 3为质粒 pXZ- A20的示意图。
图 4为质粒 PXZ-A21的示意图。
图 5为 XZ-A30菌株发酵液的高效液相色谱仪测得的组分 图谱。
实施发明的最佳方式
以下实施例是对本发明进一步的说明，并不构 成对本发明实质内容的 限制。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。 下 述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 其中实施例 1是构建该生产 DL-丙氨酸的工程菌的实施例，实施例 2〜5是利 用实施例 1中构建的工程菌生产 DL-丙氨酸的实施例，实施例 2〜5所使用的 分析方法为： 使用安捷伦 （Agi lent- 1200) 高效液相色谱仪对发酵液中的 组分进行测定； DL-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐 （Daciel ) 公司 的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱 （Chiralpak MA(+) ) ； 发酵液 中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐 （Biorad) 公司的 Aminex HPX - 87H 糖分析柱。 其中实施例 2〜5中所得发酵液的组分含量高效液相色谱仪 定 的结果如附图 5所示。 下述实施例中以!) -丙氨酸和 L-丙氨酸为标准品采用 外标法 （标准曲线法） 进行定量。
实施例 1 XZ- A30菌株的构建
XZ - A30菌株构建包括 （a) 、 (b ) 两操作步骤， 具体操作如下： (a) 丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合
丙氨酸消旋酶基因 alaR的克隆和整合， 分为以下两个步骤：
(al ) alaR基因的克隆
以枯草芽孢杆菌 168 (Moszer I, Jones LM， Moreira S， Fabry C， Danchin A. SubtiList: the reference database for the Bacillus subtilis genome. Nucleic Acids Res. 2002, 30 (1) : 62- 65.公众可从安 徽华恒生物工程有限公司获得） 的基因组 DNA 为模板， 使用引物 alaR up-Xbal/alaR down-Sail , 扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因 alaR (序列 14) 。 引物序列为：
alaR up-Xbal : GGAGAGTCTAGAATGAGCACAAAACCTTT ( SEQ ID NO: 1 ) ； alaR down-Sail : CGCTGCGTCGACTTAATTGCTTATATTTACC ( SEQ ID NO: 2) 。
扩增体系为： Stratagene PfuUltra 10Xbuffer 5ul、 dNTP (10 mM each dNTP) lul、 DNA模板 20ng、 引物 ( lOuM) lul、 PfuUltra (2. 5 U/ul) lul、 蒸馏水 40ul，总体积为 50ul。扩增条件为 95°C预变性 2分钟（1个循环）； 95°C变性 30秒、 55°C退火 30秒、 72°C延伸 2分钟 （30个循环） ； 72°C延 伸 10分钟（1个循环）。扩增产物克隆到 pTrc99A质粒（Amann, E.， Ochs, B. and Abel, K. J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli. Gene. 1988， 69 : 301-15. 公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得） 的 Xbal和 Sail酶切位点， 获得质粒 pTrc99A-alaR。
其中， 克隆步骤为： 将以引物 alaR up-Xbal/alaR down- Sail扩增获 得的 alaR基因的 PCR片段进行清洗纯化， 获得含有 alaR基因的 DNA片段 ( 1192bp, 含有序列 14及引物 1和 2引入的序列） 。 酶切体系为： 0. 2 μ g 的 alaR DNA片段， 2 μ 1 10* FastDigest Green buffer ( Thermo Scientific 公司）， 1 μ 1 FastDigest Xbal (Thermo Scientific公司）， 1 μ 1 FastDigest Sail ( Thermo Scientific公司） ， 补充蒸馏水至 20 μ 1， 37°C温浴 10分 钟。 然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有 alaR (序列 14) 的 DNA片段。 