RIVOIRE, Michel (40 rue Pasteur, Caluire, F-69300, FR)
GODFRIN, Yann (5 rue Emile Duport, Lyon, F-69009, FR)
RIVOIRE, Michel (40 rue Pasteur, Caluire, F-69300, FR)
REVENDICATIONS
1. Erythrocyte contenant du 5-fluorouracile (5-FU), susceptible d'être obtenu par :
1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 0 C,
2 - mesure de la fragilité osmotique sur un échantillon de la suspension obtenue à l'étape 1 ou sur un échantillon de suspension préparé comme à l'étape 1 , 3 - procédure de lyse et d'internalisation du 5-FU, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 0 C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8 0 C, dans une cartouche de dialyse ; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et
4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40 0 C, et en présence d'une solution hypertonique.
2. Erythrocyte selon la revendication 1 , susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre des étapes 1 à 4, le 5-FU étant ajouté dans la suspension à l'étape 1.
3. Erythrocyte selon la revendication 1 ou 2, contenant un autre principe actif.
4. Erythrocyte selon la revendication 3, contenant de l'oxaliplatine ou un autre dérivé du platine à usage anti-cancéreux.
5. Erythrocyte selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ayant subi un traitement dénaturant chimique ou thermique destiné à favoriser sa reconnaissance par les cellules érythrophagocytaires.
6. Erythrocyte selon l'une des revendications 1 à 5, traité par le glutaraldéhyde ou la neuraminidase.
7. Suspension comprenant des érythrocytes selon l'une des revendications 1 à 6, dans une solution saline pharmaceutiquement acceptable.
8. Suspension selon la revendication 7, ayant un taux d'hématocrite compris entre 40 et 70%.
9. Suspension selon la revendication 7 ou 8, comprenant des érythrocytes contenant du 5-FU et des érythrocytes contenant un autre principe actif.
10. Suspension selon la revendication 9, dans laquelle l'autre principe actif est l'oxaliplatine ou un autre dérivé du platine à usage anti-cancéreux.
11. Médicament contenant des érythrocytes selon l'une des revendications 1 à 6 ou une suspension selon l'une des revendications 7 à 10.
12. Médicament selon la revendication 11 , pour le traitement des cancers primitifs ou secondaires sensibles au 5-FU.
13. Médicament selon la revendication 12, pour le traitement des cancers secondaires présents dans le foie, la rate, les poumons, les ganglions lymphatiques.
14. Médicament selon la revendication 12, pour le traitement de tumeur au foie, notamment métastase hépatique.
15. Poche souple pour perfusion, contenant un médicament selon l'une quelconque des revendications 11 à 14.
16. Utilisation d'érythrocytes selon l'une des revendications 1 à 6 ou une suspension selon l'une des revendications 7 à 10, pour la fabrication d'un médicament anti-cancéreux.
17. Utilisation selon la revendication 16, destinée à cibler le foie.
18. Population d'érythrocytes contenant du 5-fluorouracile et de l'oxaliplatine ou d'érythrocytes contenant du 5-fluorouracile et d'érythrocytes contenant de l'oxaliplatine.
19. Erythrocytes contenant de l'oxaliplatine. |
ERYTHR YTES CONTENANT DU 5-FLUOROURACILE (5-FU) ET/OU DE LOXALIPLATINE
La présente invention est relative au traitement des cancers primitifs et secondaires sensibles au 5-FU et à une nouvelle forme pharmaceutique de 5-FU adaptée à cet usage.
Le 5-fluorouracile (5-FU ; CAS : 51-21-8) est utilisé dans les adénocarcinomes digestifs, notamment formes évoluées ou métastasiques, ou les cancers colorectaux en situation adjuvante, après résection (stade C de Dukes) ; dans les adénocarcinomes mammaires, notamment après traitement locorégional (traitement adjuvant), ou lors des rechutes ; dans les cancers épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures et de l'œsophage.
Le 5-FU est notamment employé en chimiothérapie des métastases hépatiques ayant pour origine un cancer colorectal.
Le 5-FU présente une toxicité générale et une toxicité cardiaque. Peuvent être observés des troubles de l'ECG, des insuffisances cardiaques et des infarctus aigus du myocarde.
Cette molécule a une demi-vie très courte, de l'ordre de 15 à 20 minutes. Elle n'est plus détectable dans le sang 2 à 4 heures après administration IV. Afin d'augmenter la concentration intratumorale et diminuer les taux systémiques, l'administration se fait par perfusion via un cathéter placé par voie chirurgicale dans l'artère gastroduodénale, en général après ligature de l'artère pylorique et cholécystectomie, et après contrôle par angioscintigraphie. Les taux de réponse varient de 30 à 80 % et sont plus élevés qu'après perfusion systémique. Des études randomisées multicentriques ont démontré un bénéfice en termes de survie et une amélioration de la qualité de cette survie.
Cependant les complications liées à ces méthodes sont importantes. Il s'agit d'hépatites dans 50 à 70 % des cas, de cholangites sclérosantes dans 15 % des cas, de gastro-duodénites et de thromboses artérielles survenant dans 50 % des cas avant le 6 ème mois.
Par ailleurs, des études comparatives menées sur les différents modes de traitement par le 5-FU font ressortir un avantage en termes de toxicité hépatique pour l'administration continue par rapport à l'administration d'un bolus (Sotaro Sadahiro et al., Jpn J. Clin. Oncol. 2003, 33, 8 : 377-381). L'administration par bolus de doses importantes de 5-FU pourrait causer de sévères troubles hépatiques, contrairement à une administration continue. Le schéma d'administration du 5-FU par infusion dans l'artère gastroduodénale reste controversé à l'heure actuelle.
Le 5-FU est actuellement utilisé dans des protocoles de traitement adjuvant du cancer colorectal chez des patients ayant bénéficié d'une résection de la tumeur primaire et/ou des adénocarcinomes secondaires, afin de lutter contre les métastases hépatiques. Ces protocoles (par exemple FOLFOX 4 ou LV5FU2) comprennent des cycles répétés avec administration d'un bolus (400 mg de 5-FU par m 2 ), puis perfusion continue sur 22 heures (600 mg de 5-FU par m 2 ), effectués en établissement hospitalier. Les effets cumulés du vieillissement de la population et de la maîtrise grandissante de la chirurgie de résection, accroissent dans des proportions déjà problématiques, le nombre de lits immobilisés pour des patients en traitement ou en soins palliatifs.
Un objectif de l'invention est de proposer, en pratique clinique, un nouveau mode d'administration du 5-FU permettant tout à la fois d'optimiser l'activité anti-tumorale de cette molécule tout en diminuant ses effets toxiques, et permettant de cibler de manière plus aisée et efficace certaines tumeurs telles que les métastases hépatiques. L'objectif serait notamment de disposer d'un mode d'administration permettant d'éviter de recourir aux actes chirurgicaux liés à la mise en place des voies artérielles classiques.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un mode d'administration simplifiant les protocoles de traitement intégrant le 5-FU et notamment réduisant le temps de séjour en milieu hospitalier. Un traitement 5-FU en mode ambulatoire est ainsi un objectif de l'invention.
Les érythrocytes ont été envisagés comme véhicule pour des agents anti-cancéreux et en particulier pour cibler le système réticulo-endothélial qui est le site majeur de destruction d'érythrocytes âgés ou anormaux. Il a ainsi été envisagé d'utiliser des érythrocytes pour véhiculer de tels agents anti-cancéreux directement dans les organes du RES (foie, rate, poumon, ganglions lymphatiques). Il a même été envisagé de faire subir aux érythrocytes des traitements chimiques (e.g. glutaraldéhyde ou neuraminidase) ou thermique, favorisant leur reconnaissance et leur destruction par les cellules érythrophagocytaires (macrophages). Pour une revue récente complète, on se référera à la publication de CG. Millan et al., Journal of Controlled Release 95, 2004 : 27-49. Cette revue rapporte l'incorporation d'actinomycine D, de méthotrexate, de bléomycine, d'adriamycine ou doxorubicine, de daunomycine, d'étoposide et de carboplatine, avec des résultats mitigés, aucun de ces travaux n'ayant aboutit à présent à l'utilisation d'érythrocytes comme vecteur d'agents anti-tumoraux en clinique humaine.
Malgré le potentiel théorique des érythrocytes en tant que vecteur qu'un nombre relativement important d'études fait ressortir, des inconvénients majeurs n'ont pas permis d'aboutir à des applications cliniques. Parmi ces inconvénients, on citera avec CG. Millan et al, des difficultés de stockage, les risques de contamination, et surtout la difficulté d'encapsuler des substances dans les érythrocytes et l'absence d'un procédé industriel reconnu pour leur préparation. La clinique humaine nécessite en effet de disposer de lots de médicaments de qualité reproductible, et il apparaît que les techniques utilisées jusqu'à présent relèvent de méthodes expérimentales de laboratoire ne présentant pas les spécifications requises pour passer au stade de la production de médicaments en routine.
De plus, comme P. Labrude et al. (1985 Lyon Pharmaceutique 1985, 36, 4 : 181- 187), CG. Millan et al. concluent que l'utilisation des érythrocytes comme véhicules d'agents thérapeutiques nécessite pour chaque agent thérapeutique des études spécifiques pour confirmer la capacité réelle des érythrocytes à servir de véhicule.
Ainsi, malgré tout l'intérêt que la communauté scientifique a porté sur le ciblage des tumeurs hépatiques par des érythrocytes incorporant une molécule anti-cancéreuse, ce mode de traitement n'a pas trouvé à ce jour de débouché, faute certainement et
notamment d'une molécule active adaptée à ce mode de délivrance et à l'absence de procédé permettant de l'encapsuler de manière reproductible.
Les travaux de K. K. Sawant et al. sur l'incorporation du 5-Fu dans des érythrocytes sont restés sans suite. L'incorporation du 5-Fu était réalisée par la méthode par dilution dite Presswell, les érythrocytes étaient ensuite lavés, puis traités au glutaraldéhyde. Les érythrocytes obtenus ciblaient le poumon et la rate.
La demanderesse a mis au point une méthode d'encapsulation très performante, permettant d'encapsuler de manière performante des molécules dans les érythrocytes et en particulier avec des rendements d'encapsulation suffisamment constants pour envisager un usage en clinique humaine.
L'invention a pour premier objet des érythrocytes contenant du 5-FU. Par « contenant», il faut entendre présence du principe actif à l'intérieur du globule rouge et/ou emprisonné dans la membrane du globule rouge. De préférence, ces érythrocytes ont la propriété de cibler préférentiellement le foie. Ceci signifie qu'ils ont tendance à se concentrer dans le foie où ils sont phagocytés par les macrophages d'où il s'ensuit une libération ciblée de 5-FU. Les érythrocytes de l'invention sont susceptibles d'être produits par le procédé de lyse/rescellement spécifiquement décrit ici, puis traitement de ciblage hépatique, notamment par le giutaraldéhyde, comme décrit plus loin.
La technique d'encapsulation dite par lyse-rescellement est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EP-A-679 101. Selon cette technique, on alimente en continu le compartiment primaire d'un élément de dialyse avec une suspension d'érythrocytes, tandis que le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes ; ensuite dans une unité de rescellement, on induit le rescellement des érythrocytes en présence de la molécule par augmentation de la pression osmotique et/ou oncotique, puis l'on recueille une suspension d'érythrocytes la contenant.
La présente invention ajoute avantageusement à cette technique de base, la prise en compte de la fragilité osmotique des érythrocytes servant à l'encapsulation, pour
adapter les paramètres de la dialyse, laquelle est effectuée dans un bref laps de temps après cette mesure. Ceci permet, d'un lot d'érythrocytes à l'autre, d'assurer une reproductibilité du rendement d'encapsulation compatible avec un usage en médecine humaine. Les érythrocytes selon l'invention sont donc notamment susceptibles d'être obtenus par :
1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 0 C,
2 - mesure de la fragilité osmotique sur un échantillon de la suspension obtenue à l'étape 1 ou sur un échantillon de suspension préparé comme à l'étape 1 , 3 - procédure de lyse et d'internalisation du 5-FU, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 0 C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8 0 C, dans une cartouche de dialyse ; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et
4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40 0 C, et en présence d'une solution hypertonique.
Par « internalisation », on entend pénétration du 5-FU à l'intérieur des érythrocytes et/ou emprisonnement dans la membrane des érythrocytes.
L'invention a encore pour objet une suspension de ces érythrocytes dans une solution saline pharmaceutiquement acceptable (par exemple milieu standard pour hématies, notamment solution contenant du NaCI et un ou plusieurs ingrédients choisis parmi glucose, dextrose, adénine et mannitol ; e.g. SAG-mannitol ou ADsol). Cette solution est apte à assurer la conservation des érythrocytes, et peut inclure un additif de conservation, tel que la L-cérnitine. Cette suspension peut être conditionnée prête à l'emploi ou à diluer avant utilisation. Le taux d'hématocrite final de la suspension prête à l'emploi (après éventuelle dilution extemporanée) est compris entre 40 et 70%, de préférence entre 45 et 55%, mieux de 50% ou de l'ordre de 50%. Elle est susceptible d'être administrée par voie intraveineuse, de préférence par perfusion. Par opposition à la perfusion directe dans l'artère gastroduodénale, la
suspension selon l'invention peut avantageusement être administrée (perfusée) par voie systémique.
Une telle suspension ou toute formulation administrable contenant ces érythrocytes constitue en soi un médicament ou une composition pharmaceutique objet de l'invention. Ce médicament peut être conditionné par exemple sous forme de poche souple pour perfusion, ou sous une autre forme pour administration par injection.
Suivant une caractéristique de l'invention, le médicament comprend une suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite tel qu'indiqué plus haut. Il est de préférence conditionné sous un volume de 10 à 250 ml_, de préférence de 50 à 200 mL. La forme préférée de présentation est la poche pour perfusion. La quantité de 5-FU encapsulée correspondant à la prescription médicale est de préférence contenue intégralement dans la poche de sang ou autre forme de présentation, du volume qui vient d'être indiqué.
Les érythrocytes de l'invention peuvent contenir au moins un autre principe actif, notamment choisi parmi les autres agents anti-cancéreux, et/ou au moins un composé ayant un effet adjuvant. En variante ou en sus, le médicament contient au moins une deuxième population d'érythrocytes, renfermant cet autre principe actif ou cet adjuvant.
Suivant un mode de réalisation particulier, les érythrocytes ou le médicament contient un dérivé du platine à usage anti-cancéreux, en particulier de l'oxaliplatine, e.g. Eloxatine®. L'invention décrit donc des érythrocytes renfermant de l'oxaliplatine, ainsi que les suspension et médicaments anti-cancéreux correspondants.
Le médicament ou la composition pharmaceutique est utilisable dans le traitement de toutes les formes de cancer sensibles au 5-FU. Le 5-FU est ainsi utilisé dans les adénocarcinomes digestifs, et notamment métastases hépatiques, (e.g. provenant d'un cancer colorectal ; dans les adénocarcinomes mammaires ; dans les cancers épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures et de l'œsophage).
L'utilisation principale dans le cadre de la présente invention est le traitement des tumeurs et en particulier des cancers secondaires (métastases) présents dans les organes du RES, à savoir foie, rate, poumon, ganglions lymphatiques, plus particulièrement encore, du foie (notamment métastases hépatiques ayant pour origine un cancer colorectal, un cancer du côlon, en général après résection de la tumeur primaire et/ou de la tumeur secondaire).
La cinétique des médicaments selon l'invention peut être modifiée par un traitement approprié favorisant leur reconnaissance et leur destruction par les cellules érythrophagocytaires (macrophages), conduisant à la libération rapide et massive de 5-FU dans les organes du RES et améliorant la biodisponibilité de cette molécule. Ce traitement peut être choisi pour obtenir un effet libération rapide de la totalité ou quasi-totaiité du 5-FU en un intervalle de temps prédéterminé, notamment moins de 24 heures, par exemple moins de 16 heures, dans le foie et/ou les autres organes du RES.
Selon que l'on traite ou non les érythrocytes par un tel traitement dénaturant, et selon les conditions du traitement dénaturant employé, on peut disposer de profils de libération différents, ce qui permet de s'adapter au schéma optimal de traitement d'une pathologie donnée.
Ainsi, selon un premier aspect, le profil de libération est du type libération de la totalité ou de la quasi-totalité du principe actif sur une période de temps limitée (libération rapide). On choisit dans ce cas des érythrocytes dénaturés dans des conditions adaptées à cette durée, par exemple pour une libération en moins de 24 ou 16 heures comme mentionné supra.
Selon un deuxième aspect, le profil est étalé dans le temps (libération lente), notamment sur plusieurs jours, ou plusieurs semaines. Un pic de libération par les érythrocytes les plus fragiles peut être observé peut de temps après l'administration. Des érythrocytes non dénaturés ou modérément fragilisés par un traitement dénaturant sont alors plus appropriés.
Suivant un troisième aspect, le protocole combine l'utilisation d'érythrocytes à profil de libération rapide et d'érythrocytes à profil de libération lente.
Suivant une première modalité, le traitement de dénaturation est chimique, e.g. par le glutaraldéhyde ou par la neuraminidase. Ce traitement est réalisé sur les érythrocytes contenant le 5-FU. Ce traitement peut être réalisé comme suit. Les érythrocytes sont incubés de 1 à 20 min, e.g. 10 min environ, dans de 2 à 10 volumes, e.g. 5 volumes environ, d'une solution contenant de 0,05 à 1 %, e.g. 0,1 % à 0,5% environ de glutaraldéhyde (ou de neuraminidase) et, environ 0,9% de NaCI. L'incubation est réalisée de préférence à température ambiante (20-25 0 C). Ensuite, les érythrocytes sont lavés dans une solution de NaCI à, environ 0,9%, e.g. dans 50 volumes environ de cette solution saline, et de préférence au moins deux fois. Un tel traitement, notamment par le glutaraldéhyde, favorise un ciblage hépatique.
Suivant une deuxième modalité, le traitement est thermique, e.g. chauffage entre 40 et 60 0 C, de préférence entre 45 et 50 0 C. La durée de chauffage peut être comprise entre 20 min et 1 heure, de préférence entre 30 et 45 min.
L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement des cancers primaires et/ou des tumeurs secondaires qui viennent d'être mentionnés. Cette méthode prévoit l'administration à un patient qui en a besoin d'une quantité efficace d'un tel médicament, notamment par voie intraveineuse, par injection ou perfusion, de préférence par perfusion.
Dans le cas des cancers secondaires d'un ou plusieurs organes du RES, en particulier les métastases hépatiques, la méthode utilise des érythrocytes dénaturés ou non,suivant le profil libération lente ou rapide recherché. Suivant une modalité particulière, les érythrocytes sont dénaturés de façon à favoriser une libération rapide et massive du principe actif dans l'organe touché, notamment le foie, comme décrit supra.
Suivant une modalité intéressante, le patient est traité après exérèse chirurgicale de la tumeur primaire et/ou de la tumeur secondaire.
Lorsque son état le permet, le patient peut être traité avec ses propres érythrocytes, après que ceux-ci ont été traités pour encapsuler le 5-FU. En variante, les érythrocytes proviennent d'un ou plusieurs donneurs.
La méthode peut ainsi comprendre le prélèvement d'un ou plusieurs échantillons de sang, par exemple poche(s) de sang, d'un patient ou d'un ou plusieurs donneurs, la préparation d'un culot d'érythrocytes, l'incorporation du 5-FU conformément à l'invention et la production d'un lot d'érythrocytes incorporant le principe actif, une éventuelle dénaturation contrôlée, puis l'administration de la suspension ou du médicament au patient, par voie intraveineuse.
Typiquement, on administre un volume de suspension d'érythrocytes traités apportant la dose requise de 5-FU 1 généralement adaptée au poids corporel du patient. Suivant une caractéristique de l'invention, on administre de 10 à 250 mL, de préférence de 50 à 200 mL d'une suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite compris entre 40 et 70%, de préférence entre 45 et 55%, mieux de 50%.
La méthode selon l'invention est adaptative en ce sens qu'elle permet d'apporter la quantité de 5-FU imposée par un protocole existant et en ce sens qu'elle peut le faire suivant la cinétique souhaitée. A titre d'exemple, les 1000 mg/m 2 (bolus + perfusion continue sur 22 h) d'un cycle de perfusion selon les protocoles FOLFOX 4 ou LV5FU2, peuvent être apportés par le médicament selon l'invention. De même, pour tenir compte plus largement des protocoles existants, il peut être précisé que la méthode apporte au patient une dose prescrite comprise entre 200 et 2400 mg/m 2 .
Suivant une modalité particulière, on administre une telle suspension à une fréquence comprise entre 15 jours et trois mois, de préférence mensuellement, sur une durée suffisante.
Lors du procédé de lyse/rescellement, le 5-FU peut être présent dans la suspension de départ. Dans ce cas, il est avantageux de mesurer la fragilité osmotique à l'étape 2 sur l'échantillon de suspension contenant le 5-FU.
Suivant une caractéristique de l'invention, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8 0 C, de préférence entre + 2 et + 6 0 C, typiquement aux alentours de + 4 0 C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %.
Conformément à une caractéristique importante de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée sur les érythrocytes juste avant l'étape de lyse. Les érythrocytes ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique est rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes.
Les deux paramètres permettant de maîtriser la dialyse sont le temps de présence des cellules dans le dialyseur (en fonction des caractéristiques de ce dernier) et l'osmolarité du dialysat. Les deux paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques de résistance, ou à l'inverse de fragilité, osmotique des globules rouges conditionnés pour subir les étapes de lyse/rescellement. Cette résistance osmotique peut être caractérisée par au moins un des paramètres suivants : a. l'osmolarité du milieu pour laquelle l'hémolyse apparaît, c'est-à-dire le début de la formation des pores. b. La vélocité V de l'hémolyse, déterminée par la pente de la partie linéaire de la courbe % hémolyse = f (osmolarité du milieu). c. Le pourcentage d'hémolyse pour une osmolarité donnée. d. L'osmolarité qui permet d'obtenir 50 % d'hémolyse (H 50 ). e. Le temps pour obtenir un certain pourcentage d'hémolyse (par exemple
50 %).
Suivant des modes de réalisation préférés, on caractérise la résistance osmotique à l'aide des paramètres b, d ou b et d.
La fragilité osmotique doit donc être mesurée dans un temps court, compatible avec le laps de temps court entre prise d'échantillon et début de lyse. Suivant une caractéristique de l'invention, on mesure un ou plusieurs de ces paramètres d'hémolyse, contre une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. eau (eau distillée ou autre), au travers d'une membrane semi-perméable. Une méthode manuelle peut être envisagée. Cependant, suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure automatique conformé pour mesurer la fragilité osmotique d'un échantillon d'érythrocytes en moins de 15 minutes, plus particulièrement en moins de 12 minutes et de préférence en moins de 10 minutes, et le résultat obtenu est exploité dans un bref laps de temps pour ajuster les paramètres de lyse, et débuter cette dernière.
La mesure de la fragilité osmotique peut être réalisée à l'aide d'un appareil automatisant au moins en partie la technique manuelle décrite par J. V. Dacie dans Practical Haematology, 2 nd edn, Churchill, London 1956. Un exemple d'un tel appareil est décrit dans l'article de J. Didelon et al., Clinical Hemorheology and Microcirculation 23 (2000) 31-42. Le principe est basé sur l'utilisation d'un dispositif mettant en présence, de part et d'autre d'une membrane semi-perméable, l'échantillon de la suspension d'érythrocytes à évaluer, et une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. de l'eau distillée, en volumes adaptés, de façon à générer une hémolyse lente des érythrocytes à mesure que les ions NaCI diffusent vers la solution, e.g. l'eau distillé. L'évolution de l'hémolyse au cours du temps est suivie par mesure de la transmittance (voir aussi J. Didelon et al., Biorheology 37, 2000 : 409-416) au moyen d'un rayonnement laser ayant une longueur d'onde de 808 nm. Une cellule photoélectrique mesure les variations de la lumière transmise au travers de la suspension. Par exemple, les mesures sont effectuées sur 10 minutes. L'appareil permet d'obtenir un ou plusieurs des paramètres a - e mentionnés supra.
Suivant une première modalité, on effectue la mesure de la fragilité osmotique sur un échantillon dont la température initiale est comprise entre + 1 et + 8 0 C, de préférence avec de l'eau distillée également à cette température, dans des conditions où l'évolution de la température n'est pas préjudiciable à la . mesure.
Suivant une deuxième modalité, la mesure de la fragilité osmotique est réalisée sur un échantillon maintenu à la température comprise entre + 1 et + 8 0 C. Ainsi, l'appareil de mesure décrit dans J. Didelon et al. supra peut être modifié pour permettre la régulation de la température. De préférence cette température est proche de ou identique à la température de lyse.
Une fois un ou plusieurs de ces paramètres déterminé(s), une relation peut être appliquée prenant en compte ce ou ces paramètres afin de déterminer soit le débit des cellules dans le dialyseur, soit l'osmolarité du dialysat, adéquate pour obtenir des globules rouges encapsulant le 5-FU et/ou la quantité désirée de celui-ci : Débit hématies = [A x (H 50 )] + [B x (V)] + K
- A et B = variables adaptables en fonction du dialyseur et osmolarité de la solution de lyse
- K = constante d'ajustement. Osmolarité dialysat = [C x (H 50 )] + [D x (V)] + K
- C et D = variables adaptables en fonction du dialyseur et du débit des hématies dans le dialyseur
- K = constante d'ajustement.
Selon un mode de réalisation préféré, la concentration en NaCI en g/L qui provoque 50% d'hémolyse est mesurée (paramètre d) et le débit de la suspension d'érythrocytes dans la cartouche de dialyse sont ajustés en fonction des valeurs de concentration de NaCl mesurées.
Suivant un aspect de l'invention, on débute la procédure de lyse lorsque la température de la suspension d'érythrocytes est comprise entre + 1 et + 8 0 C, et que la fragilité osmotique a été mesurée et les paramètres de lyse enregistrés.
Suivant une caractéristique avantageuse, la suspension initiale à traiter est placée dans l'enceinte de lyse-internalisation mentionnée supra. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le procédé utilise un module réfrigéré muni d'une régulation de température, on place dans ce module une poche de la suspension d'érythrocytes réfrigérée entre + 1 et + 8 0 C, raccordée, ou que l'on raccorde, à un ensemble amovible stérile à usage unique, comportant une cartouche de dialyse, des tubulures
de raccordement de la cartouche d'une part à la poche et d'autre part à la solution de lyse, le module comportant en outre des moyens susceptibles d'assurer la circulation de la suspension d'érythrocytes et de la solution de lyse, module à l'intérieur duquel on stabilise la température entre + 1 et + 8 0 C. Le module réfrigéré est dimensionné pour loger la poche et l'ensemble amovible à usage unique. Le fait de disposer la poche, la cartouche de dialyse, la solution de lyse, reliés par les diverses tubulures, dans un tel module réfrigéré unique est une caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention.
Le terme « poche » renvoie aux poches souples communément utilisées dans le domaine de la transfusion sanguine et des dérivés sanguins.
Suivant un aspect important de l'invention, on fait en sorte de maintenir les érythrocytes en suspension homogène dans la poche, de manière à maintenir stable le taux d'hématocrite de la suspension traversant le dialyseur. Suivant une caractéristique de l'invention, la poche est ainsi munie d'une circulation extérieure en boucle, susceptible d'assurer une circulation de la suspension à partir de, et vers, la poche.
Par cartouche de dialyse, on entend un élément comportant deux compartiments séparés par une paroi de dialyse à travers laquelle peut se faire un échange ionique qui permet de modifier de façon contrôlée la pression osmotique d'une solution aqueuse située dans l'un des compartiments en introduisant dans l'autre compartiment une solution aqueuse comportant un sel. Ce type de cartouche est largement utilisé dans le domaine médical. Suivant une modalité préférée, on utilise une cartouche de dialyse à fibres creuses, par exemple une telle cartouche ayant les spécifications suivantes : diamètre intérieur des fibres compris entre 100 et 400 μm, surface extérieure totale des fibres comprise entre 0,3 et 2 m 2 , longueur des fibres comprise entre 10 et 40 cm, coefficient d'ultrafiltration compris entre 1 ,5 et 8 mL/h.mmHg.
Comme il a été précisé plus haut, on peut débuter la procédure de lyse lorsque la température de la suspension dans Ia poche est comprise entre + 1 et + 8 0 C.
Suivant une modalité intéressante, on contrôle la température de la suspension à l'aide d'un capteur placé sur la circulation extérieure en boucle.
Suivant la fragilité osmotique relevée, on peut jouer sur deux paramètres principaux, le débit de la suspension d'érythrocytes dans la cartouche de dialyse et l'osmolarité de la solution de lyse, étant entendu qu'il est préférable de fixer, dans les deux cas, un débit constant pour la solution de lyse. La valeur du débit n'est pas critique.
Typiquement, pour une cartouche de dialyse à fibres creuses, telle que décrite supra, le débit de la solution de lyse est fixé entre 50 et 300 mL/min, de préférence entre 150 et 250 mL/min.
La solution de lyse est une solution saline hypotonique par rapport à la suspension de globules rouges. Lorsqu'elle est fixée à une valeur constante, son osmolarité peut typiquement être située entre 30 et 110 mOsm, de préférence entre 40 et 100 mOsm, par exemple de l'ordre de 90 mOsm.
A titre d'exemple, la solution de lyse peut comprendre Na 2 HPO 4 θt/ou NaHaPO 4 et un sucre tel que le glucose.
Suivant une première modalité, on adapte le débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, tandis que débit et osmolarité du tampon de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus le débit de la suspension est augmenté. Typiquement, pour une cartouche dont les spécifications on été indiquées supra, le débit sera amené à varier dans l'intervalle de 5 à 200 mL/min, de préférence de 10 à 40 mL/min.
Suivant une deuxième modalité, on adapte l'osmolarité de la solution de lyse, tandis que les débits de suspension et de la solution de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus l'osmolarité de la solution de lyse est augmentée. Typiquement, l'osmolarité sera amenée à varier dans l'intervalle de 10 à 200 mOsm/l, de préférence de 20 à 150 mOsm/l.
Suivant une troisième modalité, on adapte à la fois le débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, et l'osmolarité de la solution de lyse.
Le 5-FU à encapsuler peut être présent dans la poche de suspension et/ou être introduit, de préférence progressivement, dans la circulation de suspension en amont ou en aval de la cartouche de dialyse. Les volumes introduits étant faibles, une réfrigération du principe actif est optionnelle.
De préférence, la suspension de globules rouges est produite à partir d'un culot globulaire de groupe sanguin compatible avec le receveur, déleucocyté, sans pathogène recensé, notamment présenté en poche, par exemple de 500 mL Les globules rouges peuvent avoir été irradiés lorsqu'ils sont destinés à des patients fortement immunodéprimés susceptibles d'exprimer une réaction immunologique « greffon/hôte » (RJ. Davey Immunol. Invest. 1995, 24 (1-2) : 143-149).
Suivant une particularité de l'invention, le culot globulaire initial, servant à préparer la suspension, a subi au préalable un traitement visant à éliminer les éléments du sang autres que les érythrocytes. Ce type de traitement, par exemple lavage avec une solution saline pour éliminer le plasma ou une solution de conservation, est connu de l'homme du métier.
Suivant une modalité particulière, le lavage est réalisé en présence du 5-FU à encapsuler.
Le lavage peut être réalisé par toute technique usuelle, telle que la technique poche quadruple ou 4 poches pour le lavage de globules rouges (méthode et poche de transfert MacoPharma). On peut aussi utiliser un laveur de globules rouges automatique du type COBE 2991 CeII Processor.
De préférence, la température lors de l'étape de lyse, est maintenue entre + 2 et + 6 0 C, et de manière encore plus préférée aux environs de + 4 0 C.
La procédure de rescellement est de préférence effectuée par réchauffage de la suspension lysée et ajout d'une solution de rescellement hypertonique. La température de rescellement peut être comprise entre + 30 et + 40 °C. Elle est de préférence comprise entre + 35 et + 38 0 C, par exemple 37 0 C environ. L'incubation peut typiquement durer de 15 à 45 minutes.
De préférence, la suspension sortant de la cartouche de dialyse ainsi qu'une solution hypertonique de rescellement sont introduites, de préférence en continu, dans une poche intermédiaire. La suspension y est réchauffée, et incubée à la température souhaitée pendant un délai suffisant pour assurer le rescellement. Suivant un aspect particulier, la poche intermédiaire est placée dans un module ou enceinte chauffée, dont la température intérieure est régulée à la température choisie.
En variante, la suspension est amenée dans une poche intermédiaire, ainsi que Ia solution de rescellement. Lorsque la totalité de la suspension a été recueillie dans cette poche, elle est scellée et transférée dans un module permettant le chauffage et l'incubation à la température souhaitée.
La suspension de globules rouges rescellés peut ensuite subir une ou plusieurs étapes de lavage à l'aide d'une solution saline, en vue d'éliminer les cellules non ou mal rescellées, les résidus et l'hémoglobine extracellulaire.
L'éventuel traitement de dénaturation contrôlé des érythrocytes peut être réalisé à ce stade.
Suivant une autre caractéristique, on conditionne les érythrocytes dans une solution de conservation des hématies, par exemple contenant de la L-carnitine.
Les érythrocytes produits sont de préférence conservés à une température comprise entre + 1 et + 8 0 C, de préférence entre + 2 et + 6 0 C, typiquement à environ + 4 0 C.
Le taux d'hématocrite final du produit est de préférence compris entre 40 et 80 %.
L'internalisation d'un dérivé de platine, notamment l'oxaliplatine, peut être réalisée comme il vient d'être décrit à propos du 5-FU.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel :
- la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de lyse- rescellement conforme à l'invention ;
- la figure 2 est une synoptique de base du procédé ;
- la figure 3 présente des images de tomographie montrant la répartition d'érythrocytes marqués au Tc 99, selon qu'ils sont traités ou non par le glutaraldéhyde.
Exemple 1 : installation
On se réfère tout d'abord à la figure 1. Un premier cadre en traits interrompus figure un premier module 1, ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des pompes péristaltiques P1 , P2 et P3, et des moyens de réception, non représentés, d'un ensemble amovible qui va maintenant être décrit. Les pompes P1 et P3 sont à débit constant prédéterminé. La pompe P2 est pilotée pour en faire varier le débit.
L'ensemble amovible comporte une poche 2 souple de volume, contenant une suspension d'érythrocytes à lyser. Cette poche 2 est équipée d'une tubulure 3 souple, en boucle, coopérant avec la pompe P1 , afin d'assurer une circulation depuis et vers la poche pour maintenir les érythrocytes en suspension. Cette poche est en outre raccordée à sa base à une tubulure 4 souple raccordée à l'entrée du compartiment « sang » d'une cartouche de dialyse 5. Cette tubulure 4 coopère avec la pompe P2, qui assure la circulation de la suspension depuis la poche vers la cartouche. Un pousse-seringue PS1 piloté est raccordé à la tubulure 4 en amont de la cartouche 5, ce pousse-seringue permettant l'introduction de la 5-FU dans la circulation d'érythrocytes. La sortie du compartiment « sang » de la cartouche 5 est raccordée à une tubulure 6 souple de sortie, débouchant à l'extérieur du module 1. Un deuxième pousse-seringue PS2 piloté est raccordé à la tubulure 6, ce pousse-
seringue permettant l'introduction de la 5-FU dans la circulation d'érythrocytes lysés. Un flacon 7 contenant une solution de lyse est disposé dans Ie module 1 , et raccordé à l'entrée « dialysat » de la cartouche 5 par une tubulure 8 souple, coopérant avec la pompe P3 assurant la circulation de la solution de lyse au travers de la cartouche 5. Enfin, la solution de lyse sortant de la cartouche est évacuée du module 1 par une tubulure 9 souple d'évacuation, débouchant dans un flacon 10 situé en dehors du module 1.
La tubulure 6 de sortie pénètre dans un second module 11 ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des moyens de réception, non représentés, d'éléments faisant partie de l'ensemble amovible qui vient d'être en partie décrit. Il s'agit d'une poche 12 souple, raccordée à la tubulure 6, et dans laquelle vient se stocker la suspension lysée. Un pousse-seringue PS3 piloté est raccordé à la tubulure 6, et permet d'injecter le produit de rescellement.
L'ensemble amovible est entièrement réalisé en matière plastique souple et transparente, permettant une visibilité complète du processus.
Le dispositif est pourvu en outre de divers moyens non représentés:
- moyens permettant de refroidir l'intérieur du module 1 et d'y réguler la température entre + 2 et + 4 0 C, comprenant entre autres une sonde de température placée sur la tubulure 3 pour mesurer la température de la suspension y circulant, une sonde de température pour la mesure de la température T1 à l'intérieur du module 1 ,
- le module 11 est pourvu en outre de moyens permettant de chauffer l'intérieur du module 11 et d'y réguler la température T2 entre + 37 et + 38 0 C ; une sonde de température est placée à l'intérieur du module. - moyens de détection (par exemple ultrasons ou colorimétriques) de la présence d'érythrocytes dans les tubulures, en D1 et D2,
- moyens PR1 de mesure de pression à l'entrée de la cartouche de dialyse.
- dispositif électronique recevant d'une part les informations provenant des sondes de température, de pression et des moyens de détection, et d'autre
part les informations relatives aux réglages des paramètres de lyse ; à partir de ces données, le dispositif pilote les pompes P1 , P2 et P3. Un synoptique de procédé est représenté à la figure 2.
Le dispositif électronique est constitué d'un ordinateur conçu pour faire fonctionner le synoptique ci-dessus.
La mise en œuvre de ce dispositif conduit à récupérer en 12 une poche contenant une suspension d'érythrocytes renfermant la 5-FU.
Exemple 2 : production d'érythrocytes encapsulant du 5-FU
On prélève 400 mL de sang sur le patient. Le sang, maintenu à 4°C, est déleucocyté et lavé avec une solution saline pour éliminer le plasma, et placé dans une poche souple de 250 mL de volume, à une hématocrite ajustée à 80%.
On ajoute une solution aqueuse de 5-FU dans la suspension d'érythrocytes de manière à obtenir la concentration désirée de 5-FU dans la suspension pour une hématocrite de 70%.
On prélève 1 mL de la suspension à 4°C que l'on place dans l'appareil de mesure de la fragilité osmotique décrit dans J. Didelon et al. 2000 précité, dont le principe de fonctionnement a été décrit supra. Les mesures sont effectuées sur 10 minutes. L'appareil permet de déterminer la salinité permettant d'avoir 50% d'hémolyse. Cette salinité est généralement comprise entre 3 et 5,5 g de NaCI par litre.
La poche 2 souple de volume 250 mL, contenant la suspension d'érythrocytes et le 5-FU, est placé dans l'installation de l'exemple 1 , et l'on admet progressivement la suspension et la solution de lyse hypotonique dans les compartiments respectifs de la cartouche de dialyse. En fonction du paramètre de salinité déterminé à l'étape précédente (fragilité ou résistance osmotique), on règle le débit de la suspension d'érythrocytes dans le dialyseur entre 15 et 30 mL/min.
La solution de rescellement est ajoutée en ligne à 10% vol/vol à la suspension d'érythrocytes lysés juste en amont de la poche 12. La suspension est incubée 30 min à 37°C dans la poche. Elle est ensuite lavée avec une solution saline, une solution de conservation y est ajoutée (SAG-mannitol), puis la poche est conservée à + 4°C jusqu'à son emploi.
L'administration du volume total de la suspension au patient est réalisée par perfusion intraveineuse selon les pratiques usuelles de transfusion sanguine.
Exemple 3 : ciblage
Une étude comparative a été menée chez le lapin afin de déterminer l'impact du procédé de lyse/rescellement de l'invention et du traitement par le glutaraldéhyde.
I. Confection des tampons
A. Tampon HBSS pH 8, 300 mOsmol/kg
Volume fabriqué environ 921ml Potassium phosphate monobasique anhydre KH 2 PO 4 60 mg
D-Glucose anhydre 1 g
CaCI 2 96% 131 ,4 mg
MgSO 4 97,6 mg
KCI 400 mg NaCI 8 g
Sodium phosphate dibasique dodecahydrate Na 2 HPO 4 , 12H 2 O 119,8 mg
Les poudres sont pesées et reprises dans 600 ml d'eau stérile. Le pH est amené à 8 avec de la soude 1 N. L'osmolarité est alors mesurée. On ajoute le volume d'eau pour arriver à une osmolarité de 300 mosmol/kg. Stockage à 4°C.
B. Solution de lavage HBSS Glucose 0,2%, pH 8, 300 mOsmol/kg
Pour 1000 ml de tampon : 1 g de glucose ; QSP 1000ml avec du tampon HBSS, pH 8, 300 mOsmol/kg. Laisser sur glace.
C. Solution de lavage HBSS Glucose 0,2%, pH 8, 300 mOsmol/kg, glycine 1OmM
Pour 50ml de tampon : 40 mg de glycine ; QSP 50 ml avec du tampon HBSS Glucose 0,2%, pH 8, 300 mOsmol/kg. Mélanger. Laisser sur glace.
D. Glutaraldéhvde 3,6%, NaCI 0,9% (Solution stock)
Dans un Falcon de 50 ml, recouvert d'un papier aluminium, mélanger 3,6 ml de glutaraldéhyde 50% avec 46,4 ml de NaCl 0,9%.
Traitement
A. Dénaturation des culots globulaires (CGR) par le glutaraldéhyde 0,3% final
Les CGR (Hématocrite 70-80%) sont repris dans 5 fois leur volume de Glutaraldéhyde 0,36%. On prépare ce volume dans un falcon de 50 ml en diluant au 1/10 la glutaraldéhyde 3,6% dans une solution de NaCI. On mélange, puis on incube pendant 15 minutes au Bain Marie 22°C.
B. Les lavages
1. Faire un premier lavage volume à volume contre du tampon de lavage HBSS, glucose 0,2%, Glycine 1 OmM froid. La glycine permet de neutraliser l'action de la glutaraldéhyde.
2. Centrifuger 150 g, 4 0 C, 5 minutes.
3. Eliminer le surnageant
4. Ajouter volume à volume du tampon HBSS, glucose 0,2%
5. Remettre en suspension le culot
6. Recommencer deux fois à partir de l'étape 2.
III. Marquage
Un lot de globules rouges traités au glutaraldéhyde, et un lot non traité, sont ensuite marqués au Technecium 99, lavés puis injectés chacun à un lapin.
IV. Résultats
Les lapins sont observés 4 heures après l'injection à l'aide d'une gamma caméra (tomographie à émission de photon du type « Single Photon Emission Computer Tomograph ») . Les images sont présentées à la Figure 3.
A gauche de la figure, on voit l'image du lapin traité par les érythrocytes Tc 99 sans glutaraldéhyde. Le bloc cœur-poumon est très apparent, ce qui démontre que les érythrocytes Tc 99 sont dans la circulation sanguine. A noter leur présence dans les reins, qui s'explique par la forte vascularisation des reins et par l'élimination urinaire du Tc 99 libre.
A droite de la figure, on voit l'image du lapin traité par les érythrocytes Tc 99 avec glutaraldéhyde. La radioactivité est quasi-absente dans la circulation sanguine et dans les poumons et la rate. Un peu de radioactivité apparaît dans le rein, traduisant l'élimination urinaire du Tc 99 libre. La radioactivité, et donc les érythrocytes traités, se concentrent remarquablement dans le foie.