DESCRIPTION ET ÉTAT DE LA TECHNIQUE

[-] Plusieurs coronavirus peuvent entraîner des infections respiratoires dont les manifestations vont du simple rhume à des maladies plus graves comme le Syndrome Respiratoire du Moyen-Orient (MERS) et le Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS). La maladie de la COVID-19 ou syndrome respiratoire aigu sévère est causée également par un virus de la famille des coronavirus. Ce dernier a été découvert pour la première fois à Wuhan à la province de Hubeie en Chine et il a été nommé SARS-CoV2 [Zhu et al., N. Engl. J. Med. 2020, 382, 727-73; Li et al., N. Engl. J. Med. 2020, 382, 1199-1207]. Le séquençage du génome du SARS-CoV2 a montré qu’il est identique à 79,6 % au SARS-CoV [Wu et al., Nature 2020, 579, 265-269; Zhou et al., Nature 2020, 579, 270-273],

La protéase M ^pro (appelée aussi la 3CL ^pro ) est une enzyme nécessaire pour la fabrication des protéines qui sont à leur tour cruciales pour le développement et la réplication du virus. Cette protéase est considérée aujourd’hui comme une des cibles les plus prometteuses pour le développement de traitements anti-SARS-CoV2. Ceci passe par la découverte de molécules capables d’inhiber la M ^pro dont la composition chimique et la structure par diffraction des rayons X sont aujourd’hui bien élucidées [Zhang et al., Science 2020, 368, 409-412]. Cette enzyme sous forme d’un dimère contient un site catalytique caractérisé par la présence de deux acides aminés importants à savoir, le His41 et la Cysl45 de plus, ce site est directement impliqué dans la production d’acides aminées et de protéines nécessaires à la multiplication du virus [Dai et al., Science 2020, 368, 1331-1335] (Figure 1).

[-] Suite à l’apparition du virus SARS-CoV en 2002 et 2003, plusieurs études ont été réalisées partout dans le monde afin de développer des antiviraux à base de petites molécules capables d’inhiber la M ^pro . Il est à noter que cette protéase était aussi présente dans le SARS-CoV et que sa structure n’a pas beaucoup changé en comparaison avec celle découverte l’année dernière dans le SARS-CoV-2 [Zhang et al., Science 2020, 368, 409-412]). A signaler aussi que la M ^pro n’a pas d’homologue chez les humains et c’est une autre raison qui fait d’elle une cible de choix pour le développement d’antiviraux [Kim et al., PLOS Pathog. 2016, 12, el005531; Yang et al., PLOS Biol. 2005, 3, e324]. De plus, la M ^pro est conservée dans plusieurs β-coronavirus (MERS, SARS-CoV, SARS-CoV-2) ce qui permettrait d’envisager le développement d’un traitement pour la maladie actuelle mais aussi pour des maladies futures en cas d’apparition d’autres crises sanitaires causées par d’autres formes de β-coronavirus.

Depuis le début de la crise sanitaire fin 2019, quelques travaux très intéressants sur l’inhibition de la protéase M ^pro duSARS-CoV2 par de petites molécules ont été publiés dans des journaux très prestigieux [Jin et al., Nature 2020, 582, 289-293; Zhang et al., Science 2020, 368, 409-412; Dai et al., Science 2020, 368, 1331-135; Jin et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2020, 27, 529-532]. Suite à l’analyse de ces différents travaux, plusieurs informations importantes et cruciales pour la conception et le développement d’anti-SARS-CoV-2 sont résumées dans la partie suivante.

La figure 1 montre la structure tridimensionnelle de la M ^pro avec deux différentes vues, et ce, suite à une rotation de 90°. Cette figure montre également la localisation du site catalytique composé du His41 (boule bleu) et la Cysl45 (boule jaune) et la structure sous forme d’un dimère de l’enzyme.

La figure 2 contient une représentation de la surface de liaisons entre le site actif de la M ^pro et les ligands (substances actives). Grâce à cette récente étude, les équipes de Dai, Zhang, Jiang et Su ont proposé les deux molécules 11a et 11b (Figure 2) contenant chacune un aldéhyde pour faire la liaison covalente avec la Cysl45, le cyclohexyle ou le 3-fluorophenyl pour occuper la poche S2 et l’indole pour faire des liaisons hydrogènes avec la poche S4 [Dai et al., Science 2020, 368, 1331-1335]. Les IC ₅₀ (concentration inhibitrice demi-maximale) des composés 11a et 11b sont respectivement de 0,053 et 0,040 μM.

En se basant sur le mécanisme d’interaction entre le composé peptidomimétique N3 (Figure 3) et la M ^pro , Jiang, Rao et Y ang ont identifié un inhibiteur en utilisant la conception de médicaments assistée par ordinateur, puis déterminé la structure cristalline de la M ^pro du SARS-CoV-2 complexée avec le composé N3. Grâce un criblage virtuel à haut débit, plus de 10000 composés ont été analysés- y compris des médicaments approuvés, des candidats-médicaments dans les essais cliniques et autres composés biologiquement actifs. Suite à cette étude, six composés se sont révélés capables d’inhiber la M ^pro avec des valeurs des IC ₅₀ allant de 0,67 à 21,4 μM. L'un de ces six composés, l’Ebselen, a présenté également une activité antivirale prometteuse au niveau cellulaire (Figure 3) [Jin et al., Nature 2020, 582, 289-293]

Dans une autre étude, les équipes de Zhang et Yang ont pu mettre en évidence, grâce à l’obtention de la structure des rayons X, le mode d’interaction entre la M ^pro et le Carmofur (le Carmofur est utilisé depuis 1980 pour le traitement du cancer colorectal [Sakamoto et al., Jpn J. Clin. Oncol. 2005, 35, 536-544]). Ce composé établi une liaison covalente avec le site catalytique à savoir la Cysl45 tandis que la partie alkyle (hydrophobe) occupe la poche S2 (Figure 4) [Jin et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2020, 27, 529-532] (Figure 3). L’activité anti-SARS-CoV2 du Carmofur (IC ₅₀ =1,82 μM) a été révélée pour la première fois par la même équipe suite à un screening de 10 000 composés [Jin et al., Nature, 2020, 582, 289-293]

Très récemment, deux nouvelles molécules appelées GRL-1720 et 5h ont été développées par Mitsuya et ces collaborateurs comme inhibiteurs de la M ^pro . En utilisant des études cellulaires sur les cellules VeroE6 et la réplication de l’ARN par qPCR, les chercheurs ont montré que les deux composés bloquent l'infection du SARS-CoV-2 avec des valeurs des EC ₅₀ de 15 ± 4 et de 4,2 ± 0,7 μM pour GRL-1720 et 5h, respectivement. D’autres études supplémentaires par analyses par diffraction des rayons X ont montré que le composé 5h forme une liaison covalente avec la M ^pro ainsi que d’autres liaisons par interactions polaires avec plusieurs résidus d'acides aminés du site actif (Figure 5) [Flattori et al., Nat. Commun., 2021, 12:668]