质粒 pTrc99A的酶切体系： 1 μ g 的质粒 pTrc99A， 2 μ 1 10* FastDigest Green buffer ( Thermo Scientific公司 ) , 1 μ 1 FastDigest Xbal (Thermo Scientific公司) ， 1 μ 1 FastDigest Sail (Thermo Scientific公司) ， 补充蒸馏水至 20 μ 1， 37°C温浴 10分钟。 然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好 的含有 pTrc99A的 DNA片段。 连接体系： 10ng酶切回收的 pTrc99A片段， 20ng alaR的 DNA片段， 2 μ 1 Quick Ligation Reaction Buffer, 加蒸馏 水补充至 10 μ 1， 然后加 0. 5 μ 1 Quick Τ4 DNA Ligase , 25。C放置 10分 钟， 取 5 μ 1加入 50 μ 1 Transl-Tl感受态细胞中 （购自北京全式金生物 技术有限公司） ， 冰浴 30分钟。 42Ό热激 30秒， 立即置于冰上 2分钟。 加入 250 μ 1 LB培养基， 200rpm, 37°C孵育 1小时。 取 200 μ 1菌液涂在 含有氨苄青霉素 （终浓度为 lOOug/ml ) 的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒 （将 alaR DNA片段克隆到 pTrc99A中的质粒） 进行测序验证， 测序结果在酶切后的 pTrc99A质粒中连接上了含有 alaR的 DNA片段， 证明质粒构建正确， 质粒 命名为 pTrc99A- alaR。
(a2 )将 alaR基因整合到 L-丙氨酸生产菌 XZ- A26染色体的甲基乙二 醛合成酶基因 mgsA处
将 alaR基因整合到 L-丙氨酸生产菌 XZ- A26 CGMCC No. 4036 (专利公 告号为 CN102329765A, 安徽华恒生物工程有限公司）染色体的甲基乙 二醛 合成酶基因 mgsA处， 分为以下六步：
第一步， 以大肠杆菌 ATCC 8739 (Zhang X, Jantama K, Shanmugam KT, Ingram LO. Re- Engineering Escherichia coli for succinate production in mineral salts medium. Appl Environ Microbiol. 2009, 75(24) :7807-7813,公众可从安徽华恒生物工程有限公司 得）基因组 DNA 为模板， 使用引物 mgsA- up/mgsA- down, 扩增大肠杆菌 ATCC 8739的甲基 乙二醛合成酶基因 mgsA (GeneID:6064585) 及上下游 400 bp左右碱基。 引物序列为：
mgsA-up: CAGCTCATCA ACCAGGTCAA (SEQ ID NO: 3) ； mgsA-down: AAAAGCCGTC ACGTTATTGG (SEQ ID NO: 4) 。 扩增体系为： NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液 10 μ 1、 dNTP (每 种 dNTP各 10 mM) 各 1 μ 1、 DNA模板 20ng、 引物（10μΜ) 2μ 1、 Phusion High- Fidelity DNA聚合酶 （2·5 υ/μ1) 0.5μ 1、 蒸馏水 33.5μ 1， 总体 积为 50μ 1。扩增条件为 98Ό预变性 2分钟（1个循环）； 98°C变性 10秒、 59°C退火 10秒、 72°C延伸 1分钟 30秒（30个循环）； 72°C延伸 5分钟（1 个循环） . PCR扩增得到的产物为如序列 15所示的 DNA片段， 该片段包括 了甲基乙二醛合成酶基因（自序列表中序列 15的 5' 端第 495-953位核苷 酸）及该基因的上游 400 bp左右片段（自序列表中序列 15的 5' 端第 1-494 位核苷酸） 和该基因的下游 400 bp左右片段 （自序列表中序列 15的 5' 端第 954-1435位核苷酸）。将扩增产物克隆到 pEASY-Blunt克隆载体（购 自北京全式金生物技术有限公司） 上。 克隆体系为： ΐμ ΐ PCR扩增产物、 Ιμ ΐ pEASY-Blunt 克隆载体， 轻轻混合、 室温反应 5 分钟后加入 50μ 1 Transl-Tl感受态细胞中 （购自北京全式金生物技术有限公司） ， 冰浴 30 分钟。 42°C热激 30秒， 立即至于冰上 2分钟。 加入 250μ 1 LB培养基， 200rpm, 37°C孵育 1小时。 取 200μ 1菌液涂在含有卡那霉素 （终浓度为 15 ug/ml) 的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳性克 隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果表明在载体 pEASY-Blunt上插入了甲基乙二醛合成酶基因及上 游 400 bp左右碱基片 段， 证明质粒构建正确， 将得到的重组质粒命名为 PXZ-A19 (图 2) 。
