EQUIPAMENTO PARA DISCRIMINAÇÃO CROMÁTICA E CONTAGEM DE ORGANISMOS

Domínio técnico

[0001] A presente divulgação diz respeito a um dispositivo para a discriminação cromática e contagem de organismos em meio líquido com aplicação, mas não limitado, a organismos dos géneros Daphnia, Ceriodaphnio, Artemia, bem como a Coiíemboia; ou outros organismos similares.

[0002] A presente divulgação pode ser aplicada no domínio da ecotoxicologia e envolve tecnologias nas áreas da instrumentação analítica, eletrónica, informática e biologia.

Antecedentes

[0003] Um dos mais populares ensaios biológicos usados internacionalmente para avaliar a toxicidade crónica de compostos químicos e para monitorizar efluentes é o teste de reprodução de organismos das espécies do género Daphnia, particularmente Daphnia magna, Daphnia pulex e Daphnia similis, bem como do género Ceriodaphnia. Alguns testes usam também a contagem de ovos de peixe como critério de avaliação.

[0004] Atualmente a contagem da descendência destes organismos é feita a "olho nu" e em contraluz por técnicos que contam os organismos à medida que os vão removendo, um a um, do meio líquido até não restar nenhum. Este processo tem de ser repetido para os diferentes tratamentos - por exemplo diferentes concentrações de composto químico ou efluente - e para as várias réplicas de cada tratamento. Assim, este procedimento é muito moroso, sujeito a erro humano e representa um risco para a saúde do técnico, já que obriga a um esforço visual acrescido e uma prolongada exposição por contacto ou inalação a eventuais contaminantes presentes no meio.

[0005] A caracterização cromática raramente é utilizada em testes de ecotoxicologia, quer de exposição aguda, quer de reprodução, por se tratar de uma medida subjetiva e/ou muito morosa. Esta caracterização pode ser feita a olho nu, sendo realizada em simultâneo com a contagem dos organismos, o que a torna subjetiva, sujeita a erro humano e morosa. Em alternativa, pode ser realizada mediante fotografia de cada organismo, comparando visualmente a intensidade de pigmentação com uma escala de cinzentos. No entanto, este método é bastante demorado e está igualmente sujeito a erro humano. Saliente-se que a caracterização cromática pode ser um parâmetro de resposta dos organismos bastante sensível. Por exemplo, nos ensaios de reprodução, Daphnia sp. expostas a diferentes concentrações de um determinado composto químico podem produzir um número similar de descendentes mas exibindo padrões cromáticos diferentes. Do mesmo modo, por exemplo em ensaios de exposição aguda, Daphnia sp. expostas a diferentes concentrações de um determinado composto químico podem estar vivas mas apresentar padrões cromáticos diferentes. A avaliação cromática pode também indicar diferentes níveis de ingestão de alimento, por exemplo em resposta a diferentes níveis de oxigénio dissolvido na água.

[0006] Adicionalmente, este dispositivo permite a avaliação da ingestão em organismos, nomeadamente Daphnia sp. e Ceriodaphnia sp., expostos a compostos químicos ou efluentes contaminados. Esta avaliação é realizada através da caracterização cromática do meio em que estes organismos se encontram, em dois momentos temporais distintos.

[0007] Estes documentos ilustram o problema técnico a resolver pela presente solução.

Descrição Geral

[0008] A presente divulgação diz respeito a um dispositivo com aplicação em testes de ecotoxicologia para contagem automática e caracterização cromática de organismos em meio líquido, permitindo a diferenciação entre os organismos e eventuais artefactos - como sejam mudas de Daphnia ou outras partículas - ou permitindo a diferenciação entre diferentes organismos ou entre diferentes estádios de desenvolvimento do mesmo organismo, através de diferentes características cromáticas - como por exemplo ovos de peixe fertilizados/não fertilizados. Este dispositivo efetua uma contagem total dos organismos, contagem individualizada e não probabilística, e permite uma caracterização cromática dos organismos ou partículas, estabelecendo padrões cromáticos para o reconhecimento desses grupos, mediante análise e processamento de sinal.