Très récemment également, Rut, Drag et leurs collaborateurs ont publié la conception et la synthétise d’inhibiteurs pseudo-peptidiques du SRAS-CoV-2 issues d’un mélange d’acides aminés naturels et non naturels (Figure 6). La meilleur molécule Ac-QS5-VS (15) (Ac-Abu-dTyr-Leu-Gln-VS) a un EC50 de 3,7 μM. Ils ont également obtenu la structure cristalline en complexant une autre molécule appelée, B- QS1-VS (13) (Biotin-PEG(4)-Abu-Leu-Gln-VS) avec la M ^pro du SARS-CoV-2. Grâce à la fluorescence des composés synthétisés, ils ont suivi aussi l’interaction des inhibiteurs avec le site actif de la M ^pro du SARS-CoV-2 dans les cellules épithéliales du nasopharynx de patients souffrant d'une infection au COVID-19 [Rut et al., Nat. Chem. Biol., 2021, 17, 222-228],

Malgré les récents gros efforts, jusqu’à date il n’y a pas encore de thérapie pour traiter la COVID-19. Après la détermination de la structure cristalline de la M ^pro (Jin et al., Nature 2020, 582, 289-293), la plupart des études publiées concerne la modélisation moléculaire en étudiant l’interaction entre le site actif de la M ^pro avec plusieurs principes actifs de médicaments déjà sur le marché ou en développement clinique (antiviraux, anticancéreux...) et ce, afin d’aller plus vite et éviter certaines phases précliniques (Yoshino et al., Sci. Rep. 2020, 10, 12493; Bolcato et al. Sci. Rep. 2020, 10, 20927). Par exemple, la majorité des composés qui ont été étudiés par modélisation moléculaire, en se basant sur la structure cristalline publiée par Jin et al. (Jin et al., Nature, 2020, 582, 289-293), cible l’inhibition du site actif de la M ^pro en mimant l’action du peptidomimétique N3 (Figure 7) dont le mécanisme d’action passe par un groupement chimique électrophile (un accepteur de Michael) capable de faire une liaison covalente avec la Cys 145 (Figure 7A). Par exemple, dans l’article rapporté par W. Cui, K. Yang et H. Yang, l’étude du Carmofur (Figure 7B) par modélisation moléculaire montre que la fonction acide carboxylique du Carmofur est liée à l'atome du soufre de la Cys 145 par une liaison covalente de 1,8 Â, alors que la queue de l'acide gras est insérée dans la poche S2. L’ensemble de la molécule du Carmofur est stabilisé par de nombreuses liaisons hydrogènes et par des interactions hydrophobes. Par contre, l’inhibiteur N3 (Figure 7A) s’insère via un mécanisme différent en formant une liaison covalente avec la Cysl45 par l'addition de Michael du thiol sur le groupement vinyle. Pour le mode de liaison entre la M ^pro et les peptidomimétiques a-cétoamides GC-376 et 13b (Figure IC et 1D) d’une part, et entre la M ^pro et l’aldéhyde 11a d’autre part (Figure 1E), les études de modélisation ont montré aussi que les groupements carbonyles de ces composés sont liés de manière covalente à la Cys 145. Tandis que, les autres groupements présents sur ces mêmes composés, occupent les sites SI, S2, S3 et S4 de la protéase et établissent des interactions hydrophobes et hydrogènes. (Cui et al., Front. Mol. Biosci., 2020, 7, 616341). [-] Les inventeurs ont fait la conception et la préparation de nouveaux composés anti-SARS-CoV-2 et inhibiteurs de la protéase M ^pro (ou 3CLpro) qui répondent mieux aux besoins de la pratique, notamment par la simplicité de leur préparation. Ces composés sont potentiellement utilisables en thérapie humaine.

[-] Cet objectif est atteint par les composés de formules (I) et (II) qui sont décrits ci-après et qui constituent le premier objet de l’invention, ces composés étant de puissants anti-SARS-CoV-2 et inhibiteurs de la M ^pro . En outre, les composés sont faciles à préparer, généralement en deux à quatre étapes. L’ensemble des composés de formules (I) et (II) sont obtenus de manière très commode en utilisant des réactions chimiques très simples et bien connues de la litérature.

[-] La présente invention a pour objectif les composés de formules (I) et (II) suivantes :

Dans lesquelles :

W et Z, identiques ou différents et indépendamment les uns aux autres, représentent un atome d’hydrogène, d’halogène, d’hydroxy ou d’amine, de préférence W est un atome d’hydrogène ou de chlore et Z est un atome de chlore, de fluor, de brome ou un hydoxy;

- V, X et Y, identiques ou différents et indépendamment les uns aux autres, représentent un atome de carbone, d’azote, d’oxygène ou de soufre, de préférence V et X sont des atomes d’azote et Y est un atome de carbone ou d’azote.

U est un atome de carbone ou un ou plusieurs atomes d’azote qui remplacent les atomes de carbone du cycle aromatique à six chaînons, de préférence U est un atome de carbone ou un ou deux atomes d’azote. n et n’, identiques ou différents et indépendamment les uns aux autres, représentent la longueur de la chaîne alkyle, hydroxy, perfluoroalkyle, alkylthio, aminoalkyle et alcoxy, pouvant comprendre de 1 à 10 atomes de carbone.

RI, R2, R3 et R4, identiques ou différents et indépendamment les uns aux autres, représentent un atome d’hydrogène, d’halogène, d’hydroxy, d’alcoxy, d’alkyle, d’aryle, d’héteroaryle, d’amine. Lesdits groupes alkyles, hydroxy, perfluoroalkyle, alkylthio, aminoalkyle et alcoxy pouvant comprendre de 1 à 10 atomes de carbone.

[-] Au sens de la présente invention, on entend par :

Alkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant 1 à 10 carbones, de préférence de 1 à 2 atomes de carbone. Le terme « ramifié » signifie qu’au moins un groupe alkyle inférieur tel qu’un méthyle ou un éthyle est porté par une chaîne alkyle linéaire (alkyle supérieur). Le terme alkyle « inférieur » désigne un alkyle ayant 1 ou 2 atomes de carbone ; le terme alkyle « supérieur » désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 3 à 10 atomes de carbone. A titre d’exemple de groupe alkyle, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isobutyle, tert-butyle, n- butyle et n-pentyle.

- Atome d’halogène : désigne un atome de brome, de chlore, d’iode et de fluor; les désignations brome, chlore et fluor étant préférées.