第二步， 以 pXZ- A19质粒 DNA为模板， 使用引物 mgsA- 1/ mgsA- 3扩 增出一段 DNA片段， 引物序列为：
mgsA-1: AGCGTTATCT CGCGGACCGT (SEQ ID NO: 5) ； mgsA-3: GCATTTGTTTGCAGTGATCG (SEQ ID NO: 6) 。 扩增体系为： NewEnglandBiolabs Phusion 5X缓冲液 10 μ 1、 dNTP (每 种 dNTP各 10 mM) 各 1μ 1、 DNA模板 20ng、 引物（10μΜ) 2μ 1、 Phusion High- Fidelity DNA Polymerase (2.5 U/μ 1) 0·5μ 1、 蒸馏水 33.5μ 1， 总体积为 50μ 1。 扩增条件为 98°C预变性 2分钟 （1个循环） ； 98°C变性 10秒、 60°C退火 10秒、 72Ό延伸 2分钟 （30个循环） ； 72°C延伸 5分钟 (1个循环） 。 PCR扩增产物包含 pEASY-Blunt载体和甲基乙二醛合成酶 基因的上下游 400 bp左右碱基， 即 pEASY- Blunt载体和自序列 15的 5' 端第 925- 1435位核苷酸序列和自序列 15的 5' 端第 1-570位核苷酸序列。
第三步， 将含有氯霉素基因 （cat) 和果聚糖蔗糖转移酶基因 （sacB) DNA片段连接至第二步的 PCR扩增产物。 以 pL0I4162质粒 （Jantama K, Zhang X, Moore JC, Shanmugam KT, Svoronos SA, Ingram L0. Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnol Bioeng. 2008, 101(5)： 881-893. , 公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得） 为模板， 使用引物 cat- sacB- up/down PCR扩增 cat- sacB片段。 引物序列为：
cat-sacB-up: GGAGAAAATACCGCATCAGG (SEQ ID NO: 7) ； cat-sacB-down: GCGTTGGCCGATTCATTA (SEQ ID NO: 8) 。 扩增体系同第一步，琼脂糖凝胶电泳回收，获 得含有氯霉素基因（cat) 和果聚糖蔗糖转移酶基因 （sacB) 的 DNA片段 （3030bp。 将含有氯霉素基 因 （cat) 和果聚糖蔗糖转移酶基因 （sacB) DNA片段连接至第二步的 PCR 扩增产物的连接体系为： 10ng的第二步 PCR扩增产物， 30ng的 cat- sacB DNA 片段， 2μ 1 10XT4 连接缓冲液（NEB 公司）， lu 1 T4 连接酶（NEB 公司， 400, 000 cohesive end units/ml), 补充蒸馏水至 20μ 1。 室温连接 2小 时， 取 5μ 1加入 50μ 1 Transl-Tl感受态细胞中 （购自北京全式金生物 技术有限公司） ， 冰浴 30分钟。 42Ό热激 30秒， 立即置于冰上 2分钟。 加入 250 μ 1 LB培养基， 200rpm， 37°C孵育 1小时。 取 200 μ 1菌液涂在 含有氯霉素 （终浓度为 17ug/ml) 的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳 性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳 性克隆质粒（将 cat-sacBDNA 片段克隆到 pXZ- A19中的质粒） 进行测序验证， 测序结果在上述第二步的 PCR扩增产物上连接了 cat-sacBDNA片段， 证明质粒构建正确， 将得到的 重组质粒命名为 pXZ- A20 (图 3) 。
第四步， 以 pXZ- A20质粒 DNA为模板， 使用引物 mgsA- up/ mgsA-down (SEQ ID NO: 3/ SEQ ID NO: 4)扩增出 DNA片段 I，扩增体系为： NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液 10μ 1、 dNTP (每种 dNTP各 10 mM)各 1μ 1、 DNA模板 20ng、 引物 （10μΜ) 2μ 1、 Phusion High- Fidelity DNA 聚合 酶（2.5υ/μ 1) 1μ 1、 蒸馏水 33.5 μ 1， 总体积为 50μ1。 扩增条件为 98 °C 预变性 2分钟 （1个循环） ； 98°C变性 10秒、 59°C退火 10秒、 72°C延伸 1分钟 40秒 （30个循环） ； 72°C延伸 5分钟 （1个循环） 。 扩增得到 DNA 片段 I， DNA片段 I由依次连接的甲基乙二醛合成酶基因 mgsA上游 400个 左右碱基 （自序列 15 的 5' 端第 1-570位核苷酸序列） 、 cat- sacB DNA 片段、甲基乙二醛合成酶基因 mgsA下游 400个左右碱基（自序列 15的 5' 端第 925-1435位核苷酸序列） 组成。
