【技术领域】 本发明涉及智能药物技术领域， 具体地说， 是一种环境响应基础共聚物及其制备 方法。

说

【背景技术】 很多药物在体内的分布不具选择性， 或是水溶性差， 使药物对健康组织产生毒性 书

或是极易被清除。 靶向给药、 可控释药能够在取得治疗效果的同时将药物对 健康组织 的毒性降低， 一直是药物开发和治疗研究的重点。 以共聚物胶束作为载体， 包埋药物 制备用于疾病治疗的靶向载药胶束。 运用具有可检测功能的共聚物， 使胶束本身具有 可检测性或包埋诊断试剂就能制备用于疾病进 行诊断的同时具有疾病治疗与检测诊 断功能的多功能疾病胶束诊疗平台。

以制备一种用于肿瘤的诊疗平台为例。 肿瘤靶向分为主动靶向和被动靶向。 前者 利用抗体与抗原或肿瘤相关受体的配体与受体 间的特异性结合来实现。后者通过实体 肿瘤的 EPR ( enhanced penneability and retention ) 效应实现。 EPR效应： 肿瘤细胞快 速无节制的生长需要大量血液输送营养物质、 氧气， 引发血管生长过度丰富而杂乱， 结构不完整， 存在大量的增殖性血管壁内皮细胞， 导致血管内皮细胞之间的间隙达到 了 200-600 nm _; 血管通透因子引发的外湊； 损坏的淋巴毛细管引起的肿瘤淋巴排泄功 能低下。 EPR效应可以促进大分子和纳米颗粒在肿瘤组织 中被动蓄积。肿瘤靶向的药 物输送系统， 能够将治疗剂量控制在尽可能低的范围内， 以降低对非靶点的毒性， 又 能够将足够剂量的药物输送到病灶取得治疗效 果。

近年来， 随着纳米技术的突飞猛进， 一门新的交叉学科诊疗学（ eranostics )逐 步发展了起来。诊疗学主要综合了治疗和诊断 两个概念，可以实现同步的诊断与治疗。

【发明内容】 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供 一种环境响应基础共聚物及其制备 方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种环境响应基础共聚物， 共聚物的结构如结构式 1所示， 具有明确的三嵌段结 构， 依次分别为疏水段、 亲水环境响应段和具有反应活性的聚 N-甲基丙烯酰氧琥珀 酰亚胺 （PNAS) 链。

基础共聚物

所述的疏水段的材料选自可生物降解疏水性聚 合物， 包括聚氨基酸、 多肽、 聚乳 酸 -羟基乙酸共聚物、 聚乳酸、 聚羟基乙酸、 聚己内酯、 聚乳酸聚己内酯共混材料及 其衍生物中的一种或几种。

所述的亲水环境响应段的环境响应包括温度、 pH、 超声、 光。环境响应材料选自 N-垸基丙烯酰胺类， 如： N- (异） 丙基 （甲基） 丙烯酰胺、 N-叔丁基丙烯酰胺、 N，N- 二乙基丙烯酰胺、 2-羧基异丙基丙烯酰胺。 烯酸类及其酯类， 如： 甲基丙烯酸、 双甲 基丙烯酸、 10-十一烯酸、 甲基丙烯酸 [2- (二甲基氨基） 乙基]酯、 甲基丙烯酸甲酯、 丙烯酸丁酯、 甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯、 甲基丙烯酸二乙胺基乙酯。 其他如： 甲基 纤维素、 羧基丙基纤维素、 乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物、 乙烯基甲醚、 N-乙烯基己内 酰胺、 聚氨酯。 亲水环境响应段形成具有极好生物相容性的胶 束外壳。 起到稳定、 保 护胶束的作用， 并可进行环境响应释放胶束包埋的药物和诊断 试剂。

所述的具有反应活性的聚 N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺 （PNAS) 聚合物链为 N- 甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺聚合而成。

疏水段形成胶束的疏水内核， 用于包埋疏水性难溶药物和诊断试剂。

亲水环境响应段形成具有极好生物相容性的胶 束外壳； 起到稳定、 保护胶束的作 用， 并可进行环境响应释放胶束包埋的药物和诊断 试剂； PNAS链使基础共聚物能够 与不同的功能配体， 如叶酸、 荧光素、 氮氧自由基， 连接制备各种功能模块， 包括靶 向和检测功能模块。

各功能模块， 包括靶向和检测功能模块， 都具有一致的环境响应性能； 各功能模 块可以整合成为一个仓储式功能模块库； 根据需要从库中选取多种不同功能模块， 包 括靶向和检测功能模块， 按需要比例混合， 包埋药物或诊断试剂， 组成多功能疾病诊 疗胶束， 实现同时靶向给药和仪器的检测。 可为疾病的实验室研究与临床治疗提供一 种使用简便的多功能平台 （如附图 1所示）。

仓储式功能模块库是开放式的； 若库中现有功能模块不能满足需要； 本发明的基 础共聚物能够迅速而简单地与新的功能配体相 连接， 方便地扩展出新的功能模块， 扩 充功能模块库， 而不必从头设计合成功能材料， 大大简化功能材料的制备过程。 实现 在生物医学领域更多、 更广的应用。

一种环境响应基础共聚物在制备肿瘤药物领域 中的应用。

本发明可为疾病的实验室研究与临床治疗提供 一种使用简便的多功能平台。 所述的多功能疾病诊疗胶束， 所述的胶束粒径小于 200 nm， 最优值为 100〜150 nm。

所述的多功能疾病诊疗胶束， 制备过程中无需添加其他额外的乳化剂。 最适合的 制备方法有如下两种：

透析法： 用可以溶解功能模块， 包括靶向和检测功能模块， 和药物或诊断试剂， 同时又与水能够互溶的有机溶剂， 如 DMF (二甲基甲酰胺）， DMSO (二甲基亚砜）， 溶解功能模块与药物或诊断试剂， 将混合溶液置入透析袋内对水透析， 自组装形成包 埋有药物或诊断试剂的胶束。

溶剂挥发成膜法制备法： 将功能模块， 包括靶向和检测功能模块， 和药物或诊断 试剂同时溶解于易挥发的有机溶剂， 如氯仿， 二氯甲垸， 将混合溶液置于烧瓶中， 减 压旋蒸除去有机溶剂， 使功能模块与药物或诊断试剂在瓶壁形成一层 薄膜。 然后向瓶 中注入水， 使薄膜充分被水浸润， 自组装形成包埋有药物或诊断试剂的胶束。 最后透 析除去未包埋的药物或诊断试剂和其他杂质。

一种环境响应基础共聚物的制备方法， 其具体步骤为：

( 1 ) 将疏水段与一个小分子 RAFT链转移剂以摩尔比 1 :1的比例连接， 制备一 种大分子 RAFT引发剂； RAFT是指可逆加成-断裂链转移聚合方法；

(2)将环境响应单体与大分子 RAFT引发剂以摩尔比 100: 0.01到 100:1的比例 进行一步 RAFT聚合；

(3 )将 N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺 （NAS)单体与第一步的产物以摩尔比 100:

0.01到 100:1的比例进行第二步 RAFT聚合， 制备出环境响应基础共聚物。

与现有技术相比， 本发明的积极效果是： 本发明的优点在于环境响应基础共聚物的结构 是可控的， 疏水段、 亲水环境响应 段与 PNAS链相互独立， 具有清晰明确的结构， 可以充分发挥各链段的性能。 由基础 共聚物能够简单地制备多种功能模块， 包括靶向与检测模块。 根据治疗的需要和检测 手段的不同， 灵活选取相应的靶向和检测功能模块， 制备包埋药物或诊断试剂的多功 能疾病诊疗胶束， 实现同时靶向给药和仪器的检测。

【附图说明】

附图 1 以基础共聚物开发出功能模块组成仓储式功能 模块库， 根据需要选取相 应的功能模块自组装成功能胶束。

附图 2 基础共聚物 PLA-PNNUA-PNAS 的合成及其三种功能模块

PLA-PNNUA-FA, PLA-PNNUA-FITC和 PLA-PNNUA-TEMPO的合成。

附图 3 基础共聚物 PLA-PNNUA-PNAS的结构 （A) 与 ¹ H NMR谱 （B)。 附图 4胶束的 pH协同温敏性能。

附图 5 多功能胶束的荧光图谱。

附图 6 多功能胶束的电子顺磁共振图谱。

附图 7 多功能胶束的透射电镜照片 （A) 与粒径分布 （B)

附图 8 多功能胶束对 KB细胞与 NIH 3T3细胞共同孵育 3小时的激光共聚焦显 微镜照片 （图 8 A、 B ) 与电子顺磁共振图谱 （图 8 a、 b)。

附图 9 阿霉素诊疗胶束的透射电镜照片。

附图 10 阿霉素诊疗胶束的粒度分布 （A) 和 ^^电位 （B)。

附图 11 阿霉素诊疗胶束 37'C下在不同 PBS缓冲液中的释药曲线。

附图 12游离阿霉素和阿霉素诊疗胶束对 MCF-7细胞的细胞毒性。

附图 13 MCF-7荷瘤小鼠的活体成像 （图 13 a) 与组织照片 （图 13 b)。

附图 14 MCF-7荷瘤小鼠的活体成像 （图 14 a) 与组织照片 （图 14 b)。

附图 15 PLA-PNNUA-FA， PLA-PNNUA-FITC， PLA-PNNUA-TEMPO 和

PLA-PNNUA的细胞毒性测试。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种环境响应基础共聚物及其 制备方法的具体实施方式。 实施例 1

聚乳酸 （PLA) 的制备： 在烧瓶内加入工业 DL-乳酸 22.5 g。 氮气保护下升温至 130 °C并保温 3小时。冷却至 50 °C后加入 20 mL甲苯和催化剂二水辛酸亚锡 100 mg， 160 V , 反应 24小时。 反应完后冷却至室温， 将反应液全部倒入 50 %乙醇中， 静置 产生沉淀。 过滤收集沉淀后用无水乙醇清洗， 室温真空干燥 24小时。 即为目标产物 聚乳酸 （PLA)， „ = 2 300 g mol _{; w} / „= 1.94 (凝胶潫透色谱仪， GPC) 。

小分子 RAFT链转移剂的合成： 烧瓶内加入正十二硫醇 20.20 g和四丁基溴化铵， 丙酮溶解。 滴加 50 %氢氧化钠水溶液 10 mL。 加入二硫化碳 7.61 g， 氯仿 20 mL和 50 %氢氧化钠溶液 20 mL， 反应过夜。 滴加入浓盐酸， 产生固体物。 过滤反应液， 收 集固体， 正己垸重结晶， 室温真空干燥后得黄色结晶小分子 RAFT链转移剂。

^! H NMR (δ' ppm)： 0.88 (t， 3H， CH ₃ )， 1.23-1.43 (m， 18H， CH ₂ -CH ₂ )，

1.61-1.74 (m， 8H， C-CH ₃ 和 S-CH ₂ -CH ₂ ) ， 3.28 (t， 2H， S-CH ₂ ) 。

聚乳酸大分子 RAFT引发剂的合成：烧瓶中加入小分子 RAFT链转移剂 3.6 g和少 量三乙胺， 二氯甲垸溶解。 加入等摩尔量的草酰氯， 反应 6小时。 过滤， 收集滤液， 转移入装有聚乳酸 3.7 g的烧瓶中，室温下反应 24小时。然后将反应液减压旋蒸浓縮， 倾倒入冰无水乙醚中产生沉淀， 离心收集沉淀清洗后真空烘箱 40 'C烘干， 得到淡黄 色粉末聚乳酸大分子 RAFT引发剂， 分子量 2300 g mol (凝胶潫透色谱仪， GPC ) 。

基础共聚物 PLA-PNNUA-PNAS的合成： 第一步， 向烧瓶中加入一定比例的 N-异丙 基甲基丙烯酰胺、 N-异丙基马来酰胺酸、 10-十一烯酸， DMF (二甲基甲酰胺） 溶解。 加入 AIBN (偶氮二异丁腈） 和聚乳酸大分子 RAFT引发剂。 通氮气除氧。 80'C反应

6小时。 反应结束后将反应液倒入无水乙醚中， 将得到的沉淀离心收集， 清洗后室温 真空烘干， 得白色粉末 PLA-PNNUA, Mn = 34 400 g mol, Mw/Mn = 1.18 (凝胶潫透 色谱仪， GPC) 。 第二步， 以 PLA-PNNUA作为 RAFT引发剂， 与单体 NAS (N-甲基丙烯酰氧琥 珀酰亚胺） 制备基础共聚物 PLA-PNNUA-PNAS。 烧瓶中加入 PLA-PNNUA和 NAS 单体， 加入 5 mLDMF溶解， 加入 AIBN。 通氮气除氧。 80 °C反应 6小时。 反应结束 后将反应液倒入无水乙醚中， 将得到的沉淀离心收集， 清洗后室温真空烘干， 得白色 粉末 PLA-PNNUA-PNAS, Mn = 48 800 g mol， Mw/Mn = 1.22 (凝胶潫透色谱仪， GPC )。 核磁共振氢谱 （ NMR， 附图 3 ) 对 PLA-PNNUA-PNAS的结构经行了表征， 结果 表明成功制备了环境响应基础共聚物 PLA-PNNUA-PNAS。

实施例 2

肿瘤靶向 PLA-PNNUA-FA、 荧光 PLA-PNNUA-FITC和 TEMPO自旋标记

PLA-PNNUA-TEMPO三种不同功能模块的制备

1. 肿瘤靶向 PLA-PNNUA-FA功能模块的制备：烧瓶中加入 FA (叶酸） 0.5 g， DMSO (二甲基亚砜） 溶解。 冰水浴下加入 DCC (N,N ^? -二环己基碳二亚胺） 0.5 g禾 a NHS (N-羟基琥珀酰亚胺） 0.3 g。暗处反应过夜。反应完成后，过滤除去白� �副产物沉淀， 将滤液倒入无水乙醚中， 产物为 NHS活化的叶酸 FA-NHS, 离心分离沉淀并清洗， 室温真空干燥。烧瓶中先后加入等摩尔 2，2'- (乙烯二氧）双（乙胺）和 FA-NHS， DMSO 溶解， 避光反应 48小时。 反应液倒入无水乙醚中， 产生橘黄色桨状物， 为氨基化的 叶酸 FA-NH ₂ ， 离心收集清洗后真空干燥。

将 PLA-PNNUA-PNAS与 FA-NH ₂ 混合溶于 DMSO， 避光反应 48小时。 反应液 对 1000 mL超纯水透析 24小时。 冻干透析袋内的液体， 得到浅黄色粉末， 为肿瘤靶 向功能模块 PLA-PNNUA-FA。

2. 荧光 PLA-PNNUA-FITC功能模块的制备： 烧瓶中加入 2，2'- (乙烯二氧） 双 （乙 胺） 和 FITC (异硫氰酸荧光素）， DMSO溶解。 避光反应 48小时。 反应液倒入无水 乙醚中， 底部产生黄绿色桨状物， 为氨基化异硫氰酸荧光素 FITC-NH ₂ ， 离心后收集 清洗后室温真空干燥。

将 PLA-PNNUA-PNAS与 FITC-NH ₂ 溶于 DMSO，避光反应 48小时。反应液对 1000 mL超纯水透析 24小时。 冻干透析袋内的液体， 得到浅黄绿色粉末， 为荧光功能模块 PLA-PNNUA-FITC。

3. TEMPO (4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶 -1-氧自由基） 自旋标记 PLA-PNNUA-TEMPO 功能模块的制备：将 PLA-PNNUA-PNAS与 TEMPO溶于 DMSO，避光反应 48 小时。 反应液对 1000 mL超纯水透析 24 小时。 冻干透析袋内的液体， 得到橘红色粉末， 为