[0009] As presentes realizações são úteis para contar os organismos distinguindo os organismos dos não-organismos consoante a característica do sinal cromático recebido, nomeadamente diferenciando os organismos Daphnia em relação às respetivas mudas, ou por exemplo, diferenciando ovos de peixes fertilizados de ovos não fertilizados. Com as várias realizações da presente invenção, além da caracterização da amostra, efetua- se a contagem presencial de todos os organismos, com a eliminação dos falsos positivos, e com uma caracterização cromática de todos os organismos presentes. Em testes de ecotoxicologia, todos os organismos em exposição contam para os resultados finais da exposição e o equipamento efetua a contagem total e presencial desses organismos, um a um, e não mediante uma avaliação estatística ou probabilística da sua distribuição e número.

[0010] Na presente divulgação considera-se que os principais organismos são espécimes de Daphnia sp., Ceriodaphnia sp., Coilemboía, Artemia, mas podem ser utilizados outros organismos crustáceos, plâncton, cnidários, ovos de peixe, ovos de anfíbios ou mesmo ovos de répteis entre outros.

[0011] A presente divulgação descreve um dispositivo de contagem e caracterização cromática de organismos, com particular interesse em ensaios de ecotoxicologia com a utilização dos organismos referidos na presente divulgação, mas pode ser também utilizado para contagem e caracterização cromática de outros organismos em suspensão e com dimensões similares. [0012] Um dos aspetos da presente divulgação descreve um dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos de uma amostra em meio líquido, que compreende:

um canal para conduzir a amostra, em que o canal tem uma secção interna de tal forma que os organismos são conduzidos sequencialmente um-a-um pelo canal;

um coletor para conduzir a amostra para o referido canal;

um emissor de luz para emitir um sinal cromático para o referido canal;

um recetor de luz para captar o sinal cromático do organismo presente no referido canal;

um processador eletrónico de dados configurado para diferenciar os organismos contados consoante a cor do sinal cromático recebido.

[0013] Numa realização o dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos pode compreender um canal tubular, de preferência um estilete.

[0014] Numa realização o coletor do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o coletor pode ser um funil.

[0015] Numa realização o coletor do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o coletor pode estar colocado relativamente ao canal de tal forma que a condução da amostra seja por gravidade.

[0016] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o sinal cromático presente no referido canal é o sinal cromático refletido, absorvido, refratado e/ou auto-emitido pelo organismo.

[0017] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o recetor de luz pode estar colocado a 180° do emissor para captar o sinal cromático de transmitância do organismo presente no referido canal.

[0018] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o recetor de luz pode estar colocado a um ângulo inferior a 180° do emissor para captar o sinal cromático de reflexão, refração e/ou auto-emissão do organismo presente no referido canal.

[0019] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o emissor e o recetor de luz estão compreendidos num conjunto ótico acoplado na secção transversal do referido canal.

[0020] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o componente ótico pode compreender fibra ótica, lente ou filtro para filtragem cromática para evidenciar a distinção entre a cor do sinal cromático recebido de organismo e de não-organismo, em particular sendo a filtragem cromática um filtro de cor verde.

[0021] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos pode compreender um segundo emissor de luz e um segundo recetor de luz para caracterização cromática do meio da amostra.

[0022] Numa realização do dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos o segundo emissor de luz e o segundo recetor de luz podem estar dispostos a montante do primeiro emissor de luz e do primeiro recetor de luz.

[0023] Numa realização o dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos pode compreender ainda um ecrã ou mostrador integrado para visualização da contagem.

[0024] Numa realização o dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos pode compreender ainda uma ligação de dados para enviar os dados da contagem.

[0025] Outro aspeto da presente divulgação compreende um sistema compreender dois ou mais dispositivos de discriminação cromática e contagem de organismos descrito na presente divulgação em que os dispositivos estão acoplados em paralelo para processamento simultâneo de amostras, ou acoplados em série para processamento sequencial de amostras com diferentes características, ou acoplados em combinação série-paralelo.

[0026] Numa realização o dispositivo é composto por: uma componente de serialização (2), uma componente ótica (3), uma componente eletrónica (4) e uma componente computacional (5).

[0027] Numa realização do dispositivo, a componente de serialização serializa a totalidade dos organismos em suspensão no meio líquido por intermédio de um dispositivo de afunilamento (2.1) e escoamento por gravidade do líquido, ao longo de um estilete (2.2) de secção interna adaptada às dimensões do organismo.