将 DNA片段 I用于第一次同源重组。首先将 PKD46质粒 (Dower et al. , 1988； Dower, W. J. , Miller, J. F. , Ragsdale, C. W.1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res.16: 6127-6145。 公众可从安徽华 恒生物工程有限公司获得） 通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌 ATCC8739, 然后将 DNA片段 I电激转化至带有 pKD46的大肠杆菌 ATCC8739。
电激转化条件为： 首先准备带有 PKD46质粒的大肠杆菌 ATCC8739的 电转化感受态细胞； 将 50 μ ΐ感受态细胞置于冰上， 加入 50ngDNA片段 I， 冰上放置 2分钟， 转移至 0.2 cm的 Bio- Rad电击杯。 使用 MicroPulser (Bio- Rad公司）电穿孔仪， 电击参数为电压 2.5kv。 电击后迅速将 1ml LB 培养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75转， 30°C孵育 2小 时。 取 200 μ ΐ菌液涂在含有氯霉素 （终浓度为 17ug/ml) 的 LB平板上， 37°C过夜培养后， 挑选 5 个单菌落进行 PCR 验证 （使用引物 mgsA- up/mgsA- down (SEQ ID N0 : 3/ SEQ ID NO: 4) 进行验证， 正确的 菌落扩增产物为 4111bp。 挑选一个正确的单菌落， 将其命名为 XZ- A27。
XZ-A27中，染色体上甲基乙二醛合成酶基因通 过同源重组替换为 cat-sacB DNA片段。
第五步， 以质粒 pTrc99A- alaR为模板，使用引物 alaR-up/ alaR- down 扩增出 P Trc99A质粒载体上的 e/基因和 ire启动子以及丙氨酸消旋酶 基因 a?, 并连接至第二步 PCR扩增产物。 引物序列为：
alaR-up: GGCATGCATTTACGTTGACA (SEQ ID NO: 9) ； alaR- down: AGAAACGCAAAAAGGCCATC (SEQ ID NO: 10) 。 克隆体系与中第三步相同。 取 200μ 1 菌液涂在含有卡那霉素 （终浓 度为 15ug/ml) 的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳性 克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果表明在载 体 pXZ- A19上插入了丙氨酸消旋酶基因 alaR, 证明质粒构建正确， 将得到 的质粒命名为 pXZ- A21 (图 4) 。
第六步，以 pXZ- A21质粒 DNA为模板，用引物 mgsA- up/mgsA- down(SEQ
ID NO: 3/ SEQ ID NO: 4) 扩增出 DNA片段 II。 DNA片段 II有依次连接 的甲基乙二醛合成酶基因 fflgsA上游 400个左右碱基 （自序列 15的 5' 端 第 1-570位核苷酸序列）、 e/基因、 ire启动子、丙氨酸消旋酶基因 alaR、 甲基乙二醛合成酶基因 mgsA下游 400个左右碱基 （自序列 15的 5' 端第 925-1435位核苷酸序列） 组成。 DNA片段 II用于第二次同源重组。 首先 将 pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至 XZ- A27， 然后将 DNA片段 II电激 转化至带有 PKD46质粒的 XZ- A27。
电激转化条件为： 首先准备带有 PKD46质粒的 XZ- A27 的电转化感受 态细胞； 将 50 μ ΐ感受态细胞置于冰上， 加入 50ng DNA片段 II， 冰上放 置 2分钟， 转移至 0. 2 cm的 Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser (Bio- ad 公司） 电穿孔仪， 电击参数为电压 2. 5kv。 电击后迅速将 lml LB培养基转 移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75转， 30°C孵育 4小时。 将菌 液转移至含有 10% (质量百分含量） 蔗糖的没有氯化钠的 LB 液体培养基 ( 250ml烧瓶中装 50ml培养基） ， 培养 24小时后在含有 6% (质量百分含 量） 蔗糖的没有氯化钠的 LB固体培养基上划线培养。 经过 PCR验证 （使 用引物 mgsA-up/mgsA-down ( SEQ ID NO: 3/ SEQ ID NO: 4) 进行验证， 正确的菌落扩增产物为 4210bp 的片段。 挑选一个正确的单菌落， 将其命 名为 XZ- A28。 XZ- A28中， 染色体上 cat-sacB DNA片段通过同源重组替换 为 基因、 re启动子和丙氨酸消旋酶基因 ？。