Perfluoroalkyle : désigne un groupe alkyle tel que défini ci-dessous dans lequel tous les atomes d’hydrogène ont été remplacés par des atomes de fluor. Parmi les groupes perfluoroalkyle, les groupes trifluorométhyle et perfluoroéthyle sont préférés ;

- Alcoxy : désigne un groupe O-alkyle dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus. A titre d’exemple de groupe alcoxy, on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy et pentoxy ;

- Alkylthio : désigne un groupe alkyl-S dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus. A titre d’exemple de groupe alkylthio, on peut citer les groupes méthylthio, éthylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, pentylamino ;

- Aminoalkyle : désigne un groupe alkyle-N dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus. A titre d’exemples de groupe aminoalkyl, on peut citer les groupes aminométhyl, aminoéthyl, iso-propylamino, butylamino et pentylamino ; - Aryle : désigne un groupe aromatique hydrocarboné insaturé, cyclique, ayant 4 à 6 carbones, de préférence de 5 à 6 atomes de carbone.

Hétéroaryle : désigne un aryle tel que défini ci-dessus dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone ont été remplacés par des atomes d’azote, oxygène ou soufre. A titre d’exemple de groupe hétéroaryle, on peut citer les groupes pyridine, pyrimidine, thiophène, furane, imidazole, pyrole et triazole.

[-] Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, les composés de formule (I) et (II) sont choisis parmi ceux dans lesquels Z et W représentent un halogène et un alcoxy, de préférence un hydroxy.

[-] Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, les composés de formule (I) et (II) sont choisis parmi ceux dans lesquels X et Y représentent un atome d’azote et un atome de carbone ou deux atomes d’azote.

[-] Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, les composés de formule (I) et (II) sont choisis parmi ceux dans lesquels n et n’ représentent une longueur de la chaîne de 0 à 3 carbone, de préférence n et n’ sont égales à 0 et 1.

[-] Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, les composés de formule (I) et (II) sont choisis parmi ceux dans lesquels R1 , R2, R3 et R4 représentent un hydrogène, un alkyle, un hydroxy et un alkylamine, de préférence un hydrogène, un méthyle, une aminométhyl et un hydroxy.

[-] A titre de composés de formules (I) et (II), on peut citer :

2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylénebutanoyl)phénoxy)-N-( 1 -méthyl-1 H- indol-5-yl)acétamide de formule suivante :

(Composé P5) ;

2-(2,3 -dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-N-( 1 -methyl-1 H-indazol-5 -yl)acétamide de formule suivante :

-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-N-( 1 H- indol-4-yl)acctamidc de formule suivante : -(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-N-( 1 H- indol-5-yl)acctamidc de formule suivante :

(Composé P12) ; -(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-N-( 1 H- indol-6-yl)acctamidc de formule suivante :

2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-jV-(l- méthyl-lH-indazol-4-yl)acétamide de formule suivante :

(Composé P18) ;

2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-jV-(l- méthyl-lH-indazol-6-yl)acétamide de formule suivante :

O

P20

(Composé P20) ;

2-(2,3 -dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-jV-( 1 -méthyl - 17/-indazol-7 -yl)acétamide de formule suivante :

O

(Composé P21) ; l-(4-(2-(l/7-indazol-l-yl)-2-oxoéthoxy)-2,3-dichlorophényl )-2-méthylènebutan-l-one de formule suivante :

(Composé P22) ;

2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-N-( 1 H- indazol-5-yl)acctamidc de formule suivante :

(Composé P26) ;

2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylcncbutanoyl)phénoxy)-N-(2-m� �thyl-2H- indazol-6-yl)acétamidc de formule suivante :

2-(2,3-dichloro-4-(2-méhylcncbutanoyl)phénoxy)-N-(2-mé thyl-2H- indazol-7-yl)acétamidc de formule suivante : 2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-N-(2-mcthyl- 2H-indazol-4-yl)acctamidc de formule suivante :

2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phcnoxy)-/V-( 1 -((4-mcthoxyphcnyl)sulfonyl)-1 H-indazol-5- yl)acétamide de formule suivante :

(Composé P32) ;

Tert-butyl 5-(2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phenoxy)acctamido) -1 H-indazolc-1 -carboxylatc de formule suivante : 2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phenoxy)-N-( 1 -(prop-2-yn-l -yl )- 1 H- indazol-4-yl)acctamidc de formule suivante :

Tert-butyl (2-(2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)acéta mido)éthyl)carbamate de formule suivante :

Tert-butyl (l-(2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)acéty l)pipéridin-4-yl)carbamate de formule suivante :

(Composé P36) ; iV-(2-chloroéthyl)-2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl )phénoxy)acétamide de formule suivante :

(Composé P37) ; tert- butyl 4-(2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)acétyl )pipérazine-l-carboxylate de formule suivante :

(Composé P38) ;

N -butyl-2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)ac� �tamide de formule suivante :

2-(2,3-dichloro-4-(2-mcthylcncbutanoyl)phenoxy)-N-(( 1 -méthyl-1 H- indazol-5-yl)méthyl) acétamide de formule suivante :

(Composé P40) ;

1 -(2,3 -dichloro-4-(2-(5 -méthyl-l/Z-indazol- 1 -yl)-2-oxoéthoxy)phényl)-2-méthylènebutan- 1 -one de formule suivante :

(Composé P41) ; l-(2,3-dichloro-4-(2-oxo-2-(177-pyrazolo[4,3-6]pyridin-l-yl) éthoxy)phényl)-2-methylènebutan-l-one de formule suivante :

(Composé P42) ;

2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-N-(1-m éthyl-l/7-benzo[t/]imidazol-5-yl)acétamide de formule suivante :

Préparation des composés

La synthèse de tous les analogues s’effectue selon le schéma réactionnel 1 suivant :

Les amines utilisées sont préparées généralement en deux étapes selon les références de la littérature [Swama et al., J. Med. Chem. 2002, 45, 3, 740-743 ; Down et al., J. Med. Chem. 2015, 58, 18, 7381-7399 ; Usninn et al., Chem. Commun., 2012,48, 2680-2682], L’acide éthacrynique (AE) est ensuite traité avec différentes amines via une réaction d’amidation menée selon la procédure décrite dans le schéma 1. Cette séquence a eu lieu en présence des agents d’activation tels que le ,N, ,N- di c y c 1 o h ex y 1 c ar b o diinri de (DCC), l’hydroxybenzotriazole (HOBt) et la 4-diméthylaminopyridine (DMAP) dans le DCM à température ambiante. Les produits désirés sont obtenus avec des rendements satisfaisants après purification sur colonne de gel de silice.

