La présente invention concerne de nouveaux substrats enzymatiques chromogènes pour la détection d'activité aminopeptidase. Ces substrats sont utilisables dans les applications comportant une étape d'hydrolyse enzymatique produisant un signal physico-chimique notamment en microbiologie, biochimie, immunologie, biologie moléculaire, histologie, etc.

L'invention concerne également des milieux de culture contenant de tels substrats, l'utilisation des substrats ou des milieux pour la détection d'activités aminopeptidases et/ou la différentiation de bactéries à Gram positif par rapport à des bactéries à Gram négatif et des procédés d'utilisation.

Comparativement aux substrats existants, la plupart fluorigènes, ces nouveaux substrats peuvent être utilisés notamment en milieux gélifiés pour la détection de micro- organismes car ils produisent une coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel donc concentrée au niveau des colonies.

Des substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection d'activité aminopeptidase ne diffusant pas sont décrits et déjà connus de l'état de la technique. Ainsi, de tels substrats sont couverts par les demandes de brevet WO-A-98/04735 et WO-A- 99/38995 déposées par la Demanderesse. Néanmoins, ces substrats présentent différents inconvénients : leur synthèse est difficile, la pureté est réduite et les rendements faibles. De plus, pour une utilisation en milieux de culture, il faut définir une composition de milieu très précise pour observer une couleur. Aucun des autres substrats actuellement décrits ne peut être utilisé en milieux solides pour la détection de micro-organismes en cultures mixtes.

D'autre part, des molécules à base d'acridine sont connues. Elles sont utilisées pour : leurs propriétés de colorant, voir par exemples Rapposch S. et al. J. Dairy Sci. 2000 Dec ; 83 (12) : 2753-2758, ou bien par exemple Giorgio A. et al. Microbiologica 1989 Jan ; 12 (1) : 97-100, leurs propriétés chimiothérapeutiques, par exemple Costes N. et al. J. Med. Chem. 2000 Jun 15 ; 43 (12) : 2395-2402, ou

effectuer des intercalations dans l'ADN, par exemples Okwumabua O. et al. Res.

Microbiol. 1992 Feb ; 143 (2) : 183-189 ou encore par exemple Schelhorn T. et al. Cell.

Mol. Biol. 1992 Jul ; 38 (4) : 345-365.

Le brevet EP-B-0.270. 946 propose des substrats enzymatiques chromogéniques à base d'acridinone, qui est un dérivé de l'acridine. Le radical, qui peut être clivé par une enzyme, est présent au niveau de la position 7 du groupement acridine. Sa structure ne permet la révélation que des activités enzymatiques suivantes : estérases et glycosidases.

Conformément à la présente invention, il est proposé de nouveaux substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection chez des micro-organismes d'une activité aminopeptidase ou pour définir l'appartenance d'au moins une bactérie au groupe des Gram positifs ou des Gram négatifs selon sa coloration. L'invention concerne également des milieux de culture contenant de tels substrats, l'utilisation des substrats ou des milieux pour la détection d'activités aminopeptidases et/ou la différentiation de bactéries à Gram positif par rapport à des bactéries à Gram négatif et des procédés d'utilisation A cet effet, la présente invention concerne des substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection chez des micro-organismes d'une activité aminopeptidase ou pour définir l'appartenance d'au moins une bactérie au groupe des Gram positifs ou des Gram négatifs selon sa coloration. Ils ont la formule ffl suivante : dans laquelle : Ri est rien ou un groupement alkyle, allyle, aryle,

R2 est constitué par au moins un acide aminé, préférentiellement alanine, # R3, R4, R5 et 1 ?, 6 sont constitués indépendamnent l'un de l'autre par H- ou -O-alkyle, préférentiellement-O-CH3, R7 est constitué par H, O-CH3, alkyle ou halogène, R8 est constitué par H ou Cl, et n est un chiffre entier correspondant à 0 ou 1.

Selon l'invention, on entend notamment par aryle un noyau aromatique en Cs-CIo, notamment phényle, benzyle, 1-naphtyle ou 2-naphtyle.

On entend par alkyle un alkyle en Ci-Ce, à savoir un alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'iso-propyle, le butyle, le t-butyle, le pentyle, l'iso-pentyle et l'hexyle.

Par atome d'halogène, on entend le chlore, le brome, l'iode et le fluor.

Les acides aminés utilisés dans l'invention sont tout acide aminé connu de l'homme du métier.

Par au moins un acide aminé, on entend un ou plusieurs acides aminés.

Selon un mode de réalisation de l'invention, R représente un acide aminé ou un peptide ayant au plus 10 acides aminés dans lequel les acides aminés sont identiques ou différents. De préférence, pour une question de coût du substrat, A représente un acide aminé ou un peptide ayant au plus 4 acides aminés dans lequel les acides aminés sont identiques ou différents, de préférence identiques.

Le ou les acides aminés R peuvent être couplés à un agent de blocage, ce qui constitue un autre mode de réalisation de l'invention.

Ces agents de blocage comprennent tout agent de blocage connu de l'homme du métier qui est capable de protéger les amines. A titre d'exemple, on peut citer le t- butoxycarbonyle (N-tBOC), le 9-fluorényloxycarbonyle, un agent de solubilisation tel que le succinyle, ou bien un acide aminé non métabolisable, c'est-à-dire non naturel, tel que l'acide pipécolique.

Selon un mode de réalisation, le substrat a la formule (la) suivante : N, nu L-ALiiiine (la) . a) ou il a la formule (Ib) suivante : 'N-1 L-niee

Selon un autre mode de réalisation, le substrat répond à la formule (T) ci-dessus dans laquelle R1 est un groupement méthyle ou allyle, Selon encore un autre mode de réalisation, le substrat répond à la formule (I) ci- dessus dans laquelle R1 est un groupement alkyle, de préférence méthyle, ou un groupement allyle, R2 est au moins un acide aminé, éventuellement bloqué avec un agent de blocage, de préférence au moins une alanine, R3, R4, R5, R6, R7 et R5 sont H, et n est 0 ou 1.

Selon encore un autre mode de réalisation, le substrat a la formule (Ic) suivante : 0 < O-CH3 /\ CI33 (Ic) <\ O-CH3 (Ic) ou il a la formule ad) suivante : N nu /X L-e (Id)

Les composés de l'invention peuvent être préparés en fonction de la valeur de n, comme suit : (1) Quand n=0, on met à réagir avec de l'acridine chlorhydrique appropriée (R8 est H ou Cl) avec de l'aniline appropriée (R3, R4, R5 et R6 étant tels que définis précédemment) et du soufre pour obtenir la 9- (4-aminophényl) acridine appropriée. Cette dernière est ensuite mise à réagir avec au moins un acide aminé couplé à un agent de blocage et le composé obtenu est éventuellement déprotégé pour séparer l'agent de blocage du composé de l'invention.

Lorsqu'on veut obtenir un composé pour lequel l'azote en position 10 est quartemisé, on met à réagir le composé obtenu avec un XRI dans laquelle X est un halogène et Rj est tel que défini précédemment, et (2) Quand n=l, on met à réagir de la 9-méthylacridine, préparée selon la méthode de Campbell et al. (1958, supra), ou de la 9-chloroacridine, préparée selon la méthode de Lehmstedt et Schrader (Albert, 1966, supra), avec dunitrobenzaldéhyde approprié (R3, R4, Rs et R6 étant tels que définis précédemment) et du chlorure de zinc pour préparer de la 9- (4- nitrostyryl) acridine appropriée. Le groupement nitro est ensuite réduit soit par du chlorure d'étain (II) dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éthanol, soit par du borhydrate de sodium et de l'acétylacétonate de cuivre, pour obtenir la 9- (4-aminostyryl) acridine. Cette dernière est ensuite mise à réagir avec au moins un acide aminé couplé à un agent de blocage et le composé obtenu est éventuellement déprotégé pour séparer l'agent de blocage du composé de l'invention. Lorsqu'on veut obtenir un composé pour lequel l'azote en position 10 est

quarternisé, on met à réagir le composé obtenu avec un XRI dans laquelle X est un halogène et Ri est tel que défini précédemment.

L'invention concerne également un milieu de culture utilisant au moins un substrat chromogénique enzymatique, tel que décrit ci-dessus, seul ou en combinaison avec au moins un autre substrat enzymatique spécifique d'une activité enzymatique différente d'une activité de celle détectée par le substrat selon l'invention.

En effet, lorsque des microorganismes exprimant une activité peptidase sont ensemencés dans un milieu réactionnel contenant les composés de l'invention, il se produit une coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel, et donc concentrée au niveau des colonies.

Par milieu réactionnel selon l'invention, on entend un milieu permettant le développement d'au moins une activité enzymatique d'au moins un microorganisme.

Ce milieu réactionnel peut soit servir uniquement de milieu de révélation, soit de milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu réactionnel constitue également le milieu de culture.

Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié.

Préférentiellement, ce milieu est constitué par un milieu gélifié.

L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).

La quantité d'agar dans le milieu réactionnel est de 2 à 40g/1 et de préférence de 9 à 25g/1.

Les substrats enzymatiques de l'invention sont utilisables dans une large gamme de pH, notamment entre pH 5,5 et 10.

La concentration de substrat enzymatique de l'invention dans le milieu réactionnel est

comprise entre 0,025 et 1,0 g/1 et, avantageusement, elle est de 0,3 g/1. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration.

Le milieu réactionnel peut comprendre au moins un autre substrat spécifique d'une activité enzymatique différente de celle détectée par le substrat selon l'invention. L'hydrolyse enzymatique du ou des autres substrats génère un signal détectable, différent du signal détecté par le substrat de l'invention, comme par exemple des produits colorés ou fluorescents différents, pour permettre la mise en évidence comme la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'un ou plusieurs microorganismes.

A titre d'autre substrat spécifique, on peut utiliser tout autre substrat classiquement utilisé dans la détection des microorganismes.

La concentration de l'autre substrat enzymatique spécifique est généralement comprise entre 0,01 et 2 g/1. L'homme du métier pourra déterminer facilement une telle concentration en fonction du substrat utilisé.

Le milieu réactionnel peut également comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des antibiotiques, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux. Des exemples de milieux sont décrits dans les demandes de brevet de la Demanderesse, EP 656 421 et W099/09 207.

Les substrats enzymatiques et milieux réactionnels de l'invention sont donc utiles dans le diagnostic de microorganismes à activité peptidase.

Ainsi, la présente invention a trait également à l'utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que décrits ci-dessus, ou d'un milieu de culture, également décrit ci-dessus, pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité aminopeptidase.

La présente invention a toujours pour objet l'utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que décrits ci-dessus, ou d'un milieu de culture, également décrit ci-dessus, pour séparer les bactéries à coloration à Gram positif des bactéries à coloration à Gram négatif.

L'invention concerne enfin un procédé pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité aminopeptidase, ce procédé consiste à : disposer d'un milieu de culture, tel que défini précédemment, ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, laisser incuber, et 'révéler la présence d'au moins une activité aminopeptidase seule ou en combinaison avec au moins une autre activité enzymatique différente.

L'invention concerne aussi un autre procédé pour la différentiation chez des bactéries de leur appartenance aux germes du type Gram positif ou aux germes du type Gram négatif, ce procédé consiste à : disposer d'un milieu de culture, tel que défini précédemment, ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, laisser incuber, et 'révéler la présence d'au moins une coloration synonyme de la présence de germe (s) du type Gram négatif.

Quel que soit le procédé utilisé, lorsque l'azote en position 10 du groupement acridine n'est pas quaternisé, la révélation de la présence d'au moins une activité aminopeptidase est réalisée par l'ajout d'acide, préférentiellement d'acide chlorhydrique, d'acide acétique ou d'acide citrique, sur la culture. Par quaternisé, il faut comprendre que l'azote en position 10 du groupement acridine est tétravalent, c'est-à-dire qu'il est lié par trois liaisons classiques avec le cycle phényle et une liaison complémentaire avec un radical, de sorte que ledit atome d'azote est porteur d'une charge positive et est donc cationique. Dans ce cas, la molécule est sous la forme d'un sel, par exemple un sel de chlorure, bromure ou trifluoroacétate.

Toutes les réactions, qui vont être décrites ci-dessous dans les exemples, ont été suivies en chromatographie sur couche mince (CCM) et les structures des produits ont été confirmées par spectrométrie de masse (MS) et résonance magnétique nucléaire (RMN).

Exemple 1 : Révélation de l'activité LAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrats non quaternisés : 1.1 : Molécules utilisées : On a réalisé un étude comparative de deux substrats à base d'acridine la L-Alanyl-9- (4-aminostyryl) acridine, ci-après référencée L-Ala-4-ASA, et la L-Alanyl- aminophenylacridine (substrats non quaternisés), ci-après référencée L-Ala-APA, de formules respectives : L-Alanine HN zL-Alanine ß H fY") t"rY L-Alanyl-aminophenylacridine L-Alanyl-9-(4-aminostyryl) acridine 1.2 : Synthèse des substrats : 1.2. 1 : Synthèse de la L-Ala-4-ASA : Cette synthèse s'effectue en plusieurs étapes.

Préparation de 9-chloroacridine : La préparation est effectuée en utilisant la méthode de Lehmstedt et Schrader qui a été référencée par Albert dans son livre'The Acridines', Arnold, second edition, (1966), page 33.

Préparation de 9-méthylacridine La méthode de Campbell, Franklin, Morgan et Tivey (réf. J. Chenu. Soc., 1958,1145) a été utilisée. Les rendements ont atteint 90%.

Préparation de 9-(4-nitrostyryl)acridine par fusion Un mélange de 9-méthylacridine (4,83 g, 25,0 mmole), 4-nitrobenzaldéhyde (4,23 g, 31,25 mmole) et chlorure de zinc (5,06 g, 31,25 mmole) est chauffé à 130°C pendant 3 heures avec

un bain d'huile. Le solide récupéré est chauffé dans une solution de sodium metabisulfite pour éliminer l'excès de l'aldéhyde et le mélange chaud est filtré. Des précipités obtenus sont dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofurane et de l'eau est ajoutée dans la solution pour avoir le produit sous forme de précipités. Ces précipités sont récupérés par une filtration et séchés. Le produit peut être recristallisé dans l'éthanol. Le rendement est de 35%.

Préparation de 9- (4-aminostyryl) acridine Le produit 9- (4-nitrostyryl) acridine (2,86 g, 10,0 mmole) est dissous dans de l'acétate d'éthyle (250ml), puis porté au reflux. Une solution de chlorure d'étain (H) dihydraté (9, 0g, 40mrnrnol) dans de méthanol chaud (150ml) est refroidit et ajouté à la solution de 9- (4- nitrostyryl) acridine. L'ensemble est mis à réagir sous reflux et sous agitation pendant 5 heures. Après refroidissement, la 9- (4-aminostyryl) acridine précipite et est isolée par filtration sous vide. Le filtrat est séché par évaporation et repris dans de l'eau (500ml) sous agitation.

La solution est alcalinisée (pH 13-14) avec une solution de soude. La fraction de 9- (4-aminostyryl) acridine précédemment isolée qui contient une forte proportion de sel d'étain est également alcalinisée. La 9- (4-aminostyryl) acridine est séparée par filtration, lavée à l'eau et séchée. Elle est suffisamment pure pour l'étape suivante.

Préparation de t-Boc-alanyl-9- (4-aminostyryl) acridine Le produit t-Boc-alanine (3,79 g, 20,0 mmole) est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofurane (tuf) anhydride et la solution est refroidie à-15°C à l'aide d'un mélange éthylène glycol/carbone glace dans un bain. La Nméthylmorpholine (NMM) (2,02 g, 20 mmole) est ajoutée goutte à goutte dans le mélange. Le chloroformiate d'isobutyle (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmole) est ensuite introduit goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Il faut que la température soit au-dessous de-10°C. Au bout de 3 minutes environ, la 9- (4-aminostyryl) acridine (5,4 g, 20 mmole), qui est dissoute dans une quantité minimum de tétrahydrofurane (THF) anhydride et refroidie à-15°C, est introduite. Le mélange réactionnel est agité et on le laisse revenir à la température ambiante. Le sel de N-méthylmorpholine est éliminé par une filtration avec un entonnoir à plaque filtrante. Le mélange est évaporé jusqu'à son quatrième volume original avec un évaporateur rotatif. Le filtrat est introduit goutte à goutte dans un mélange eau/glace en quantité importante sous agitation. Des précipités jaunes,

formés, sont récupérés par une filtration, lavés avec de l'eau et séchés. Le produit peut être recristallisé dans le méthanol. Le rendement est de sensiblement 75 %.

D'autres analogues des acides aminés protégés par le t-Boc ont aussi été utilisés pour former de nouveaux produits. Les acides aminés sont : la proline, la glycine, la sérine et la ß- alanine. Les rendements pour ces produits sont dans la zone de 60 à 80 %, les résultats étant généralement les meilleurs pour les analogues de la (3-alanine et les moins bons pour les analogues de la sérine.

1.2. 2 : Synthèse de la L-Ala-APA : La préparation de 9- (4-aminophényl) acridine par une réaction de soufre fondu peut être réalisée par deux méthodes différentes.

Méthode A L'acridine chlorhydrique (9,7 g, 45,0 mmole), l'aniline (8,37 g, 90,0 mmole) et 10,0 g de soufre sont bien mélangés et chauffés à 130°C pendant 4 heures sous une hotte efficace. Le milieu réactionnel dans le ballon est refroidi à température ambiante et dissous dans le méthanol chaud pour donner une solution de couleur rouge sanguine. La solution est refroidie et le soufre est éliminé par une filtration. L'alcanilisation du filtrat est réalisée à l'aide d'une solution d'ammoniaque concentrée. Des précipités jaunes légers, formés, sont filtrés puis lavés avec le méthanol froid. Le rendement est de 65%.

Méthode B L'acridine (8,06 g, 45,0 mmole), l'aniline chlorhydrique (11,61 g, 90 mmole) et 10,0 g de soufre sont bien mélangés et chauffés à 130°C pendant 4 heures. Le milieu réactionnel est ensuite traité comme dans la Méthode A ci-dessus.

Ensuite on réalise une préparation sur la base de l'une et/ou l'autre des deux méthodes précédentes.

Préparation de t-Boc-alanyl-9- (4-aminophényl) acridine Le produit t-Boc-alanine (3,79 g, 20,0 mmole) est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofurane (TIF) anhydride et la solution est refroidie à-15°C à l'aide d'un mélange éthylène glycol/carbone glace dans un bain. La Nméthyimorpholine (NMM) (2,02 g, 20 mmole) est ajoutée goutte à goutte dans le mélange. Le chloroformiate d'isobutyle (IBCF)

(2,53 g, 20,0 mmole) est ensuite introduit goutte à goutte dans le mélange réactionnel. E faut que la température soit au-dessous de-10°C. Au bout de 3 minutes environ, la 9- (4-aminophényl) acridine (5,4 g, 20 mmole), qui est dissoute dans une quantité minimum de tétrahydrofurane (THF) anhydride et refroidie à-15°C, est introduite. Le mélange réactionnel est agité et on le laisse revenir à la température ambiante. Le sel de N-méthyhnorpholine est éliminé par une filtration avec un entonnoir à plaque filtrante. Le mélange est évaporé jusqu'à son quatrième volume original avec un évaporateur rotatif. Le filtrat est introduit goutte à goutte dans un mélange eau/glace en quantité importante sous agitation. Des précipités jaunes, formés, sont récupérés par une filtration, lavés avec de l'eau et séchés. Le produit peut être recristallisé dans le méthanol. Le rendement est de 75%.

D'autres analogues des acides aminés protégés par le t-Boc ont aussi été utilisés pour former de nouveaux produits. Les acides aminés sont : la proline, la glycine, la sérine et la ß- alanine. Les rendements pour ces produits sont dans la zone de 60 à 80% : les résultats étant généralement les meilleurs pour les analogues de la (3-alanine et les moins bons pour les analogues de la sérine.

1.3 : Préparation du milieu : Un milieu gélifié comprenant de la L-Alanyl-9- (4-aminostyryl) acridine (ci-après référencée LAla-4-ASA) ou de la LAlanyl-aminophenylacridine (ci-après référencée L Ala-APA) est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés. Ce milieu réactionnel est séparé en deux milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,3 g/1 de L-Ala-4-ASA apporté par une solution mère dans du DMSO et 0,3 g/1 de L-Ala-APA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO.

Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide chlorhydrique.

1.4 : Résultats :

Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. En absence d'HCl, les deux substrats ne donnent pas de coloration spontanée. En présence d'une goutte d'HCl, les colonies possédant l'activité L-Alanine-aminopeptidase sont colorées en gris-mauve à mauve.

Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent ncolores. Ces substrats sont donc sensibles et spécifiques. Us peuvent permettre dans le cas d'une culture mixte Gram positif et Gram négatif de séparer les deux types de germes. 0, 3 g/1 0, 3 g/l 0, 3 g/l 0, 3 gel ESPECES (N° souche # L-Ala-4-ASA # L-Ala-APA # L-Ala-4-ASA # L-Ala-APA sans HCI sans HCI avec HCI avec HCI Escherichia coli incolore incolore gris mauve mauve pâle Proteus mirabilis incolore incolore gris mauve mauve très pâle pâle Klebsiella pneumoniae incolore incolore gris mauve mauve Enterobacter cloacae incolore incolore gris mauve mauve Citrobacter koseri incolore incolore gris mauve mauve Streptococcus agalactiae incolore incolore incolore incolore Enterococciisfaecalis incolore incolore incolore incolore Staphylococcus aureus incolore incolore incolore incolore Listeria innocua incolore incolore incolore incolore Candida albicans incolore incolore incolore incolore

Tableau 1 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par la L- Ala-4-ASA ou la L-Ala-APA sur milieu gélifié Exemple 2 : Révélation de l'activité LAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrat quaternisé : 2.1 : Molécule utilisée : L'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié est réalisée par l'utilisation du chlorure de L-Alanyl-9 (4-aminophenyl)-10-allyl-acridinium (substrat quaternisé), ci-après désigné L-Ala-4-AP-10-AA, de formule : L-Alanine N-"' Hlf c Allyl

chlorure de L-Alanyl-9 (4-aminophenyl)-10-allyl-acridinium 2.2 : Synthèse de L-Ala-4-AP 10-AA Le composé de départ est la t-Boc-alanyl-9- (4-aminophényl) acridine dont la synthèse a déjà été exposée au paragraphe 1.2. 2 (Synthèse de L-Ala-APA). Dans un flacon de 10 ml qui peut être fermé, la t-Boc-alanyl-9-(4-aminophényl) acridine (0,88 g, 2,0 mmole) est introduite dans le tétrahydrofurane anhydride (4,0 ml) et le mélange est mis en l'ébullition pour avoir une solution partielle. La solution/suspension est refroidie et le bromure d'allyle (2,0 ml) est ajouté. Le flacon est ensuite porté au reflux pendant 8 heures, et la réaction est régulièrement suivie par chromatographie sur couche mince (CCM). Après refroidissement et élimination du solvant, le sel quaternaire est lavé avec de l'éther diéthylique et séché.

Le produit est dissous dans une quantité minimum d'éthanol et agité avec l'acétate d'éthyle (10 ml) saturé par HC1. Des précipités, qui sont formés quelques heures après, sont récupérés par une filtration sous pression réduite. L'introduction de l'éther éthylique dans le filtrat permet de récupérer le produit en plus. Les fractions réunies du produit sont lavées avec l'éther éthylique et séchées rapidement pour éviter l'absorption d'humidité. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> 2.3 : Préparation du milieu :<BR> ............................

Un milieu gélifié comprenant comme substrat du LAla-4-AP-10-AA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés. Ce milieu réactionnel est séparé en trois milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,1 g/1, 0,2 g/1, 0,4 g/1 de L-Ala-4-AP-10-AA apporté par une solution mère dans du DMSO.

Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées.

2.4 : Résultats : Les résultats sont exprimés en intensité de coloration en se basant sur une échelle arbitraire allant de 0 à 4. Ces résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

Ce substrat permet de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolores. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre dans le cas d'une culture mixte Gram positif et Gram négatif de séparer les deux types de germes. Le fait de « quaterniser » l'azote en position 10 du groupement acridine permet d'obtenir une réaction spontanée sans ajout d'acide comparativement à la même molécule non quaternisée décrite dans l'exemple 1. Temps 0, 1 gilde 0, 2 g/1 de 0, 4 g/1 de SOUCHES d'incu L-Ala-4-AP-10-AA L-Ala-4-AP-10-AA LrAla-4-AP-10- - batio Couleur Intensité Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 24 H beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 2,5 (032) 48 h beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 3 Proteus mirabilis 24 H beige traces rose-orange 0,5 rose-orange 3 (103) 48 h beige traces rose-orange 1 rose-orange 3 Klebsiella 24 H beige traces rose-orange 1 rose-orange 3 pneumoniae (023) 48 h beige traces rose-orange 2 rose-orange 3,5 Citrobacter koseri 24 H beige 0,5 rose-orange 1 rose-orange 3 (090) 48 h beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 3,5 Staphylococcus 24 H inhibé-inhibé-inhibé- aureus (070) 48 h inhibé-inhibé-inhibé- Streptococcus 24 H inhibé-inhibé-inhibé- pyogenes (067) 48 h incolore-incolore-incolore- Enterococcus 24 H incolore-orange traces orange traces faecalis (075) 48 h incolore orange 0,5 orange 1 Listeria innocua 24 H incolore-incolore-incolore- (036) 48 h incolore - incolore - incolore - Candida albicans 24 H incolore-incolore-incolore- (056) 48 h incolore - incolore - incolore -

Tableau 2 : Influence de la concentration en substrat dans la révélation de l'activité L-Alanine- aminopeptidase de micro-organismes par désigné la L-Ala-4-AP-10-AA Exemple 3 : Révélation de l'activité LAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un autre substrat quatemisé : 3.1 : Molécule utilisés La révélation de l'activité LrAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé chlorure de LAlanyl-9 (4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium (substrat quatemisé), ci-après appelé L Ala-4-AP-10-MA, dont la formule est la suivante : L-Alanine Ho N+ CH3

chlorure de L-Alanyl-9 (4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium 3.2 : Synthèse de L-Ala-4-AP-10-MA : Cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 2.2 ci-dessus, dans laquelle le bromure d'allyle a été remplacé par l'iodure de méthyle. H convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Ala-4-AP-10-MA.

3.3 : Préparation du milieu Un milieu gélifié comprenant 300 mg/1 de LrAla-4-AP-10-MA, est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés, le substrat est ensuite apporté par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur le milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées.

3.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous : SOUCHES Temps 0,3 g/1 de I-Ala-4-AP-10-MA d'incubation Couleur Intensité Escherichia coli 24 H rose-orange 3,5 (032) 48 h rose-orange 3,5 Proteus mirabilis 24 H rose-orange (103) 48 h rose-orange 2 Klebsiella 24 H rose-orange 3 pneumoniae (023) 48 h rose-orange 3 Citrobacter koseri 24 H rose-orange 3 (090) 48 h rose-orange 3 Staphylococcus 24 H inhibé- aureus (070) 48 h irhibé Streptococcus 24 H inhibé- pyogenes (067) 48 h inhibé- Enterococcus 24 H rose traces faecalis (075) 48 h rose-orange 0,5 Listeria innocua 24 H incolore- (036) 48 h rose-orange traces Candida albicans 24 H incolore (056) 48 h incolore

Tableau 3 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Ala-4-AP-10-AA dont la concentration en substrat est optimisée Ce substrat permet de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur rose- orange concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolores. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre dans le cas d'une culture mixte Gram +/Gram-de séparer les deux types de germes. Comparativement au substrat décrit dans l'exemple 2, il semble permettre d'obtenir des intensités de coloration plus fortes pour les souches positives. La différence entre ces deux substrats est le type de groupement en position 10 sur l'azote du noyau d'acridine.

Exemple 4 : Révélation de l'activité LAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'autres substrats non quatemisés : 4.1 : Molécules utilisées : La révélation de l'activité LrAlanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de deux substrats appelés L-Alanyl-2- methoxyaminophenylacridine, ci-après appelée L-Ala-2-MeOAPA, et L-Alanyl-2,5- dimethoxyaminophenylacridine, ci-après appelée IJAla-2, 5-diMeOAPA, dont les formules sont respectivement les suivantes : L-Alanine L-Alanine c HN Hlf f) 1 CHg r T CHg "r o , Y Y CH3 CH3 N O L-Alanyl-2-methoxyaminophenylacridine L-Alanyl-2, 5-dimethoxyaminophenylacridine 4.2 : Synthèse des substrats 4.2. 1 : Synthèse de L-Ala-2-MeOAPA : Sur la base de ce qui est décrit au point 1.2. 2 ci-dessus, d'autres analogues d'aniline sont aussi utilisés pour former des nouveaux produits, y compris l'anisidine (3-méthoxyaniline) qui donne la 9- (4-amino-2-méthoxyphényl) acridine.

4.2. 2 : Synthèse de L-Ala-2, 5-diMeOAPA : Sur la base de ce qui est décrit au point 1.2. 2 ci-dessus, d'autres analogues d'aniline sont aussi utilisés pour former des nouveaux produits, y compris la 2, 5-diméthoxyaniline qui donne la 9- (4-amino-2, 5-diméthoxyphényl) acridine.

4.3 : Préparation du milieu. :

Un milieu gélifié comprenant de la L-Ala-2-MeOAPA ou de la L-Ala-2, 5- diMeOAPA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés. Ce milieu réactionnel est séparé en deux milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,3 g/1 de LrAla-2-MeOAPA apporté par une solution mère dans du DMSO et 0,3 g/1 de L-Ala-2, 5-diMeOAPA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24 heures. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées après ajout d'HCl.

4.4 : Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous : SOUCHES Temps I-Ala-2-MeOAPA L-Ala-2, 5-di MeOAPA d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 24 H orange 0, 5 jaune orange 1, 5 (032) 48 h rose 3,5 jaune orange 2 Proteus mirabilis 24 H orange 1 incolore 0, (037) 48 h orange 1,5 orange 0,5 Klebsiella 24 H rose 3 orange 1 pneumonie (023) 48 h rose 3,5 jaune orange 2,5 Citrobacter koseri 24 H orange 2 orange 1 (012) 48 h rose 3,5 jaune orange 2,5 Enterobacter 24 H rose 2 jaune orange 1,5 cloacae (061) 48 h rose 2 jaune orange 2 Staphylococcus 24 H incolore* 0 incolore 0 aureus (035) 48 h incolore* 0 incolore 0 Streptococcus 24 H inhibé-incolore 0 agalactie (001) 48 h inhibé incolore 0 Enterococcus 24 H inhibé-jaune orange 0,5 faecalis (117) 48 h inhibé jaune orange 3 Listeria innocua 24 H incolore* 0 incolore 0 (036) 48 h incolore* 0 incolore 0 Candida albicans 24 H inhibé-incolore 0 (077) 48 h inhibé incolore 0 * croissance très faible

Tableau 4 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par les L-Ala-2-MeOAPA et La-Ala-2, 5-diMeOAPA Ces deux substrats permettent après ajout d'une goutte d'HCl de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram positif. L'ajout de substituants (Méthoxy-) sur le groupement phényl permet en plus de réduire la toxicité des substrats, notamment vis-à-vis des bactéries à Gram positif. Cependant, ce gain en fertilité se fait au détriment de la spécificité, en effet, Enterococcus faecalis présente une activité avec la Ir Ala-2, 5-diMeOAPA après 48 heures d'incubation.

Exemple 5 : Révélation de l'activité ß-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié : utilisation du chlorure de ßAlanyll-9 (4-aminophenyl))-10-methyl-acridinium (substrat quatemisé) : 5.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité P-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé chlorure de P-Alanyl-9 (4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium (substrat quatemisé), ci-après appelé P- Ala-4-AP-10-MA, dont la formule est la suivante : fAlan ins 1 HN 1' CH3 chlorure de ß-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium <BR> <BR> <BR> 5.2 : Synthèse de-Ala-4-AP-10-MA :<BR> Synthèse de ß-Ala-4-AP-10-MA :

Le composé de départ est la t-Boc-alanyl-9- (4-aminophényl) acridine dont la synthèse a déjà été exposée au paragraphe 1.2. 2 (Synthèse du LAla-APA). La t-Boc- alanyl-9- (4-aminophényl) acridine (0,67 g, 1,5 mmole) est dissoute dans l'acétonitrile (volume minimum) et chauffée au reflux avec de l'iodure de méthyle (4,0 ml) Le flacon est ensuite fermé et incubé à 40°C pendant plus de 100 heures. Le réactif solide est dissous au fur et à mesure en formant une solution orange. Des cristaux orangés-noirs apparaissent dans cette solution.

A l'issue des 100 heures, le mélange réactionnel est transféré dans l'acétate d'éthyle (100 ml) sous agitation. Après une durée nécessaire, le sel quaternaire est filtré et lavé avec l'éther diéthylique.

Le produit est dissous dans une quantité minimum d'éthanol et agité avec l'acétate d'éthyle (10 ml) saturé par HCI. Des précipités, qui sont formés quelques heures après, sont récupérés par une filtration sous pression réduite. L'introduction de l'éther diéthylique dans le filtrat permet de récupérer le produit en plus. Les fractions réunies du produit sont lavées avec l'éther diéthylique et séchées rapidement pour éviter l'absorption d'humidité.

La déprotection est la même que celle décrite précédemment. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> 5.3 : Préparation du milieu :<BR> ....... »....................

Un milieu gélifié comprenant 300 mg/1 de ßAla-4-AP-10-MA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Cblumbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés, le substrat est ensuite apporté par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur le milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées.

5.4 : Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous.

Ce substrat permet de révéler une activité ß-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur orange concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolore. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre d'identifier les souches de Pseudomonas aeruginosa et notamment de les différencier des autres bactéries.

SOUCHES Temps 0,3 g/1 de-Ala-4-AP-10-MA d'incubation Couleur Intensité Pseudomonas 24 H orange 2 aeruginosa (052) 48 h orange 3 Pseudomonas 24 H orange 1,5 aeruginosa (165) 48 h orange 3 Burkholderia 24 H incolore- cepacia (004) 48 h incolore - Pseudomonas 24 H inhibé- fluorescens (016) 48 h incolore - Pseudomonas 24 H inhibé- stutzeri (073) 48 h incolore - Pseudomonas 24 H incolore - putida (028) 48 H incolore - Acinetobacter 24 H incolore - calcoaceticus (034) 48 H incolore Escherichia coli 24 H incolore (032) 481-1 incolore Klebsiella 24 H incolore pneumoniae (023) 48 H incolore Tableau 5 : Révélation de l'activité ß-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par de la ß-Ala-4-AP-10-MA Exemple 6 : Révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un substrat non quaternis à base de Proline : 6.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé L-Prolyl-9 (4-aminophenyl)-acridine (substrat non quaternisé). ci-après appelée L-Pro-4-APA, dont la formule est la suivante : nu l L-Proline L-Prolyl-9 (4-aminophenyl) acridine

6.2 : Synthèse de L-Pro-4-APA: Cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 1.2 ci-dessus, selon deux méthodes A et B, dans lesquelles l'acide aminé Alanine a été remplacé par l'acide aminé Proline. Il convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Pro-4-APA.

6.3 : Préparation du milieu Un milieu gélifié comprenant de la L-Prolyl-9- (4-aminophenyl) acridine (ci-après référencée L-Pro-4-APA) est préparé comme suit : 45g d'agar Sabouraud sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclavés. Ce milieu réactionnel comprend 0,3 g/1 de L-Pro-APA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO.

Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide acétique, ci-après GAA (glacial acetic acid).

6.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous : SOUCHES Goutte d'Acide 0,3 g/1 de L-Pro-4-APA Acétique Couleur Intensité Candida albicans avant GAA jaune 2 (138) après GAA jaune 3 Candida avant GAA blanc- parapsilosis (040) après GAA jaune 2 Candida avant GAA pas de croissance- lusitaniae (045) après GAA pas de croissance Candida avant GAA pas de croissance guilliermondii (046) après GAA pas de croissance Candida krusel-avant GAA jaune 1 (026) après GAA jaune 3 Candida glabrata avant GAA jaune 2 (051) après GAA jaune 3

Tableau 6 : Révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Pro-4-APA dont la concentration en substrat est optimisée Avec certaines souches de levures Candida, la nature inhibitrice du substrat est démontrée. Cependant, certaines levures produisent une coloration jaune, sans l'addition d'acide. Cette coloration est plus intense pour certaines souches, notamment Candida albicans, elle est également plus intense qu'en l'absence de culture. Ceci démontre bien que notre substrat, contenant la Proline comme acide aminé, permet de révéler l'activité L-Proline-aminopeptidase chez les levures.

Exemple 7 : Révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un substrat non quatemisé à base de Sérine 7.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes surmilieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé L-Séryl-9 (4-aminophenyl)-acridine (substrat non quaternisé), ci-après appelée L-Ser-4-APA, dont la formule est la suivante : "CfC /\ L&me L-Séryl-9 (4-aminophenyl) acridine

7.2 : Synthèse de L-Ser-4-APA : A l'instar de ce qui a été exposé pour la L-Pro-4-APA (paragraphe 6.2 ci-dessus), cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 1.2 ci-dessus, selon deux méthodes A et B, dans lesquelles l'acide aminé Alanine a été remplacé par l'acide aminé Sérine. Il convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Ser-4-APA.

7.3 : Préparation du milieu : Un milieu gélifié comprenant de la L-Seryl-9 (4-aminophenyl) acridine (ci-après référencé LSer-4-APA) est préparé comme suit : 30 milligrammes de LSer-4-APA sont ajoutés à 4 grammes d'agar Columbia, additionnés à 0,1 litre d'eau distillée puis autoclavés.

Ce milieu réactionnel est mis à l'autoclave à 116°C pendant 20 minutes. La majeure partie du substrat se retrouve en solution, sans coloration résiduelle.

Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24 heures. Des échantillons de 10 al de chaque suspension sont ensuite cultivés pour produire des colonies. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18 à 24 heures d'incubation.

La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide acétique, ci-après GAA (glacial acetic acid).

7.4 : Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous : SOUCHES GAA 0, 3 g/l de L-Ser-4-APA Couleur Intensité Escherichia coli avant GAA crème - (009) après GAA orange pâle 2 Klebsiella avant GAA crème- pneumonias (012) après GAA orange pâle 2 Yersinia avant GAA crème - enterocolitica (061) après GAA orange âle 2 Candida albicans avant GAA crème (138) après GAA crème Staphylococcus avant GAA crène aureus (008) après GAA crème- Enterococcus avant GAA crème faecalis (117) après GAA crème

Tableau 7 : Révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Ser-4-APA dont la concentration en substrat est optimisée Encore une fois, certaines souches ont une inhibition partielle avec le substrat à base d'acridine. Les trois souches à Gram négatif testées produisent une coloration réactionnelle particulière après l'addition d'acide acétique.

Exemple 8 : Révélation de l'activité L-alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrats quaternisés à base de une, deux ou trois L-alanine : 8.1 : Molécule utilisée La révélation de l'activité L-alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de trois substrats, à savoir la h-Ala-4-AP-10-MA telle que décrite dans l'exemple 3, la LAla-L-Ala-4-AP-10-MA qui correspond à la L-AIa-4-AP- 10-MA comprenant une Lalanine supplémentaire, et la LrAla-L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA qui possède encore une L-Alanine supplémentaire.

8.2 :. Synthèse de ces substrats :

Ces substrats ont été préparés comme décrits dans le point 3.2 ci-dessus à partir du composé de départ approprié possédant une, deux ou trois L-Alanines.

8.3 : PréParation du milieu Un milieu gélifié comprenant ces trois substrats est préparé comme suit : 30 mg de chaque substrat sont dissous (chauffage) dans 10 ml d'eau distillée stérile. Dix rnl de cette solution sont ensuite ajoutés à 90 ml d'agar Columbia maintenus en surfusion à 50°C.

Diverses souches de microorganismes issues de la collection NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) ont été ensemencées sur les milieux ainsi obtenus selon l'inoculation multi-point : pour chaque souche, une goutte de 10gel d'une suspension à 0,5 McFarland est déposée sur chacun des milieux de culture.

Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24h et 48h d'incubation.

La coloration et la croissance de ces colonies ont été notées.

8.4 : Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous : SOUCHES L-Ata-4-AP-lO-MA LAla-LAla4-AP-10-LAla-LAla-LAla-4-AP- (Référence) MA 10-MA 24h 48h 24h 48h 24h 48h E. coli 0157 Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 12079) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Salmonella Orange Orange Orange Orange Orange Orange typhimurium (++) (++) (++) (++) (++) (+@ (NCTC 74) Salomonella Poona Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 4840) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Shigella sonnei Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 9774) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Pseudomonas Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 10662) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Klebsiella pneumoniae Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 10896) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Enterobacter cloacae Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 11936) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Burkholderia cepacia Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 10743) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Serratia marcescens Orange Orange Orange Orange Orange Orange (NCTC 10211) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Enterococcus faecalis PC PC Incolore Incolore Incolore Incolore (NCTC 755) (++) (++) (++) (++) Enterococcusfaecalis Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore (NCTC 12697) (+/-) (+/-) (++) (++) (++) (++) Enterococcus faecium Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore (NCTC 7171) (++) (++) (++) (++) (++) (++) Listeria Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore monocytogenes (++) (++) (++) (++) (++) ( (NCTC 11994) Staphylococcus PC PC PC PC Incolore Incolore aureus (++) (++) (NCTC 6571) Staphylococcus Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore Incolore aureus (++) (++) (++) (++) (++) ( (NCTC 11939) ++ signifie bonne croissance, + signifie croissance modérée, +/-signifie faible croissance et PC signifie pas de croissance

Sur les trois milieux, les souches de bactéries à Gram négatif ont formé des colonies colorées en orange, alors que les souches de bactéries à Gram positif ont formé des colonies incolores ou ne se sont pas développées. Ces trois milieux permettent donc de différencier les bactéries à Gram négatif de celles à Gram positif, et suivant les milieux, la croissance de tout ou partie des souches testées.

Exemple 9 : Révélation de l'activité Pyroglutamine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrats quatemisés à base de sel de chorhvdrate de pyroglutamyl- 9- (4-ammophényl)-10-méthyl-acridine : 9.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité pyroglutamine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de pyroglutamyl-9- (4-aminophényl)-10-méthyl- acridine, ci-après appelée PG-4-AP-10-MA.

9.2 : Synthèse de ce substrat : Ce substrat a été préparé comme décrit dans le point 3.2 ci-dessus à ceci près qu'on a remplacé la L-alanine par la pyroglutamine.

9.3 :. Préparation du milieu : Un milieu gélifié comprenant ce substrat est préparé comme suit : 30 mg de chaque substrat sont dissous (chauffage) dans 10 ml d'eau distillée stérile. Dix ml de cette solution sont ensuite ajoutés à 90 ml d'agar Columbia maintenus en surfusion à 50°C.

Diverses souches de microorganismes issues de la collection NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) ont été ensemencées sur les milieux ainsi obtenus selon l'inoculation multi-point décrite dans l'exemple 8 ci-dessus.

Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24h et 48h d'incubation.

La coloration et la croissance de ces colonies ont été notées.

9.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 9 ci-dessous : SOUCHE (référence) PG-4-AP-10-MA 24h 48h Escherichia coli (NCTC 14018) Incolore (++) Incolore (++) Escherichia coli 0157 (NCTC 12079) Incolore (++) Incolore (++) Salomonella typhimurium (NCTC 74) Incolore (++) Incolore (++) Salmonella poona (NCTC 4840) Incolore (++) Incolore (++) Shigella sonnei (NCTC 9774) Incolore (++) Incolore (++) Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) Incolore (++) Orange (++) Klebsiella pneumonia (NCTC 10896) Incolore (++) Orange pale (++) Enterobacter cloacae (NCTC 11936) Incolore (++) Orange pale (++) Burkholderia cepacia (NCTC 10743) Incolore (++) Orange pale (++) Serratia marcescens (NCTC 10211) Incolore (++) Orange pale (++) ++ signifie bonne croissance, + signifie croissance modérée, +/-signifie faible croissance et PC signifie pas de croissance

Le milieu de l'exemple permet de différencier les bactéries exprimant une activité pyroglutamyl-aminopeptidase de celles ne l'exprimant pas.

Exemple 10 : Révélation de l'activité glycine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un substrat quaternisé à base de sel de chlorhydrate de glycyl-9- (4- aminophényl)-10-méthyl-acridine : 10.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité glycine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de glycyl-9- (4-aminophényl)-10-méthyl-acridine, ci-après appelée G-4-AP-10-MA.

10.2 : Synthèse de ce substrat : Ce substrat a été préparé comme décrit dans le point 3.2 ci-dessus à ceci près qu'on a remplacé la L-alanine par la glycine.

10.3 : Pr aration du milieu :<BR> Préparation du milieu : Un milieu gélifié comprenant ce substrat est préparé comme suit : 30 mg du substrat sont dissous (chauffage) dans 10 ml d'eau distillée stérile. Dix ml de cette solution sont ensuite ajoutés à 90 ml d'agar Columbia maintenus en surfusion à 50°C.

Diverses souches de microorganismes issues de la collection NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) ont été ensemencées sur les milieux ainsi obtenus selon l'inoculation multi-point décrite dans l'exemple 8 ci-dessus.

Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24h et 48h d'incubation.

La coloration et la croissance de ces colonies ont été notées.

10.4 Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 10 ci-dessous :

SOUCHE (référence) G-4-AP-10-MA 24h 48h Escherichia coliNCTC 14018) PC PC Escherichia coli 0157 (NCTC 12079) Orange (++) Orange (++) Salomonella typhimurium (NCTC 74) Orange pale (++) Orange pale (++) Salmonella poona (NCTC 4840) Orange (++) Orange (++) Shigella sonnei (NCTC 9774) Orange (++) Orange (++) Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) Orange pale (++) Orange (++) Klebsiella pneumonia (NCTC 10896) Orange (++) Orange (++) Enterobacter cloacae (NCTC 11936) Orange (++) Orange (++) Burkholderia cepacia (NCTC 10743) Orange (++) Orange (++) Serratia marcescens (NCTC 10211) Orange (++) Orange (++) Enterococcus faecalis (NCTC 755) PC PC Enterococcusfaecalis (NCTC 12697) Incolore (+) Incolore (+) Eraterococcus faecium (NCTC 7171) Incolore (+) Incolore (+) Listeria monocytogenes (NCTC 11994) Incolore (+) Incolore (+) 1 Staphylococ us aureus (NCTC 6571) PC PC Staphylococcus aureus (NCTC 11939) Incolore (+) Incolore (+) ++ signifie bonne croissance, + signifie croissance modérée, +/-signifie faible croissance et PC signifie pas de croissance

Le milieu de l'exemple permet de différencier les bactéries exprimant une activité glycylamyl-aminopeptidase de celles ne l'exprimant pas.

Exemple 11 : Révélation de l'activité t-BOC-L-alanvl-L-alanyl-L-alanyl-peptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un substrat quatemisé pour lequel l'acide aminé est couplé à un agent de blocage, substrat à base de sel de chlorhydrate de t-BOC-L-alanyl- L-alanyl-L-alanyl-9- (4-aminophényl)-10-méthyl-acridine : 11.1 : Molécule utilisée La révélation de l'activité Lalanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de t-BOC-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl-9- (4-aminophényl)- 10-méthyl-acridine, ci-après appelée t-BOC-L-Ala-4-AP-10-MA.

11.2 :. Svnthèse de ce substrat : Ce substrat a été préparé comme décrit dans le point 3.2 ci-dessus à ceci près qu'on n'a pas procédé à la déprotection du composé aminé.

11. 3 : Pr aration du milieu : Un milieu gélifié comprenant ce substrat est préparé comme suit : 30 mg du substrat sont dissous (chauffage) dans 10 ml d'eau distillée stérile. Dix ml de cette solution sont ensuite ajoutés à 90 ml d'agar Columbia maintenus en surfusion à 50°C.

Diverses souches de microorganismes issues de la collection NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) ont été ensemencées sur les milieux ainsi obtenus selon l'inoculation multi-point décrite dans l'exemple 8 ci-dessus.

Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24h et 48h d'incubation.

La coloration et la croissance de ces colonies ont été notées.

11.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 11 ci-dessous : SOUCHE (référence) t-BOC-L-Ala-Ala-Ala-4-AP-10-MA 24h 48h Escherichia coli 0157 (NCTC 12079) Orange pale (++) Orange pale (++) Salomonella íyphimurium (NCTC 74) Orange pale (++) Orange pale (++) Salmonella poona (NCTC 4840) Orange pale (++) Orange pale (++) Shigella sonnei (NCTC 9774) Orange pale (++) Orange pale (++) Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) Orange pale (++) Orange pale (++) Klebsiellapneumonia (NCTC 10896) Orange (++) Orange (++) Enterobacter cloacae (NCTC 11936) Orange (++) Orange (++) Burkholderia cepacia (NCTC 10743) Orange (++) Orange (++) Serratia marcescens (NCTC 10211) Orange (++) Orange (++) Enterococcusfaecalis (NCTC 755) PC PC Enterococcusfaecalis (NCTC 12697) Incolore (+/-) Incolore (+/-) Enterococcusfaecium (NCTC 7171) Incolore (+/-) Incolore (++) Listeria monocytogenes (NCTC 11994) Incolore (+/-) Incolore (+) Staphylococcus aureus (NCTC 6571) PC PC Staphylococcus aureus (NCTC 11939) Incolore (+) Incolore (+) ++ signifie bonne croissance, + signifie croissance modérée, +/-signifie faible croissance et PC signifie pas de croissance

Le milieu de l'exemple permet d'obtenir quatre groupes de microorganismes : ceux formant des colonies colorées en orange franc, ceux formant des colonies colorées en orange pâle, ceux formant des colonies incolores et ceux ne formant pas de colonie.

Parmi les souches testées, les bactéries à Gram négatif appartiennent aux deux premiers groupes, alors que les bactéries à Gram positif appartiennent aux deux derniers.

La présence d'un agent de blocage (t-Boc) permet de moduler l'activité par rapport aux résultats obtenus avec le substrat déprotégé (voir exemple 8 ci-dessus).

Autres expériences réalisées : D'autres substrats ont été testés qui permettent de valider les résultats présentés ici, on peut par exemple citer : # chlorure de L-Alanyl 9-(4-amino-3-methoxyphenyl)-10-methylacridinium, 'chlorhydrate de chlorure de L-Alanyl 9-(4-aminophenyl)-10-methylacridinium, 'chlorhydrate de chlorure de L-Alanyl 9- (4-amino-2, 5-dimethoxyphenyl)-10- methylacridinium, 'chlorhydrate de chlorure de ß-Alanyl 9-(4-aminophenyl)-10-methylacridinium, ß-Alanyl-9-(4-amino-2-methoxy-aminophenyl) acridine, # ß-Alanyl-9-(4-amino-2,5-dimethoxy-aminophenyl) acridine, 'chlorhydrate de chlorure de ß-Alanyl 9-(4-amino-3-methoxyphenyl)-10-methylacridinium, 'chlorhydrate de chlorure de ß-Alanyl 9- (4-amino-2, 5-dimethoxyphenyl)-10- methylacridinium.

De même d'autres espèces de micro-organismes, généralement des bactéries, ont également été testés, telles que : <BR> <BR> <BR> # Salmonella typhimurium,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> e Staphylococcus epidermidis,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Serratia marcescens.