(b) 丙氨酸消旋酶基因 a ?的调控
丙氨酸消旋酶基因 alaR的调控， 共以下两步：
第一步， 以重组大肠杆菌菌株 M1-93 的基因组 DNA ( Lu J, Tang几， Liu Y， Zhu X, Zhang T， Zhang X. Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improved alternative glucose uti lization. Appl Microbiol Biotechnol. 2012, 93 : 2455-2462。 公众 可从安徽华恒生物工程有限公司获得） 为模板， 使用引物 mgsA-up-FRT/ mgsA-alaR-FRT-down扩增用于 alaR基因表达调控的 DNA片段 III (序列为 序列表中序列 16) , 引物序列为：
mgsA-up-FRT ： ATGGAACTGACGACTCGCACTTTACCTGCGCGGAAACATATTGC
GCTGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC ( SEQ ID NO: 11 ) ； mgsA-alaR-FRT-down ： GACAAGTCAATTTCCGCCCACGTATCTCTGTAAAAAGG TTTTGTGCTCATAGCTGTTTCCTGGTT (SEQ ID NO: 12) 。 第二步： 将 DNA片段 III电转至带有 pKD46质粒的 XZ- A28。
电转条件为： 首先准备带有 PKD46质粒的大肠杆菌 XZ-A28的电转化 感受态细胞； 将 50μ 1感受态细胞置于冰上， 加入 50ngDNA片段 III， 冰 上放置 2 分钟， 转移至 0.2 cm 的 Bio-Rad 电击杯。 使用 MicroPulser (Bio- Rad公司）电穿孔仪， 电击参数为电压 2.5kv。 电击后迅速将 lml LB 培养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75转， 30°C孵育 2小 时。 取 200 μ ΐ菌液涂在含有卡纳霉素（终浓度为 15ug/ml) 的 LB平板上， 37°C过夜培养后， 挑选 5个单菌落进行 PCR验证（使用引物 mgsA- up-FRT/ alaR-FRT-cexu (SEQ ID NO: 11/ SEQ ID N0 : 13) 进行验证， 引物序列 为：
alaR-FRT-cexu: GCAGCGATTGCCACATACTC (SEQ ID NO: 13) 。 正确的菌落扩增产物为 1890bp， 挑选一个正确的单菌落， 将其命名为 大肠埃希氏菌 Escherichia coli ) XZ-A30菌株。 在 XZ- A30菌株中， 丙氨 酸消旋酶基因 alaR受人工调控元件 Ml- 93 (序列 17) 的调控
大肠埃希氏菌 Escherichia coliYkl- 菌株， 已于 2012年 10月 12日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号，中国科学院微生物研 究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 (CGMCC), 保藏编 号为： CGMCC No.6667。 其具有发酵产生高浓度 DL-丙氨酸的能力， 且 D - 丙氨酸和 L-丙氨酸的光学纯度比例是 50: 50。
上述 XZ- A30菌株的构建过程中所使用所用的材料、 试剂等， 如无特 殊说明， 均可从商业途径得到。 所使用到质粒 （如图 2、 3、 4所示） 及其 构建如表 1所示。
表 1: 本发明的 DL-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒 - alaR up-Xbal/alaR down-Sail )
PXZ-A19 大肠杆菌 mgsA基因片段 （ mgsA- up/mgsA- down扩增） 克隆至 pEASY- Blunt载体
pXZ-A20 Cat-sacB 片 段 克 隆 至 pXZ_A19 的 mgsA 中
(mgsA- l/mgsA-3 )
pXZ-A21 丙氨酸消旋酶基因克隆至 pXZ- A19 的 mgsA 中
( mgsA-l/mgsA-3 )
实施例 2 以 XZ- A30菌株厌氧发酵生产 DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为： 葡萄糖 120g/L， 氯化铵 4g/L， NaH 2 P0 4 5g/L， Na 2 HP0 4 5g/L, MgS0 4 · 7 0 lg/L, CaCl 2 2H 2 0 0. lg/L, 微量 无机盐 4ml/L， 培养基 pH 6. 5。 微量无机盐组成为： FeCl 3 · 6H 2 0 1. 5mg, CoCl 2 · 6H 2 0 0. lmg, CuCl 2 · 2H 2 0 0. lrag, ZnCl 2 0. lmg， Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 0. lmg， MnCl 2 - 4H 2 0 2 0. 2mg, 蒸馏水定容至 1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为 150ml， 121 °C灭菌 15min。 冷却后接入 XZ-A30, 培养温度为 30°C， 摇床转速为 50r/min ( 50转 /分） ， 培养 18 h， 用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为 2. 4L, 121 °C灭菌 15min。 接种量为 0. 1%
(V/V, ) , 发酵温度为 30°C， 搅拌转速为 lOOrpm ( 100转 /分） 。 发酵过程 采用氨水控制 pH在 6. 5， 发酵时间为 48h。
分析方法： 使用安捷伦 （Agilent-1200) 高效液相色谱仪对发酵液中 的组分进行测定。 DL-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐 （Daciel ) 公 司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱 （Chiralpak MA (+) ) 。 发酵 液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐（Biorad )公司的 Aminex HPX - 87H 糖分析柱。
结果： 发酵液中 DL-丙氨酸和有机酸含量： DL-丙氨酸的浓度为 114. 6 g/L， 其中 D-丙氨酸为 57. 3 g/L， L-丙氨酸为 57. 3 g/L, D-丙氨酸和 L- 丙氨酸的光学纯度比例为 50: 50 (如图 5所示） 。 乳酸含量低于 0. lg/L、 乙酸含量低于 0. lg/L、 乙醇含量低于 0. lg/L、 丁二酸含量低于 0. lg/L 0 实施例 3 以 XZ-A30菌株厌氧发酵生产 DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为： 葡萄糖 120g/L， 氯化铵 4g/L， NaH 2 P0 4 5g/L, Na 2 HP0 4 5g/L, MgS0 4 - 7H 2 0 lg/L, CaCl 2 2H 2 0 0. lg/L, 微量 无机盐 4ml/L， 培养基 pH 6. 5。 微量无机盐组成为： FeCl 3 · 6 0 1. 5mg， CoCl 2 · 6H 2 0 0. lmg, CuCl 2 · 2H 2 0 0. lmg, ZnCl 2 0. lmg, Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 0. lmg， MnCl 2 · 4H 2 0 2 0. 2mg， 蒸馏水定容至 1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为 150ml， 121 °C灭菌 15min。 冷却后接入 XZ-A30, 培养温度为 30°C， 摇床转速为 50r/min ( 50转 /分） ， 培养 18 h， 用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为 2. 4L， 121 °C灭菌 15min。 接种量为 0. 1% (V/V, )， 发酵温度为 42Ό， 搅拌转速为 lOOrpm ( 100转 /分） 。 发酵过程 采用氨水控制 pH在 7. 5， 发酵时间为 60h。
结果： 发酵液中 DL-丙氨酸和有机酸含量： DL-丙氨酸的浓度为 83. 2 g/L， 其中 D-丙氨酸为 41. 6 g/L， L-丙氨酸为 41. 6 g/L, D-丙氨酸和 L- 丙氨酸的光学纯度比例为 50: 50。 乳酸含量低于 0. 1g/L、 乙酸含量低于 0. lg/L. 乙醇含量低于 0. lg/L、 丁二酸含量低于 0. lg/L。
实施例 4 以 XZ- A30菌株有氧发酵生产 DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为： 葡萄糖 120g/L， 氯化铵 ½/L，
NaH2P04 5g/L， Na2HP04 5 g/L, MgS04 · 7H20 lg/L, CaC12 2H20 0. lg/L, 微量无机盐 4ml/L,培养基 pH 6. 5。微量无机盐组成为： FeCl 3 ·6Η 2 0 1. 5mg,
CoCl 2 · 6H 2 0 0. lmg, CuCl 2 · 2H 2 0 0. lmg, ZnCl 2 0. lmg, Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 0. lmg,
MnCl 2 · 4H 2 0 2 0. 2mg， 蒸馏水定容至 1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为 150ml， 121 °C灭菌 15min。 冷却后接入
XZ-A30, 培养温度为 30°C， 摇床转速为 50r/min ( 50转 /分） ， 培养 18 h， 用于发酵培养基接种。 3L发酵罐发酵培养基体积为 2. 4L， 121 °C灭菌 15min。 接种量为 0. 1% (V/V) , 发酵温度为 30Ό， 搅拌转速为 lOOrpm ( 100转 /分） ， 通气量 （空 气） 为 0. l L/min，L。 发酵过程采用氨水控制 pH在 6. 5, 发酵时间为 40h。
结果： 发酵液中 DL-丙氨酸和有机酸含量： DL-丙氨酸的浓度为 110. 8 g/L， 其中 D-丙氨酸为 55. 4 g/L， L-丙氨酸为 55. 4 g/L， D-丙氨酸和 L- 丙氨酸的光学纯度比例为 50: 50。 乳酸含量低于 0. 1g/L、 乙酸含量低于 0. lg/ 乙醇含量低于 0. lg/L、 丁二酸含量低于 0. lg/L。
实施例 5 以 XZ-A30菌株有氧发酵生产 DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为： 葡萄糖 120g/L， 氯化铵 4g/L， NaH 2 P0 4 5g/L， Na 2 HP0 4 5g/L, MgS0 4 · 7H 2 0 lg/L, CaCl 2 2H 2 0 0. lg/L, 微量 无机盐 4ml/L， 培养基 pH 6. 5。 微量无机盐组成为： FeCl 3 · 6¾0 1. 5mg, CoCl 2 · 6H 2 0 0. lmg， CuCl 2 · 2H 2 0 0. lmg, ZnCl 2 0. lmg， Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 0. lmg, MnCl 2 · 4H 2 0 2 0. 2mg， 蒸馏水定容至 1L, 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为 150ml， 121 °C灭菌 15πήη。 冷却后接入 ΧΖ-Α30, 培养温度为 30°C， 摇床转速为 50r/min ( 50转 /分） ， 培养 18 h， 用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为 2. 4L, 121 °C灭菌 15min。 接种量为 0. 1% (V/V) , 发酵温度为 42°C， 搅拌转速为 lOOrpm ( 100转 /分） ， 通气量 （空 气）为 0. 1 L/min-Lo 发酵过程采用氨水控制 pH在 7. 5， 发酵时间为 54 h。
结果： 发酵液中 DL-丙氨酸和有机酸含量： DL-丙氨酸的浓度为 80. 4 g/L， 其中 D-丙氨酸为 40. 2 g/L, L-丙氨酸为 40. 2 g/L, D-丙氨酸和 L- 丙氨酸的光学纯度比例为 50: 50ο 乳酸含量低于 0. 1g/L、 乙酸含量低于 0. lg/L, 乙醇含量低于 0. lg/L、 丁二酸含量低于 0. lg/L。
工业应用
利用本发明的工程菌生产 DL-丙氨酸工艺简单， 只需在起始阶段向发 酵罐中投加葡萄糖等糖原和无机盐， 并接入少量的该工程菌菌种即可发酵 生产 DL-丙氨酸。 本申请中优选采用的厌氧培养条件下进行发酵 ， 该条件 下发酵 DL-丙氨酸产量可高达 114. 6g/L,提高 DL-丙氨酸产率和减少能耗， 另外发酵过程也不需要添加抗生素， 节约原料成本同时提高产品的品质。 打印件 (原件为电子形式)
1 下面的说明与本申请说明书中此处提到的
保藏的微生物或其他生物材料相关：
1-1 段落号 第三页第四行
1-3 保藏事项
1-3-1 保藏单位名称 C6 CC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心
1-3-2 保藏单位地址 Institute of Microbiology, Chinese Academy of
Sciences, No. 1, West Be i chen Road, Chaoyang District, Beijing 100101, China
1-3-3 保藏日期 2012年 10月 120 (12.10.2012)
1-3-4 保藏号 CGMCC 6667
1-5 本说明是对下列指定国
所有指定国 由受理局填写
0-4 本表格与国际申请一起收到：
(是或否）
0-4-1 受权官员 由国际局填写
0-5 国际局收到本表格日期：
0-5-1 受权官员