Protocoles de synthèse et caractérisation de différents composés selon l’invention

Les solvants ont été séchés selon des méthodes standards et distillés sous azote avant utilisation. Tous les réactifs sont utilisés sans purification préalable à partir des sources commerciales classiques. Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du carbone ¹³ C et du proton 'H ont été enregistrés sur un appareil JEOL AC500 (500 MHz). Les déplacements chimiques (d) sont enregistrés en ppm par-rapport au pic résiduel de référence TMS. JNM-ECZ500R/S 1 FT NMR SYSTEM (JEOL)

Les protocoles expérimentaux

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylénebutanoyl)phénoxy)- V-(l -méthyl-1H- indol-5-yl)acétamide (P5)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml), est ajoutée à 0°C, la l-méthyl-1H-indol-5-amine (24.12 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9: 1 à 8:2 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P5 sous forme d’un solide blanc (48 mg avec un rendement de 67 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.56 (s, 1H), 7.95 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.38 (dd, J= 2.0, 8.7 Hz, 1H), 7.32 (d , J= 8.7 Hz, 1H), 7.25 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 7.38 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.53-6.48 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.64 (s, 1H), 4.75 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.51 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.18 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.50, 164.30, 154.41, 150.27, 134.53, 134.33, 131.55, 129.90, 128.95, 128.75, 128.53, 127.32, 115.52, 112.73, 111.12, 109.44, 101.10, 68.40, 32.90, 23.40, 12.40.

- Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)- V-( l -méthyl-1H- indazol-5-yl)acétamide (P7)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml), est ajoutée à 0°C, la l-méthyl-1H-indazol-5-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P7 sous forme d’un solide blanc (55 mg avec un rendement de 77%). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.63 (s, 1H), 8.14 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 8.01-7.96 (m, 1H), 7.49 (dd, J = 1.5, 8.9 Hz, 1H), 7.40 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.24 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.63 (s, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.09 (s, 3H), 2.50 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.18 (t, J= 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.42, 164.62, 154.33, 150.19, 137.70, 134.59, 132.85, 131.56, 129.85, 128.85, 127.36, 124.05, 123.07, 120.75, 112.05, 111.25, 109.47, 68.48, 35.63, 23.46, 12.43.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-.V-(l H- indol-4- vDacétamide (Pli)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le 1Hi-ndol-4-amine (21.78 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P11 sous forme d’un solide blanc (37 mg avec un rendement de 51 %).

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)-.V-( l H- indol-5- vDacétamide (P 12)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml), est ajoutée à 0°C, la 5-aminoindole (21.81 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P12 sous forme d’un solide blanc (44 mg avec un rendement de 64 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): 8.57 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.41-7.29 (m, 2H), 7.27-7.18 (m, 2H), 6.92 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.63 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 2.51 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.18 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm): 195.54, 164.53, 154.44, 150.23, 134.33, 133.54, 131.55, 129.24, 128.86, 128.07, 127.27, 125.45, 123.06, 116.06, 112.66, 111.35, 111.15, 102.85, 68.46, 23.43, 12.43. Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-.V-(l H- indol-6- vDacétamide (P 13)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la li/-indol-6-amine (21.78 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P13 sous forme d’un solide blanc (35 mg avec un rendement de 49 %).

Préparation de la 2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylcncbutanoyl)nhénoxy)-/V-(1 -mcthyl-1H- indazol-4-yl)acétamide (P 18)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la l-méthyl--1Hi-ndazol-4-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P18 sous forme d’un solide blanc (41 mg avec un rendement de 58 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.96 (s, 1H), 8.07 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.40 (dd, J= 8.4, 7.6 Hz, 1H), 7.26-7.19 (m, 1H), 6.94 (d, .7= 8.5 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.82-4.75 (m, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.09 (s, 3H), 2.47 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.15 (t, J= 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.59, 164.73, 154.14, 150.27, 140.95, 134.66, 131.82, 129.44, 129.09, 129.02, 127.48, 127.38, 122.95, 116.70, 111.13, 110.95, 106.02, 68.14, 35.92, 23.48, 12.47.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-.V-( 1 -methyl-1H- indazol-6-yl)acétamide (P20)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml), est ajoutée à 0°C, la l-méthyl--1Hi-ndazol-6-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P20 sous forme d’un solide blanc (55 mg avec un rendement de 77%). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.74 (s, 1H), 8.24-8.13 (m, 1H), 7.93 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 8.5, 0.8 Hz, 1H), 7.23 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.11 (s, 1H), 4.07 (s, 3H), 2.35 (q, .7= 7.4 Hz, 2H), 1.13 (t, .7= 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.40, 164.92, 156.89, 137.16, 132.80, 131.75, 129.07, 127.46, 121.86, 121.41, 119.04, 114.40, 114.40, 111.28, 99.64, 68.43, 49.26, 35.78, 23.48, 12.47.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-.V-( l -mcthyl-1H- indazol-7-yl)acétamide (P21)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la l-méthyl--1Hi-ndazol-7-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P21 sous forme d’un solide blanc (34 mg avec un rendement de 44 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.98 (s, 1H), 7.66 (dd, J= 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.50 (dt, J= 7.5, 1.0 Hz, 1H), 7.25 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.19-7.13 (m, 1H), 6.97 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.36 (s, 1H), 4.27 (s, 3H), 2.47 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.52, 166.41, 156.88, 150.28, 135.04, 134.82, 133.22, 131.85, 129.07, 127.48, 126.97, 124.55, 121.13, 120.64, 118.98, 111.09, 68.41, 49.25, 38.47, 23.47, 12.47.

Préparation de la l-(4-(2-(lH-indazol-l-yl)-2-oxoéthoxy)-2.3-dichlorophényl) -2- méthylènebutan-l-one (P22)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 177-indazole (19.47 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec le DCM pour obtenir le produit attendu P22 sous forme d’un solide blanc (41 mg avec un rendement de 62 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): 8.44 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.97 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.65-7.63 (m, 1H), 7.46-7.44 (m, 1H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.94 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.71 (s, 2H), 5.65 (s, 1H), 2.49 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.17 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm) : 195.80, 166.41,155.46, 155.60, 150.10, 141.20, 139.00, 133.84, 131.55, 130.12, 128.50, 126.00, 125.21, 123.41, 121.20, 115.11, 111.00, 67.40, 23.41, 12.40.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)-.V-( l H- indazol-5- vDacétamide (P26)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la -1Hi-ndazol-5-amine (21.91 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P26 sous forme d’un solide blanc (34 mg avec un rendement de 50 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 13.01 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.51 (d, .7= 8.9 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.59 (s, 1H), 4.98 (s, 2H), 2.38 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.08 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.60, 165.60, 156.10, 149.80, 137.05, 133.09, 132.90, 131.70, 130.00, 129.80, 128.00, 123.10, 121.60, 120.80, 112.04, 110.70, 110.60, 68.40, 23.40, 12.80.

Préparation de la 2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylèncbutanoyl)nhénoxy)-.V-(2-mé thyl-2H- indazol-6-yl)acétamide (P29)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg g, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 2-méthyl-2//-indazol-6-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P29 sous forme d’un solide blanc (41 mg avec un rendement de 58 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.65 (s, 1H), 7.92-7.82 (m, 1H), 7.71-7.58 (m, 1H), 7.59 (d, J= 2.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.23-7.10 (m, 1H), 6.90 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.59 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.18 (s, 3H), 2.44 (q, 7.4 Hz, 2H), 0.98 (t,J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 201.31, 164.57, 150.23, 134.64, 133.00, 130.88, 129.93, 128.82, 127.97, 126.97, 125.26, 124.17, 121.09, 117.09, 115.29, 111.26, 110.90, 68.29, 48.24, 23.47, 11.06.

Préparation de la 2-(2.3-dichloro-4-(2-méhylènebutanoyl)phénoxy)-/V-(2-mét hyl-2H- indazol-7-yl)acétamide (P30) - A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 2-méthyl-2H- indazol-7-aminc (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P30 sous forme d’un solide blanc (33 mg avec un rendement de 46 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 9.59 (s, 1H), 8.17 (dd, J= 7.3, 0.8 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.38 (dd, J = 8.4, 0.8 Hz, 1H), 7.19 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.07 (dd, J= 8.5, 7.3 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.95 (t, J= 1.5 Hz, 1H), 5.59 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 4.20 (s, 3H), 2.47 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.14 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.81, 165.00, 154.65, 150.30, 141.98, 134.28, 131.60, 128.94, 127.26, 126.37, 124.25, 123.59, 122.48, 122.44, 115.82, 113.22, 111.00, 68.39, 40.57, 23.50, 12.48. Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)-.V-(2-mé thyl-2H- indazol-4-yl)acétamide (P31)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 2-méthyl-2H- indazol-4-amine (24.29 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P31 sous forme d’un solide blanc (40 mg avec un rendement de 56 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.72 (s, 1H), 7.98 (d, J= 0.9 Hz, 1H), 7.55-7.50 (m, 2H), 7.30-7.20 (m, 2H), 6.93 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.59 (s, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.22 (s, 3H), 2.47 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.14 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.56, 164.45, 154.20, 150.27, 149.99, 134.63, 131.70, 129.08, 128.30, 127.57, 126.33, 122.84, 121.96, 116.44, 114.78, 112.25, 111.11, 68.24, 40.70, 23.48, 12.47. Préparation de la 2-!2.3-dichloro-4-!2-méthylènebutanoyl)phénoxy)-.N-(1 -((4- méthoxyphénvDsulfonyl)- 1 H- indazol-5-yl)acétamidc (P32)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 1 -((4-mcthoxyphcnyl)sulfonyl)-l H- indazol-5-aminc (50.06 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4: 1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P32 sous forme d’un solide blanc (49 mg avec un rendement de 51 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.69 (s, 1H), 8.22-8.14 (m, 3H), 7.93- 7.86 (m, 2H), 7.53 (dd, J= 8.9, 2.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.92-6.86 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.59 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.47 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.14 (t, J = 7.5 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.55, 165.02, 164.29, 154.25, 150.25, 141.31, 137.72, 134.78, 133.18, 131.75, 129.99, 129.07, 128.79, 127.46, 126.43, 123.10, 122.74, 114.57, 113.95, 112.15, 111.33, 68.39, 55.80, 23.48, 12.47.

Préparation du 7er/-butyl 5-(2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy) acctamidohl H- indazole-1 -carboxylatc (P33)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et dAE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le Tert-butyl 5-amino-lH-indazole-l-carboxylate (38.49 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4: 1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P33 sous forme d’un solide blanc (49 mg avec un rendement de 57 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.70 (s, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 8.19- 8.13 (m, 2H), 7.52 (dd, J= 9.0, 2.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.96 (t ,J= 1.5 Hz, 1H), 5.59 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H), 2.47 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.72 (s, 9H), 1.14 (t, J = 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.56, 164.93, 154.32, 150.26, 149.16, 139.61, 137.19, 134.73, 132.77, 131.74, 129.05, 127.47, 126.35, 123.11, 122.29, 115.27, 111.84, 111.31, 85.23, 68.41, 28.25, 23.47, 12.46.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)- N-(1 -(nron-2-yn- 1 -yl)- l H- indazol-4-yl)acétamidc (P34)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la l-(prop-2-yn-l-yl)--1Hi-ndazol-4-amine (28.22 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P34 sous forme d’un solide blanc (41 mg avec un rendement de 55%). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): 8.97 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 4.4, 1.0 Hz, 1H), 7.94-7.91 (m, 1H), 7.42-7.39 (m, 1H), 7.25-7.22 (m, 1H), 6.94 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 5.06 - 4.99 (m, 1H), 4.77 (s, 2H), 2.47 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.15 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm): 195.59, 164.73, 154.12, 150.27, 140.29, 134.68, 132.55, 131.83, 130.34, 129.63, 129.05, 127.88, 127.49, 118.16, 111.78, 111.32, 110.94, 106.36, 74.02, 68.12, 39.24, 23.48, 12.47.

Préparation du Tert-butyl (2-(2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy) acétamido)éthyl)carbamate (P35)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d’AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le Tert-butyl (2-aminoéthyl)carbamate (26.44 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P35 sous forme d’un solide blanc (48 mg avec un rendement de 66 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.20 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.68 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.88 (br, 1H), 4.59 (s, 2H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.36-3.32 (m, 2H), 2.49 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.52, 172.46, 167.33, 154.63, 150.22, 134.24, 131.55, 130.97, 128.78, 127.19, 123.19, 110.97, 68.26, 40.36, 39.75, 28.35, 23.45, 12.35. Préparation du Tert-butyl (l-(2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)acéty l) pipéridin-4-yl)carbamate (P36)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le Tert-butyl pipéridin-4-ylcarbamate (33.05 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l’acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (4:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P36 sous forme d’un solide blanc (39 mg avec un rendement de 49 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.16 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.62 (s, 1H), 4.93-4.73 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 4.04-4.02 (m, 1H), 3.70 (br, 1H), 3.26-3.16 (m, 1H), 2.90-2.79 (m, 1H), 2.49 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 2.09-1.98 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.37-1.25 (m, 2H), 1.16 (t, J = 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 198.01, 195.81, 165.04, 155.23, 155.03, 150.26, 133.76, 128.75, 127.14, 110.64, 68.83, 44.43, 41.33, 33.95, 33.13, 32.05, 28.35, 25.63, 24.95, 23.43, 12.41.

Préparation de la A-(2-chloroéthyl)-2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl) phénoxy) acétamide (P37)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol), de triéthylamine (0,033 mL, 0.248 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le chlorhydrate de 2- chloroéthylamine (19.14 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec le DCM pour obtenir le produit attendu P37 sous forme d’un solide blanc (33 mg avec un rendement de 55 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.24 (br, 1H), 7.22 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.89 (d ,J= 8.6 Hz, 1H), 5.98 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.84-3.66 (m, 4H), 2.50 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.17 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.50, 166.09, 154.40, 150.20, 134.30, 131.50, 128.70, 127.02, 110.09, 110.08, 68.10, 43.05, 40.70, 23.40, 12.40.

Préparation du tert- butyl 4-(2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy) acétyl) pipérazine-l-carboxylate (P38)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, le Tert-butyl pipérazine-l-carboxylate (30.69 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l’acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 à 8:2 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P38 sous forme d’un solide blanc (43 mg avec un rendement de 56 %). RMN 1 H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.17 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.85 (s, 2H), 3.62-3.55 (m, 4H), 3.47-3.45 (m, 4H), 2.55-2.41 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.16 (t, J = 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) :

195.77, 165.40, 155.08, 154.42, 150.18, 133.85, 131.48, 128.72, 127.10, 110.64, 80.52,

68.77, 45.48, 42.13, 33.97, 29.70, 28.37, 23.42, 12.40, 12.39.

Préparation du A-butyl-2-(2.3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)ac étamide (P39) - A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la n-butyl amine (12.05 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P39 sous forme d’un solide blanc (39 mg avec un rendement de 65 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 7.19 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.87 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.79 (br, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.59 (s, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.39 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 2.47 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.63-1.53 (m, 2H), 1.47-1.32 (m, 2H), 1.15 (t, .7= 7.4 Hz, 3H), 0.95 (t, .7= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz), δ (ppm) : 195.50, 166.51, 154.50, 150.10, 134.10, 131.40, 128.70, 127.20, 122.80, 110.80, 68.20, 38.80, 31.40, 23.40, 19.90, 13.70, 12.30. Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)phénoxy)- V-(( l -méthyl-l II- indazol-5-yl)méthyl)acétamide (P40)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la ( 1 -méthyl-l H- indazol-5-yl jméthanaminc (26.56 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l’acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P40 sous forme d’un solide blanc (37 mg avec un rendement de 51 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): d 7.94 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 8.3, 0.8 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 1.0 Hz, 1H), 7.17 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.08 (dd, J= 8.3, 1.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.55 (s, 1H), 4.71 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.64 (s, 2H), 4.23 (br, 1H), 4.05 (s, 3 H), 2.45 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.12 (t, J = 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm): 195.64, 166.87, 156.96, 154.51, 150.25, 140.14, 136.07, 134.39, 132.77, 131.61, 128.96, 127.34, 123.62, 121.77, 120.59, 111.05, 107.86, 68.36, 43.60, 35.69, 23.47, 12.46.

Préparation de la dichloro-4-(2-(5-méthyl-l H- indazol-1 -yl)-2-oxoélhoxy) phényl)-2-méthylènebutan- 1 -one (P41 )

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la 5-méthyl-17/-indazole (21.78 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec le (DCM pour obtenir le produit attendu P41 sous forme d’un solide blanc (40 mg avec un rendement de 58 %). RMN ^C H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm) : 8.26 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.55 - 7.49 (m, 1H), 7.41 (dd, .7= 8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.89 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.66 (s, 2H), 5.62 (s, 1H), 2.48 (s, 3 H), 2.47 - 2.42 (m, 2H), 1.13 (t, J= 7.4 Hz, 3H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm): 196.07, 166.34, 155.78, 150.25, 141.09, 137.55, 135.34, 133.83, 131.93, 129.17, 128.80, 126.92, 126.58, 123.47, 120.74, 114.79, 111.02, 67.45, 23.51, 21.42, 12.47. Préparation de la 1 -(2,3-dichloro-4-(2-oxo-2-(l H- nyrazolor4.3-/dnyridin-l - yl)éthoxy)phényl) -2-méthylènebutan-l-one (P42)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la -1Hp-yrazolo[4,3-b]pyridine (19.64 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l'acétate d'éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, fdtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P42 sous forme d’un solide blanc (35 mg avec un rendement de 53 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): 8.77 (dd, J= 4.6, 1.4 Hz, 1H), 8.67 (dt, J= 8.4, 1.4 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.52 (dd, J= 8.4, 4.6 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.91 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.94 (t, J= 1.5 Hz, 1H), 5.70 (s, 2H), 5.61 (s, 1H), 2.46 (q, J= 7.4, 2H), 1.13 (t , J = 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm): 195.97, 166.81, 155.54, 150.25, 149.26, 144.20, 141.89, 134.14, 132.72, 131.74, 128.86, 126.89, 124.03, 123.62, 123.01, 111.08, 67.27, 23.49, 12.47.

Préparation de la 2-(2,3-dichloro-4-(2-méthylènebutanoyl)nhénoxy)-.V-( l -mcthyl-1 H- benzor<71imidazol-5-yl)acétamide (P43)

- A une solution de DCC (37.45 mg, 0.182 mmol), de HOBt (30.32 mg, 0.198 mmol), de DMAP (2.02 mg, 0.017 mmol) et d'AE (50 mg, 0.165 mmol) dans le DCM (5 ml) est ajoutée à 0°C, la l-méthyl-li7-benzo[<7]imidazol-5-amine (24.26 mg, 0.165 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Après extraction avec de l’acétate d’éthyle, les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée du chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et puis concentrées sous pression. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne en éluant avec un mélange (DCM/EtOAc (9:1 (v/v))) pour obtenir le produit attendu P43 sous forme d’un solide blanc (56 mg avec un rendement de 79 %). RMN ¹ H (CDCl ₃ , 500 MHz), δ (ppm): 8.66 (s, 1H), 8.05 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.63 (dd, J = 1.8, 8.6 Hz, 1H), 7.40 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.25 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.97 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.63 (s, 1H), 4.76 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.51 (q, .7= 7.4 Hz, 2H), 1.18 (t , J = 7.4 Hz, 3 H). RMN ¹³ C (CDCl ₃ , 126 MHz) δ (ppm) : 195.41, 164.52, 154.32, 150.10, 144.51, 143.91, 134.51, 132.20, 131.70, 131.61, 128.82, 127.31, 123.10, 116.81, 112.10, 111.21, 109.50, 68.41, 31.11, 23.41, 12.42.

Activités biologiques

Protocoles

La stratégie la plus rapide pour tenter de trouver des médicaments efficaces contre la COVID-19 est de mener des essais cliniques avec des médicaments déjà utilisés contre d’autres maladies, puisque l’on sait comment les administrer et qu’on en connaît les doses efficaces (stratégie du « positionnement de médicament », ou drug repositioning en anglais). Cependant, les inhibiteurs d’une protéase donnée ne sont pas nécessairement efficaces pour bloquer une autre protéase, qui a des propriétés structurales et fonctionnelles différentes. Des molécules de la famille des cétones a,β-insaturées (accepteurs de Mickaël), capables de bloquer la protéase 3CLpro du SARS-CoV-2, représentent un espoir réel pour traiter les patients. Certaines ont déjà été utilisées en clinique, comme le Telaprevir ou le Boceprevir, qui furent parmi les premiers inhibiteurs de protéase prescrits dès 2011 pour traiter les patients atteints d’hépatite C. Le développement d’inhibiteurs de protéase devrait bénéficier de moyens conséquents pour pouvoir disposer rapidement d’un traitement efficace contre le COVID-19.

Nous avons utilisé un test de microneutralisation, décrit par Amanat .F et al. [Amanat et al., Curr Protoc Microbiol 2020, 58, el08] et qui permet d’évaluer de manière quantitative si des anticorps ou des médicaments peuvent bloquer l'entrée et/ou la réplication du SRAS-CoV-2 in vitro. Pour se faire, Les dosages de microneutralisation sont effectués dans un format de 96 puits, ce qui permet un débit moyen. Si le test décrit initialement par Amanat et al. ail [Amanat et al., Curr Protoc Microbiol 2020, 58, el 08] est basé sur la coloration de la nucléoprotéine du virus (NP) par test Elisa, nous avons opté pour un test plutôt basé sur la RT-PCR par amplification des gènes codant respectivement, la nucléoprotéine du virus (N) et la Polymérase ARN-dépendante (R) et le Gène de l’enveloppe (E). Cette approche, également utilisée par David et al., [David et al., Nature 2020, 583, 459-468], permet d’évaluer quantitativement le % d’inhibition et de corroborer ainsi les observations visuelles de l'effet cytopathique (CPE).

Partie expérimentale

Biologie

L’activité anti-SRAS-CoV-2 des molécules candidates a été étudiée in vitro sur des cellules Vero. Les caractéristiques de l’infection des cellules Vero par le SARS-CoV-2 sont décrites par Yajing [Yao et al., Virol Sin. 2020, 35, 348-350], La lignée de cellules Vero provient de cellules de rein de singe vert isolées en 1962. Les cellules Vero-E6 et Vero employées lors de cette étude sont issues de deux banques cellulaires (INRA de Toulouse, France) et (Société Biopharma, Rabat, Maroc) au passage 39 et 159 respectivement. Une formulation de milieu de culture avec glucose et L-glutamine a été utilisée.

Culture des cellules Vero-E6 et Vero

Les cultures cellulaires et les infections par le virus SARS-CoV2 ont été réalisées dans un laboratoire de niveau 3 en biosécurité (BSL-3). Les cellules sont cultivées dans un milieu de culture avec 6% de sérum de veau fœtal (SVF) et 2% du sérum donneur (SD). Il sera nommé par la suite milieu de référence (MEC). La première étape de propagation cellulaire est réalisée en flacons de culture statique T 175 cm ² ensemencés avec 30 000 cell.cm ^"2 pour les Vero-E6 et 40 000 cell.cm ^"2 pour les cellules Vero. Ces cultures sont placées dans un incubateur contrôlé à 37 °C et 5 % de CO2. Pour les passages cellulaires, on a procédé par trypsinisation des cellules et la suspension cellulaire est collectée et utilisée pour les ensemencements ultérieurs. Le volume de culture est ensuite ajusté par du MEC frais, préalablement porté à 37°C.

Isolement et confirmation du SARS CoV-2

L’isolement du virus SARS CoV-2 est réalisé au niveau du laboratoire de Biosécurité L3 (BSL-3) à partir de deux prélèvements (nasopharyngé et oropharyngé) trouvés positifs chez une patiente (279CC) hospitalisée au Centre de Virologie et Maladies Infectieuses Tropicales (CVMIT), Hôpital Militaire d’instruction Mohammed V de Rabat. L’isolement viral est réalisé selon le protocole décrit par (Harcourt et al., bioRxiv, 2020) en utilisant un milieu d’entretien appelé INOC. L’effet cytopathique (ECP) est visible dès le premier passage (Figure 8). Un test de confirmation de la propagation de virus dans les cellules vero réalisé sur le surnageant cellulaire extrait par le kit viral RNA mini kit (QLAGEN, Hilden, Germany) et amplifié par technique qRT-PCR avec le Kit IVD GeneFinder™ COVID-19 PLUS RealAmp assay (Korea).

Séquençage de génome complet du virus SARS-CoV-2 isolé en culture

Le séquençage du génome viral complet est réalisé par NGS (Ion proton, ThermoFisher) et par séquençage Sanger. Le matériel génétique viral utilisé pour le séquençage est extrait au passage P4 de la souche 279CC sur Vero-E6. La séquence du génome complet obtenue par la technique de Sanger a été déposée au niveau de la base de données international GISAID sous la référence hCoV- 19/Morocco/HMIMV_279CC/2020 Accession ID: EPI ISL 971451.

Adaptation, propagation, production et récolte virale

Le virus 279CC isolé sur Vero-E6 sur milieu INOC est ensuite mis en adaptation réalisée sur les cellules Vero à partir du passage 2 (P2). La propagation et la production virales sont réalisées en flacons de culture statique T500 cm ² avec du milieu INOC. La production virale dure 5 jours post-infection. Des prélèvements quotidiens d’aliquotes permettent de suivre l’augmentation du titre viral et de suivre la croissance et le métabolisme cellulaire. La récolte du virus est réalisée le 5 ^eme jour après l’infection. Le surnageant de culture est ensuite clarifié par centrifugation, aliquoté et congelé à -80 °C.

Détermination du titre viral Les titres infectieux ont été déterminés dans les surnageants de culture de cellules infectées et calculés selon la technique de Reed et Muench (1938). Ils ont été obtenus par technique d'infection par dilution limite et sont exprimés en TClD ₅₀ /mL (50% Tissue Culture Infectious Dose) ou log TClD ₅₀ /mL.

A titre d’exemple de composés de formules (1) ou (2) les composés P7, P26 et P30 ont été choisis pour illustrer les études biologiques réalisées.

Criblage de molécules synthétisées pour évaluer leurs effets antiviraux Détermination des concentrations des molécules Les trois composés sont solubilisés dans du DMSO selon leur Molarité.

Etude de Cytotoxicité

L’étude de la cytotoxicité consiste principalement en l’évaluation de la viabilité cellulaire par l’intermédiaire d’un colorant fluorescent, l'iodure de propidium (logos, Biosystems, USA). Il est réalisé après 24 et 48 h d'incubation avec un compteur automatique de cellules intégré à une optique de fluorescence et à un logiciel d'analyse d'images (Luma, logos, Biosystems, USA).

La cytotoxicité des différents composés est déterminée par le comptage moyen des cellules à chaque essai dans une plaque de cellules non infectées. Les résultats sont présentés en figures IA et sont exprimés en pourcentage (%).

Détermination de l'effet antiviral des molécules

Les cultures de criblage antiviral des molécules sont réalisées dans des plaques de culture 96 puits avec un volume de milieu MEC de 100 mΐ pour une densité de 2.5 x 10 ⁵ cellules/ml. Le protocole employé suit une approche prophylactique (4h d’incubation avant l'infection in vitro ) En effet, les cellules sont incubées en présence ou absence de composés testés pendant 4 h puis infectées à une MOI (Multiplicity Of Infection) de 0.04 pour une durée de 48h dans de l’INOC à 37 °C sous 5 % de CO2.

L'effet sur la production virale (effet antiviral) in vitro est mesuré par la qRT-PCR et par la détermination des titres infectieux (logDIT ₅₀ / ml ou DITC ₅₀ /mL) réalisée sur des cellules Vero après 48h d'incubation. Le rapport du titre infectieux dans chaque condition a été exprimé en fonction du titre infectieux mesuré dans la condition contrôle (sans traitement).

Les titres infectieux mesurés dans les conditions expérimentales en présence des composés testés sont fortement réduits par rapport à la condition contrôle, où les cellules ont été infectées mais non traitées.

En effet, les molécules P7 (16.6 μM), P26 (16.6 μM) et P30 (5.54 μM) permettent une réduction de 100%, 97,96% et 96,75% respectivement des titres infectieux par rapport au contrôle (cf. Ligure 9). A partir de ces résultats, une gamme plus large de concentrations a été testée pour chacun des trois composés sur des cellules Vero dans les mêmes conditions expérimentales, afin de déterminer la gamme de concentration efficace, et ainsi déterminer une IC ₅₀ (half maximal Inhibitory Concentration) c'est-à- dire la dose nécessaire pour obtenir 50% d'inhibition de la production virale (cf. Figure 10).

En effet, les molécules P7, P26 et P30 à 10 μM permettent une réduction de 100%, 93,09% et 100% respectivement des titres infectieux par rapport au contrôle (cf. Figure 2). A 8μM, le pourcentage d’inhibition de ces molécules est de l’ordre de 96,70%, 52,14% et 99,67% respectivement. A 6μM seules les molécules P26, et P30 ont donné une inhibition de l’ordre de 30% de la réplication virale, alors que la P7 n’a pas du tout inhibé la réplication de virus à cette concentration

L’effet inhibiteur de la réplication de la souche SARS-CoV-2 par les 3 molécules a été confirmé par RT -PCR sur trois gènes de virus à savoir le gène RdRP, le gène N et Le gène E. (Tableau 1)

Les valeurs d’ IC ₅₀ pour ces trois composés sont répertoriées dans le tableau suivant (Tableau 2) :

Ces valeurs d'IC ₅₀ sont relativement faibles par rapport aux concentrations usuelles connues pour ces composés dans leurs applications hors champs infectieux. Ces valeurs sont également très éloignées des concentrations de cytotoxicité (CC50).

Structure de la protéine M ^pro du SARS-CoV-2

La structure de la 3-CLpro (M ^pro ) a été téléchargée depuis la Protein Data Bank (PDB ID: 6LU7) cette structure est un complexe de SARS-CoV-23CL ^pro avec son inhibiteur lié de façon covalente à la Cysl45. [Jin et al., Nature 2020, 582, 289-293]. La structure a été minimisée énergétiquement dans Rosetta [Leaver-Fay et al., Methods Enzymol. 2011, 487, 545-574]

Procédure d’amarrage :

1- Optimisation de la structure de la 3-CL ^pro (M ^pro ) (PDB ID: 6LU7) par l’ajout de ses hydrogènes polaires ainsi que les charges partielles de tous ses atomes. Le squelette de la protéine a été fixé lors de la minimisation. Le modèle de score le plus bas a été choisi parmi 1000 modèles. MGLTools (version 1.5.6) a été utilisé pour générer le fichier PDBQT pour l’amarrage.

A titre d’exemple de composés de formules (1) ou (2) le composé P7 a été choisi pour illustrer les études de modélisation moléculaire. 2- Optimisation des ligands :

Les ligands choisis pour Docking moléculaire ont été optimisés par ajout des charges partielles et atomes d’hydrogènes suivis d’une minimisation de l’énergie en utilisant le serveur PRODRG (http://davapcl.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg/).

3- Préparation du fichier de configuration et calcul de grille de potentiel.

Le fichier de configuration a été préparé pour exécuter AutoDock Vina. AutoDockTools est utilisé pour préparer le fichier « input.PDBQT » pour Mpro et pour définir la position et les dimensions de la boîte (X ; Y ; Z). La taille de la grille a été fixée à 20 x 20 x 20 points (x, y et z), et le centre de la grille aux dimensions x, y et z de -10,729204, 12,417653 et 68,816122, respectivement. Le fichier préparé a été enregistré au format « .PDBQT »

4- L’amarrage moléculaire ( Docking )

Le processus d'amarrage moléculaire permet de rechercher les positions et orientations possibles des ligands et d’exploiter au mieux la spécificité du site d’amarrage et le potentiel d’interaction du ligand arrimé. AutoDock Vina (version 1.1.2) [Trott et al., J. Comput. Chem. 2010, 31, 455-461 ; Zhang et al., J. Mol. Recognit. 2016, 29, 520-527] a été utilisé pour Docker les molécules synthétisées au niveau de la poche de liaison du substrat de la M ^pro (PDB ID: 6LU7).La simulation d’amarrage des ligands a été maintenues flexibles tandis que le récepteur, rendue rigide.

5- Recherche des solutions d'amarrage.

La meilleure solution d'amarrage consiste à rechercher les positions et orientations les plus probables par rapport à la poche active avec la plus basse énergie en kcal.mol-1 en tenant compte les différentes modes de liaison de chaque ligand avec le récepteur (Tableau 3).

5- Analyse des résultats

Les meilleurs solutions ou poses ont ensuite été évaluées par le logiciel Discovery Studio Biovia 2021 (Dassault Systèmes, San Diego, Californie, États-Unis) et visualisées à l'aide de PyMOL par score d'amarrage, classement et distance entre l'atome réactif et l'atome de soufre de Cysl45 dans la structure d'origine comme décrit précédemment [Ai et al., J. Chem. Inf. Model. 2016, 56, 1563-1575].

Les analyses post-docking ont montré les tailles et les emplacements des sites de liaison, les interactions entre les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et les distances de liaison sous forme de rayons d'interaction de <5 Â à partir de la position du ligand ancré. Les composés ont été arrimés au site actif, ensuite, les poses de liaison de chaque ligand ont été observées et leurs interactions avec la protéine ont été caractérisées, et les conformations les plus énergétiquement favorables de chaque ligand ont été sélectionnées (figure 11)

Les propriétés physicochimiques des molécules de synthèse (tableau 4) répondaient aux critères des 5 règles de Lipinski, également connue sous le nom de règle de Lipinski de ressemblance avec le médicament. Ces règles permettent d’évaluer les similitudes structurelles des composés avec celles des médicaments oraux actifs et sont basées sur des profils physico-chimiques. Les poids moléculaires et les interactions de liaison hydrogène entre les donneurs et les accepteurs sont des déterminants structurels cruciaux des cibles protéiques et des sites de liaison aux ligands [Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2016, 101, 34-41; Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, 46, 3-26 ; Zhang et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 478-88], En particulier, les composés sont plus susceptibles d'être perméables et actifs en tant que ligands lorsqu'ils n’ont pas plus de 5 donneurs de liaisons hydrogène, et pas plus de 10 accepteurs de liaisons hydrogène, une masse moléculaire inférieure à 500 et des valeurs log P (CLog P) calculées inférieure à 5 [Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, 46, 3-26 ; Zhang et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 478-88].