TEMPO自旋标记功能模块 PLA-PNNUA-TEMPO。

实施例 3

仓储式功能模块库的建立： 以实施例 5中制备的三种功能模块 PLA-PNNUA-FA、 PLA-PNNUA-FITC和 PLA-PNNUA-TEMPO—起建立了一个仓储式的功能模块 库。 可根据需要从仓储式功能模块库中选取多种不 同功能模块，包括肿瘤靶向和检测功能 模块， 按任意需要比例混合， 按需包埋抗肿瘤药物， 组成多功能肿瘤诊疗胶束。 实施例 4

pH协同温敏 LCST (低临界溶解温度） 的测定： 用可见光吸收法在波长 542 nm 处测定胶束在考察胶束的 pH协同温敏响应性能。 以超纯水作为透光率 =100 %。 将 PLA-PNNUA胶束分别用 pH值为 7.4、 6.5和 5.0的 PBS缓冲溶液 (0.02M) 配制成 浓度 500 mg/mL， 以透光率对温度绘制出曲线， 得到各 pH值下的 LCST (附图 4)。 结果显示， 胶束的 LCST在 pH值 5.0时为 35.4 °C， pH值 6.5时为 37.5 °C， pH值 7.4 时为 39.4 °C。

实施例 5

具有肿瘤靶向、 荧光和 TEMPO自旋标记功能的多功能胶束的制备与表征� �� 多功能 胶束由透析法制备。 将 PLA-PNNUA与三种功能模块 PLA-PNNUA-FA,

PLA-PNNUA-FITC和 PLA-PNNUA-TEMPO以适当比例混合， 溶于 1 mL DMSO中。 对超纯水 1000 mL透析 24小时。 在激发波长 488 nm下， 530 nm处的荧光峰是属于 PLA-PNNUA-FITC中 FITC所发出荧光 （附图 5 )。 附图 6为电子顺磁共振图谱， 谱 线具有典型的 ¹⁴ N三线态超精细裂分结构， 属于 PLA-PNNUA-TEMPO中 TEMPO的 顺磁信号。 透射电镜照片显示多功能胶束为均一分散的球 形纳米颗粒， 平均水合半径 为 121.5 nm， PDI=0.19 (附图 7)。

实施例 6

多功能胶束的体外细胞摄取实验：使用激光共 聚焦显微镜和电子顺磁共振方法评 价多功能胶束对叶酸受体过度表达的 KB细胞（人口腔表皮样癌细胞）和叶酸受体表 达缺乏的 NIH 3T3细胞 （小鼠胚胎成纤维细胞） 进行体外细胞摄取考察。 首先是激光共聚焦显微镜观察， 取 KB细胞或者 NIH 3T3细胞种入带有盖玻片 的 6孔板。 培养 24小时贴壁后弃去原培养基， 加入浓度 250 mg L的多功能胶束培养 液。继续培养 3小时后， PBS缓冲液洗涤， 4 %多聚甲醛， 1 % Triton (曲拉通） X-100， ^g mL DAPI (4'，6-二脒基 -2-苯基吲哚） 染色细胞核。 将盖玻片取出密封后用激光共 聚焦显微镜观察， 激发波长为 405、 488 nm, 发射波通道选择分别为 DAPI和 FITC。

第二部分是电子顺磁共振检测。 取 KB细胞或者 NIH 3T3细胞种入 6孔板。 培 养 24小时贴壁后弃去原培养基， 加入浓度 250 mg L的多功能胶束培养液。 继续培养 3小时后， PBS缓冲液洗涤， 胰酶消化， 加入 PBS缓冲液使细胞重新悬浮， 离心弃去 上清液收集细胞。 高纯氮气流吹干细胞， 加入 0.2 mL DMSO， 超声 30分钟后用电子 顺磁共振波谱仪 X-波段于 298 K下检测 DMSO溶液的电子顺磁共振信号。 激光共聚焦显微镜观察显示胶束能够选择性地 被 KB细胞摄取。 从附图 8 A的 FITC通道中可以看出胶束中 PLA-PNNUA-FITC所产生的荧光发自细胞胞桨。这是� �� 束通过 KB细胞的内吞作用进入细胞的典型特征。 但当多功能胶束与在同样条件下与 NIH 3T3细胞共同孵育后，由于 NIH 3T3细胞表面缺乏叶酸受体，从附图 8 B的 FITC 通道中未发现 FITC所发出的荧光。附图 8 A、B右下角小图分别是 KB细胞和 NIH 3T3 细胞的顺磁电子信号图谱，可以发现 KB细胞具有较强的信号而 NIH 3T3细胞未检测 出信号。 这与激光共聚焦显微镜观察的结果相符。

实施例 7

肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的制备 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束包埋有具有荧光的抗 肿瘤药物阿霉素（DOX)， 同时具 有肿瘤靶向和荧光功能。 将肿瘤靶向功能模块 PLA-PNNUA-FA与 PLA-PNNUA溶于 氯仿， 加入阿霉素氯仿溶液。 混合后旋蒸除去氯仿。 超声下加入 10 mL双蒸水， 即得 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束 （样品编号 FA-PN4-7)。 将胶束置于透析袋中， 对 lOOO mL 超纯水透析 24小时。 透析介质在 480 nm波长下用紫外-可见光分光光度仪测定吸光 度， 代入阿霉素标准曲线计算包封率、 载药量。 计算公式如下： 1 载药量 ^(%) =¾载H药纳米i胶S束S的I质量 ^xi00 公式 ² 经计算， 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的包封率为 77.48 %， 载药量为 5.51 %。 透射 电镜照片显示胶束为均一分散的球形纳米颗粒 ， 而且显示出明显的核壳结构， 中间深 色区域为包埋有阿霉素的胶束疏水核心，包埋 在周围的浅色部分是干燥后塌縮的胶束 亲水链段 （附图 9)。 粒径为 138.2 nm， PDI (分散指数） 为 0.160， 单分散分布， zeta 电位为 -33.65mv (附图 10)。

实施例 8

肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的体外释放： 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束 （FA-PN4-7) 的体外释放在 37°C、 100 ipm的振荡条件下进行。 取新鲜制备的胶束溶液 5 mL置透 析袋中对释放介质透析。 释放介质为 lOO mL的 PBS缓冲液， pH分别为 7.4、 6.8、 5.5。 定时取出 3.0 mL释放介质， 立即补回等体积的新鲜释放介质， 用紫外-可见光分 光光度法测定释放介质中阿霉素的浓度。 根据标准曲线计算药物的释放量， 以累计释 药百分率对时间作释药曲线。 由得到的释药曲线（附图 11 )可知， 肿瘤靶向阿霉素诊 疗胶束释药具有 pH敏感的特征，在弱酸环境下，可以较快地释� ��纳米胶束中阿霉素， 而在生理 pH或者是较高 pH下， 释放较为缓慢。

实施例 9

肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的体外抗肿瘤性能： 取 MCF-7细胞 （人乳腺癌细胞） 用 MTT法评价肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束 （FA-PN4-7) 和游离阿霉素的细胞毒性。 从 附图 12可知， 在相同浓度相同暴露时间的条件下， 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的细胞 毒性大于游离阿霉素。 且两者对细胞的毒性均具有浓度和时间依赖性 。游离阿霉素是 小分子状态， 通过被动扩散进入细胞， 而表面带有叶酸分子的肿瘤靶向阿霉素诊疗胶 束是通过受体介导内吞作用的方式进入细胞内 ，然后积聚在酸性环境的溶酶体和内涵 体中， 在低 pH条件下胶束塌縮挤压释放出药物， 进入细胞核与 DNA作用影响 DNA 的复制从而杀死细胞。 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的细胞毒性与药物的 释放有关， 胶束 进入细胞后通过对环境做出响应快速释放药物 ， 使细胞内短时间内药物浓度大大增 加， 其速率超过被动扩散依赖细胞内外浓度差的方 式， 使得药物进入细胞核的速度超 过游离阿霉素。

实施例 10

肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束在荷 MCF-7肿瘤小鼠体内的活体成像实验：使用多功� �� 活体成像系统 Kodak In-vivo Imaging System FX Pro对荷 MCF-7肿瘤小鼠尾静脉单剂 量注射阿霉素或肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束后的 药物体内分布进行实时的活体成像检

将荷瘤小鼠分为两组， 每组 4头小鼠。 用 2 %戊巴比妥钠 0.2mL腹腔注射全身 麻醉。 实验组每头小鼠以阿霉素计 5 mg Kg体重单剂量尾静脉注射给药。分组情况如 下：

第一组 4头小鼠的处理方式分别为：

1-A: 阴性对照组， 不给药。 1-B: 阳性对照组， 游离阿霉素溶液。

1- C: 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束。 1-D: 无叶酸配体的阿霉素载药胶束。

第二组 4头小鼠的处理方式分别为：

2- A: 阴性对照组， 不给药。 2-B: 肿瘤部位先注射 KH ₂ P0 ₄ 溶液 （0.02 M， pH 值约为 5.5 ) 再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束。

2-C: 肿瘤部位先注射 {01^0 ₄ 溶液 （0.02 M， pH值约为 5.5 ) 并加热至 42 'C， 再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束， 保持 42 °C半小时。 2-D: 肿瘤部位加热至 42 °C， 再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束， 保持 42 °C半小时。

每组注射完成后将小鼠由左至右依次摆放在样 品台上， 并放置一个装有阿霉素 溶液的 1.5 mL离心管作为阳性对照。设置仪器激发波长 =470 nm，检测发射波长 =600 nm， 曝光时间 90 S。

实验结果： 第一组的实验结果如附图 13所示， 箭头处为荷瘤位置。 给药 1小时后， 小鼠 1-B活体成像的荧光呈现全身分布的特征， 而且整体强度较弱， 荷瘤部位未见明 显的荧光， 表明荷瘤部位的阿霉素浓度较低。 而且将小鼠解剖后各脏器内的荧光强度 都较弱。 小鼠 1-C荷瘤部位的荧光强度很高， 表明小鼠荷瘤部位的阿霉素浓度较高， 肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束具有主动靶向肿瘤的 能力。 从脏器荧光成像来看， 肿瘤的荧 光强度也较高。小鼠 1-D注射的是无叶酸配体的 PLA-PNNUA阿霉素载药胶束，从活 体成像上可以看出小鼠体内阿霉素的分布也是 全身性的，荷瘤部位的荧光强度略强于 其他部位。 各脏器的荧光强度除了肿瘤和肝脏较高之外其 余都较平均。 这是由于肿瘤 的 EPR效应使得胶束具有被动靶向肿瘤组织的能力 。 本组实验结果表明与游离阿霉 素和无叶酸配体的 PLA-PNNUA阿霉素载药胶束相比，肿瘤靶向阿霉素 诊疗胶束在荷 瘤小鼠体内表现出主动靶向肿瘤组织的能力， 而且能够延长药物在小鼠体内的循环时 间。

第二组的实验结果如附图 14所示， 箭头处为荷瘤位置。 小鼠 2-B的肿瘤部位预 先注射 KH ₂ P0 ₄ 溶液造成局部弱酸性环境， 结果显示小鼠 2-B的荷瘤部位呈现出较强 的荧光， 同时解剖后肿瘤组织也产生了较强的荧光。 小鼠 2-C 的荷瘤部位既经过

KH ₂ P0 ₄ 溶液的酸化， 同时又在荷瘤部位局部加热至 42 °C， 以触发载药胶束的 pH协 同温敏响应。 结果显示在小鼠的荷瘤部位显示了极其强烈的 荧光， 解剖后的肿瘤组织 也观察到了很强的荧光。 小鼠 2-D只在荷瘤部位局部加热至 42 V， 而没有在荷瘤部 位注射 KH ₂ P0 ₄ 溶液， 其活体成像和解剖的结果也显示在小鼠的荷瘤 部位有较强的荧 光。小鼠 2-B荷瘤部位荧光较 2-C和 2-D弱，其原因是活体成像是四头小鼠一次成像 ， 小鼠 2-C和 2-D的荷瘤部位荧光很强， 为了使小鼠 2-C和 2-D不过曝， 降低了整体的 荧光强度， 从而小鼠 2-B的荷瘤部位荧光就显得弱了。

实施例 11

功能模块和简单共聚物 PLA-PNNUA的细胞毒性测试 取 NIH 3T3细胞用 MTT (噻唑蓝） 法评价 PLA-PNNUA-FA、 PLA-PNNUA-FITC, PLA-PNNUA-TEMPO和 PLA-PNNUA的细胞毒性。 实验结果如附图 15所示， 各功 能模块和 PLA-PNNUA在达到较高浓度 500 mg/L, 并与细胞共同孵育 48小时之后也 未发现对细胞的存活率有明显的影响。 这表明这些共聚物材料的细胞毒性较低， 生物 相容性较好。