[0028] Numa realização do dispositivo, a componente ótica é composta por um ou mais emissores de luz (3.1) e por um ou mais recetores de luz (3.2), distribuídos radialmente em torno de uma janela ótica (3.3) situada numa secção transversal do estilete, e garantindo a interceção dos feixes óticos por todos os organismos. A captação do sinal é feita medindo a transmitância da luz em recetores colocados a 180^ dos emissores, e/ou medindo a reflexão, refração e/ou emissão em recetores colocados a um ângulo inferior a 180^ dos emissores. A disposição radial dos feixes óticos permite não apenas redundância na contagem e/ou caracterização cromática no mesmo plano espacial e instante temporal, mas também, ao intercetar o organismo em diferentes ângulos, minimizar eventuais problemas de morfologias assimétricas dos organismos, como por exemplo em Daphnia magna.

[0029] Numa realização do dispositivo, a componente eletrónica (4) é responsável pelo condicionamento dos sinais elétricos recebidos nos recetores e subsequente conversão analógico-digital.

[0030] Numa realização do dispositivo, a componente computacional (5) é responsável pelo processamento dos sinais digitais para contagem automática e caracterização cromática individualizada de todos os organismos. [0031] Uma possível forma de realização permite a adaptação às características cromáticas dos organismos a avaliar, mediante seleção das características cromáticas dos emissores de luz, e/ou mediante seleção das características cromáticas dos recetores de luz, e/ou mediante colocação de filtros óticos no feixe ótico.

[0032] Outra possível forma de realização inclui várias componentes óticas dispostas em diferentes níveis do estilete da componente de serialização, o que possibilita redundância na contagem e/ou caracterização cromática melhorando dessa forma a precisão do dispositivo.

[0033] Outra possível forma de realização utiliza fibras óticas no dueto do componente ótico (3.4) para condução e eventual filtragem do sinal ótico para os detetores (3.2).

[0034] Outra possível forma de realização é caracterizada por o componente ótico recorrer a lentes (3.5) para condicionamento do feixe ótico de forma a melhorar o sinal ótico e/ou maximizar o rendimento dos detetores de luz.

[0035] Outra possível forma de realização é caracterizada por ter emissores e recetores aplicados na parte superior do recipiente coletor (2.1), permitindo a caracterização cromática do meio em simultâneo com a contagem e caracterização cromática dos organismos. Esta funcionalidade possibilita a realização da caracterização cromática do meio em simultâneo com a contagem e caracterização cromática dos organismos. Esta funcionalidade, por exemplo como medida indireta da concentração de algas no meio, é particularmente útil em ensaios ecotoxicológicos para avaliação da ingestão.

[0036] Outra possível forma de realização é caracterizada pela apresentação em tempo real dos resultados.

[0037] Outra possível forma de realização é caracterizada pela visualização dos resultados no próprio dispositivo recorrendo a displays de sete segmentos ou outro visualizador simples que pode fazer parte do próprio dispositivo. [0038] Outra possível forma de realização é caracterizada pelo envio dos resultados para um sistema computacional de apoio permitindo o seu armazenamento remoto e/ou outro processamento sobre estes resultados.

[0039] Outra possível forma de realização é caracterizada pela replicação em paralelo de cada dispositivo unitário de contagem e caracterização cromática, permitindo reduzir o tempo de processamento para múltiplas réplicas e/ou permitir o processamento simultâneo de amostras com diferentes características, como por exemplo diferentes concentrações.

[0040] O dispositivo permite a reprocessamento da mesma amostra, as vezes que for necessário, mediante recolha e reposição da amostra em estudo.

[0041] Ao longo da descrição e reivindicações a palavra "compreende" e variações da palavra, não têm intenções de excluir outras características técnicas, componentes, ou passos. Objetos adicionais, vantagens e características da invenção irão tornar-se evidentes para os peritos na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos como forma de ilustração, e não têm a intenção de serem limitativos da presente invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as possíveis combinações de formas de realização particulares ou preferenciais aqui descritas.

Breve descrição das figuras

[0042] Para uma mais fácil compreensão da solução juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.

[0043] Figura 1 - Representação esquemática de uma forma de realização do dispositivo, exemplificando uma concretização das reivindicações 1 a 9, seguindo-se uma descrição detalhada do significado das partes constituintes enumeradas. [0044] Figura 2 - Representação de uma realização para múltiplas contagens e caracterizações cromáticas de várias réplicas, procedimento comum em testes de ecotoxicologia.

