Domaine technique

La présente invention concerne la préparation de mycosporines glucosylées par un procédé de cascade enzymatique mettant en œuvre des a-transglucosylases et du saccharose, et leur utilisation en particulier pour leurs propriétés anti-UV (e.g. propriétés d’absorption et de protection des UV, propriétés antioxydantes).

La présente invention trouve par exemple des applications dans le domaine de l’ophtalmologie, la dermatologie, la cosmétologie, des matériaux, de l’agriculture. Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

La prévention et la protection sont essentielles pour faire face aux dommages chroniques et aigües causés par les rayonnements UV sur la santé humaine, en particulier sur la peau et les yeux. Ainsi, la réduction de l’exposition aux UV et l’application d’un écran solaire est fortement recommandée en prévention des maladies de peau. Les écrans solaires inorganiques à large spectre composés de dioxyde de titane (TiC ) et d’oxyde de zinc (ZnO), agissant essentiellement par absorption mais également par diffusion des radiations, sont communément utilisés [1]. Cependant, leur aspect généralement couvrant et blanc n’est pas accepté par tous les consommateurs, et l’éventuelle cytotoxicité de l’accumulation des nanoparticules dans l’organisme n’est pas encore suffisamment étudiée [2], Les filtres organiques composés de molécules synthétiques ont été accusés d’avoir une efficacité relativement limitée pour la protection de la peau, d’être parfois allergisants, et d’être des perturbateurs endocriniens [1 ,2], Certains sont même soupçonnés de se dégrader en composés cancérigènes, comme l’octocrylène [3] dont il a été récemment établi qu’il se dégradait au fil du temps en benzophénone. De plus, le manque de photostabilité de certains composés pourrait créer un effet contre-productif en créant des ROS (Reactive Oxygen Species) et en augmentant le stress oxydatif. Enfin, d’un point de vue environnemental, ces deux types de filtres sont accusés de s’accumuler dans les eaux du littoral, provoquant des changements endocriniens chez les poissons et des phénomènes de blanchiment de coraux [4,1], En outre, dans les écrans solaires, les filtres chimiques tels que l’oxybenzone provoquent des allergies et des effets secondaires chez les humains, et sont connus pour endommager les récifs coraliens [4], Il est donc nécessaire de développer de nouvelles solutions s’appuyant sur des ressources naturelles et mettant en œuvre des procédés respectueux de l’environnement.

Les mycosporines et les acides aminés de type mycosporines (Mycosporine- like Amino-Acids, MAA) (ci-après tous deux dénommés sous le terme générique de mycosporines) sont de petites molécules d’environ 400 dalton (Da), organisés autour d’un cycle cyclohexénone ou cyclohexénimine. En raison de leur structure, ces zwitterions présentent des capacités uniques d’absorption des rayons UV, avec une gamme d’absorption allant de 309 à 362 nm et un coefficient d’extinction de 21 800 cnr ¹ .M’ ¹ à 50 000 cnr ¹ .M’ ¹ [5]. Ils couvrent donc à la fois la plage des UV-A et UV-B. Les mycosporines sont également décrites comme de puissants antioxydants. Ce sont des métabolites secondaires et leur rôle comme filtre solaire naturel est étudié depuis des années. Leur potentiel est prometteur pour plusieurs raisons : (i) elles peuvent agir comme filtre UV et antioxydants, une combinaison efficace pour protéger l’organisme contre les multiples dommages des photolésions, (ii) elles sont également étudiées pour leurs propriétés anticancéreuses, anti-vieillissement et anti-inflammatoires, et (iii) elles présentent un fort potentiel pour favoriser la cicatrisation des blessures [1]. Leur mécanisme d’action est le suivant : dans un état photoexcité, elles subissent une rapide conversion interne vers l’état électronique fondamental (S0) en dégageant de la chaleur ou bien en effectuant une isomérisation réversible [1 ,6]. Grâce à ce mécanisme, plus de 90% de l’énergie reçue est libérée par transfert de chaleur vers le milieu environnant sans génération de ROS. Aucune émission de fluorescence n’a été particulièrement rapportée [7],

Les mycosporines sont présentes dans une très grande diversité d’organismes. Les radiations UV impactent la vie terrestre, mais elles peuvent aussi pénétrer dans les eaux de 0,5 à 47 mètres de profondeur, selon la clarté de l’eau et les conditions météorologiques [1]. Les mycosporines ont ainsi été identifiées dans des cyanobactéries, mais aussi dans des bactéries hétérotrophes et des champignons marins, des microalgues, des macroalgues (en majorité des algues rouges et brunes), du phytoplancton (diatomées, dinoflagellés), des coraux, des mollusques et des poissons [7,8]. Elles ont également été identifiées dans des organismes terrestres, tels que les lichens vivant dans des conditions parfois très extrêmes [9]. C’est le cas de la mycosporine-sérinol MSer(OH) présente notamment dans l’espèce Lichina pygmea, présente dans les zones médiolittorales des côtes de l’Europe de l’ouest.

Chez les métazoaires comme les poissons, les mycosporines peuvent s’accumuler rapidement dans les tissus des couches externes exposées au soleil, comme par exemple la peau de la surface dorsale, ainsi que les organes sensibles comme les voies digestives, les organes reproducteurs, et également les yeux [1 ,5,7,8]. Dans l’œil, elles sont particulièrement concentrées dans la cornée et le cristallin, préservant ainsi la rétine des dommages photooxydatifs causés par les rayons UV [10].

La présence de mycosporines dans les tissus oculaires des poissons est un sujet de bioinspiration particulièrement intéressant, notamment dans la mise en place de solutions biomédicales préventives et/ou curatives dans le domaine ophtalmologique. Cependant, la formulation de produits biomédicaux à partir des mycosporines actuellement disponibles est compliquée du fait de leurs petites tailles qui conduit à leur rapide élimination des muqueuses (notamment de l’œil).

Les mycosporines glycosylées sont déjà présentes dans la nature avec essentiellement un degré de polymérisation (DP) de 1 à 2 unités glycosylé (/.e. xylose, galactose, glucosamine, etc...), exceptionnellement jusqu’à 8 unités glycosylé de différente nature (/.e. xylose, galactose, glucosamine, etc...) pour un cas de mycosporine de type mycosporine-glycine [11]. Cependant, les plus largement décrites sont celles retrouvées dans la matrice exopolysaccharidique de cyanobactéries terrestres du genre Nostoc (Nostoc commune, Nostoc sphaericum) [12-14], Dans ces organismes, différentes mycosporines ont été identifiées (shinorine, porphyra-334, palythine, mycosporine-glycine, mycosporine-glutamicol) liées à différentes unités glycosylé (galactose, glucosamine, xylose, etc...). Bien que le rôle de ces mycosporines glycosylées n’ait pas été totalement découvert, elles assurent probablement un rôle plurifonctionnel de protection envers les UV mais également envers le stress thermique ou la dessication. L’intérêt des sucres liés de manière covalente aux mycosporines n’est pas non plus totalement élucidé, même s’il est fortement avancé que cela améliorerait les interactions envers la matrice exopolysaccharidique de ces cyanobactéries [13]. En plus de la stabilité accrue et de l’attachement non covalent à la matrice extracellulaire de glycanes, la proportion importante de mycosporines glycosylées témoigne sûrement d’un autre rôle utile : Ishihara et al. ont ainsi identifié que 86,5% du total des mycosporines de Nostoc sphaericum étaient des p-galactose-porphyra-334 ; 13,2% étaient des hexose-shinorines et seulement 0,2% étaient des porphyra-334 libres [14],

Description de l’invention

Les Inventeurs ont émis l’hypothèse qu’il pourrait être intéressant d’intégrer de longues chaînes glucosylées aux mycosporines afin de voir si les molécules obtenues seraient suffisamment stables et conserveraient leurs propriétés anti-UV (photostabilité) pour être utilisables.

Les Inventeurs ont donc mis au point un nouveau procédé capable d’ajouter une longue chaîne glucosyle aux mycosporines, ce qui a permis d’obtenir de nouveaux produits ou biomatériaux respectueux de l’environnement et hautement protecteurs des UV, en remplacement des filtres UV actuels, capables de rallonger le temps de rétention des mycosporines dans des organes, comme par exemple les yeux. La nature de la chaine glucidique (uniquement composée d’unités glucosyle) devrait permettre de diminuer le risque de réaction allergique.

Les biomolécules obtenues (mycosporine glucosylées) protectrices contre les UV avec un temps prolongé de rétention utilisant des précurseurs exclusivement naturels, peuvent être appliquées dans des formulations cosmétiques, des produits médicaux (e.g. en ophtalmologie), des biomatériaux et matériaux d’extérieur comme alternatives aux ingrédients actifs courants.

Pour cela, bien qu’elle n’ait encore jamais été étudiée en relation avec les mycosporines, la glycosylation par voie enzymatique est apparue comme le procédé le plus efficace. Une famille d’enzyme est apparue comme particulièrement intéressante pour ce type de catalyse enzymatique. Il s’agit des a-transglucosylases de la famille 70 des Glycosides Hydrolases (GH-70) [15], des enzymes que l’on retrouve naturellement dans les bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, Oenococcus ou Weissela sp. [16]. Ces enzymes présentent un intérêt industriel non négligeable du fait de leur mécanisme catalytique, illustré à la Figure 16. A partir de saccharose, un substrat très bon marché et issu de ressources renouvelables (betterave et canne à sucre), ces enzymes sont capables de former divers produits en fonction de la nature de la molécule acceptrice. Après avoir formé un intermédiaire covalent (étape 1 sur la Figure 16), les GH-70 peuvent transférer l’unité glucosyle sur [17] :

- de l’eau (étape 3 sur la Figure 16) pour réaliser une réaction d’hydrolyse, il y a dans ce cas formation de glucose libre (ayant lieu majoritairement en début de réaction pour les très bonnes polymérases de la famille GH-70).

- un glucose et progressivement des oligosaccharides de glucose de taille croissante (étape 4 sur la Figure 16), pour réaliser la synthèse d’homopolymères d’unités a-D-glucosyle, appelés a-glucanes. Ceux-ci représentent une large diversité de polymères, allant de 10 ³ à 10 ⁹ Da et composés de liaisons osidiques de différentes natures (a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 et/ou a-1 ,6). Parmi ces a-glucanes, l’un des plus connus est le dextrane. C’est un polymère plus ou moins linéaire contenant une majorité d’unités glucosyle liées en a-1 ,6 et qui possède de nombreuses applications en industrie (domaines agroalimentaire, cosmétique et pharmaceutique par exemple).

- du fructose (étape 5 sur la Figure 16), il y a alors formation d’isomères du saccharose, tel que le leucrose par exemple. Ces produits sont néanmoins minoritaires.

- une molécule acceptrice exogène rajoutée dans le milieu en début de réaction (glycone ou aglycone), possédant au moins une fonction hydroxyle (étape 6 de la Figure 16), cette action catalytique est nommée la réaction d’accepteur.

La capacité à transférer les unités glucosyle sur ces molécules exogènes dépend de plusieurs facteurs dont la structure de l’accepteur et celle du site actif de l’enzyme. Un accepteur qualifié d’efficace pourra rediriger la quasi-totalité du transfert des unités glucosyle non pas vers la formation de polymères mais vers sa propre glucosylation. A ce jour, une grande variété d’accepteurs a déjà été testée, dont par exemple les flavonoïdes tels que la quercétine et la lutéoline [18].

La présente invention vise donc à produire des dérivés glucosylés de mycosporines, en particulier de la myscosporine-sérinol (nommée ci-après MSer(OH)) issue notamment du lichen marin Lichina pygmea, grâce à un procédé de cascade enzymatique mettant en œuvre des a-transglucosylases de la famille 70 des Glycoside Hydrolases (GH-70) et du saccharose. Naturellement, ces enzymes utilisent le saccharose issu de la betterave ou de la canne à sucre pour synthétiser (polymérases) ou décorer (branching sucrases) des polymères d’unités glucosyle de haute masse molaire (a-glucanes). A titre de comparaison, certaines sucrose phosphorylases qui utilisent également le saccharose comme donneur d’unités glucosyle, ainsi que des CGTases commerciales appartenant à la famille GH-13 qui utilisent l’amidon (un autre substrat naturel et abondant) comme donneur d’unités glucosyle ont également été testées, mais sans succès.

La méthode de cascade enzymatique décrite ici (Figure 1 ) a l’avantage de ne pas mettre en œuvre de réaction chimique ; cela permet d’éviter plusieurs étapes de protection/déprotection des fonctions hydroxyles des sucres qui demandent en général l’utilisation de catalyseurs métalliques ou d’acides forts. Ces derniers sont connus pour générer de grandes quantités de déchets à traiter et peuvent conduire à des réactions parasites non maitrisées.

La production de mycosporines glucosylées est réalisée dans un milieu totalement aqueux sans ajout de solvant organique.

La glucosylation peut être réalisée en une seule étape (co-synthèse ou synthèse one-pot) ou en deux étapes comme suit :

1/ glucosylation d’une mycosporine (e.g. de la mycosporine-sérinol, MSer(OH)) par l’enzyme GS-D (a-transglucosylase de la famille GH-70) à partir de saccharose, permettant l’obtention de produits intermédiaires de glucosylation nommés mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) ;

2/ allongement des produits intermédiaires de glucosylation mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) par d’autres a-transglucosylases de la famille GH-70 à partir de saccharose, permettant l’obtention de produits de glucosylation finaux nommés mycosporine-polym (e.g. MSer(OH)-polym).

Cette seconde étape de la cascade enzymatique permet la synthèse « à façon » de mycosporine liée de manière covalente à des chaînes glucosylées de longueurs et de liaisons osidiques variées (a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 et/ou a-1 ,6) selon les enzymes et les conditions de réaction mises en œuvre. Les produits intermédiaires mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) peuvent porter jusqu’à 4 unités glucosyle avec un degré de polymérisation (DP) moyen majoritairement centré entre 1 et 2 unités glucosyle, tandis que les produits finaux mycosporine-polym (e.g. MSer(OH)-polym) peuvent présenter entre 2 et 1 00 000 unités glucosyle, avec un degré de polymérisation (DP) moyen centré entre 3 et 1 000 000, entre 3 et 800 000, entre 3 et 500 000, entre 3 et 24 000, entre 3 et 60, ou entre 3 et 41 unités glucosyle, selon les enzymes utilisées. Les mycosporines étant qualifiées de filtres solaires naturels, les dérivés de mycosporines développés par le procédé de la présente invention composés de mycosporines possédant une longue chaîne glucosylée pourraient facilement être utilisés pour la prévention et protection des cellules (dermiques et oculaires) et avoir des applications à visées cosmétiques, médicales et/ou pharmaceutiques. Notamment, des applications dans des produits ophtalmologiques pour la protection de l’œil (e.g. prévention de la cataracte) ou pour la protection des personnes ayant des anomalies génétiques et héréditaires telles que l’albinisme et xeroderma pigmentosum, peuvent être envisagées. Une autre application serait d’intégrer ces mycosporines glucosylées dans des crèmes solaires biosourcées, biodégradables et sans conséquences environnementales telles que le blanchissement des coraux. Enfin, ces myscosporines glucosylées peuvent également être utilisées pour la protection de matériaux utilisés en extérieur [19].

La présente invention a donc pour objet un procédé de production d’une mycosporine glucosylée, ledit procédé comprenant une étape a) de glucosylation d’une mycosporine par l’enzyme a-transglucosylase GS-D à partir de saccharose pour l’obtention d’un produit intermédiaire de glucosylation étant une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation allant de 1 à 4 unités glucosyle, de préférence un degré de polymérisation moyen de 1 à 2 unités glucosyle.

Selon un mode particulier de la présente invention, le procédé peut comprendre en outre une étape b) d’élongation de la partie glucidique du produit intermédiaire de glucosylation obtenu à l’étape a) à partir de saccharose par au moins une a-transglucosylase différente de l’a-transglucosylase GS-D pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000 000 unités glucosyle, de 3 à 800 000 unités glucosyle, de 3 à 500 000 unités glucosyle, de 3 à 24 000 unités glucosyle (pour une très bonne polymérase comme par exemple l’enzyme dextrane-saccharase DSR-OK A1 ), de 3 à 60 unités glucosyle, de 3 à 41 unités glucosyle ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle, de 9 à 800 000 unités glucosyle, de 9 à 500 000 unités glucosyle, de 9 à 24 000 unités glucosyle, de 9 à 60 unités glucosyle, ou de 9 à 41 unités glucosyle.

Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, les étapes a) et b) peuvent être réalisées de manière concomitante, à savoir que ledit procédé comprend la glucosylation d’une mycosporine et l’élongation de sa partie glucidique par l’enzyme a-transglucosylase GS-D et au moins une autre a-transglucosylase différente de l’a-transglucosylase GS-D à partir de saccharose, pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000000 unités glucosyle, de 3 à 800 000 unités glucosyle, de 3 à 500 000 unités glucosyle, de 3 à 24 000 unités glucosyle (pour une très bonne polymérase comme par exemple l’enzyme dextrane-saccharase DSR-OK A1 ), de 3 à 60 unités glucosyle, de 3 à 41 unités glucosyle ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle, de 9 à 800 000 unités glucosyle, de 9 à 500 000 unités glucosyle, de 9 à 24 000 unités glucosyle, de 9 à 60 unités glucosyle, ou de 9 à 41 unités glucosyle.

On entend par « degré de polymérisation (DP) moyen » au sens de la présente invention, le degré de polymérisation déterminé à l’apex des pics obtenus par analyse de chromatographie d’exclusion de taille haute performance couplée à un détecteur UV et étalonnage/calibration de la colonne à l’aide de dextranes commerciaux de masse molaire comprise entre 342 g/mol et 70 000 g/mol.

Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, ladite au moins une a-transglucosylase de l’étape b) est choisie dans le groupe constituée de : glucane-saccharases GS-A, GS-B, GS-C, GS-F A1 , et GS-FS ; dextrane- saccharases DSR-M A1 , DSR-M A2 W624A, DSR-G A1 , DSR-S vardel A4N, et DSR-OK A1 ; alternane-saccharase ASR A1 .

Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, la mycosporine de l’étape a) est choisie dans le groupe constitué de : mycosporine pure ou purifiée, extrait de lichen Lichina pygmea enrichi en mycosporine de 0 à 50% en poids d’extrait, de préférence de 5 à 35 % en poids d’extrait, préférentiellement de 15 à 25% en poids d’extrait, tout préférentiellement de 10% en poids d’extrait. De préférence, la mycosporine utilisée à l’étape a) est la mycosporine-sérinol (MSer(OH)). Cette dernière peut être isolée à partir d’extrait de cyanolichens tels que Lichina pygmae et Lichina confiais, de différentes espèces de Peltigera, de Stereum hirsutum, d’Alternaria chrysanthemi, d’Ascochyta pisi, d'Ophiobolus graminis, de Pleospora herbarum, ou encore de Pyronema omphalodes. Elle peut également être produite à partir de son précurseur (gadusol) par biologie de synthèse.

La présente invention a encore pour objet, un produit intermédiaire de glucosylation obtenu par le procédé de la présente invention, ledit produit intermédiaire de glucosylation étant une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 4 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de préférence de 1 à 2 unités glucosyle (liaisons de type alpha).

La présente invention a encore pour objet, une mycosporine glucosylée obtenue par le procédé de la présente invention, ladite mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 00 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 800 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 500 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 24 000 unités glucosyles (liaisons de type alpha), de 3 à 60 unités glucosyles (liaisons de type alpha), ou de 3 à 41 unités glucosyle (liaisons de type alpha) ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 800 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 500 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 24 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha) de 9 à 60 unités glucosyle (liaisons de type alpha), ou de 9 à 41 unités glucosyle (liaisons de type alpha).

La présente invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique d’une mycosporine glucosylée selon la présente invention, comme agent anti-UV, pour (i) protéger la peau des rayons UV, (ii) lutter contre le photo-vieillissement.

La présente invention a encore pour objet une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une mycosporine glucosylée selon la présente invention.

La présente invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique d’une composition cosmétique selon la présente invention, pour (i) protéger la peau des rayons UV, (ii) lutter contre le photo-vieillissement.

La présente invention a encore pour objet une mycosporine glucosylée selon la présente invention pour une utilisation comme médicament, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement, par exemple, de la cataracte, de maladies de peau associées à une sensibilité aux UV telles que le xeroderma pigmentosum, de maladies génétiques héréditaires telles que l’albinisme, ou encore du cancer de la peau.

En conclusion, l’invention met en place des procédés verts et mobilise des ressources naturelles à savoir des mycosporines, notamment issues d’un lichen se développant en bord de mer, et du saccharose. Cette dernière ressource, servant de substrat aux enzymes de la famille GH-70, est disponible en grande quantité et à moindre coût. Les réactions enzymatiques sont des procédés en conditions douces et ne produisent pas de déchets (toxiques). Certaines chaînes glucosylées ont des signatures de dextrane, un a-glucane très utilisé dans le domaine cosmétique et biomédical, car très bien supporté par l’organisme. La chaîne dextrane des produits MSer(OH)-polym étant modulable « à façon » (/.e. en terme de liaisons osidiques, de taille de chaine glucidique), elle peut facilement être adaptée au type d’application visée. Dans la nature, dans le mucus et le cristallin des poissons par exemple, les mycosporines sont liées à des protéines [7,20,21], Dans le cadre de la présente invention, ce phénomène a été imité en produisant des dérivés de mycosporines MSer(OH)-polym ayant une chaîne glucidique allongée. Par rapport aux molécules de mycosporines libres, les mycosporines glucosylées obtenues par le procédé de la présente invention présentent de meilleures propriétés, notamment de photostabilité.

Par rapport aux molécules commerciales de protection contre les UV, comme e.g. l’oxybenzone (un bloqueur d’UVA et d’UVB) qui provoque le blanchiment des récifs coraliens [4], les mycosporines glucosylées ne provoqueraient pas de tels dégâts.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente le principe de la cascade enzymatique permettant la glucosylation de mycosporines à partir de saccharose et impliquant des a- transglucosylases de la famille GH-70 : une première étape de glucosylation réalisée par l’enzyme GS-D puis un allongement de la chaîne glucosidique par différentes enzymes de la famille, permettant à la fois un contrôle de la taille et de la structure de cette chaîne (différents types de liaisons a-osidiques selon l’enzyme choisie).

La Figure 2 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des enzymes a-transglucosylases de la famille GH-70 criblées pour la glucosylation de MSer(OH). Seule l’enzyme GS-D parvient à glucosyler efficacement MSer(OH).

La Figure 3 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des enzymes CGTases et sucrose-phosphorylases commerciales criblées pour la glucosylation de MSer(OH).

La Figure 4 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des différents produits de glucosylation de 5 mM de MSer(OH) par GS-D, nommés MSer(OH)-glu. La numérotation 1 -8 identifie les différents produits de glucosylation MSer(OH)-glu qui ont été obtenus à l’issue de la première étape de la cascade enzymatique. La Figure 5 représente (A) la structure chimique de la MSer(OH) avec la numérotation des carbones et l’illustration des positions éventuelles de glucosylation. Les hexagones représentent des unités glucosyle liées à la MSer(OH) (B) exemples de structures des DP2 produits par la glucosylation de MSer(OH) par l’enzyme GS-D (C) exemples de structure de DP3 produits par la glucosylation de MSer(OH) par l’enzyme GS-D (D) exemples de structures de produits issus de la cascade enzymatique (glucosylation+elongation).

La Figure 6 représente les spectres RMN ¹ H (spectre A) et HMBC (spectre B) confirmant la glucosylation de MSer(OH) par GS-D en produit intermédiaire de glucosylation (MSer(OH)-glu) ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 2 unités glucosyle.

La Figure 7 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de MSer(OH) par GS-D, à 5 et 50 mM de MSer(OH).

La Figure 8 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des polymérisations en cascade enzymatique GS-D puis une polymérase (i.e. une autre a-transglucosylase de la famille GH-70). Les enzymes utilisées en seconde étape sont indiquées sur les chromatogrammes.

La Figure 9 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) de 6 des 11 différentes réactions, séparées par chromatographie d’exclusion de taille haute performance (HPSEC). Le chromatogramme annoté DEX 10 000 Da est celui d’un dextrane commercial de masse molaire moyenne 10 000 g/mol. Les astérisques identifient la ou les populations majoritaires pour chaque réaction. Les pics DP1 et DP2 correspondent respectivement aux Pic 1 et Pic 2 de la Figure 4.

La Figure 10 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) de 3 des 11 différentes réactions, séparées par chromatographie d’exclusion de taille haute performance (HPSEC). Le chromatogramme annoté DEX 70 000 Da est celui d’un dextrane commercial de masse molaire moyenne 70 000 g/mol.

La figure 11 représente la comparaison des analyses par CLHP sur colonne C18 Synergi™ Fusion-RP couplée à un détecteur UV (À=310 nm) des réactions de polymérisation des produits MSer(OH)-glu par l’enzyme DSR-M A2 et son mutant DSR-M A2 W624A.

La figure 12 représente les scans de l’absorbance de MSer(OH) et des produits MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym pour des longueurs d’onde allant de 200 nm à 800 nm (zone d’intérêt présentée : 200 à 400nm). La Figure 13 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de GS-D sur la MSer(OH) purifiée et présente à hauteur de 10% dans un extrait brut de lichen Lichina pygmea, lors de réactions réalisées avec 6,37 mM de MSer(OH) et 292 mM de saccharose.

La Figure 14 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de GS-D puis DSR-M A1 sur la MSer(OH) purifiée et celle présente dans l’extrait brut issu du lichen Lichina pygmea.

La Figure 15 représente les chromatogrammes des polymérisations en cosynthèse. Les produits MSer(OH)-glu sont moins efficacement consommés par les polymérases, moins de MSer(OH)-polym sont produits.

La Figure 16 représente le schéma des différents mécanismes catalytiques des GH-70.

La Figure 17 représente le rendement quantique du MSer(OH) et des différents produits de glucosylation MSer(OH)-glu et Mser(OH)-polym obtenus par le procédé de l’invention.

La Figure 18 représente le score TEAC du MSer(OH) et des produits de la cascade enzymatique du procédé de l’invention, avec et sans MSer(OH).

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : EXEMPLE DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE DE L’INVENTION

Premier criblage :

Une collection d’a-transglucosylases des familles GH70 et GH13 a été criblée pour leur aptitude à glucosyler la molécule de mycosporine-sérinol (MSer(OH)) à partir de saccharose ou éventuellement d’amidon. Dans un premier temps, les travaux ont été réalisés à partir de MSer(OH) pure obtenue à partir d’un extrait de Lichina pygmea. Les enzymes référencées dans le Tableau 1 ci-dessous ont toutes été produites sous forme recombinante chez Escherichia coli, hormis les CGTases et sucrose-phosphorylase (enzymes n°22, 23 et 24) qui sont des formulations commerciales.

Tableau 1

L.=Leuconostoc Lb.=Lactobacillus Bb.=Bifidobacterium P=Polymérase ; B=Branching sucrase ; Bif=bifonctionnelle ; GT=a-glucano transférases ; S- Php=phosphorolyse du saccharose ; N.D=non déterminé.

Les enzymes ont été produites à partir des cellules d’E. coli BL21 Star (DE3) transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes cibles (Tableau 2). 300 pL du mélange de transformation ont permis d’ensemencer un volume de 30 mL de LB (Lysogeny Both), supplémenté en ampicilline à 100 pg/mL. Le milieu a été mis à incuber sur la nuit à 37 °C afin de préparer une préculture. Des cultures de 1 L en milieu ZYM5052 modifié [22], dont les caractéristiques sont présentées dans le Tableau 2, ont été ensemencées à une DO (À=600nm) initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille, puis mises à incuber 26 heures à 21 °C et à 150 rpm.

En fin de fermentation, les milieux de culture ont été centrifugés (15 minutes, 800 g, 8 °C) et les culots ont été concentrés à une DO (À=600nm) de 80 dans du tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les cellules ont alors été cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30% de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Les surnageants de sonication contenant les enzymes d’intérêt solubles ont ensuite été récupérés après 30 minutes de centrifugation (15 000 g, 6 °C) et conservés à 4 °C. [Tableau 2]

Gly=Glycérol ; Glu=Glucose ; a-Lac=a-Lactose ; L-Ara=L-arabinose

L’activité enzymatique a été déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide dinitrosalicilique (DNS) [23]. Une unité enzymatique a représenté la quantité d’enzyme qui libère une pmole de fructose par minute, à 30 °C, à partir de 100 g/L de saccharose dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH=5,75. Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel ont été prélevés et la réaction a été stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons ont ensuite été chauffés 5 minutes à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance a été lue à À=540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g/L de fructose a permis d’établir un lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs.

Le premier criblage, qui a impliqué l’ensemble des enzymes du Tableau 1 , a été réalisé dans un volume de 25 pL contenant 5 mM de MSer(OH), 292 mM de saccharose et 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. La réaction a été incubée à 30 °C sous une agitation de 500 rpm. Au bout de 24 heures, le mix réactionnel a été incubé à 70 °C pendant 10 minutes afin d’inactiver les enzymes. En vue de leurs analyses, les milieux réactionnels ont été dilués au 1/10 dans de l’eau et centrifugés 5 minutes à 2000 g.

La séparation des différents produits (MSer(OH)-glu) été effectuée en phase inverse avec une colonne C18 Synergi™ Fusion-RP 250 mm x 2 mm (porosité : 80 Â, granulométrie : 4 pm, Phenomenex, USA). Cette colonne a été maintenue à 30 °C sur un système CLHP Thermo Ultimate 3 000 équipé d’un détecteur UV (Thermo Ultimate 3 000) à À=310 nm et d’un détecteur CAD (Charged Aerosol Detector) Corona Véo (température de nébulisation : 50 °C). La phase mobile était composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité LC-MS (solvant B) à un débit de 0,2 mL/min. La séparation a été assurée en 75 minutes par un gradient linéaire, tel que défini dans le Tableau 3.

[Tableau 3]

Lors de cette étape, l’enzyme GS-D s’est avérée être de loin la plus performante (Figures 2 et 3), convertissant 95% de MSer(OH) en 8 produits glucosylés différents alors que pour toutes les autres enzymes testées, le taux de conversion a été compris entre 0% et 6,5%. Représentant à eux seuls 72,3% d’aires de l’ensemble des produits MSer(OH)-glu, les pics majoritaires sont les pics numérotés 1 et 2 sur la Figure 4. Leurs analyses par chromatographie liquide couplée à un détecteur de masse (LC-MS) ont montré qu’ils présentaient un degré de polymérisation (DP) de 1 et 2 unités glucosyle respectivement. Les pics minoritaires (produits 3 à 8 sur la Figure 4) seraient de degré de polymérisation (DP) de 3 à 4 unités glucosyle.

Afin d’identifier la position des unités glucosyle sur MSer(OH)-glu, des analyses de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont été réalisées. Les spectres ¹ H, ¹³ C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI 5 mm z-gradient H-BB-D. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.5. L’ensemble de ces analyses ont mis en évidence que la glucosylation a eu lieu sur les hydroxyles portés par le carbone C8 et les carbones équivalents C10/C11 de MSer(OH) (Figure 5A). Les Figures 5B-D précisent la structure des produits obtenus par le procédé de l’invention, et que le nombre de substitutions par des unités glucosyles peut varier de 1 à 2, possiblement 3, et la variété des produits glucosylés que le milieu de culture peut comprendre.

Afin d’évaluer la possibilité d’une application industrielle, la réaction de glucosylation de MSer(OH) par GS-D a été testée sur une concentration de MSer(OH) de 50 mM soit une concentration 10 fois plus importante que lors du criblage. Le protocole suivi a été, par ailleurs, identique à celui décrit précédemment. Notamment, la concentration en saccharose étant conservée à 292 mM, le ratio molaire sacccharose:MSer(OH) est passé de 60:1 à 6:1. La comparaison des chromatogrammes pour ces deux réactions est représentée sur la Figure 7. Le taux de conversion de MSer(OH) en MSer(OH)-glu est passé seulement de 95% avec 5 mM de MSer(OH) à 90% avec 50 mM de MSer(OH). Ce nouveau taux de conversion satisfaisant a montré qu’il était envisageable d’augmenter les quantités de produit glucosylé lors d’une réaction en mode batch. Il a été observé que la proportion relative entre les pics 1 et 2 évoluait légèrement, le produit correspondant à la MSer(OH) diglucosylée (pic 2) étant favorisé quand la concentration initiale est de 5 mM (i.e. quand le ratio saccharose:MSer(OH) est le plus élevé).

Second criblage :

Suite à ces premiers résultats, la prolongation des produits glucosylés MSer(OH)-glu à partir de saccharose par certaines polymérases de la famille GH- 70 a fait l’objet d’un second criblage (cf. Tableau 1 ). Un produit MSer(OH)-polym a été obtenu dont la partie glucosidique a été très nettement rallongée par rapport à celle obtenue par GS-D.

Une production de MSer(OH)-glu a été réalisée dans des conditions similaires à celles décrites en premier criblage mais en quantité plus importante. La réaction a ainsi été conduite dans un volume de 50 pL contenant 25 mM de MSer(OH) pure, 292 mM de saccharose, 1 U.mL’ ¹ de GS-D, et 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. Celle-ci a été incubée à 30 °C sous une agitation de 500 rpm. Au bout de 24 heures, le milieu réactionnel a été incubé à 70 °C pendant 10 minutes afin d’inactiver l’enzyme. L’allongement des produits intermédiaires MSer(OH)-glu par d’autres enzymes de la même famille a été réalisé sans étape de purification préalable de MSer(OH)-glu : 5 pL de milieu réactionnel de l’étape 1 ont été incorporés dans une nouvelle réaction de 25 pL de telle manière que la concentration molaire finale en MSer(OH)-glu soit équivalente à 5 mM de MSer(OH) libre. A cela ont été rajoutés l’équivalent de 292 mM de saccharose et 1 U.mL’ ¹ d’enzyme sélectionnée pour la seconde étape de la cascade enzymatique (cf. Tableau 1 ). Ce nouveau milieu contenait également 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. Les réactions ont été incubées à 30 °C sous une agitation de 500 rpm pendant 24 heures, puis stoppées par un chauffage à 70 °C pendant 10 minutes.

La séparation des différents produits (MSer(OH)-polym) a été réalisée de la même façon que pour les MSer(OH)-glu lors du premier criblage.

Comme le montre la Figure 8, les 11 polymérases testées ont permis de rallonger les intermédiaires MSer(OH)-glu avec des chaînes d’unités glucosyle de taille et de nature variables selon la spécificité de liaison de l’enzyme testée. Sur l’ensemble des réactions, au minimum 67,6% et jusqu’à 97,7% des produits intermédiaires MSer(OH)-glu ont été allongés (Tableau 4). Les pics 1 et 2 des produits intermédiaires MSer(OH)-glu (espèces très majoritaires dans le milieu) ont été principalement consommés par les polymérases, le pourcentage de conversion de chacun de ces deux pics pouvant varier selon la spécificité de l’enzyme utilisée (Tableau 4). Pour la plupart des cascades enzymatiques, le pic 2 (MSer(OH) di glucosylée) est consommé préférentiellement et parfois en quasi-totalité.

La masse moyenne des chaînes glucidiques des MSer(OH)-glu allongées (/.e. MSer(OH)-polym) a été analysée par chromatographie d’exclusion de taille (HPSEC) sur colonne Shodex 802.5. L’élution a été réalisée de manière isocratique à un débit d’eau à 0,3 mL/min et à une température de 70°C. Dans le cas de l’allongement des produits intermédiaires MSer(OH)-glu par les enzymes DSR-OK A1 et DSR-S vardel A4N qui forment des polymères naturels beaucoup plus grands, l’analyse HPSEC a été réalisée en associant une colonne Shodex 805 et une colonne Shodex 802.5 en série. L’élution a été réalisée avec un mélange NaNOs à 450mM, 1 % v/v éthylène glycol.

L’étalonnage de la séparation s’est appuyé sur une gamme étalon de dextranes (polymères d’unités glucosyle liées en a-1 ,6) commerciaux de tailles croissantes entre 342 et 70 000 Da. Les masses moyennes MM _moy des produits ont été déterminées à l’apex des pics d’élution. Le degré de polymérisation moyen (DPmoy) visible en UV a été estimé grâce à la relation suivante : DPmoy = MM _moy / 162.

Selon la polymérase utilisée lors de cette seconde étape, des chaînes d’unités glucosyle allant en moyenne de 3 à 41 unités ont pu être identifiées (Tableau 4, Figures 9 et 10).

[Tableau 4]

Pic 1 = MSer(OH)-monoglucosylée ; Pic 2 = MSer(OH)-diglucosylée ; n.d : non déterminé

De façon notable, les enzymes DSR-M A1, DSR-M A2 et DSR-M A2 W624A ont rallongé très efficacement MSer(OH)-glu puisqu’elles ont permis une conversion de MSer(OH)-glu de 80,2% et 90,4% respectivement. Elles ont produit un motif de type dextrane, composé exclusivement d’unités glucosyle liées par liaisons a-1 ,6 (motif naturel de ces enzymes) ; ce qui leur confère un moindre risque de choc anaphylactique. Comme illustré dans la Figure 11 , il a été possible de contrôler la taille des polymères par ingénierie des enzymes, DSR-M A2 W624A étant un variant de l’enzyme DSR-M A1 [24], La mutation W624A a permis en effet d’obtenir des MSer(OH)-polym de masse molaire moyenne réduite (10 unités) alors que la réaction avec l’enzyme DSR-M A1 a produit des MSer(OH)-polym de masse molaire moyenne supérieure, comprenant en moyenne 37 unités glucosyle.

Les dextranes de faible masse molaire sont déjà commercialisés pour des applications pharmaceutiques, notamment dans certains produits ophtalmologiques. Sous forme libre, ils sont utilisés comme lubrifiant oculaire ou larmes artificielles (cf. https://www.dextran.com/application-areas/eve). Leur couplage à une MSer(OH) présentant une forte capacité d’absorption des UV devrait permettre le développement de nouveaux produits, formulations, (bio)matériaux, médicaments combinant les propriétés des sucres et des mycosporines.

La capacité d’absorption des mycosporines n’a pas été affectée par le greffage d’une chaîne polysaccharidique. En effet, les scans de l’absorbance entre À=200 nm et À=800 nm des produits MSer(OH)-polym obtenus avec l’ensemble des enzymes testées, réalisés à l’aide d’un spectrophotomètre CARY 3 500 ont montré que la glucosylation et l’allongement des chaînes glucosyle sur les MSer(OH) n’ont pas provoqué de changement de longueurs d’onde maximales ÀMAX d’absorbance (Figure 12).

Enfin, la réaction de glucosylation a également été testée sur un extrait brut de Lichina pygmea, plus facilement sourçable, pouvant être obtenu à partir d’une extraction aqueuse ou hydroalcoolique, suivi éventuellement d’une lyophilisation. L’extrait est issu directement du lichen Lichina pygmea, non purifié mais enrichi en MSer(OH) à hauteur de 10% de la masse totale de l’extrait. La première étape de glucosylation par GS-D a donné des résultats identiques aux réactions menées sur MSer(OH) pure, i.e. 95% de MSer(OH) glucosylée (Figure 13). La deuxième étape mettant en jeu les polymérases a été également aussi efficace qu’en la réalisant avec la MSer(OH) purifiée (Figure 14 avec l’enzyme DSR-M A1 ). Ainsi, les enzymes ne sont pas inhibées par d’autres composants du milieu brut. Ceci est particulièrement avantageux pour une approche industrielle du procédé s’affranchissant de la coûteuse étape de purification de MSer(OH).

Avantage de la cascade enzymatique en 2 étapes vs synthèse « one-pot » :

L’utilisation de la GS-D et d’une autre polymérase en synergie (synthèse one- pot ou co-synthèse pour la glucosylation et le rallongement simultanés de MSer(OH)) a été évaluée et comparée aux rendements de glucosylation obtenus lors des cascades enzymatiques en deux étapes.

Cependant, comme illustrée par la comparaison des Figure 8 (cascade enzymatique) et 15 (co-synthèse), les conversions globales de MSer(OH) obtenues sont moins intéressantes en co-synthèse que lors de la cascade enzymatique. En co-synthèse, les produits MSer(OH)-glu sont moins consommés par les polymérases, il y a donc une population plus importante de MSer(OH)-glu et une plus faible population de MSer(OH)-polym.

EXEMPLE 2 : PROPRIETES DES MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym

Les propriétés antioxydantes et la photostabilité des produits MSer(OH) ; MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym générés par le procédé de l’invention ont été testées sur des milieux réactionnels purifiés de l’ADN présent dans les extraits cellulaires ayant servi à la glucosylation de MSer(OH), afin d’éviter les interférences de l’ADN dans les phénomènes étudiés. Cette purification a été réalisée par une chromatographie échangeuse d’anions, avec une résine Diaion.

Photostabilité des produits synthétisés :

La photostabilité a été évaluée sur les différents produits de glucosylation de MSer(OH). Pour cela, les échantillons ont été irradiés dans un simulateur solaire Sun Test XLS (Atlas Material Testing Solutions, USA). Le filtre solaire a été choisi pour reproduire une exposition solaire classique. La concentration en molécules restantes a été suivie par mesure de l’absorbance à À=310 nm. Les cinétiques de photodégradation obtenues permettent le calcul du rendement quantique de photodégradation des produits. Ce rendement quantique représente le rapport entre les molécules photo-dégradées et le nombre de photons reçus par ces molécules, et se calcule d’après la formule suivante : où ro est le taux de photo-décomposition (mol.L’ ¹ .s’ ¹ ), V est le volume de la solution (L), NA est le nombre d'Avogadro (mol ^-1 ), lo le nombre de photons émis dans le domaine de la bande d'absorbance de MSer(OH) et A l'absorbance de la solution des différents échantillons. Les expériences ont été réalisées en triplicat.

Tous les produits de glucosylation et d’élongation de la MSer(OH) présentent une forte photostabilité, avec des rendements quantiques de l’ordre de 10 ^-5 (Figure 17), comparables à ceux de certains filtres solaires ainsi qu’à d’autres mycosporines [25, 26],

La glucosylation de la mycosporine n’impacte donc pas la photostabilité. Cela est dû au fait que les positions de glucosylation n’empêchent pas la délocalisation du nuage électronique permettant la dissipation de l’énergie reçue sous forme de chaleur. Également, la longueur de la chaîne glucidique ne modifie pas la photostabilité des produits.

Cependant, des tests préliminaires ont permis de mettre en évidence l’intéraction de l’ADN dans la photostabilité des produits, par l’intermédiaire de la génération d’espèces réactives. Cela se traduit par une moins bonne photostabilité du produit issu de la cascade MSer(OH)+GS-D+DSR-M A2 W624A, dont la purification de l’ADN a été la moins efficace.

Enfin, il apparait que le produit de la cascade MSer(OH)+GS-D+DSR-OK A1 possède une plus importante photostabilité que la MSer(OH) libre. Cela peut s’expliquer par le rôle de protection physique que procure la longue chaine de dextrane, qui protège la MSer(OH) des irradiations.

Pouvoir antioxydant :

Le pouvoir antioxydant des produits de glucosylation MSer(OH)-glu et Mser(OH)-polym a été déterminé selon la méthode du TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Le test TEAC est bien établi pour l'évaluation des propriétés de piégeage des radicaux et permet de comparer les scores TEAC avec une large bibliographie. Basée sur la réduction de la forme ABTS+ préalablement oxydée, cette méthode spectrophotométrique est facile à mettre en œuvre [27], La réduction de l’ABTS+ se traduit par une baisse de l’absorbance à À=734 nm et est proportionnelle à la concentration en molécule antioxydante. Le score TEAC s’établit en comparant les coefficients directeurs de %inhibition = ^concentration antioxydant) avec ceux obtenus avec le Trolox, une molécule antioxydante de référence. Les expériences ont été réalisées en triplicat.

Les scores obtenus pour la MSer(OH) ainsi que ses dérivés glucosylés sont tous supérieurs à 1 (Figure 18). Les produits testés présentent donc un fort pouvoir antioxydant et ce pouvoir est conservé pour tous les produits de glucosylation obtenus, contrairement à ce qui avait été observé lors de la glucosylation de flavonoïdes tels que la lutéoline [28]. Le pouvoir antioxydants de produits issus des cascades enzymatiques sans MSer(OH) a été évalué comme quasiment nul, ce qui atteste que cette propriété biologique est effectivement due à la partie mycosporine de la molécule.

Afin de vérifier la bonne exécution du test nous avons également vérifié le score TEAC d’un antioxydant connu, l’acide ascorbique ou vitamine C. La valeur obtenue (0.8 TEAC) est en accord avec celles de la bibliographie [29]. Ainsi, d’après notre test, tous les produits de la cascade enzymatique possèdent un pouvoir antioxydant supérieur à celui de l’acide ascorbique.

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