ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La deficiencia o baja actividad en lactasa intestinal que resulta en una capacidad insuficiente o hasta nula para digerir lactosa, es rara como error metabólico congénito, pero es un síndrome común en humanos adultos. Sin embargo, en la mayor parte de los mamíferos existe una acusada disminución de la actividad lactasa desde el momento del destete. En humanos cuyos antepasados hayan dependido de un consumo sustancial de leche o productos'lácteos durante largo tiempo, esta disminución es menos frecuente. Por otra parte, en lactantes es bastante infrecuente la deficiente o baja actividad en lactasa intestinal.

La determinación de la actividad lactasa intestinal es de importancia en pediatría y gastroenterología y puede llevarse a cabo directamente, a partir de una muestra de mucosa, o indirectamente, a partir del nivel de glucosa en sangre o del hidrógeno espirado, después de la administración de una dosis de lactasa al individuo.

- * La determinación directa tiene la desventaja de constituir un método complejo y caro.. debido a que requiere instrumental específico y personal muy especializado para la práctica de la extracción de la muestra que deberá someterse a análisis posteriormente, a parte de resultar desagradable y no carente de peligro

para el individuo.

Otros métodos de determinación de la lactasa intestinal se basan en que determinados disacáridos son, en base a su afinidad a la lactasa, susceptibles de actuar como sustrato de la lactasa y se transforman, por acción de la enzima, en determinados monosacáridos que son absorbidos fácilmente por el intestino y eliminados por la orina.

En la patente española ES-P-9001680 se describe la preparación del disacárido 4-O-ß-galactopiranosil-D- xilosa de la fórmula (I) para la evaluación de la actividad lactasa intestinal.

Dicho disacárido se administra oralmente, actúa como sustrato de la lactasa intestinal y por tanto se descompone, en el tracto intestinal, en xilosa y galactosa, siendo absorbida la xilosa y eliminada por la orina en la que la xilosa puede evaluarse directamente mediante un método colorimétrico simple.

Las cantidades de xilosa excretadas en orina están correlacionadas con los niveles de lactasa intestinal.

La patente española ES-P-9001680 también describe un método de preparación básicamente para la 4-O-ß-

galactopiranosil-D-xilosa, que comprende una síntesis a partir de bencil B-D-xilopiranósido y que sigue una secuencia de operaciones que implica reacciones de protección selectiva, glicosilación y desprotección.

Tanto el número de etapas de reacción, como la utilización de reactivos caros tales como el triflato de plata en la reacción de glicosilación, y el empleo de columnas de cromatografía en la purificación de intermedios y del producto final, producen costes y presentan dificultades para llevar a cabo este procedimiento a escala industrial.

Las patentes españolas ES-P-9502185 y ES-P-9701156 describen procedimientos enzimáticos para la preparación de mezclas de disacáridos galactopiranosil-xilosas que contienen el disacárido (I) y sus regioisómeros 2-O-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa y la 3-O-ß-D-galactopiranosil- D-xilosa que, respectivamente, presentan las siguientes fórmulas

Los procedimientos descritos en las patentes españolas ES-P-9502185 y ES-P-9701156 permiten obtener en una sola etapa de reacción y tras purificación cromatográfica, mezclas de 2-, 3-y 4-O--D- galactopiranosil-D-xilosa útiles como sustratos y, por tanto, para la determinación de la actividad de la enzima lactasa intestinal. Dichos procedimientos, aunque viables a partir de sustratos y enzimas asequibles, presentan dificultades, desde el punto de vista de la síntesis industrial, en cuanto a la caracterización de las proporciones más adecuadas, la reproducibilidad de la preparación en dichas proporciones y la determinación de posibles impurezas.

Por otra parte, Gorin et al. en"The Synthesis of Galacto-And B-Gluco-Pyranosyl Disaccharides by Sporobolomyces SinQularis", Can. J. Chem. 42 (1964) 2307- 2319, describen la síntesis de una pluralidad de disacáridos, entre ellos 2-O-ß-D-galactopiranosil-D- xilosa y la 3-O-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa, mediante un procedimiento utilizando células. En esta publicación no se describe ninguna utilidad de los diversos disacáridos sintetizados.

OBJETO DE LA INVENCIÓN Es un primer objeto de la presente invención superar los inconvenientes del estado de la técnica anteriormente descrito.

Es otro objeto de la invención, proporcionar un procedimiento mejorado que implica una reacción enzimática entre D-xilosa y un sustrato í3-D- galactopiranósido y una posterior fase de aislamiento y purificación, que permite aumentar la proporción de 4-0- B-D-galactopiranosil-D-xilosa en la mezcla final de la reacción enzimática frente a los disacáridos 2-y 3-0-B- D-galactopiranosil-D-xilosa, a partir de cuya mezcla final puede aislarse la 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa mediante operaciones simples.

La 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa que puede obtenerse mediante el procedimiento anteriormente mencionado así como las composiciones que comprenden dicha 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa, constituyen ulteriores objetos de la invención.

Es otro objeto de la invención usar la 4-0-B-D- galactopiranosil-D-xilosa en la preparación de composiciones y disoluciones útiles en la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los objetos anteriormente mencionados se consiguen de acuerdo con la presente invención, mediante un procedimiento enzimático para obtener 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa que comprende una primera etapa en la que se prepara una primera mezcla de reacción de 2-20 % en peso de D-xilosa 0,5-5% en peso de un sustrato B-D- galactopiranósido 75-97,5 % en peso de un medio de reacción que comprende agua tamponada a un pH entre 5. O... y 9.0 ; añadiéndose 10 a 1.000 unidades de una enzima B-D-galactosidasa, por gramo de B-D-galactopiranósido a la primera'mezcla de reacción ; y obteniéndose una segunda mezcla de reacción ;

una segunda etapa en la que la segunda mezcla de reacción se somete a una reacción a una temperatura comprendida entre una temperatura superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción y 45°C, durante 2 a 48 horas, para formar disacáridos en la segunda mezcla de reacción; una tercera etapa en la que se para la reacción cuando se han formado los disacáridos en la cantidad deseada, mediante un tratamiento elegido entre una desactivación de la ß-D-galactosidasa por congelación de la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre- 20gC y-170gC, una desactivación de la B-D-galactosidasa por calentamiento de la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre 95 y 110°C, y una separación de la B-D- galactosidasa de la segunda mezcla de reacción por ultrafiltración; obteniéndose una tercera mezcla de reacción ; una cuarta etapa en la que se separa de la tercera mezcla de reacción, mediante extracción o filtración, un fragmento aglicónico del sustrato B-D-galactopiranósido usado en la primera etapa; obteniéndose una cuarta mezcla de reacción; una quinta etapa en la que se aíslan fracciones que contienen 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa, seleccionada entre una adición de celita a la cuarta-mezcla de reacción, seguida de extracción sólido-líquido con un disolvente y elución con un primer eluyente en una columna, y una adición directa de carbób activo a la cuarta mezcla de reacción seguida de filtración y elución con un segundo eluyente, y una sexta etapa, las fracciones que contienen 4-0- ß-D-galactopiranosil-D-xilosa se cristalizan en una mezcla de cristalización seleccionada entre mezclas de

acetona/metanol en una relación entre 5/1 a 20/1, y mezclas de acetona/agua en una relación entre 5/1 a 20/1.

De acuerdo con la invención, la proporción de D- xilosa en la segunda mezcla de reacción es preferentemente de 7,5% en peso, la proporción del B-D- galactopiranósido en la segunda mezcla de reacción es de 1,5% en peso, y se añaden 100 unidades de B-D- galactosidasa, por gramo de B-D-galactopiranósido.

Opcionalmente, el medio de reacción puede comprender además al menos un medio codisolvente seleccionado entre dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y mezclas de los mismos, preferentemente en una proporción del 20% referida al medio de reacción. En una realización de la invención, el medio de reacción está tamponado a pH 7.

La reacción convenientemente se lleva a cabo a temperatura constante, a fin de aumentar su reproducibilidad. En una realización del procedimiento de la invención, la temperatura de reacción es superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción e inferior a 40°C. En otra realización, la reacción se realiza a temperatura ambiente, lo cual permite buenos rendimientos sin necesidad de enfriar la segunda mezcla de reacción. La reacción también puede realizarse a-5°C, o a 37gC. La temperatura de reacción es preferentemente inferior a 0°C pero superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción.

De acuerdo con la invención, el sustrato ß-D- galactopiranósido preferentemente se selecciona entre o- nitrofenil ß-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y lactosa. La enzima ß-galactosidasa puede ser ß-galactosidasa de E. coli o de Kluyveramyces lactis (como por ejemplo MAXILACTO). Cuando se usa Gal-ONP como sustrato se forma en la reacción o-nitrofenol que se elimina por extracción con acetato de etilo en el caso de que la reacción se pare por calentamiento, o bien se elimina por simple

filtración en el caso de que la reacción se pare por enfriamiento.

Cuando, en la tercera etapa del procedimiento la reacción se para mediante congelación de la segunda mezcla de reacción, se aplica preferentemente una temperatura de-78gC. Por otra parte, cuando en la tercera etapa la reacción se para mediante calentamiento de la segunda mezcla de reacción, se aplica preferentemente una temperatura de 100gC.

En la quinta etapa, la 4-0-ß-D-galactopiranosil-D- xilosa puede aislarse de la mezcla de reacción, mediante varios métodos alternativos.

Según un primer método alternativo, se elimina el agua de la cuarta mezcla de reacción para obtener un residuo de reacción que contiene los disacáridos, se somete el residuo de reacción a un tratamiento de acetilación para obtener un derivado peracetilado de 4-0- ß-D-galactopiranosil-D-xilosa, y a una separación del derivado peracetilado en columna cromatográfica en gel de sílice. La acetilación del residuo de reacción se realiza preferentemente con anhídrido acético en piridina, mientras que, preferentemente, la desacetilación del derivado peracetilado se realiza catalíticamente con metóxido sódico en metanol.

Según un segundo método alternativo, la cuarta mezcla de reacción se somete a una elución en columna con un primer eluyente que puede seleccionarse entre mezclas de agua con metanol, etanol o isopropanol, preferentemente una mezcla agua/isopropanol con una proporción de isopropanol de 1 a 10% (v/v), preferentemente del 2% (v/v).

La elución se lleva a cabo en una columna de filtración seleccionada entre columnas de filtración con rellenos de polímeros de dextranos entrecruzados, como por ejemplo una columna con relleno de SEPHADEX, columnas

de filtración con rellenos de polímeros de acrilamida, como por ejemplo una columna con relleno de BIOGEL, y columnas de filtración de carbón activo o de carbón activo-celita, para obtener fracciones que contienen 4- 0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa.

Preferentemente, la cuarta mezcla de reacción se concentra antes de someterse a la elución en la columna.

Según un tercer método alternativo se adiciona celita a la cuarta mezcla de reacción, se concentra hasta sequedad la mezcla así obtenida y se somete el residuo a una extracción sólido-líquido con un disolvente orgánico en un extractor"soxhlet"seguida de elución en una columna. El disolvente preferido para la extracción sólido-líquido es acetato de etilo. La columna está seleccionada entre columnas de filtración con rellenos de polímeros de dextranos entrecruzados, como por ejemplo una columna con relleno de SEPHADEX, columnas de filtración con rellenos de polímeros de acrilamida, como por ejemplo una columna con relleno de BIOGEL, y columnas de filtración de carbón activo o de carbón activo-celita. Preferentemente la columna es de carbón activo-celita, en la que se desactiva el carbón mediante adición de ácido clorhídrico.

Este tercer método alternativo ofrece la ventaja de eliminar la mayor parte de la xilosa-sobre todo cuando se usa en gran exceso en la reacción-antes de la elución en la columna con lo cual el relleno, así como la cantidad de primer eluyente que se necesita para la elución es mucho menor. Otra ventaja de este tercer método alternativo es que la extracción sólido-líquido en acetato de etilo es completamente selectiva puesto que en la fase líquida no se observa presencia de disacáridos, sino únicamente de xilosa y galactosa.

Según un cuarto método alternativo la elución en la quinta etapa se realiza en lugar de utilizando una columna de relleno, adicionando carbón activo a la cuarta

mezcla de reacción una vez separado el fragmento aglicónico del sustrato en la cuarta etapa, consiguiendo así que la 4-0-6-D-galactopiranosil-D-xilosa, se adsorba sobre el carbón activo y eluyendo la 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa del carbón activo con un segundo eluyente. Dicha elución se lleva a cabo preferentemente mediante lavados consecutivo. s con agua y con isopropanol diluido con proporción creciente en volumen de isopropanol en pasos sucesivos. La proporción en volumen de isopropanol está comprendida entre 1% y 3% en un primer paso, entre un 3% y un 5% en un segundo paso, y entre un 5% y un 7% en un tercer paso. La concentración de isopropanol preferida para el lavado es una secuencia de isopropanol al 2%, seguida de elución con isopropanol al 4% y seguida de elución con isopropanol al 6%. Del residuo obtenido por concentración, se obtiene la 4-0- ! 3-D- galactopiranosil-D-xilosa pura cristalizándola en acetona- agua.

Preferentemente, según este cuarto método alternativo se usa o-nitrofenil B-D-galactopiranósido como sustrato para la reacción.

Según este cuarto método alternativo se obtienen múltiples ventajas tales como que no es necesario calentar la segunda mezcla de reacción a 100su para detener la reacción, ni tampoco separar el fragmento aglicónico del sustrato en la cuarta etapa mediante extracción. De igual modo, se evita la necesidad de concentrar la cuarta mezcla de reacción, con lo que no se produce caramelización de la misma. Se reduce la cantidad de carbón activo que se necesitaría para el relleno de una columna, se reduce también la cantidad total de eluyentes, y se evita el uso de celita.

De acuerdo con la invención según la sexta etapa se cristalizan las fracciones que contienen 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa obtenidas en una mezcla de

cristalización elegida entre mezclas de acetona/metanol en una relación entre 5/1 a 20/1, y mezclas de acetona/agua en una relación entre 5/1 a 20/1, preferentemente una relación de 10/1.

La invención también se refiere a 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante el procedimiento anteriormente descrito, y a composiciones y disoluciones salinas o acuosa, que comprenden una 4-0-B- D-galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante dicho procedimiento, así como al uso de una 4-0-B-D- galactopiranosil-D-xilosa en la preparación de composiciones y disoluciones para la evaluación in vivo de lactasa intestinal en humanos.

En tales composiciones y disoluciones, la B-D- galactopiranosil-D-xilosa se combina con cantidades farmacéuticamente aceptables de al menos un aditivo seleccionado entre estabilizantes, protectores, saborizantes, lactosa, gelificantes, fluidificantes y conservantes, farmacéuticamente aceptables y en s, l convencionales.

La 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa o las composiciones o disoluciones que la contienen, se administran por vía oral y conducen a la aparición en orina de xilosa que, valorada espectrofotométricamente, se utiliza de manera específica, rutinaria, incruenta y sencilla para la evaluación diagnóstica de las deficiencias en actividad lactasa.

MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se describirá ahora en base a unos ejemplos que ilustrarán con más detalle algunas de las características anteriormente descritas.

Ejemplo 1 : Para determinar la influencia de la temperatura de reacción se realizó el siguiente ensayo : Se prepararon muestras de mezclas de reacción

compuestas por 125mg (500mM) de D-xilosa 25mg (50mM) de o-nitrofenil ß-D-gaLactopiranósido 1, 75ml de un medio de reacción comprendido por una disolución acuosa tamponada a pH 7 (O, 05M KH2PO4/K22HP04, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), a las que se añadieron unidades de enzima B-galactosidasa de E. Colí en función de las temperaturas de reacción aplicadas, de acuerdo con el siguiente esquema : temperatura de reacción unidades de enzima añadidas (gC) (u) 45 1,6 37 1,6 25 1,6 5 10 - 5 20 Los incrementos en la cantidad de enzima fueron necesarios para compensar la ralentización que se produce en la reacción por la bajada de la temperatura de reacción. Cabe indicar que es posible operar a temperaturas debajo del punto de congelación del agua gracias al descenso crioscópico que se produce en el medio de reacción debido a la alta concentración de azúcares en las muestras.

Se determinó, para cada una de las muestras y para cada etapa del procedimiento, la relación entre 4-, 2-y 3-0-3-D-galactopiranosil-D-xilosa, por cromatografia de gases con un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama y columna capilar SE-54 de 15 m de longitud, 0,15mm de diámetro interno y 0,3um de espesor.

Se empleó un flujo de nitrógeno de lml/min. El programa de temperaturas utilizado era : Temperatura inicial : 160°C Tiempo inicial : 2 min Incremento temperatura : 5°C/min Temperatura final : 250°C.

Las muestras se analizaron después de trimetilsililación mediante el siguiente protocolo : Una alícuota (10piu) se congeló a-170gC y se liofilizó hasta obtener un residuo seco, tras lo cual se añadió, al residuo seco, piridina (25µl) que contenía como referencia interna bencil B-D-xilopiranósido (10mM) y N-trimetilsilimidazol (25ß1), y se continuó la calefacción a 60°C durante 30 minutos. Los tiempos de retención de los picos asignables a los distintos disacáridos fueron los siguientes : Bencil B-D-xilopiranósido : 12,04min 2-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa : 18,46 y 19,50min 3-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa : 18, 30min 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa : 20,35 y 20,50min La siguiente tabla refleja las proporciones tomadas en el máximo de formación de disacáridos, de 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa (=compuesto I) frente a la suma de sus regioisómeros 2-y 3-0-B-D-galactopiranosil-D- xilosa que se obtuvieron :

Tabla 1 Temperatura Tiempo aproximado de relación compuesto I/ reacción (minutos) compuestos II + III 45 90 68 : 32 37 150 71 : 29 25 180 79 : 21 5 270 80 : 20 - 5 120 83 : 17 De la anterior tabla se desprende que a medida que se bajaba la temperatura, se produjo un aumento en la proporción de 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa.

Ejemplo 2 : Para determinar la influencia del pH en la reacción, se prepararon las siguientes muestras : Gal-ONP (50mM) : 25mg D-xilosa (500mM) : 125mg Galactosidasa de E. coli : 1,6 u Disolución acuosa tamponada (fosfato potásico 50mM, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) a pH : 8,5 1, 6ml 7 1, 6ml 5 1, 6ml y se hicieron reaccionar a 37°C.

E1 progreso de la reacción se siguió del mismo modo que se describe en el ejemplo 1.

La siguiente tabla refleja las proporciones de 4-0- ß-D-galactopiranosil-D-xilosa (=compuesto I) frente a la suma de sus regioisómeros 2-y 3-o-ß-D-galactopiranosil- D-xilosa que se obtuvieron : Tabla 2

pH Tiempo aproximado de relación compuesto I/ reacción (minutos) compuestos II + III 8,5 60 68 : 32 7 150 71 : 29 5 180 81 : 19 De la anterior tabla se desprende que en medio básico (pH=8,5), la proporción del compuesto I era menor que en medio neutro (pH=7), detectándose la mayor proporción del compuesto I en medio ácido (pH=5).

Ejemplo 3 : Para sintetizar 4-0-ß-D-galactopiranosil-D- xilosa se disolvieron 6g de o-nitrofenil B-D- galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0, 05M KH2PO4/K22HP04, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieron 2mg (640u) de enzima B- galactosidasa de E. Coli, y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 30° C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 4 horas). El seguimiento de la reacción se llevó a cabo por cromatografía en capa fina con isopropanol/NH3 (30%)/H20 = 7, 5/0, 5/2, 5 como eluyente y tomando como referencia los valores de Rf siguientes : Rf (Gal-ONP) : 0,58 Rf (D-xilosa) : 0,47 Rf (4-0-jB-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,17 Rf (2-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa + 3-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,26 La reacción se paró por calentamiento en baño de agua a 1009C durante 10 minutos, y seguidamente se extrajo el o-nitrofenol formado con CH2Cl2. La disolución acuosa se concentró hasta sequedad y el residuo se acetiló de manera en sí convencional (anhídrido

acético/piridina = 1 : 1, a temperatura ambiente, durante una noche y con agitación magnética). Pasado este tiempo, la mezcla de reacción se concentró y los restos de piridina y anhídrido acético se eliminaron por adiciones y evaporaciones sucesivas de tolueno. Las sales precipitadas se filtraron, el filtrado se concentró a sequedad y el residuo se cromatografió en columna de gel de sílice utilizando como eluyente un gradiente de hexano/acetato de etilo de 4 : 1-1 : 1. De la columna se eluyó primero la D-xilosa acetilada y después la mezcla de los disacáridos acetilados. Una vez concentradas las fracciones que contenían la mezcla de disacáridos, el residuo se disolvió en MeOH, se añadió una disolución de MeONa/MeOH 1M, y la mezcla así obtenida se agitó hasta que la desacetilación era completa (seguimiento por tlc con isopropanol/NH3/H20). La mezcla se neutralizó con AMBERLITA IR-120 (H+) y se concentró hasta sequedad. La mezcla de disacáridos libres se cristalizó dos veces sucesivas con MeOH/acetona, obteniéndose 1, 07g de 4-0-3- D-galactopiranosil-D-xilosa pura con un 17% de rendimiento basado en el Gal-ONP inicial. (Punto de fusión : 171-176gC ; 1HRMN (D20) 6 5,17 Y 4,58 (2D, lh, J 3,8 y 7,8Hz, H-la y H-lß), 4,55 y 4,45 (2d, 1H, J 7.8 Hz, H-I'), 4,05 (dd, 1H, J 5.3 y 11.6Hz, H-5e), 3,38 (dd, 1H, J 10,6 y 11,6 Hz), 3,25 (dd, IH, J 7,8 y 9,4 Hz, H-2').

Ejemplo 4 : Se preparó una columna de actívo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HC1 (35%) para desactivar el carbón, así como para lavar restos de hierro y. cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm (o) x 50cm, y se compactó.

Para sintetizar 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil ß-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0, 05M SH2PO4/K22H2o4t MgC12, Smtf mercaptoetanol), se añadieron 2mg (640u) de enzima ß- galactosidasa de E. Coli, y se sometió la disolución asi obtenida a incubación a 37° C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas). Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 1009C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. La disolución acuosa se concentró hasta un volumen aproximado de 50ml, se filtró a través de lana de vidrio y se pasó por la columna de carbón gactivo/celita. En primer lugar se eluyó con agua el exceso de D-xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de EtOH/H2O (2%-10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla sí obtenida en frío. La 4-0- B-D-galactopiranosil-D-xilosa cristalizó de forma pura., obteniéndose 970mg, es decir, un 19% basado en el Gal-ONP inicial, cuyos datos espectrales coincidieron con los expuestos con respecto al producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 3.

Ejemplo 5 : Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HC1 (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y'cenizas alcalinas, y posteriormente se

lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm (o) x 50cm, y se compactó.

Para sintetizar 4-0--D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil ß-D-gaLactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0, 05M KH2PO4/K22HP04, imm MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieron 2mg (640u) de enzima B- galactosidasa de E. Coli, y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37° C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas). Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 1009C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. La disolución acuosa se concentró hasta un volumen de aproximadamente 50ml, se filtró a través de lana de vidrio y se pasó por la columna de carbón activo/celita.

Para cristalizar la 4-0-B-D-galactopiranosil-D- xilosa, en primer lugar se eluyó con agua el exceso de D- xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de EtOH/H20 (2%-10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron, se concentraron a un volumen reducido y se disolvieron en la cantidad mínima posible de agua, tras lo cual se añadió acetona gota a gota, hasta la aparición de turbidez dejándose cristalizar la mezcla así obtenida a temperatura ambiente durante dos horas. Al cabo de dos horas se comprobó, con una capa fina del sobrenadante (transparente) que aún quedaba una cantidad de 4-0-ß-D- galactopiranosil-D-xilosa sin cristalizar. Se volvió a añadir acetona hasta turbidez y se dejo reposar otras dos horas. Finalmente, se añadió más acetona y se almacenó la muestra en nevera durante la noche y se comprobó que el

sobrenadante producido contenía sólo una mínima cantidad de 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa. Los cristales de 4- O--D-galactopiranosil-D-xilosa se filtraron y lavaron con acetona.

La 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa se obtuvo de forma pura, obteniéndose 1557mg, es decir, un 30% basado en el Gal-ONP inicial, cuyos datos espectrales coincidieron con los expuestos con respecto al producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 3.

Ejemplo 6 : Se preparó una-columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HC1 (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm () x 50cm, y se compactó.

Para sintetizar 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil ß-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa-én 330ml de agua tamponada a pH 6,8 (0, 05M KH2PO4/K22HPO4, 1MM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieron 70 unidades de enzima 13 :- galactosidasa de Kluyveramyces lactís (MAXILACTO), y disolución así obtenida se sometió a incubación a 37° C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas). La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H20 (7,5/0,5/2,5) resultando los siguientes Rf's : Rf (Gal-ONP) : 0,58 Rf (D-xilosa) : 0,47 Rf (4-0-13-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,17

Rf (2-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa + 3-0-ß-D-galactopirancsil-D-ilosa) : 0,26 Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 4, se paró la reacción por calentamiento a 100°C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo y se filtró para eliminar restos de la enzima. La disolución acuosa se concentró a vacío a un volumen aproximado de 45ml, y se pasó por columna de carbón activo/celita. En primer lugar se eluyó con agua el exceso de D-xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de EtOH/H2O (2% 10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-ß-D-galactopiranosil- D-xilosa se juntaron y se concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla así obtenida en frío. La 4-0-B-D-galactopiranosil-D-xilosa cristalizada se filtró por placa filtrante, obteniéndose 817mg, es decir, un 16% basado en el Gal-ONP inicial.

Ejemplo 7 : Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HC1 (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron nutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografia de 5cm () x 50cm, y se compactó.

Para sintetizar 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil ß-D-galactopiran6sido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (O, 05M KH2P04/K22HP04, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieron 80 unidades de enzima fi-

galactosidasa de E. coli, y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37° C en un agitador orbitálico durante 24 horas. La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H ? O (7,5/0,5/2,5) resultando los siguientes Rf's : Rf (Gal-ONP) : 0,58 Rf (D-xilosa) : 0,47 Rf (4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0 17 Rf (2-o-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa + 3-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,26 Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 100°C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo y se filtró para eliminar restos de la enzima. La disolución acuosa se concentró a vacío hasta un volumen aproximado de 70ml, y la disolución concentrada se eluyó a través de una columna de carbón activo/celita. En primer lugar se eluyó con isopropanol/agua al 2% y se recogieron 1,3 litros.

Después se recogieron fracciones al 4% hasta 2,6 litros, utilizándose un volumen total de 3,9 litros.

Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0 J3-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla así obtenida en frío. La 4-0-B-D-galactópiranosil- D-xilosa cristalizada se filtró por placa filtrante, obteniéndose 1. 213mg, es decir, un 24% basado en el Gal- ONP inicial.

Ejemplo 8 : Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 24g de carbón activado (DARCO G-60) y 24 g de celita, y se añadió agua hasta que

se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 18ml de HCl (35%) para desactivar el carbón así como lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía y se compactó.

Para sintetizar 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil B-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0, 05M KH2PO4/K22HP04, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieren 80 unidades de enzima galactosidasa de E. Coli, y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37g C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (24 horas). La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H2O (7, 5/0, 5/2, 5) de manera análoga a la indicada en el ejemplo 7. Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 100°C durante 10 minutos, se dejó enfriar y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. A la disolución acuosa se añadió celita (40g) y la mezcla se concentró hasta sequedad. El residuo sólido se sometió a una extracción sólido-líquido usando un extractor"soxhlet"equipado con cartucho de celulosa y usando acetato de etilo (500ml) como disolvente. Al cabo de 23 horas el sólido resultante se lavó con agua (3 x 40 ml) y la disolución acuosa se eluyó a través de la columna de carbón activo-celita. En primer lugar se eluyó con isopropanol/agua al 2% y a continuación con isopropanol/agua al 4%, utilizándose un volumen total de eluyente de 400 ml. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-13-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta sequedad. El residuo se cristalizó de acetona-agua de manera similar a la descrita en el ejemplo 7, obteniéndose 0,44g de

disacárido puro y cristalino.

Ejemplo 9 : Para sintetizar 4-0-ß-D-gaLactopiranosil-D- xilosa se disolvieron 4,12g de o-nitrofenol ß-D- galactopiranósido (Gal-ONP) y 20, 6 g de D-xilosa en 272ml de agua tamponada a pH 7 (0, OSM KH2P04/K22HP04, 1mM MgCl2, 5mM mercaptoetanol), se añadieron 66 unidades de enzima ß-galactosidasa de E. Coli, y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37gC en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (21 horas). La reacción de detuvo por enfriamiento a 0gC y se filtró el o-nitrofenol como un sólido. Al filtrado se le añadieron 60 g de carbón activo y la mezcla resultante se agitó durante 30 min. Por medio de tIc del sobrenadante se observó la ausencia de disacárido en disolución, al estar adsorbido sobre el carbón activo. La mezcla se filtró y el sólido de carbón activo se lavó con agua (400 ml), isopropanol al 2% (100 ml), isopropanol al 4% (200 ml) e isopropanol al 6% (200 ml). Las fracciones que contenían disacárido 4-0-ß-D-galactopiranosil-D- xilosa se concentraron y el residuo (2,38 g) se cristalizó de acetona-agua obteniéndose 1,55 g de un sólido que se cristalizó de nuevo de la misma mezcla de disolventes de manera análoga a la del ejemplo 7. Se obtuvieron 1,32 g de disacárido puro (32%).