[0045] Figura 3 - Representação esquemática de um diagrama com a forma de realização singular do equipamento de contagem.

[0046] Figura 4 - Representação esquemática de uma forma de realização composta por 2 ou mais dispositivos de contagem ligados a uma única unidade de processamento.

[0047] Em ecotoxicologia, a realização de ensaios de reprodução com organismos modelo, ex. Daphnia sp., exige a contagem do número total de organismos em diversos replicados, para avaliação dos diversos índices de toxicidade. Atualmente a contagem é efectuada por técnicos mediante observação direta dos organismos expostos em contraluz. No entanto, este processo de contagem a "olho nu" é lento, cansativo e sujeito a erro humano, para além de poder ter efeitos nefastos na acuidade visual do pessoal técnico envolvido na contagem. A presente divulgação automatiza este processo de contagem com ganhos em termos de tempo de execução e precisão de contagem, além de também permitir a caracterização cromática dos organismos.

[0048] O dispositivo é dirigido para a contagem e caracterização cromática de organismos de reduzidas dimensões em suspensão, em particular Daphnia sp., Ceriodaphnia, Artemia ou ovos de peixe, permitindo a diferenciação entre o tipo específico de organismos a contar e eventuais artefactos recorrendo a diferentes características cromáticas. Adicionalmente, este dispositivo permite a avaliação da ingestão, por exemplo considerando testes com Daphnia ou Ceriodaphnia, através da caracterização cromática do meio em que estes organismos se encontram.

[0049] Numa realização, o amostrador (1) de organismos em suspensão num líquido. O recipiente na figura é apenas ilustrativo de uma possível realização podendo o líquido provir de outro aparelho, como, por exemplo, através de tubagens. [0050] Numa realização, o componente de serialização de todos os organismos presentes, composta por um segmento coletor da amostra na secção superior (2.1), com uma funcionalidade tipo funil; e um segmento cilíndrico, estilete, na secção inferior (2.2), com diâmetro interno adaptado à dimensão dos organismos. A componente de serialização, ou parte dela, está inserida numa câmara escura para eliminar interferências luminosas do exterior.

[0051] Numa realização, a componente ótica composta por um ou mais emissores de luz (3.1) e por um ou mais recetores de luz (3.2), distribuídos radialmente em torno de uma janela ótica (3.3) através de duetos (3.4) para passagem do feixe ótico e que podem conter fibra ótica. A componente ótica pode também incluir lentes ou filtros óticos (3.5) colocados imediatamente após os emissores de luz e/ou antes dos recetores de luz. A emissão de luz é ajustável, eventualmente com espectro adaptado às características do tipo de organismo a contar, garantindo um contraste mínimo entre os organismos e o meio líquido envolvente.

[0052] Numa realização, a componente eletrónica, para condicionamento dos sinais elétricos recebidos nos recetores e subsequente conversão analógico-digital.

[0053] Componente computacional, portátil ou outro, de contagem e/ou caracterização cromática dos organismos, podendo também registar outra informação considerada relevante como a data, localização, temperatura, etc.

[0054] Coletor dos organismos e da solução, podendo ser um recipiente, como ilustrado na figura, ou outro aparelho

[0055] Esta forma de realização tem as seguintes partes constituintes:

• Replicação das componentes de serialização;

• Componente eletrónica partilhada;

• Componente computacional partilhada. [0056] Uma aplicação para este dispositivo pode ser em estudos de ecotoxicologia com organismos Daphnia, em particular na contagem de neonatos como estipulado na norma OECD número 221, mas pode ser aplicada na contagem e caracterização cromática de outros organismos.

[0057] O processo é realizado com a serialização de todos os organismos presente, recorrendo a um dispositivo, simultaneamente leve, pouco volumoso, e de grande portabilidade. O dispositivo permite substituir o atual processo a "olho nu" de contagem de organismos, nomeadamente Daphnia, em testes de ecotoxicologia. O dispositivo utiliza um sistema automático de elevada fiabilidade, minimizando a duração da contagem, afastando o erro humano e possíveis consequências para a saúde dos técnicos. Para além disso, uma possível forma de realização deste dispositivo permite uma adaptação cromática ao meio ou a cada tipo de organismo, minimizando possíveis erros de contagem. Adicionalmente, a caracterização cromática do meio pode ser utilizada como um parâmetro de avaliação da assimilação dos organismos, particularmente útil em testes de ingestão. Independentemente dessa possibilidade, neste sistema a contagem e repetição da contagem é um processo simples e rápido.

[0058] Dada a simplicidade do dispositivo, este pode também ser utilizados para procedimentos de contagem automática de outros organismos, tais como Ceriodaphnia e Artemia, e também ovos de peixes diferenciando ovos fecundados de ovos não fecundados. Em adição à contagem de organismos aquáticos, este dispositivo pode ser usado para contar outros organismos desde que os mesmos sejam colocados em suspensão, como por exemplo organismos do género Collembola.

[0059] Adicionalmente, a caracterização cromática pode ser utilizada para avaliação da coloração dos organismos, um indicador do seu estado de saúde. Com a caracterização cromática, este indicador pode ser traduzido por um parâmetro quantitativo digital e que descreveria quantitativamente a alteração do estado de saúde resultante da exposição a compostos químicos ou determinados fatores ambientais. [0060] Este dispositivo permite ainda a avaliação das taxas de ingestão, por exemplo em testes com Daphnia e Ceriodaphnia, através da caracterização cromática do meio em que estes dafnídeos se encontram em dois momentos temporais distintos.

Descrição da contagem de Daphnia numa amostra com Daphnia e mudas de Daphnia utilizando o dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos da presente divulgação

[0061] Para a contagem de neonatos de Daphnia, a solução com os organismos é colocada no coletor da unidade de serialização, sendo os organismos serializados e direcionados de modo a interceptar os feixes na componente óptica, gerando assim um sinal próprio que será condicionado e enviado para a unidade computacional para processamento e apuramento do resultado. A contagem total, um número normalmente entre 0 e 60 indivíduos por solução de lOOmL, é obtida em cerca de 60 segundos; no entanto, o número de contagens a realizar por teste pode ascender às centenas. No início de cada sessão deve ser feita uma calibração com o conjunto de organismos em teste para que o equipamento seja calibrado de acordo com os organismos - neonatos de Daphnia e mudas de neonatos de Daphnia - que vai receber. O sinal cromático individual produzido por cada um dos elementos do grupo dos neonatos apresenta um padrão similar intra-grupo mas diferente e distinto do padrão individual apresentado pelos elementos do outro grupo das mudas, e é com base nessa diferenciação cromática que a unidade computacional vai discernir o grupo a que pertence cada um dos elementos ou itens analisado na componente óptica, e incrementar - unidade a unidade - ou um ou o outro grupo em análise, e de acordo com o padrão cromático produzido por esse elemento. Em trabalhos de rotina poderá ser utilizada uma calibração de "fábrica" fornecida com o equipamento. Descrição da contagem de ovos de peixe fertilizado e não fertilizados utilizando o dispositivo para discriminação cromática e contagem de organismos da presente divulgação

[0062] Numa realização, para a contagem de ovos de peixes, fertilizados e não fertilizados, colocam-se os ovos, em cerca de 100ml de solução aquosa, ou outra, sendo posteriormente colocados no coletor da unidade de serialização, e seguindo-se o processo descrito na alínea anterior. No início de cada sessão deve ser feita uma calibração com três conjuntos de ovos; por exemplo, procedendo à aquisição de um padrão com 50 ovos fertilizados, outro padrão com 50 ovos não fertilizados, assim como de uma mistura, por exemplo, com 50 ovos fertilizados + 50 ovos não fertilizados, como medida de avaliação do equipamento. A contagem indica o número total de ovos, o número total de ovos fecundados e o número total de ovos não fecundados, podendo ainda indicar um número de ovos cuja classificação foi inconclusiva.

[0063] O termo "compreende" ou "compreendendo" quando utilizado neste documento destina-se a indicar a presença das características, elementos, inteiros, passos e componentes mencionados, mas não impede a presença ou a adição de uma ou mais outras características, elementos, inteiros, passos e componentes, ou grupos dos mesmos.

[0064] As realizações atrás descritas são combináveis entre si.

[0065] A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma e de substituições de características técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, tal como definido nas reivindicações anexas.

[0066] As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais.