Die vorliegende Erfindung betrifft ein biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von Furandimethanolen aus Hydroxymethylfurfuralen, katalysiert von geeigneten Alkoholdehydrogenase-Enzymen und die Verwendung der so hergestellten Dimethanole zur Herstellung von bzw. in Polyestern, Bisphenol-A Ersatzstoffen, Harzen, Bindern, Polyethern, Lösemitteln, Aminen.

Hintergrund der Erfindung

Hydroxymethylfurfural (HMF) stellt eine wichtige Ausgangsubstanz für die chemische Synthese dar. Prinzipiell ist HMF aus nachwachsenden Rohstoffen via Fructose oder oder wie kürzlich berichtet aus Cellulose zugänglich (Y. Su, H.M. Brown, X. Huang, X. Zhou, J.E. Amonette, Z.C. Zhang: Single-step conversion of cellulose to 5- hydroxymethylfurfural (HMF), a versatile platform chemical, in: Appl. Catalysis, 2009, A 361, S. 117-122). Für eine einfachere Folgechemie wäre es sinnvoll, HMF in einen stabileren Baustein mit einheitlicher Redoxstufe umzuwandeln. Ein solcher Baustein könnte beispielsweise Diformylfuran (DFF) oder Furandimethanol (FDM) sein.

Furandimethanol Hydroxymethylfuran Diformylfuran (FDM) (HMF) (DFF)

Erschwerend für die weitere Umsetzung von HMF ist der Umstand, dass bei den etablierten HMF-Synthesen größere Mengen Huminstoffe anfallen, die beispielsweise eine Reduktion mit klassischen Homogenkatalysatoren deutlich erschweren (Küster, Ben F.M., Laurens, Jan; Stärke, 1977, 29, S. 172).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Reduktion von HMF Verbindungen bereitzustellen, welches derartige Nachteile nicht aufweist.

Kurzfassung der Erfindung Obige Aufgabe konnte überraschenderweise durch Bereitstellung eines biokatalytischen Verfahrens gemäß den beiliegenden Patentansprüchen gelöst werden.

Überraschenderweise konnten durch umfangreiches Screening geeignete Dehydrogenasen lokalisiert werden, welche die gewünschte Reduktionsreaktion katalysieren.

Figurenbeschreibung

Figur 1 zeigt das Ergebnis eines Photometerscreenings auf enzymatische Reduktion von HMF für 5 verschiedene Dehydrogenasen. 1 Unit entspricht der Proteinmenge, die in einer Minute Ι μηηοΙ NAD(P)H oxidiert bzw. NAD(P) reduziert.

Figur 2 veranschaulicht den beobachteten Umsatz von 75mmol (9,5 g) HMF mit dem PDH/GDH-System (Reaktionsvolumen 0,5 Liter).

Figur 3 veranschaulicht die Reduktion von HMF [2 g; [O] zu FDM [D]mit der Dehydrogenase EbN 1 (LU1 1558) (Reaktionsvolumen 0,1 L).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1. Allgemeine Definitionen

„Dehydrogenasen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind allgemein Enzyme bzw. Enzymmutanten, welche insbesondere die Aktivität einer HMF Reduktase zeigen.

Insbesondere handelt es sich um Vertreter von Alkoholdehydrogenasen der Klassen

EC 1 .1 .1.1 und 1 .1.1.2.

Aufgrund der Reversibilität enzymatischer Reaktionen betrifft die vorliegende Erfindung die hierin beschriebenen enzymatischen Umsetzungen in beiden

Umsetzungsrichtungen.

„Funktionale Mutanten" einer „Dehydrogenase" oder eines „Enzyms mit HMF

Reduktase-Aktivität" umfassen die unten definierten„funktionalen Äquivalente" solcher

Enzyme.

Der Begriff „biokatalytisches Verfahren" betrifft jegliches in Gegenwart von katalytischer Aktivität einer erfindungsgemäßen„Dehydrogenase" oder eines„Enzyms mit HMF Reduktase-Aktivität" durchgeführtes Verfahren, d.h. Verfahren in Gegenwart von rohem, oder gereinigtem, gelöstem, dispergiertem oder immobilisiertem Enzym, oder in Gegenwart ganzer mikrobieller Zellen, welche derartige Enzymaktivität aufweisen oder exprimieren. Biokatalytische Verfahren umfassen somit enzymatische als auch mikrobielle Verfahren.

Der Begriff „stereospezifisch" bedeutet, dass eines von mehreren möglichen Stereoisomeren einer erfindungsgemäß hergestellten Verbindung mit wenigstens eine Asymmetriezentrum durch die Wirkung eines erfindungsgemäßen Enzyms in hohem „Enatiomerenüberschuß" oder hoher "Enantiomerenreinheit", wie z.B. wenigstens 90%ee, insbesondere wenigstens 95 %ee, oder wenigstens 98 %ee, oder wenigstens 99 %ee produziert wird. Der ee% Wert wird nach folgender Formel berechnet: ee% = [XA-XB]/[ XA+XB] ^* 100, worin X _A und X _B für den Molenbruch der Enantiomere A bzw B stehen.

Alkyl sowie alle Alkylteile in davon abgeleiteten Resten, wie z.B. Hydroxyalkyl steht für: gesättigte, geradkettige oder verzweigte Niedrigalkylreste, d.h. Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 4, 1 bis 6, 1 bis 8 oder 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, z. B.

Ci-C ₆ -Alkyl: wie Methyl, Ethyl, Propyl, 1 -Methylethyl, Butyl, 1 -Methyl-propyl, 2- Methylpropyl, und 1 ,1 -Dimethylethyl als beispielhafte Vertreter für CrC ₄ -Alkyl; sowie Pentyl, 1 -Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Di-methylpropyl, 1 -Ethylpropyl, Hexyl, 1 ,1 -Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 1 -Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3- Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,1 -Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1 -Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethyl-1 -methylpropyl und 1 -Ethyl-2- methylpropyl.

Alkenyl steht für ein- oder mehrfach, insbesondere einfach ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Niedrigalkenylreste, d.h. Kohlenwasserstoffreste mit 2 bis 4, 2 bis 6, 2 bis 8, 2 bis 10 oder 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer Doppelbindung in einer beliebigen Position, z. B. C ₂ -C ₆ -Alkenyl wie Ethenyl, 1 -Propenyl, 2-Propenyl, 1 - Methylethenyl, 1 -Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1 -Methyl-1 -propenyl, 2-Methyl-1 - propenyl, 1 -Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1 -Pentenyl, 2-Pentenyl, 3- Pentenyl, 4-Pentenyl, 1 -Methyl-1 -butenyl, 2-Methyl-1 -butenyl, 3-Methyl-1 -butenyl, 1 - Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1 -Methyl-3-butenyl, 2-Methyl- 3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1 ,1 -Dimethyl-2-propenyl, 1 ,2-Dimethyl-1 -propenyl, 1 ,2- Dimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-1 -propenyl, 1 -Ethyl-2-propenyl, 1 -Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1 -Methyl-1 -pentenyl, 2-Methyl-1 -pentenyl, 3-Methyl-1 -pentenyl, 4-Methyl-1 -pentenyl, 1 -Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1 -Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1 -Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl,

1 ,1 -Dimethyl-2-butenyl, 1.1 - Dimethyl-3-butenyl, 1.2- Dimethyl-1 -butenyl, 1 ,2-Dimethyl-2-butenyl, 1.2- Dimethyl-3-butenyl, 1.3- Dimethyl-1 -butenyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butenyl, 1.3- Dimethyl-3-butenyl, 2.2- Dimethyl-3-butenyl, 2, 3-Dimethyl-1 -butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2.3- Dimethyl-3-butenyl,

3,3-Dimethyl-1 -butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1 -Ethyl-1 -butenyl, 1 -Ethyl-2-butenyl, "l -Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1 -butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-1 -methyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-2-methyl-1 -propenyl und 1 -Ethyl-2-methyl-2-propenyl.

2. Spezielle Ausführungsformen der Erfindung

Biokatalytisches Verfahren zur Herstellung einer Furandimethanol (FDM)

Verbindung der allgemeinen Formel I

worin

a und b unabhängig voneinander für eine C-C-Einfach- oder Doppelbindung stehen, insbesondere gleichzeitig für eine C-C-Dopelbindung (C=C) stehen R-i, R ₂ und R ₃ gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für H, Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, Stehen, insbesondere gleichzeitig für H oder Niedrigalkyl, wie insbesondere Methyl, stehen; und

R ₄ und R ₅ gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für H, Niedrigalkyl, Halogen, Hydroxyl, Mercapto, Amino oder Nitro stehen; insbesondere gleichzeitig für H oder Niedrigalkyl, wie Methyl, stehen; wobei man eine Hydroxymethylfurfural (HMF) - Verbindung der der Formel II worin a, b, Ri bis R ₅ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen; in Gegenwart einer HMF reduzierenden Dehydrogenase und in Gegenwart des Cofaktors NAD(P)H, insbesondere NADH , und unter dessen Verbrauch umsetzt und gegebenenfalls das anfallende Reaktionsprodukt anschließend weiter reinigt.

Verfahren nach Ausführungsform 1 , wobei die HMF reduzierenden Dehydrogenase eine Alkohldehydrogenase (ADH) (E.C. 1 .1 .1 .1 , für NAD abhängiges Enzym) oder E.C. 1 .1 .1 .2 (für NADP abhängiges Enzym) ist, ausgewählt unter ADHs, isolierbar aus Mikroorganismen der Gattungen Aromatoleum, Stenotrophomonas, Streptomyces und Escherichia.

Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1 und 2, wobei die ADH eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder eine dazu zu mindestens 60% identische Aminosäuresequenz umfasst.

Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Umsetzung enzymatisch, in Gegenwart wenigstens einer der ADHs, eines ADH enthaltenden Proteingemisches, oder in Gegenwart eines rekombinanten, eine ADH funktional exprimierenden Mikroorganismus, eines davon abgeleiteten ADH-haltigen Zellhomogenats oder einer ADH-haltigen Fraktion davon erfolgt.

Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die ADH oder der die ADH funktional exprimierende Mikroorganismus im Reaktionsgemisch frei oder in immobilisierter Form vorliegt. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 4 und 5, wobei der rekombinante Mikroorganismus ein ADH funktional exprimierenden Bakterienstamm, insbesondere E. coli-Stamm, ist. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man den bei der Umsetzung verbrauchten Cofaktor regeneriert.

Verfahren nach Ausführungsform 7, wobei der Cofaktor enzymatisch regeneriert wird.

Verfahren nach Ausführungsform 8, wobei die Umsetzung mit einem Cofaktorregenerierungssystem gekoppelt ist, bei welchem verbrauchtes NADH durch die ADH EbN1 unter Verbrauch von Isopropanol regeneriert wird;

Verfahren nach Ausführungsform 8, wobei die Umsetzung mit einem Enzym gekoppelt ist, welches verbrauchtes NADH regeneriert, wobei das Enzym ausgewählt ist unter Glutamat gehydrogenase (GluDH) , NADH- Dehydrogenasen, Formiatdehydrogenasen (FDH), Alkoholdehydrogenasen (ADH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH),

Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie Glucosedehydrogenasen (GDH), wobei das cofactorregenerierende Enzym in freier oder immobilisierter Form vorliegt oder von einem rekombinanten Mikroorganismus exprimiert wird.

Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die eingesetzte HMF-Verbindung Hydroxymethylfurfural ist und zu Furandimethanol reduziert wird.

Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei das eingesetzte HMF synthetisch aus Fructose oder Cellulose gewonnen wird.

Verwendung einer Verbindung der Formel I, hergestellt nach einem Verfahren der Ausführungsformen 1 bis 12, oder eines nach einem Verfahren der Ausführungsformen 1 bis 12 erhaltenen Reaktionsproduktes zur Herstellung von bzw. in Polyestern, Bisphenol-A Ersatzstoffen, Harzen, Bindern, Polyethern, Lösemitteln, Aminen. 3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung

3.1 Enzyme

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin konkret offenbarten „Dehydrogenasen" oder„Enzyme mit HMF Reduktase-Aktivität" (gemäß SEQ ID NO:2, 4, 6, 8) beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme und Enzymmutanten insbesondere SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. HMF-Reduktase-Aktivität, besitzen.

So versteht man beispielsweise unter„funktionalen Äquivalenten" Enzyme und Mutanten, die in einem verwendeten Test auf „HMF-Reduktase-Aktivität" im Sinne der Erfindung (d.h. mit einem Referenzsubstrat, wie HMF, unter Standardbedingungen) eine um mindestens 1 %, insbesondere um mindestens etwa 5 bis 10 % wie z.B. mindestens 10% oder mindestens 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Enzyms, umfassend eine hierin konkret definierte Aminosäuresequenz (z.B. einer Mutante, abgeleitet von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8) aufweisen.

Die Aktivitätsangaben für funktionale Äquivalente beziehen sich hierin, wenn nichts anderes angegeben ist) auf Aktivitätsbestimmungen, durchgeführt mittels eines Referenzsubstrates, wie HMF, unter Standardbedingungen, wie hierin definiert.

Die „HMF-Reduktase-Aktivität" im Sinne der Erfindung kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. HMF, unter Standardbedingungen, wie oben beschrieben und im experimentellen Teil erläutert, zu nennen.

Funktionale Äquivalente sind außerdem z.B. zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 5 bis 10, wie insbesondere 6,5 bis 9,5 oder 7 bis 8 oder etwa bei 7,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 80°C oder 20°C bis 70°C, wie z.B. etwa 30 bis 60°C oder etwa 35 bis 45°C, wie etwa bei 40°C.

„Funktionale Äquivalente" umfassen die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1 bis 50, 2 bis 30, 2 bis 15, 4 bis 12 oder 5 bis 10„zusätzliche Mutationen", wie Aminosäure- Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zusammengefasst:

Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gin; His

Asp Glu

Cys Ser

Gin Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn ; Gin lle Leu; Val

Leu lle; Val

Lys Arg ; Gin ; Glu

Met Leu ; lle

Phe Met ; Leu ; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp ; Phe

Val lle; Leu

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide.

„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.

Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme.

Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.

Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algorithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble- Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1 -7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ). Alternativ kann jedoch auch in Mikroorganismen, wie z.B. ohne darauf beschränkt zu sein, in solchen der Gattungen Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsieila, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia oder Yokenella, nach geeigneten Dehydrogenase, insbesondere ADH, insbesondere Enzymen mit HMF-Reduktase- Aktivität, gesucht werden, die die entsprechende Reduktion von HMF zu FDM katalysieren.

3.2 Nukleinsäuren

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein wie oben beschriebenes Enzym bzw. eine oben beschriebenen Mutante davon mit HMF- Reduktase-Aktivität kodieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Identitätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen.

Unter„Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151 -1 ) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:

Multiple alignment parameters:

Gap opening penalty 10

Gap extension penalty 10

Gap Separation penalty ränge 8

Gap Separation penalty off

% identity for alignment delay 40

Residue specific gaps off

Hydrophilic residue gap off

Transition weighting 0 Pairwise alignment parameter:

FAST algorithm on

K-tuple size 1

Gap penalty 3

Window size 5

Number of best diagonals 5

Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, gemäß Internetadresse: http://www.ebi.ac.Uk Tools/clustalw/index.html# und mit den folgenden Parametern bestimmt werden:

DNA Gap Open Penalty 15.0

DNA Gap Extension Penalty 6.66

DNA Matrix Identity

Protein Gap Open Penalty 10.0

Protein Gap Extension Penalty 0.2

Protein matrix Gönnet

Protein/DNA ENDGAP -1

Protein/DNA GAPDIST 4

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer

Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896- 897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen

Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.

Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nichtkomplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure

Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Die„Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen.

Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch,

E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31 -9.57 oder in Current Protocols in

Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6 beschrieben.

Unter „stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 %

Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschschritt der Filter mit 0,1x

SSC bei 65°C.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.

So können weitere erfindungsgemäße, Enzyme mit HMF-Reduktase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:1 , 3, 5, 7 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen, für Enzyme mit HMF-Reduktase- Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen abgeleitet von Sequenz SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA- Sequenz, zu verstehen.

Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertion, Inversion und/oder Deletion verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des Weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

3.3 Generierung funktionaler Mutanten

Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler

Mutanten erfindungsgemäßer Enzyme bekannt.

Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 .

Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der von diesen codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise - die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),

- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler- Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ),

- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- die SeSaM-Methode (Sequence Saturation Method), bei der bevorzugte Austausche durch die Polymerase verhindert werden. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279

- das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von

Nukleotidsequenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder

- das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).

Unter Anwendung der so genannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display-Systeme.

Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen, wie z.B. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern auch wichtige Informationen in Bezug auf Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere können sogenannte „hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eignen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren.

Ebenfalls sind Informationen ableitbar bezüglich Aminosäure-Sequenzpositionen, in deren Bereich Mutationen durchgeführt werden können, die voraussichtlich wenig Einfuß auf die Enzymaktivität haben sollten, und als potentielle „silent mutations bezeichnet werden können. 3.4 Konstrukte

Gegenstand der Erfindung sind außerdem, insbesondere rekombinante, Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie, insbesondere rekombinante, Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Unter einer„Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer „regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.

Unter einer „Expressionskassette" oder „Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.

Die Begriffe "Expression" oder „Überexpression" beschreiben im Kontext der

Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einem „Promotor", einer„Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer „Promotorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.

Unter einer„funktionellen" oder„operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.

Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere eine für ein Enzym mit HMF-Reduktase-Aktivität kodierende Sequenz, z.B. abgeleitet von SEQ ID NO: 1 , 3, 5 oder 7 oder kodierend für ein Enzym der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein. Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl ^q" T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaP _B AD)SP6-, lambda-P _R - oder im lambda-P _L -Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.

Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pl N-l 11 ^{1 3} -B 1 , Agt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac ⁺ , pBIN 19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen. Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Codonnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

3.5 Mikroorganismen

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff„Mikroorganismus" der Wildtyp- Mikroorganismus oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma- Proteobacterien zu finden

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden.

3.6 Rekombinante Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten

Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1 . Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide.

Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische

Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in

Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach

Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen werden. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Für die Expression erfindungsgemäßer Mutanten kann auf die Beschreibung der

Expression des Wildtypenzyms EbN1 und der dafür brauchbaren Expressionssysteme in der WO2005/108590 und der WO2006/094945, zurückgegriffen werden, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. 3.7. Enzymimmobilisierung

Die erfindungsgemäßen Enzyme (Enzyme mit HMF-Reduktase-Aktivitä sowie die ggf. zur Kofaktorregenerierung erforderlichen Ezyme, wie z.B eine GDH) können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991 -1032, Wiley- VCH, Weinheim beschrieben. Weitere Informationen zu Biotransformationen und Bioreaktoren zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren findet man z.B. auch in Rehm et al (Ed) Biotechology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.

3.8. Enzymatische Reduktion von Hydroxymethylfurfuralen der Formel (II)

Insbesondere wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines Enzyms durchgeführt, wobei das Enzym von einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 , 3, 5 oder 7 oder einem funktionalen Äquivalent davon kodiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz Bestandteil eines Genkonstrukts oder Vektors ist.

Die Wirtszelle, die ein Genkonstrukt oder einen Vektor enthält, worin die Nukleinsäuresequenz enthalten ist, die das Enzym mit der gewünschten Aktivität kodiert, bezeichnet man auch als transgenen Organismus. Die Herstellung solche transgenen Organismen ist prinzipiell bekannt.

Als transgene Organismen werden insbesondere Zellen aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Hefen ausgewählt. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Pilzen der Gattung Pichia oder Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus oder Lactococcus. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Spezies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor oder Zymomonas mobilis.

Weiterhin bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym mit der HMF-Reduktase-Aktivität von einem Mikroorganismus generiert wurde, der das Enzym überproduziert und der ausgewählt wurde aus der Gruppe der Mikroorganismen bestehend aus den Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus und Lactococcus.

Besonders zu erwähnen ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet dass das Enzym mit der HMF-Reduktase-Aktivität von transgenen Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis oder Zymomonas mobilis erzeugt wurde, welche das Enzym mit der HMF-Reduktase-Aktivität überproduzieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in wenigstens einer der folgenden Formen vorliegt: a) freies, gegebenenfalls gereinigtes oder teilweise gereinigtes Polypeptid; b) immobilisiertes Polypeptid;

c) aus Zellen isoliertes Polypeptid gemäß a) oder b);

d) ganze Zelle, gegebenenfalls ruhende oder wachsende Zellen, enthaltend mindestens ein solches Polypeptid;

e) Lysat oder Homogenisat der Zellen gemäß d).

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Mikroorganismen sind, bevorzugt transgene Mikroorganismen exprimierend mindestens ein heterologes Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid mit der HMF-Reduktase-Aktivität.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst wenigsten die folgenden Schritte a), b) und d): a) einen ein Enzym mit HMF-Reduktase-Aktivität produzierenden Mikroorganismus aus einer natürlichen Quelle zu isolieren oder rekombinant herzustellen,

b) diesen Mikroorganismus zu vermehren,

c) aus dem Mikroorganismus das Enzym mit HMF-Reduktase-Aktivität gegebenenfalls zu isolieren oder eine dieses Enzym enthaltende Proteinfraktion herzustellen, und

d) den Mikroorganismus gemäß Stufe b) oder das Enzym gemäß Stufe c) in ein Medium zu überführen, das Substrat, z.B. ein HMF der allgemeinen Formel (II), enthält.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Substrat, wie z.B. HMF, mit dem Enzym, das die Aktivität einer HMF-Reduktase besitzt, in einem Medium in Kontakt gebracht und/oder so inkubiert, dass eine Umsetzung des Substrats in Gegenwart des Enzyms erfolgt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Medium um ein wässriges Reaktionsmedium. Der pH-Wert des wässrigen Reaktionsmediums, in dem das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt durchgeführt wird, wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und 10, bevorzugt zwischen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehalten.

Bei den wässrigen Reaktionsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH-Wert von vorzugsweise von 5 bis 8, aufweisen. Als Puffer kann ein Citrat-, Phosphat-, TRIS- (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) oder MES-Puffer (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) verwendet werden. Ferner kann das Reaktionsmedium noch weitere Zusätze enthalten, wie z.B. Detergentien (beispielsweise Taurodeoxycholat).

Das Substrat, wie z.B. HMF, wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,001

- 200mM, besonders bevorzugt von 0,01 - 25mM in die enzymatische Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.

Die enzymatische Reduktion erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unterhalb der Desaktivierungstemperatur des eingesetzten Enzyms und oberhalb von - 10°C. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C und 95°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 15°C und 60°C, insbesondere zwischen 20 und 40°C, z.B. bei etwa 25 bis 30 °C durchgeführt.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Reaktion von HMF bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40 °C und/oder einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 erfolgt.

Neben diesen einphasigen wässrigen Systemen können in einer weiteren Variante der Erfindung, falls erforderlich, auch zweiphasige Systeme eingesetzt. Dabei werden neben einer wässrigen Phase als zweite Phase, organische, nicht-wassermischbare Reaktionsmedien verwendet. Dadurch akkumulieren hydrophobere Reaktionsprodukte in der organischen Phase. Nach der Reaktion ist das Produkt, in der organische Phase leicht von der wässrigen Phase, die den Biokatalysator enthält, abtrennbar. Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes Verfahren aber dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einphasigen wässrigen Systemen erfolgt.

Das Reaktionsprodukt kann ggf. unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln extrahiert werden und gegebenenfalls zur Aufreinigung destilliert werden.

Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Cyclooctan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, die Xylole, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol, aliphatische acyclische und cyclische Ether oder Alkohole, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Isopropanol, Diethylether, Methyl-tert-butylether, Ethyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetrahydrofuran oder Ester wie Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Besonders bevorzugt werden die vorgenannten Heptan, Methyl-tert- butylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Ethylacetat verwendet.

Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Reduktion des HMF-Substrats der Formel (II) in Gegenwart eines geeigneten Cofaktors (auch als Cosubstrat bezeichnet). Als Cofaktoren für die Reduktion des Ketons dient üblicherweise NADH und/oder NADPH. Daneben können Enzyme mit HMF-Reduktase-Aktivität als zelluläre Systeme eingesetzt werden, die inhärent Cofaktor enthalten, oder es können alternative Redoxmediatoren zugesetzt werden (A. Schmidt, F. Hollmann und B. Bühler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim).

Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Reduktion des HMF-Substrats der Formel (II) außerdem in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels (oder auch als Opfersubstrat bezeichnet), welches den im Verlauf der Reduktion den oxidierten Cofaktor regeneriert. Beispiele für geeignete Reduktionsmittel (Opfersubstrate) sind Zucker, insbesondere Hexosen, wie Glucose, Mannose, Fructose, und/oder oxidierbare Alkohole, insbesondere Ethanol, Propanol oder Isopropanol, sowie Formiat, Phosphit oder molekularer Wasserstoff. Zur Oxidation des Reduktionsmittels und damit verbunden zur Regeneration des Coenzyms kann eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucosedehydrogenase bei Verwendung von Glucose als Reduktionsmittel oder Formiat-Dehydrogenase bei der Verwendung von Formiat als Reduktionsmittel, zugesetzt werden. Diese kann als freies oder immobilisiertes Enzym oder in Form von freien oder immobilisierten Zellen eingesetzt werden. Ihre Herstellung kann sowohl separat als auch durch Coexpression in einem (rekombinanten) Dehydrogenase-Stamm erfolgen. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung des EbN1 Enzyms erübrigt sich die Verwendung eines weiteren Dehydrogenaseenzyms da das gleichen Enzym, das die HMF-Reduktion katalysiert auch die Cofaktorregeneration unter Verbrauch eines Alkanols als Reduktionsmittel (Opfersubstrat), insbesondere von iso-Propanol unter Bildung von Aceton katalysieren kann. Die Zugabe von Reduktionsmittel erfolgt z.B. in zumindest equimolaren Mengen zum HMF-Substrat, insbesondere aber im Überschuss, z.B. 1 - 20-fachen, 1 - 10- fachen oder 1 - 5-fachen molaren Überschuss zum HMF-Substrat.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme können im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym, wie oben bereits beschrieben, verwendet werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können auch ruhende oder wachsende, freie oder immobilisierte Zellen verwendet werden, die für das Enzym kodierenden Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch aufgeschlossene Zellen, wie Zelllysate oder Zellhomogenate, können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung beispielsweise mit Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder teilweise gereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden.

Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt, beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.

Experimenteller Teil

A) Material und Methoden

Chemikalien:

Nicotinamidadenindinucleotid, Roche Diagnostic GmbH, Penzberg / ^' so-Propanol, Merck KGaA; Darmstadt

Glucose, NaOH, K ₂ HP0 ₄ , KH ₂ P0 ₄ , MgCI ₂ ; Sigma -Aldrich, Taufkirchen

HMF, DFF, FDM; BASF SE, Ludwigshafen

Verwendete Mikroorganismen Im Folgenden sind die getesteten Alkoholdehydrogenasen dahinter in Klammern, beispielhaft ein rekombinanter E.coli-Stamm bezeichnet, welcher das gewünschte Enzym exprimiert, und dahinter eine Literaturstelle bzw. ein Genbank-Eintrag zur näheren Bezeichnung der Enzymsequenz angegeben.

EbN1 (LU 1 1558) Aromatoleum aromaticum WO2005/108590 A2, Q5P5I4

Steno-ADH (LU15153) Stenotrophomonas maltophilia R551 -3 ZP:01644961 .1

Gl:1 19877990

Sc-ADH (LU 14881 ) Streptomyces coelicolor A3(2) NP_631415.1

PDH (LU12418) Escherichia coli WO2006/053713 A1 , P39451

Hefe-ADH (Fa. Sigma, Best.Nr.: A701 1 ) und

In Abwandelung davon der Durchschnittsfachmann unter Befolgung seines allgemeinen Fachwissens kodierende Enzymsequenzen in übliche Expressionskonstrukte einbauen und unter Verwendung üblicher Expressionsstämme (wie z.B. im obigen allgemeinen Teil der Beschreibung erläutert) zur Expression bringen und auf erfindungsgemäße Enzymaktivität testen.

Bestimmung von HMF und FDM mittels HPLC:

Säule: Gemini C18, 150 ^* 4, 6mm (Fa. Phenomenex; Aschaffenburg)

Vorsäule: C18 Gemini

Temperatur: 40 °C

Flußrate: 1 ,50 mL/min

Injektionsvolumen: 5,0 μί

Detektion: 225nm

Eluent A 40mM NaH ₂ PO ₄ xH ₂ 0 auf pH 7,8 mit ca. 1 ,85 mL/L NaOH (50%) Eluent B Acetonitril:Methanol:Wasser 45:45:10

Gradient: Zeit [min] A [%] B [%] Fluss [mL/min]

0,0 100,0 0,0 1 ,50

8,0 60,0 40,0 1 ,50

12,0 60,0 40,0 1 ,50

Analyten: Retentionszeit [min]

FDM 4,36 HMF 4,65

DFF 4,98

Photometrischer Dehydrogenase Test:

In 1 ml_ Puffer (50 mM KPj, pH 6,5; 1 mM MgCI ₂ ) wurden 0,2 mM NADH bzw. NADPH und 10 μηιοΙ HMF (1 ,26 mg) gegeben. Zur Untersuchung der Oxidation von HMF mit NAD(P) wurde 50 mM TRIS*HCIi, pH 8,5, 1 mM MgCI ₂ als Puffersystem verwendet. Durch Zugabe von 10 μΙ_ zellfreiem Rohextrakt von Mikroorganismen, welche verschiedene Alkoholdehydrogenasen produzieren, wurde die Reaktion gestartet. Bei 340nm wurde im Photometer die enzymatische Aktivität durch die Umsetzung des Kofaktors bestimmt. 1 Unit entspricht dabei der Proteinmenge, die in einer Minute 1 μηηοΙ NAD(P)H oxidiert bzw. NAD(P) reduziert. B) Beispiele:

Beispiel 1 : Photometer-Screening von Alkohol^dehydro^genasen zur Umsetzung von HMF Ein photometrischer Dehydrogenase-Test, wurde, wie oben beschrieben durchgeführt. Verwendet wurden die folgenden Dehydrogenase-Katalysatoren:

EbN 1 (LU 1 1558), Steno-ADH (LU 15153) Sc-ADH (LU 14881 ), Hefe-ADH (Fa. Sigma, Best.Nr.: A701 1 ) und PDH (LU 12418)

Von den ersten getesteten Dehydrogenasen zeigten bereits vier Kandidaten eine deutliche Aktivität in der HMF-Reduktion im Photometertest (vgl. Figur 1 ).

Mit den beiden Katalysatorsystemen PDH und EbN 1 wurden in größeren Ansätzen weitere Untersuchungen durchgeführt.

Beispiel 2: Umsetzung von HMF mit und PDH (LU12418) - Regenerierung des Redoxkofaktors mit Glucosedehydrogenase (GDH)

Die PDH gehört zu den Enzymen, die den reduzierten Redoxkofaktor Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) nicht selbständig aus /so-Propanol oder einem anderen günstigen Reduktionsmittel regenerieren können. Vielmehr ist es hier nötig, ein Hilfsenzym zuzugeben, das die NADH-Regeneration ermöglicht. Bewährt hat sich hierfür beispielsweise eine rekombinante Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis.

Die Dehydrogenasen, die in den Photometerversuchen HMF reduzieren können, wurden in Übernachtinkubationen getestet. Bei der Umsetzung mit PDH findet die Kofaktorregeneration mit Hilfe der Glucosedehydrogenase statt, die Elektronen von Glucose auf NAD überträgt. Hierbei oxidiert die GDH Glucose zu Gluconolacton, welches zur korrespondierenden Säure hydrolysiert, welche durch Zugabe von NaOH neutralisiert wird. Der Laugeverbrauch bildet den Reaktionsverlauf ab.

In einem Gesamtvolumen von 0,5 L KP _r Puffer (50 mM, 1 mM MgCI ₂ , pH 6,5) wurden 50 mmol HMF (=6,3 g) mit 5 mL PDH Rohextrakt (1 1 ,95 mg/mL Protein), 5 mL GDH Rohextrakt (49,25 mg/mL Protein) inkubiert. 0,05 mmol NAD (= 33 mg) wurden als Redoxkofaktor zugegeben, als Elektronenquelle diente 100 mmol (18 g) Glucose. Die Mischung wurde bei 30 °C inkubiert. Danach wurde der Gehalt an FDM und HMF mittels HPLC bestimmt.

Mit diesen beiden Enzymen (PDH, GDH) wurde im 0,5 L-Ansatz konnten 50mmol

HMF bereits nach 3 Stunden zu mehr als 80% umgesetzt werden, so dass weitere 25mmol HMF nachdosiert wurden. Die gesamte Menge HMF (9,5 g) wurden innerhalb von 7 Stunden komplett zu FDM reduziert (Figur 2). Beispiel 3: Umsetzung von HMF mit und EbN1 (LIM 1558) bei gleichzeitiger Regeneration des Redoxkofaktors

Schließlich wurden die Umsetzungen mit authentischem HMF aus der Fructoseaufarbeitung wiederholt. Hierbei wurde als Biokatalysator die Dehydrogenase EbN1 verwendet, die in den Vorversuchen ebenfalls vielversprechende Ergebnisse gezeigt hatte. Bei der chemischen Synthese von HMF aus Fructose entstehen Humine als unerwünschte Nebenprodukte, die möglicherweise die enzymatische Reaktion stören können. Aus diesem Grund wurde für die Umsetzung von HMF, das nicht gesondert aufgearbeitet wurde, die Dehydrogenase EbN1 verwendet. Dieses Enzym hat sich als verhältnismäßig robust erwiesen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass im Gegensatz zur PDH die Dehydrogenase EbN1 / ^' so-Propanol als Opferalkohol für die Regeneration von NADH akzeptiert, und ein zusätzliches Hilfsenzym für die Regenerierung nicht nötig ist.

90 mL 2,2%ige HMF-Lösung (= 176mM in 60% Polyether) wurden mit 10 mL iso- Propanol (0,13 mol), 0,51 g K ₂ HP0 ₄ (3,75 mmol), 0,28g KH ₂ P0 ₄ (1 ,61 mmol), 0,02g MgCI ₂ (0,1 mmol) gemischt und der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Durch Zugabe von 27 mg NAD (0,04 mmol) und 2,5 mL EbN 1 -Rohextrakt wurde die Reaktion gestartet. Nach 22stündiger Inkubation bei 30°C wurde der Ansatz abgebrochen und mittels HPLC analysiert.

Figur 3 zeigt, dass auch mit EbN1 als Katalysator ein vollständiger Umsatz von HMF zu FDM erreicht werden kann. Die Verunreinigungen im Einsatzstoff scheinen keine deutliche Beeinträchtigung der Dehydrogenase auszumachen.

Es zeigt sich somit, dass Dehydrogenasen prinzipiell in der Lage sind, Hydroxymethylfurfural (HMF) zum korrespondierenden Diol zu reduzieren. In vorliegender Beschreibung wird auf folgende Sequenzinformationen verwiesen:

Zuordnung der SEQ ID NOs

Auf die Offenbarung der hierin zitierten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.

EbN1 (LU 1 1558) Aromatoleum aromaticum WO2005/108590 A2, Q5P5I4

Steno-ADH (LU15153) Stenotrophomonas maltophilia R551 -3 ZP:01644961 .1

Gl:1 19877990

Sc-ADH (LU 14881 ) Streptomyces coelicolor A3(2) NP_631415.1

PDH (LU12418) Escherichia coli WO2006/053713 A1 , P39451

EbN1 :

MTQRLKDKLAVITGGANGIGRAIAERFAVEGADIAIADLVPAPEAEAAIRNLGRRVL TVK CDVSQPGDVEAFGKQVISTFGRCDILVNNAGIYPLIPFDELTFEQWKKTFEINVDSGFL MAKAFVPGMKRNGWGRIINLTSTTYWLKIEAYTHYISTKAANIGFTRALASDLGKDGIT VNAIAPSLVRTATTEASALSAMFDVLPNMLQAIPRLQVPLDLTGAAAFLASDDASFITG QTLAVDGGMVRH

Steno ADH

MNSTMKAAWREFGKPLVIEEVSVPRPGAGEVLVKIEACGVCHTDLHAAEGDWPVKP NPPFIPGHEGVGHIVAVGGGVGHVKEGDRVGIPWLYSACGHCEHCLGGWETLCETQ RNTGYSVNGGFAEYALADANYVGLLPKEVGFVEIAPVLCAGVTVYKGLKVTDTKPGD WWISGIGGLGHMAVQYARAMGLNVAAVDVDDSKLALARQLGAQITVNARTTDPAAF LKKEIGGAHGALVTAVSPKAFEQALGMVRRGGTVSLNGLPPGNFPLDIFGMVLNGITV RGSIVGTRLDLQESLQFAAEGKVAATVSTDRLENINDVFARMHAGTIEGRWLDFAA

SC-ADH MKALQYRTIGAPPEWTVPDPEPGPGQVLLKVTAAGVCHSDIAVMSWPAEGFPYELP LTLGHEGVGTVAALGAGVTGLAEGDAVAVYGPWGCGTCAKCAEGKENYCLRADELG IRPPGLGRPGSMAEYLLIDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLVPG STAVVIGTGGLGHVAIQLLRALTSARVVALDVSEEKLRLARAVGAHEAVLSDAKAADA VREITGGLGAEAVFDFVGVAPTVQTAGAVAAVEGDVTLVGIGGGSLPVGFGMLPFEV SVNAPYWGSRSELTEVLNLARSGAVSVHTETYSLDDAPLAYERLHEGRVNGRAVILP HG

PDH

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GDH 2

MYPDLKGKWAITGAASGLGKAMAI RFGKEQAKWI NYYSN KQDPN EVKEEVI KAGGE AWVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNL TGAFLGSREAI KYFVEN DI KGNVI N MSSVHAFPWPLFVHYAASKGGI KLMTETLALEYA PKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEA SYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG