本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及一种肠道病毒 71型病毒样颗粒及其 制备方法， 以及以其制备的手足口病疫苗。

背景技术

手足口病 （HFMD )是肠道病毒引起的常见传染病之一。 5岁以下婴幼儿发 病率最高。 每年 6 ~ 8月为流行季节， 传播途径主要是呼吸道和经口感染。 本病传 染性强， 传播途径广， 传播快， 流行强度大， 在短期内即可造成大流行。 肠道病 毒 71型 （enterovirus 71 , EV71 )和柯萨奇病毒 A16 ( CA16 )是本病的主要致病 原。 较 CA16而言， EV71型肠病毒则凶险得多， 90%以上的重症病例和死亡病例 都是由 EV71病毒引起。 EV71病毒可侵犯心、 脑、 肾等重要器官， 导致了严重的 并发症， 如急性弛缓性麻痹、 脑炎、 无菌性脑膜炎、 心肌炎、 肝炎、 新生儿败血 症等， 对儿童身心健康造成严重威胁。 近年来手足口病在我国持续高发， 卫生部 公布的数据显示， 2012年全国累计报告手足口病发病 219.8万余例， 死亡病例 569 例， 较 2011年的发病率和死亡率均有增长。 从近几年的情况看， 我国每年的患者 人数多、增长速度快、分布广、大部分还在不 发达地区， 给国家带来了巨大损失, 同时也影响着社会安全。 手足口病已经成为了党和政府及民众关注的焦 点。

目前全世界对手足口病的预防尚没有可用的疫 苗上巿销售，对感染的病人亦 没有有效的治疗药物。 尽管国际上有亚单位疫苗、 DNA疫苗和减毒活疫苗研究 进展方面的报道， 但都没有达到满意的动物保护效果。 某些减毒活疫苗存在毒力 回复的风险， 并且还能导致轻度的神经性临床症状， 疫苗的安全性还存在不确定 因素。 目前已知向国家药监局申报的 EV71疫苗都属于灭活疫苗， 此类疫苗某些 抗原靶位被破坏， 免疫原性较差， 使用剂量过大以及目前使用的动物模型的适用 性还存有疑议。 体外实验表明灭活 EV71全病毒疫苗对临床样品分离的许多 EV71 病毒株没有中和作用； 再者， 在幼鼠感染动物模型上没有保护作用； 并且灭活疫 苗存在灭活不完全的风险。因此，研制高效廉 价的预防性 EV71疫苗，对预防 EV71 感染的手足口病具有十分重要的意义。

病毒样颗粒 (Virus Like Particle, VLP)疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗 提供了一个新的契机。 VLP疫苗是通过分子生物学技术， 表达病毒的一个或多个 结构蛋白， 这些结构蛋白具有天然的自组装配能力， 可形成与天然病毒颗粒相似 的空间构型和抗原表位但无病毒核酸， 免疫原性强， 又没有感染性， 不存在灭活 不完全或毒力回复的风险， 并且表面有高密度的病毒抗原， 保存了构象表位， 可 通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞 ，有效诱导机体免疫系统产生免疫 保护反应。 在这一点上它还优于灭活过程中可能破坏一些 重要的抗原决定簇。 此 外， 还有一个优点是可根据其需要任意改造，使之 能更好地刺激机体产生保护性 免疫反应。

EV71属于小 RNA病毒， 病毒基因组为约 7.4kb的单链 RNA, 病毒颗粒为二十 面体立体对称的球形结构， 无包膜和突起， 直径大约 24 ~ 30nm。 病毒粒子的衣 壳由 60个亚单位组成，每个亚单位均由 4种衣壳蛋白 (VP1-VP4)拼装成有五聚体样 结构。 研究表明， EV71的四种结构蛋白在细胞内可自行组装成病� �样颗粒结构 ( Virus Like Particle, VLP ), 具有与天然病毒相似的空间结构。 目前国内外多家 研究机构都在进行 EV71病毒样颗粒疫苗的研制， EV71的组装是通过在同一细胞 中共表达 EV71的病毒蛋白酶 3CD及 P1前体蛋白， 通过 3CD蛋白酶加工处理 P1蛋 白后产生 4种结构蛋白， 在细胞内自行组装成类病毒颗粒， 该病毒颗粒不带有病 毒核酸， 无潜在致癌危险， 具有良好的安全性， 免疫特性和生物学活性， 并可以 大规模制备和纯化。 因此， VLP疫苗已成为预防性 EV71疫苗发展的主要方向。

EV71 VLP预防性疫苗研发的关键是能够大量高效的制 备 VLP样品， 目前最 常用的表达系统是原核表达系统和真核表达系 统。

原核表达系统表达的蛋白大多失去天然构象， 不能产生保护性抗体。或者表 达产物多为包涵体， 包涵体变性、 复性步骤复杂， 且蛋白损失量大， 收率低， 很 难实现大规模生产。 也见可溶性表达的例子， 但是表达量低， 纯化目的蛋白难度 大。 也有报道进行融合表达增加目的蛋白可溶性及 表达量， 纯化相对容易， 但融 合蛋白的切割需要昂贵的酶， 无法实现大规模生产。

常用的真核表达系统有哺乳动物细胞表达系统 、 昆虫杆状病毒表达系统、 酵 母表达系统。 在真核表达系统中蛋白能自发的形成 VLP, 为纯化工艺提供极大的 便利。 但是， 由于目前主要用昆虫细胞制备 VLP, 培养条件要求较高， 纯化过程 复杂， 限制了大规模的生产需求； 另外， 杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生杆状 病毒颗粒及其他明星影响疫苗效果的污染物， 杆状病毒颗粒很难与制备的 VLP分 离， 且需要进行灭活处理等措施， 因此对疫苗质量有很大的影响。 哺乳动物细胞 表达系统对于蛋白表达后的加工修饰和正确折 叠能起到作用， 但是它不易人为 控制而且花费高， 所以应用受到了限制。 多形汉逊酵母表达系统具遗传性质稳 定、 操作简单、 易于高密度培养、 外源蛋白产量高、 生产成本低、 适合于工业化 大生产等特点， 还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白 翻译后加工等优 势， 同时避免了其他酵母表达菌株不稳定、 质粒易丟失、 过度糖基化等缺点。 是 一种优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为 先进的 VLP疫苗表达系统。 发明内容

本发明的目的在于提供一种从汉逊酵母表达系 统获得的 EV71病毒样颗粒。 本发明的另一目的在于提供一种 EV71疫苗。

本发明的再一目的在于提供一种同时含有 EV71病毒 P1基因和 3CD基因的 重组表达载体。

为了提高蛋白的表达量，本发明利用汉逊酵母 偏爱密码子对所述核酸序列进 行了密码子优化。本发明提供的编码 P1及 3CD蛋白的基因其核苷酸序列为去掉 酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终 止信号的序列。 本发明编码 P1及 3CD 蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的 密码子。 汉逊酵母密码子使 用频率可参见 http://www.kazusa.or.jp/codon八 为了避免翻译出来的 mRNA的 GC 含量过高、 mRNA 的二级结构影响翻译的效率， 本发明对某些氨基酸使用次偏 爱密码， 前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非 常接近， 氨基酸序列原序 列不变， 在某些很特殊的情况下， 为了减少或增加酶切位点， 某些位置的序列做 适当的序列调整。 使用汉逊酵母密码子将肠道病毒 71型 P1及 3CD蛋白的多核 苷酸进行优化合成， 该 P1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示， 其编码基因 如序列表中 SEQ ID N0.1所示； 该 3CD蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.4所示， 其编码基因如序列表中 SEQ ID N0.3所示。

在本发明一个实施例中， 用于 PCR 扩增 P1 基因的引物序列为： F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG, R- CGGAATTCTTATTACT

GGGTCACGGCCTGTC； 用 于 PCR 扩增 3 CD 基因 引 物序列如下： F-AACC ACACCCACC ACGTGTACAGAAAC , R- ACTCGCTATTTC

AGCTTTTCATCTC。

本发明提供的重组表达载体中， EV71病毒 P1基因其核苷酸序列是如下 a) 或 b):

a)其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. l所示； 或

b ) 由 SEQ ID No.l所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸� � 得到编码 P1 蛋白的核苷酸序列。 所述 EV71病毒 3CD基因其核苷酸序列是如下 a)或 b) _:

a)其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.3所示； 或

b ) 由 SEQ ID No.3所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸� � 得到编码 P1 蛋白的核苷酸序列。

其中，上述重组表达载体含有甲醇氧化酶启动 子（Methanol oxidase , MOX ) 或甲醛脱氢酶启动子 （Formate dehydrogenase, FMD ) 。

优选地， 上述载体含有甲醇氧化酶启动子 （MOX ) 。

更进一步地， 上述重组表达载体， 其为 PMV-P1-3CD。

本发明还提供了重组表达载体 PMV-P1-3CD的制备方法， 包括以下步骤： ( 1 )蛋白基因的优化合成：使用汉逊酵母密码子� �肠道病毒 71型 P1及 3CD 蛋白的多核苷酸进行优化合成， 该 P1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示， 其编码基因如序列表中 SEQ ID N0.1所示； 该 3CD蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.4所示， 其编码基因如序列表中 SEQ ID N0.3所示；

( 2 ) 重组表达载体的构建： 用肠道病毒 EV71的 P1蛋白基因和 3CD蛋白 酶基因与 PMV质粒连接后， 得到 PMV-P1-3CD重组表达载体。

进一步， 本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细 胞。

进一步地， 所述宿主细胞为汉逊酵母（Hansenula polymorpha )细胞。 所述汉逊酵母细胞为 ATCC34438 , ATCC26012。

优选地， 所述汉逊酵母细胞为 ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞。 本发明 使用的 ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞为多型汉逊酵母 AU-0501 , 其已在中 国专利保藏编号为 CGMCC No.7013 ,已于 2012年 12月 18日在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（地址： 北京巿朝阳区大屯路， 中国科学院微生 物研究所， 简称 CGMCC , 邮编 100101 ) 保藏， 分类命名为多型汉逊酵母 ( Hansenula polymorpha ) 。

进一步， 将所述重组表达质粒转入汉逊酵母 AU-0501 细胞中， 得到 AU-PMV-P1-3CD重组表达菌株。

在本发明的一个实施例中， 将 PMV-P1-3CD重组表达质粒通过电转化汉逊 酵母宿主菌， 经过选择培养基筛选重组表达菌株； 利用重组表达菌株进行发酵培 养和甲醇诱导表达 EV71病毒样颗粒蛋白。

因此本发明提供重组表达载体在制备 EV71病毒疫苗中的应用。

本发明通过构建并培养能够表达 EV71 病毒样颗粒的汉逊酵母重组表达菌 株，成功的获得了一种易于通过发酵培养，适 合工业化生产，且易于纯化的 EV71 病毒样颗粒。 该 EV71病毒样颗粒， 其通过以下方法制备得到： （1 )将本发明的 重组表达载体转入汉逊酵母 AU-0501表达菌株， 得到 AU-PMV -P1-3CD重组表 达菌株； （2 )发酵培养该重组表达菌株， （3 )分离纯化 EV71病毒样颗粒： 离心 收集菌体进行高压均浆破碎， 澄清、超滤、沉淀病毒颗粒，超速离心收集上 清液， 上清液经离子交换层析、疏水层析或分子筛层 析，纯化后获得 EV71病毒样颗粒。

EV71病毒样颗粒的制备方法中，所述的破碎是� � AU-PMV- P1-3CD重组表 达菌株发酵得到的汉逊酵母细胞，重悬于细胞 裂解缓冲液中 (20 mmol/L NaH ₂ P0 ₄ , 2 mmol/L EDTA-Na ₂ , 0.4 mol/L NaCl, pH 7.5)洗 2次， 然后以 1 :4 ( w/v ) 的比例 悬浮于含 2 mmol/L PMSF , l% Tween-20, 3% PEG6000的细胞裂解缓冲液中， 使用高压匀浆机在压力 1100 bar的操作压力下破碎细胞 2次， 使细胞破碎率达 95%以上。

上述方法中，所述的澄清是将破碎后的细胞液 倒入离心简中，进行 8000rpm 离心 20min, 收集上清液， 以 0.45μιη膜包进行微滤以除掉大分子物质。

上述方法中，所述的超滤是将澄清后的蛋白液 以 50KD的膜包进行超滤以除 掉小分子物质。

所述的沉淀病毒颗粒是将超滤后蛋白液， 以 0.5M NaOH调 ρΗ6.5 , 加入 5Μ NaCl溶液， 搅拌条件下滴加 0.5 g/ml PEG6000溶液至终浓度 0.12 g/ml , 4°C下静 置 2 h, 4°C下 12000rpm 离心 30 min, 弃上清液， 用适当体积的 20 mmol/L PB 溶解沉淀， 于 4°C下 5000rpm再次离心 30 min, 收集第 2次离心上清液即为粗纯 蛋白液。

所述的超速离心是向粗纯蛋白液中加入固体漠 化钾调密度至 1.25g/ml。超度 离心上样顺序为： NaCl-EDTA 150ml; 1.25KBr样品液 300 ml; 1.30KBr梯度液 700ml; 1.35KBr梯度液 540ml。 8°C , 25000 rpm离心 4h, 以 1.35KBr溶液做为 顶液， 分管收集 UV280nm紫外吸收峰， 每管取样进行 SDS-PAGE检测， 检测结 果如图 10所示。

分子筛层析： 以 Sephacryl S-500HR为例， 以 PBS ( pH7.0 )进行洗脱， 收集 UV280nm紫外吸收峰即为纯化蛋白液。

纯化蛋白浓度检测（Lowry法）： 精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液（100 g/ml ) 0ml、 0.2ml、 0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 1.0ml , 分别置于试管中， 加蒸馏水 补至 1ml , 同时量取 4倍稀释纯化蛋白液 1ml于试管中， 分别加 5ml碱性铜液， 0.5ml酚试剂， 于比色杯中用 650nm波长测定吸光度值。 以标准蛋白的蛋白含量 做为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线， 本发明的一个实施例中 Lowry 法检测结果获得纯化蛋白终浓度为 207μ _§ /ιη1。

本发明还提供一种手足口病疫苗， 含有本发明的 EV71病毒样颗粒。

一种制备手足口病疫苗的方法， 将本发明的 EV71病毒样颗粒用磷酸铝佐剂 吸附后制备成含 20μ _§ /ιη1病毒样颗粒的疫苗。

具体地， 本发明提供一种手足口病疫苗的制备方法， 包括： （1 )蛋白基因的 优化合成：使用汉逊酵母密码子将肠道病毒 71型 P1及 3CD蛋白的多核苷酸进行 优化合成，该 P1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示，其编码基因如序列表中 SEQ ID N0.1所示； 该 3CD蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.4所示， 其编码基因 如序列表中 SEQ ID N0.3所示； （2 ) 重组表达质粒的构建： 用肠道病毒 EV71的 P1蛋白基因和 3CD蛋白酶基因与 PMV质粒连接后构建 PMV-P1-3CD重组表达质 粒； （3 ) 重组表达质粒转入表达菌株： 所述重组表达质粒转入汉逊酵母 AU-0501 表达菌株， 得到 AU-PMV-P1-3CD重组表达菌株； （4 ) 重组表达菌株发酵培养及 EV71病毒样颗粒的纯化： 30L发酵罐培养上述表达菌株， 离心收集菌体进行高压 均浆破碎， 离心收集上清液， 所述上清液经微滤、 超滤、 PEG沉淀、 超速离心、 分子筛层析等纯化后获得 EV71病毒样颗粒； （5 )制备疫苗： 所述 EV71病毒样颗 粒用磷酸铝佐剂吸附后制备成含 20 _μ§ /ιη1病毒样颗粒的疫苗。

本发明的有益效果在于：

(一）易于获得高效表达菌株： 本发明将 EV71的 P1及 3CD蛋白基因序列 进行了优化设计， 并且提供了高效表达 EV71病毒样颗粒的重组表达载体， 通过 汉逊酵母表达系统实现了病毒样颗粒（VLP _S ) 的高效表达。

(二）适于工业化生产： 本发明筛选的汉逊酵母重组表达菌株具有原核 细胞 生长快、 遗传操作简单、 易于培养、 生产成本低， 能进行高密度发酵培养， 且外 源蛋白产量高， 适合于工业化大生产等特点。

(三）稳定性好： 所述重组表达质粒能与酵母宿主细胞的染色体 基因组 DNA 发生同源重组， 质粒稳定性好， 不易丟失； 所述发酵表达产物贮存于过氧化物酶 体中， 使其免受蛋白酶的降解。

(四）本发明的 EV71病毒样颗粒适于制备疫苗： 本发明所述蛋白质在汉逊 酵母体内能够正确进行加工修饰和折叠， 无过度糖基化现象。发酵表达产物经过 纯化后， 经电镜观察纯化样品呈现病毒样颗粒， 颗粒直径在 30nm左右， 颗粒完 整、 规则。 本发明提供 EV71病毒样颗粒不带有病毒核酸， 无潜在致癌危险， 具 有良好的安全性， 免疫特性和生物学活性， 并可以大规模制备和纯化， 能够用于 制备 VLP疫苗， 具有较好的经济价值和应用前景。 附图说明

图 1 为 PCR鉴定重组表达质粒 PMV-P1及重组表达质粒 PMV-3CD大肠杆 菌转化克隆检测结果： 其中， 图 la中 1-12为 PCR鉴定 P1基因 （lOOObp )检测 结果； 图 lb中 13-24为 PCR鉴定 3CD基因（630bp )检测结果；其中 M: DL2000 (宝生物工程有限公司）。

图 2 为提取的重组表达质粒 PMV-P1和 PMV-3CD检测结果： 其中， 1-2为 重组表达质粒 PMV-P1 ; 3-8为重组表达质粒 PMV-3CD; M: DL 10000 Plus (北 京全式金生物技术有限公司）。

图 3 为重组表达质粒 PMV-P1和 PMV-3CD进行 ΛζΖΙ Λζα!双酶切鉴定结果： 其中 1为质粒 PMV-P1对照， 2为质粒 PMV-P1双酶切 （两条带大小为： 4.4kb、 3.9kb ); 3为质粒 PMV-3CD双酶切（两条带大小为： 3.8kb、 3.9kb ); M: DL 10000 Plus (北京全式金生物技术有限公司）。

图 4 为 PCR鉴定重组表达质粒 PMV-P1-3CD大肠杆菌转化克隆检测结果： 其中，图 4a中 1-12为 P1基因 PCR鉴定检测结果（大小： lOOObp );图 4b中 13-24 为 3CD基因 PCR鉴定检测结果（大小： 630bp )； M: DL2000 (宝生物工程有 限公司）。

图 5 为提取的重组表达质粒 PMV-P1-3CD检测结果： 其中， 1-3为重组表达 质粒 PMV-P1-3CD; 4为作为对照的重组表达质粒 PMV-P1 ; M: DL 10000 Plus (北京全式金生物技术有限公司）。

图 6 为重组表达质粒 PMV-P1-3CD双酶切 （Sacl、 Sail ) 电泳检测结果： 1 为作为对照的重组表达质粒 PMV-P1双酶切； 2为重组表达质粒 PMV-P1-3CD对 照； 3-5为重组表达质粒 PMV-P1-3CD双酶切； 其中 M: DL 10000 Plus (北京全 式金生物技术有限公司）。

图 7 为汉逊酵母表达的 EV71菌株（ PMV-P1-3CD质粒转化菌）经小瓶甲醇 诱导表达 72h后的蛋白 SDS-PAGE检定结果： 1为原核表达阳性对照菌株； 2为 不带外源基因的宿主细胞蛋白 （阴性对照）； 3-14为菌株诱导样品； M为低分子 量蛋白标准 （北京全式金公司）。

图 8 为汉逊酵母表达的 EV71菌株（ PMV-P1-3CD质粒转化菌）经小瓶甲醇 诱导表达 72h后的蛋白 WB检定结果： 1为原核表达阳性对照菌株； 2为不带外 源基因的宿主细胞蛋白 （阴性对照）； 3-14为菌株诱导样品； M为低分子量蛋白 标准 （北京全式金公司）。

图 9 为汉逊酵母表达的 EV71菌株在不同发酵时间 （44、 48、 52、 56、 60、 64、 68、 72、 76、 80、 84、 88、 92、 96小时）样品的蛋白质免疫印迹（ Western blot ) 检测结果， M为低分子量蛋白标准 （北京全式金公司）。

图 10 为超速离心分管收集样品 SDS-PAGE检测结果： 1为阴性对照； 1-14 为超速离心分管收集的样品； M为低分子量蛋白标准 （北京全式金公司）。

图 11 为纯化的 EV71病毒样颗粒透射电镜照片 （放大倍数： 97000 )。

图 12 为重组表达载体构建示意图， 其中图 12a为 PMV-P1表达载体构建示 意图， 图 12b为 PMV-3CD表达载体构建示意图。

图 13 为重组表达载体 PMV-P1-3CD构建示意图。 具体实施方式

以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件， 如 Sambrook等分子克隆实验手册（ Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001 ), 或按照制造厂商说明 书建议的条件。 实施例 1 编码 EV71的 P1及 3CD蛋白的基因序列优化

根据我国流行的肠道病毒 71型的 C4a亚型毒株的 P1及 3CD蛋白的核苷酸 序列，使用 vector软件对 P1及 3CD基因序列按照汉逊酵母最偏爱密码子进行优 化设计， 以提高其在汉逊酵母细胞中的表达量。 本发明提供的编码 P1及 3CD蛋 白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽 的序列或被酵母识别的转录终止 信号的序列。本发明编码 P1及 3CD蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱 的 密码子。 汉逊酵母 （ Pichia angusta ) 密码子使用 频率可参见 http：〃 www.kazusa.or.jp/codon/。 为了避免翻译出来的 mRNA 的 GC含量过高、 mRNA 的二级结构影响翻译的效率， 本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码， 前 提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常 接近， 氨基酸序列原序列不变， 在 某些很特殊的情况下， 为了减少或增加酶切位点， 某些位置的序列做适当的序列 调整。 由此， 本发明优化设计了 P1基因， 其序列如 SEQ ID N0.1所示， 该基因 序列由上海捷瑞公司合成并克隆在 Dev-C载体（购自上海捷瑞公司） 上， P1 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示； 本发明优化设计了 3CD基因， 其序列 如 SEQIDN0.3所示， 该基因 3CD序列由上海捷瑞公司合成并克隆在 Dev-C载 体（购自上海捷瑞公司） 上。 3CD蛋白的氨基酸序列如 SEQIDN0.4所示。 实施例 1 重组表达载体 PMV-P1-3CD的构建

1、 表达载体 PMV-05的构建过程：

本发明的表达载体 PMV-05 由 6 部分组成： 启动子 （MOX-P)、 终止子

( MOX-T )、 复制子 HARS、 ura3基因、 ColEl复制子、 Amp抗性基因。

以酵母基因组 DNA为模板， 分别以引物 MOXP-F (序列见 SEQ ID N0.5 )、 MOXP-R (见 SEQ ID N0.6 ); MOXT-F (见 SEQ ID NO.7 )、 MOXT-R (见 SEQ ID NO.8 ); HARS-F (见 SEQ ID NO.9 )、 HARS-R (见 SEQ ID NO.10 ); Ura3-F (见 SEQ ID NO.11 )、 Ura3-R (见 SEQ ID NO.12 )进行 PCR扩增 , 调取基因 MOXP、 MOXT、 HARS、 Ura3。 以 PBR-SK质粒（购自宝生物工程大连有限公司， 货号： D3050 )为模板， 以引物 Amp+ColEl-F (见 SEQ IDN0.13 )、 Amp+ColEl-R (见 SEQ ID NO.14 )进行 PCR扩增，调取基因 Amp+ColEl。 PCR反应体系如下： PCR 缓冲液 ΙΟμΙ, dNTP ΙΟμΙ, 引物 F l l, 引物 Ι ΙμΙ, DNA聚合酶 Ιμΐ, 蒸馏水 157μ1总体积 200μ1。 反应条件: 95°C 2min ； 95°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min; 反 应 30个循环。 将 PCR扩增的 DNA片段以 1%琼脂糖电泳进行检测， PCR产物 大小分别约为 MOXP: 1500bp左右、 MOXT: 300bp左右、 HARS: 500bp左右、 Ura3: HOObp左右、 Amp+ColEl: 2200bp左右。 将以上 5个基因片段用 DNA 片段纯化试剂盒进行纯化。 分别取纯化好的 MOXP、 MOXT基因片段各 Ιμΐ作 为模板， 以引物 MOXP-F和 MOXT-R进行 PCR扩增获得 ΜΟΧΡ+ΜΟΧΤ基因片 段， 反应体系及反应条件同上。 分别取纯化好的 HARS、 Ura3、 Amp+ColEl基 因片段各 Ιμΐ作为模板， 以引物 HARS-R和 Amp+ColEl-R进行 PCR扩增获得 HARS+Ura3+ Amp+ColEl基因片段， PCR反应体系如下： PCR缓冲液 ΙΟμΙ , dNTP ΙΟμΙ, 引物 Fl l, 引物 Ι ΙμΙ, DNA聚合酶 Ιμΐ, 蒸馏水 155μ1, 总体积 200μ1。 反应条件: 95°C 2min; 95V 30s, 55 °C 30s, 72V 4min; 反应 30个循环。 将基因 片段 MOXP+MOXT、 HARS+Ura3+Amp+ColEl用 DNA片段纯化试剂盒进行纯 化。 将纯化好的基因片段 MOXP+MOXT、 HARS+Ura3+Amp+ColEl 分别进行

( Sad. ·¾ΖΙ)双酶切，酶切反应如下：基因片段 60μ1, Sad. ·¾ΖΙ各 3μ1, lOxBasal 缓冲液 ΙΟμΙ, lOxBSA ΙΟμΙ, 加水至 ΙΟΟμΙ, 于 37°C进行酶切过夜。 将酶切产物 经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基 因片段，通过溶液 I连接试剂盒（购 自宝生物工程（大连）有限公司）进行连接。 连接反应体系如下： HARS+Ura3+ Amp+ColEl ( Sad. Sail)双酶切纯化产物 Ιμΐ, ΜΟΧΡ+ΜΟΧΤ ( Sad. Sail)双 酶切纯化产物 4μ1, 溶液 I 5μ1共计 ΙΟμΙ反应体系， 于 16°C连接 1小时。 将连接 后的重组表达载体转化到 ΙΟΟμΙ大肠杆菌 （DH5a) 感受态细胞中， 涂 LB+Amp ( lOO g/ml ) 固体培养基 37°C培养箱过夜培养。

转化克隆筛选： 挑取 LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板， 分别以 引物 MOXP-F、 MOXP-R, Ura3-F、 Ura3-R进行 PCR鉴定转化克隆， PCR反应体 系如下： PCR缓冲液 2μ1, dNTP 2μ1, 引物 F O.l l, 引物 Ι Ο.ΙμΙ, DNA聚合 酶 Ο.ΐμΐ, 蒸馏水 15.7μ1, 总体积 20μ1。 反应条件: 95°C 2min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°Clmin;反应 30个循环。将 PCR扩增的 DNA片段以 1%琼脂糖电泳进行检测， 以 MOXP-F、 MOXP-R为引物的 PCR产物大小应约为 1500bp左右， 以 Ura3-F、 Ura3-R为引物的 PCR产物大小应约为 lOOObp左右。将 PCR鉴定正确的 5号转化 克隆命名为： 重组表达载体 PMV-05 , 并将其接种到 10ml LB+Amp液体培养基于 37°C摇床 200rpm过夜培养。 按照质粒提取试剂盒（来源： 北京全式金生物技术有 限公司）说明书进行重组表达载体 PMV-05 的提取， 将提取的重组表达载体进行 1%琼脂糖电泳进行检测。将所获得的表达载体� ��行酶切鉴定，酶切反应体积如下： 质粒 5μ1, Sad. ·¾ 各 Ιμΐ, lOxBasal缓冲液 2μ1, 10χΒ8Α2μ1, 加水至 20μ1, 于 37°C进行酶切 4小时， 结果显示成功构建重组表达载体 PMV-05。

2、 重组表达载体 PMV-P1及 PMV-3CD的构建：

将实施例 1优化合成的基因 P1及 3CD克隆在 Dev-C载体上,基因序列在优 化设计时两端均加入了 Ed fiamffl酶切位点以便克隆入表达载体。

分别将已克隆入 Pl、 3CD基因的 Dev-C载体与表达载体 ( PMV-05 )进行 EcoRl、 BamHl (均购自宝生物工程（大连）有限公司）双酶� �， 反应体系如下： 质粒 30μ1, EcoRl, B纖 HI各 3μΙ, ΙΟ Κ 缓冲液 ΙΟμΙ, 加水至 ΙΟΟμΙ, 于 37°C进 行酶切过夜。 将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后， 切胶回收基因片段与线性 表达载体， 通过溶液 I连接试剂盒（购自宝生物工程（大连）有限� �司）进行连 接。 连接反应体系如下： 载体 PMV-05 (EcoRI/fiamHI)双酶切纯化产物 Ιμΐ, Pl、 3CD基因（ EcoRI/fiizmHI )双酶切纯化产物各 5μ1,溶液 I 6μ1共计 12μ1反应体系， 于 16°C连接 1小时。 将连接后的重组表达载体转化到 ΙΟΟμΙ大肠杆菌 （DH5a) 感受态细胞中， 涂 LB+Amp ( lOO g/ml ) 固体培养基 37°C培养箱过夜培养。

转化克隆筛选： 挑取 LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板， 进行 PCR 鉴 定 转 化 克 隆 。 PI 基 因 引 物 序 列 如 下 ： 引 物 F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG, 引物 R- CGGAATTCTTATT

ACTGGGTCACGGCCTGTC; 3 CD基因引物序歹如下： 引物 F-AACC

AC ACCC ACC ACGTGTAC AGAAAC , 引物 R- ACTCGCTATTTC AG

CTTTTCATCTC。 PCR反应体系如下： PCR缓冲液 2μ1, άΝΤΡ2μ1, 引物 FO.l l, 引物 Ι Ο.ΙμΙ, Tag DNA聚合酶 Ο.ΐμΐ,蒸馏水 15.7μ1,总体积 20μ1。反应条件: 95°C 2min ； 95V 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin; 反应 30个循环。 将 PCR扩增的 DNA 片段以 1%琼脂糖电泳进行检测， P1基因 PCR产物大小约为 1000 bp左右， 3CD 基因 PCR产物大小约为 630 bp左右， PCR电泳结果见图 la、 图 lb。 将 PCR鉴 定正确的转化克隆命名为： 重组表达质粒 PMV-P1及重组表达质粒 PMV-3CD, 重组表达载体构建示意图如图 12a、 图 12b所示。 将鉴定正确的克隆接种到 10ml LB+Amp液体培养基中于 37°C摇床 200rpm过夜培养。 按照质粒提取试剂盒（来 源： 北京全式金生物技术有限公司） 说明书进行重组表达质粒 PMV-P1 和 PMV-3CD的提取，将提取的重组表达载体进行 1%琼脂糖电泳进行检测，检测结 果见图 2。将所获得的重组表达载体进行酶切鉴定，� �切反应体积如下：质粒 5μ1, Sail, feci各 Ιμΐ, ΙΟ Κ 缓冲液 2μ1, 加水至 20μ1, 于 37°C进行酶切 4小时， 酶 切结果电泳检测见图 3。

3、 重组表达载体 PMV-P1-3CD的构建：

将重组表达载体 PMV-P1以 Sizcl Xhol (均购自宝生物工程（大连）有限公 司）双酶切， 重组表达载体 PMV-3CD以 ·¾ί 、 Sail (均购自宝生物工程（大连） 有限公司）双酶切， 酶切反应体积如下： 质粒 50μ1, Sfl/I/XhoL feci各 5μ1, ΙΟχΚ 缓冲液 ΙΟμΙ, 加水至 ΙΟΟμΙ, 于 37°C进行酶切过夜。 将酶切产物经过琼脂糖凝胶 电泳分离后， 切胶回收 3CD基因片段与 PMV-P1线性载体片段， 通过溶液 I连 接试剂盒（购自宝生物工程 （大连）有限公司）进行连接。 连接反应体系如下： 载体 PMV-P1 ( SacVXhol )双酶切纯化产物 Ιμΐ, 3CD基因 (SacVSalO双酶切纯 化产物各 5μ1, 溶液 I 6μ1共计 12μ1反应体系， 于 16°C连接 1小时。 将连接后的 重组表达载体转化到 ΙΟΟμΙ 大肠杆菌 （DH5a) 感受态细胞中， 涂 LB+Amp ( lOO g/ml ) 固体培养基 37°C培养箱过夜培养。

转化克隆筛选：挑取 LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板,进� � PCR 鉴 定 转 化 克 隆 。 P1 基 因 引 物 序 列 如 下 ： 引 物 F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG ， 引 物 R- CGGAATTCTTATTACTGGGTC ACGGCCTGTC； 3 CD 基因引物序歹 'J如下： 引物 F-AACCACACCCACCACGTGTACAGAAAC , 引 物 R-

ACTCGCTATTTCAGCTTTTCATCTC。 PCR反应体系如下： PCR缓冲液 2μ1 , dNTP 2μ1 , 引物 F O. l l, 引物 Ι Ο. ΙμΙ, DNA聚合酶 Ο. ΐμΐ , 蒸馏水 15.7μ1, 总体积 20μ1。 反应条件: 95°C 2min; 95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin; 反应 30个循环。 将 PCR扩增的 DNA片段以 1%琼脂糖电泳进行检测， PI基因 PCR产物大小约为 1000 bp左右， 3CD基因 PCR产物大小约为 630 bp左右， PCR电泳结果见图 4a、图 4b。 将 PCR鉴定正确的转化克隆命名为： 重组表达载体 PMV-P1-3CD, 重组表达载体 构建示意图如图 13所示。 将鉴定正确的克隆接种到 10ml LB+Amp液体培养基中 于 37°C摇床 200rpm过夜培养。 按照质粒提取试剂盒（来源： 北京全式金生物技 术有限公司）说明书进行重组表达质粒 PMV-P1-3CD的提取， 将提取的重组表达 载体进行 1%琼脂糖电泳进行检测， 检测结果见图 5。 将所获得的重组表达载体进 行酶切鉴定，酶切反应体积如下：质粒 5μ1 ,酶 Sall、 Sad各 Ιμΐ , ΙΟ Κ 缓冲液 2μ1 , 加水至 20μ1 , 于 37°C进行酶切 4小时， 酶切结果电泳检测见图 6。

实施例 3 汉逊酵母表达的 EV71菌株的诱导表达及检测

将重组表达载体 PMV-P1-3CD通过电穿孔转化到汉逊酵母 ATCC26012尿嘧 啶缺陷型宿主细胞 AU-0501中 （野生型宿主菌来自 ATCC26012, 通过基因敲除 方法获得 ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞）,其保藏编号� � CGMCC No.7013。

通过选择培养基及 PCR法对转化克隆进行筛选和鉴定，将鉴定都含 有 P1和 3CD基因的转化克隆经过选择培养基进行稳定化 传代培养， 从而获得 P1蛋白和 3 CD 蛋白共表达菌株 AU-PMV-P1-3CD。 将表达菌株接种在选择培养基 MDL ( 0.67%酵母氮源培养基，购自 SIGMA公司，规格： Y1251-KG,批号： 030M1754 ), 0.5%硫酸铵， 2%葡萄糖）中， 33 °C摇床培养 20小时， 5000rpm离心 6min, 收集 沉淀， 加入诱导培养基 MM ( 0.67%酵母氮源培养基， 0.5%硫酸铵， 1%甲醇）中， 每天补加 1%甲醇， 诱导表达 3天。

SDS-PAGE凝胶电泳分析： 取诱导后样品 ΙΟΟμΙ离心， 收集沉淀， 用无菌水 清洗， 进行 NaOH处理 3min, 离心弃上清， 沉淀以 ΙΟΟμΙ SDS样品缓冲液重悬， 煮沸 lOmin, 离心， 取上清 ΙΟμΙ上样电泳， 电泳完毕取下凝胶进行银染， 凝胶成 像系统软件扫描分析目的蛋白表达量。

SDS-PAGE检测结果显示 （见图 7 ): 重组菌株表达的蛋白分子量在 32.7KD 左右， 分子量大小与预期的目的蛋白大小一致。 Western-blot检测： 用抗 EV71-VP1抗体（京天成生物技术 （北京）有限公 司， 22A12 )作为一抗， 使用 HRP-羊抗鼠 -IgG (北京博奥森公司 ) 作为二抗， DAB显色。

Westem-blot结果显示 （见图 8 ): 表达产物能与单克隆抗体特异性结合， 并 在 32.7KD处有较为明显的反应条带， 与 SDS-PAGE结果一致， 说明该表达产物 具有良好的免疫反应性。 实施例 4 重组 EV71酵母表达菌株在 30L发酵罐中发酵培养

将重组的汉逊酵母菌株接种到 150ml—级种子培养基（0.67%酵母氮源培养 基（购自 SIGMA公司, 规格 Y1251-KG, 批号： 030M1754 ), 0.5%硫酸铵, 2% 葡萄糖） 中， 在 33 °C , 200rpm摇床振荡培养 20小时。 然后全量接种于 1500ml 二级种子培养基（0.67%酵母氮源培养基， 0.5%硫酸铵， 2%甘油） 中， 在 33 °C , 200rpm摇床振荡培养 20小时（ 00 _6()()111 „达 8-10 )。之后全量接种至 30L发酵罐中， 其中装有 15L发酵培养基（甘油、 磷酸二氢铵、 氯化钾、 氯化钙、 氯化纳、 硫酸 镁、 乙二胺四乙酸纳， 其质量比为 140:70:20: 15:2:1 ), 补充氨水调节发酵液 pH 值维持在 5.0,发酵温度为 30°C ,转速控制在 350-750 rpm,空气流速 0.5-1.0 m ³ /h, 高密度发酵需要纯氧补充， 溶氧控制在 20-60%, 20 h时发酵培养基中碳源耗尽， 补加甘油共计 2.0L, 分 5次补加 0.40 L/次， 每次碳源耗尽， 溶氧上升时加甘油， 菌体生长共计 36h左右， 湿菌重最高可达 0.3-0.4g/ml左右； 去阻遏阶段： 转速 750rpm, 空气流速 l.OmVh,溶氧控制在 20-60%,加入 1L甘油和甲醇混合液（甘 油 400ml, 甲醇 600ml )进行去阻遏培养, 36-54h (共计 16-18h ) 之间； 诱导阶 段： 54-94h( 36-40h )之间进行甲醇诱导，溶氧维持在 40%左右。发酵结束： 92-94h 时， 待甲醇消耗完全， 溶氧上升至 80%以上， 降温至 20°C开始下罐发酵结束， 湿菌重维持在 0.3-0.4g/ml。

汉逊酵母表达的 EV71病毒样颗粒的鉴定： 取上述不同发酵时间 （44、 48、 52、 56、 60、 64、 68、 72、 76、 80、 84、 88、 92、 96 小时） 的样品进行蛋白质 免疫印迹（Western blot )检测，用抗 EV71-VP1单克隆抗体（京天成生物技术（北 京）有限公司， 22A12 ) 作为一抗， 使用 HRP-羊抗鼠 -IgG (北京博奥森公司） 作为二抗， DAB显色， 结果如图 9所示。

Western-blot结果显示： 表达产物能与单克隆抗体特异性结合， 并在 32.7KD 处有较为明显的反应条带， 说明该表达产物具有良好的免疫反应性。

重组 EV71病毒样颗粒发酵表达量测定： 将破碎后离心收集的上清液进行 10 倍系列梯度稀释， 以原核表达的 EV71-VP1纯化产物做为标准品， 用 EV71抗原 ELISA检测试剂盒（京天成生物 技术（北京）有限公司， 该试剂盒主要检测 EV71-VP1蛋白， Lot#100408 )进行 重组 EV71病毒样颗粒表达量测定， 测定结果如表 1所示。

表 1 发酵破碎液抗原含量 （ELISA法）检测结果

ELISA 测定结果显示： 发酵细胞破碎液中 EV71 病毒样颗粒的表达量为 360mg/L。 汉逊酵母细胞表达的 EV71具有较高的表达量。 实施例 5 EV71病毒样颗粒的分离纯化

破碎： 将实施例 4发酵得到的汉逊酵母细胞， 重悬于细胞裂解缓冲液中 (20 mmol/L NaH ₂ P0 ₄ , 2 mmol/L EDTA-Na ₂ , 0.4 mol/L NaCl, pH 7.5)洗 2次， 然后以 1 :4 ( w/v )的比例悬浮于含 2 mmol/L PMSF , 1% Tween-20 , 3% PEG6000的细胞 裂解缓冲液中， 使用高压匀浆机在压力 1100 bar的条件下破碎细胞 2次， 使细胞 破碎率达 95%以上。

澄清： 将破碎后的细胞液倒入离心简中， 进行 8000rpm离心 20min, 收集上 清液， 以 0.45μιη膜包进行微滤以除掉大分子物质。

超滤： 将澄清后的蛋白液以 50KD的膜包进行超滤以除掉小分子物质。 沉淀病毒颗粒： 将超滤后蛋白液， 以 0.5M NaOH调 ρΗ 6.5 , 加入 5M NaCl 溶液，搅拌条件下滴加 0.5 g/ml PEG6000溶液至终浓度 0.12 g/ml , 4°C下静置 2 h, 4°C下 12000rpm 离心 30 min,弃上清液，用适当体积的 20 mmol/L PB溶解沉淀， 于 4°C下 5000rpm再次离心 30 min, 收集第 2次离心上清液即为粗纯蛋白液。

超速离心： 向粗纯蛋白液中加入固体漠化钾调密度至 1.25g/ml。 超度离心上 样顺序为： NaCl-EDTA 150 ml; 1.25KBr样品液 300 ml; 1.30KBr梯度液 700ml; 1.35KBr梯度液 540ml。 8°C , 25000 rpm离心 4h, 以 1.35KBr溶液做为顶液， 分 管收集 UV280nm紫外吸收峰， 每管取样进行 SDS-PAGE检测， 检测结果如图 10所示。 分子筛层析： 以 Sephacryl S-500HR为例， 以 PBS ( pH7.0 )进行洗脱， 收集 UV280nm紫外吸收峰即为纯化蛋白液。

纯化蛋白浓度检测（Lowry法）： 精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液（100 g/ml ) 0ml、 0.2ml、 0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 1.0ml, 分别置于试管中， 加蒸馏水 补至 1ml, 同时量取 4倍稀释纯化蛋白液 1ml于试管中， 分别加 5ml碱性铜液， 0.5ml酚试剂， 于比色杯中用 650nm波长测定吸光度值。 以标准蛋白的蛋白含量 做为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线， 计算待检纯化蛋白液的浓度。 检 测结果如表 2所示。

表 2 纯化蛋白浓度 （Lowry法）检测结果

Lowry法检测结果获得纯化蛋白终浓度为 207μ _§ /ιη1。

纯化产物电镜分析： 取经纯化的 EV71蛋白液 lOul滴加于铜网上，避光保存 5min, 除净多余液体， 用 1%磷钨酸染色 2min, 通过透射电镜 （ TEM )对 EV71 VLPs进行分析。 结果表明 EV71蛋白呈现病毒样颗粒， 具有天然病毒的正二十 面体结构， 病毒颗粒直径在 30nm左右， 颗粒完整规则 （如图 11所示， 放大倍 数： 97000 )。 实施例 6 磷酸铝原位吸附法制备 EV71病毒样颗粒疫苗

主要指标控制： 抗原 （EV71病毒样颗粒）含量为 20μ _§ /ιη1; 铝含量控制在 0.45-0.60 mg/ml; pH值控制在 5.8-6.0。

制备方法： 将除菌过滤后的氯化纳溶液、 A1C1 ₃ 溶液、 EV71病毒样颗粒依次 加入无菌无热源的反应器中， 用磁力搅拌器进行搅拌，搅拌均匀后再以适当 恒定 速度流加 NaOH和磷酸盐混合液开始进行原位吸附反应， 同时调整 pH值。 流加速 度不宜过快， 控制在 2-5ml/min, 使吸附反应能在相对恒定的 pH值下进行。 当 pH5.8-6.0时， 停加 NaOH和磷酸盐混合液。 搅拌 30分钟， 取样测 pH值， 吸附反应 结束， 疫苗制备完成。 制备疫苗检测标准及检测结果如表 3所示。 磷酸铝原位吸附法制备 EV71病毒样颗粒疫苗的检测结果

表 3结果显示： 磷酸铝原位吸附法制备的 EV71病毒样颗粒疫苗检测指标均符 合检测标准。 实施例 7 EV71病毒样颗粒制备疫苗的免疫原性（ED _5Q )试验

疫苗样品： 实施例 6制备的含有磷酸铝佐剂的 EV71病毒液颗粒疫苗。 实验动物： 挑选 18-22g的 SPF级 BALB/c小鼠 60只， 购自北京维通利华 实验动物技术有限公司。

免疫程序： 将制备疫苗连续倍比稀释成 0.5、 0.25、 0.125、 0.0625、

0.03125μ _§ /ιη1, 每个稀释度注射小鼠 10只， 每只腹腔注射 1ml, 免疫 30天后眼 球釆血。 将釆集的血液置 37°C放置 2 h, 4000 g离心 lOmin, 吸取上清作为待检 抗血清。

间接 ELISA 法检测抗血清： 用包被液稀释实施例 5 纯化抗原液至浓度为 l g/ml各 ΙΟΟμΙ加样于 96孔酶标凹孔内， 4°C包被过夜。 除净包被液， 加满洗涤 液 PBST洗涤酶标板。 用封闭液 （ 1% BSA的 PBST液）加满酶标板 37°C孵育 1 小时。 除净封闭液每孔加入 ΙΟΟμΙ待检抗血清， 37°C孵育 1小时。 除净血清液， 加满洗涤液 PBST洗涤酶标板 3次。 每孔加入 ΙΟΟμΙ HRP标记的羊抗小鼠 IgG ( 1 :4000稀释） 37°C孵育 1小时。 除净酶标液， 加满洗涤液 PBST洗涤酶标板 3 次。每孔加入 ΙΟΟμΙ ΤΜΒ显色液，37°C避光作用 15分钟。每孔加入 50μ1 2M H ₂ S0 ₄ 终止。 用酶标仪测定 OD _45Qnm 值。

抗血清间接 ELISA法检测结果如表 4所示。

抗血清间接 ELISA法检测结果

3 2.144 0.783 0.107 0.729 0.092

4 2.902 2.192 1.448 1.051 0.101

5 2.650 0.372 0.205 0.103 0.822

6 1.815 1.545 1.338 0.301 1.038

7 1.633 2.232 2.051 2.009 0.058

8 2.589 1.351 0.793 1.473 0.078

9 1.988 1.628 0.098 0.098 0.109

10 1.902 2.749 0.229 0.672 0.991

阳性率 100% 100% 80% 70% 30% 根据检测结果， 抗体阳转率如表 5所示。

表 5 抗体阳转率计算结果

根据 Reed-Muench法计算： ED _5Q =0.049( g)

由小鼠 ED ₅₍₎ 实验结果可见： 本发明制备的 EV71病毒样颗粒疫苗仅 0.049μ _§ 免疫小鼠后就能使抗体阳转率达到 50%, 因此本发明的 EV71病毒样颗粒具有较 强的免疫原性。 实施例 8 EV71病毒样颗粒制备疫苗的异常毒性试验

疫苗样品： 实施例 6制备的含有磷酸铝佐剂的 EV71病毒液颗粒疫苗。 实验动物： 18-22g的 SPF级 BALB/c小鼠 5只， 250-350g的 SPF级 Hartley 豚鼠 2只， 均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法：注射前称量每只实验动物体重，小 鼠为 18-22g,豚鼠为 250-350g。 疫苗注射 5只小鼠和 2只豚鼠，小鼠腹腔注射 0.5ml/只，豚鼠腹腔注射 5.0ml/只， 观察 7天。 同时设同批动物空白对照。 合格标准： 观察期内空白对照和实验组动 物健存， 无异常反应， 到期每只动物体重增加。 动物试验情况如表 6所示。 动物实验情况

结论： 观察期内空白对照和实验组动物健存， 无异常反应， 第 8天每只动物 体重均增加。证明 EV71病毒样颗粒制备疫苗无异常毒性，试验动� �安全性较好。

虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本 发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术 人员而言是显 而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改 或改进， 均属于 本发明要求保护的范围。

工业实用性

本发明提供一种 EV71病毒样颗粒及其制备方法与应用。通过将 EV71病毒 的 P1蛋白基因和 3CD蛋白酶基因与 PMV质粒连接后构建 PMV-P1-3CD重组表 达质粒， 然后转入汉逊酵母 AU-0501表达菌株， 得到 AU-PMV-P1-3CD重组表 达菌株； 将重组表达菌株发酵培养和甲醇诱导表达 EV71病毒样颗粒蛋白， 离心 收集菌体进行高压均浆破碎， 上清液经离子交换层析、 疏水层析、 分子筛层析等 纯化后获得。本发明提供的 EV71病毒样颗粒疫苗具有良好的免疫原性、安� �性、 免疫特性和生物学活性， 并可以大规模制备和纯化， 可用于制备预防 EV71感染 的疫苗， 具有较好的经济价值和应用前景。 序列表

< 110> 北京民海生物科技有限公司

< 120> 一种 EV71病毒样颗粒及其制备方法与应用

< 130> KHP143111204

< 160> 18

< 170> Patentln vers ion 3. 5

<210> 1

<211> 2592

<212> DNA

<213> P1

<400> 1

atgggttctc aggtgtctac ccagagatcc ggttctcacg agaactctaa ctctgccacc 60 gagggttcta ccatcaacta caccaccatc aactactaca aggactctta cgccgccacc 120 gccggtaagc agtctctgaa gcaggaccca gacaagttcg ccaacccagt gaaggacatc 180 ttcaccgaga tggccgcccc actgaagtct ccatctgccg aggcctgcgg ttactctgac 240 agagtggccc agctgaccat cggtaactct accatcacca cccaggaggc cgccaacatc 300 atcgtgggtt acggtgagtg gccatcttac tgctctgact ctgacgccac cgccgtggac 360 aagccaacca gaccagacgt gtctgtgaac agattctaca ccctggacac caagctgtgg 420 gagaagtctt ctaagggttg gtactggaag ttcccagacg tgctgaccga gaccggtgtg 480 ttcggtcaga acgcccagtt ccactacctg tacagatccg gtttctgcat ccacgtgcag 540 tgcaacgcct ctaagttcca ccagggtgcc ctgctggtgg ccgtgctgcc agagtacgtg 600 atcggtaccg tggccggtgg taccggtacc gaggacaccc acccaccata caagcagacc 660 cagccaggtg ccgacggttt cgagctgcag cacccatacg tgctggacgc cggtatccca 720 atctctcagc tgaccgtgtg cccacaccag tggatcaacc tgagaaccaa caactgcgcc 780 accatcatcg tgccatacat caacgccctg ccattcgact ctgccctgaa ccactgcaac 840 ttcggtctgc tggtggtgcc aatctctcca ctggactacg accagggtgc caccccagtg 900 atcccaatca ccatcaccct ggccccaatg tgctctgagt tcgccggtct gagacaggcc 960 gtgacccagg gtttcccaac cgagctgaag ccaggtacca accagttcct gaccaccgac 1020 gacggtgtgt ctgccccaat cctgccaaac ttccacccaa ccccatgcat ccacatccca 1080 ggtgaggtga gaaacctgct ggagctgtgc caggtggaga ccatcctgga ggtgaacaac 1140 gtgccaacca acgccacctc tctgatggag agactgagat tcccagtgtc tgcccaggcc 1200 ggtaagggtg agctgtgcgc cgtgttcaga gccgacccag gtagaaacgg tccatggcag 1260 tctaccctgc tgggtcagct gtgcggttac tacacccagt ggtctggttc tctggaggtg 1320 accttcatgt tcaccggttc tttcatggcc accggtaaga tgctgatcgc ctacacccca 1380 ccaggtggtc cactgccaaa ggacagagcc accgccatgc tgggtaccca cgtgatctgg 1440 gacttcggtc tgcagtcttc tgtgaccctg gtgatcccat ggatctctaa cacccactac 1500 agagcccacg ccagagacgg tgtgttcgac tactacacca ccggtctggt gtctatctgg 1560 taccagacca actacgtggt gccaatcggt gccccaaaca ccgcctacat catcgccctg 1620 gccgccgccc agaagaactt caccatgaag ctgtgcaagg acgcctctga catcctgcag 1680 accggtacca tccagggtga cagagtggcc gacgtgatcg agtcttctat cggtgactct 1740 gtgtctagag ccctgaccca cgccctgcca gccccaaccg gtcagaacac ccaggtgtct 1800 tctcacagac tggacaccgg taaggtgcca gccctgcagg ccgccgagat cggtgcctct 1860 tctaacgcct ctgacgagtc tatgatcgag accagatgcg tgctgaactc tcactctacc 1920 gccgagacca ccctggactc tttcttctct agagccggtc tggtgggtga gatcgacctg 1980 ccactggagg gtaccaccaa cccaaacggt tacgccaact gggacatcga catcaccggt 2040 tacgcccaga tgagaagaaa ggtggagctg ttcacctaca tgagattcga cgccgagttc 2100 accttcgtgg cctgcacccc aaccggtgag gtggtgccac agctgctgca gtacatgttc 2160 gtgccaccag gtgccccaaa gccagactct agagagtctc tggcctggca gaccgccacc 2220 aacccatctg tgttcgtgaa gctgtctgac ccaccagccc aggtgtctgt gccattcatg 2280 tctccagcct ctgcctacca gtggttctac gacggttacc caaccttcgg tgagcacaag 2340 caggagaagg acctggagta cggtgcctgc ccaaacaaca tgatgggtac cttctctgtg 2400 agaaccgtgg gtacctctaa gtctaagtac ccactggtgg tgagaatcta catgagaatg 2460 aagcacgtga gagcctggat tccaagacca atgagaaacc agaactacct gttcaaggcc 2520 aacccaaact acgccggtaa ctctatcaag ccaaccggtg cctctagaac cgccatcacc 2580 accctgtaat ag 2592

<400> 2

Met Gly Ser Gin Val Ser Thr Gin Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr lie Asn Tyr Thr Thr lie Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gin Ser Leu Lys Gin

35 40 45

Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp lie Phe Thr Glu Met

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gin Leu Thr lie Gly Asn Ser Thr lie Thr Thr Gin Glu

85 90 95

Ala Ala Asn lie lie Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser

100 105 110

Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gin Asn Ala Gin Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175 lie His Val Gin Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gin Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val lie Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Thr Glu Asp Thr His Pro Pro Tyr Lys Gin Thr Gin Pro Gly Ala

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Leu Gin His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly lie Pro 225 230 235 240 lie Ser Gin Leu Thr Val Cys Pro His Gin Trp lie Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr lie lie Val Pro Tyr lie Asn Ala Leu Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro lie 275 280 285

Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gin Gly Ala Thr Pro Val lie Pro lie Thr 290 295 300

lie Thr Leu Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gin Ala 305 310 315 320

Val Thr Gin Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gin Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro lie Leu Pro Asn Phe His

340 345 350

Pro Thr Pro Cys lie His lie Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu 355 360 365

Leu Cys Gin Val Glu Thr lie Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn 370 375 380

Ala Thr Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gin Ala 385 390 395 400

Gly Lys Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn

405 410 415

Gly Pro Trp Gin Ser Thr Leu Leu Gly Gin Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gin Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe 435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu lie Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro 450 455 460

Leu Pro Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val lie Trp 465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gin Ser Ser Val Thr Leu Val lie Pro Trp lie Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Leu Val Ser lie Trp Tyr Gin Thr Asn Tyr Val Val Pro 515 520 525

lie Gly Ala Pro Asn Thr Ala Tyr lie lie Ala Leu Ala Ala Ala Gin 530 535 540

Lys Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp lie Leu Gin 545 550 555 560 Thr Gly Thr lie Gin Gly Asp Arg Val Ala Asp Val lie Glu Ser Ser

565 570 575 lie Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro

580 585 590

Thr Gly Gin Asn Thr Gin Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys 595 600 605

Val Pro Ala Leu Gin Ala Ala Glu lie Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Glu Ser Met lie Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr

625 630 635 640

Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly

645 650 655

Glu lie Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala

660 665 670

Asn Trp Asp lie Asp lie Thr Gly Tyr Ala Gin Met Arg Arg Lys Val

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala

690 695 700

Cys Thr Pro Thr Gly Glu Val Val Pro Gin Leu Leu Gin Tyr Met Phe

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp

725 730 735

Gin Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gin Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gin Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gin Glu Lys Asp

770 775 780

Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg lie

805 810 815

Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp lie Pro Arg Pro Met Arg

820 825 830

Asn Gin Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser

835 840 845

lie Lys Pro Thr Gly Ala Ser Arg Thr Ala lie Thr Thr Leu

850 855 860

<210> 3

<211> 1944

<212> DNA

<213> 3CD

<400> 3

atgggtccat ctctggactt cgccctgtct ctgctgagaa gaaacatcag acaggtgcag 60 accgaccagg gtcacttcac catgctgggt gtgagagaca gactggccgt gctgccaaga 120 cactctcagc caggtaagac catctggatc gagcacaagc tggtgaacgt gctggacgcc 180 gtggagctgg tggacgagca gggtgtgaac ctggagctga ccctgatcac cctggacacc 240 aacgagaagt tcagagacat caccaagttc atcccagaga acatctctac cgcctctgac 300 gccaccctgg tgatcaacac cgagcacatg ccatctatgt tcgtgccagt gggtgacgtg 360 gtgcagtacg gtttcctgaa cctgtctggt aagccaaccc acagaaccat gatgtacaac 420 ttcccaacca aggccggtca gtgcggtggt gtggtgacct ctgtgggtaa ggtggtgggt 480 atccacatcg gtggtaacgg tagacagggt ttctgcgccg gtctgaagag atcctacttc 540 gcctctgagc agggtgagat ccagtgggtg aagccaaaca aggagaccgg tagactgaac 600 atcaacggtc caaccagaac caagctggag ccatctgtgt tccacgacat cttcgagggt 660 aacaaggagc cagccgtgct gcactctaag gacccaagac tggaggtgga cttcgagcag 720 gccctgttct ctaagtacgt gggtaacacc ctgcacgagc cagacgagta catcaaggag 780 gccgccctgc actacgccaa ccagctgaag cagctggaga tcaacacctc tcagatgtct 840 atggaggagg cctgctacgg taccgagaac ctggaggcca tcgacctgca cacctctgcc 900 ggttacccat actctgccct gggtatcaag aagagagaca tcctggaccc aaccaccaga 960 gacgtgtcta gaatgaagtt ctacatggac aagtacggtc tggacctgcc atactctacc 1020 tacgtgaagg acgagctgag atccatcgac aagatcaaga agggtaagtc tagactgatc 1080 gaggcctctt ctctgaacga ctctgtgtac ctgagaatgg ccttcggtca cctgtacgag 1140 gccttccacg ccaacccagg taccatcacc ggttctgccg tgggttgcaa cccagacacc 1200 ttctggtcta agctgccaat cctgctgcca ggttctctgt tcgccttcga ctactctggt 1260 tacgacgcct ctctgtctcc agtgtggttc agagccctgg agctggtgct gagagagatc 1320 ggttactctg aggaggccat ctctctgatc gagggtatca accacaccca ccacgtgtac 1380 agaaacaaga cctactgcgt gctgggtggt atgccatctg gttgctctgg tacctctatc 1440 ttcaactcta tgatcaacaa catcatcatc agagccctgc tgatcaagac cttcaagggt 1500 atcgacctgg acgagctgaa catggtggcc tacggtgacg acgtgctggc ctcttaccca 1560 ttcccaatcg actgcctgga gctggccaag accggtaagg agtacggtct gaccatgacc 1620 ccagccgaca agtctccatg cttcaacgag gtgaactggg gtaacgccac cttcctgaag 1680 agaggtttcc tgccagacga gcagttccca ttcctgatcc acccaaccat gccaatgaga 1740 gagatccacg agtctatcag atggaccaag gacgccagaa acacccagga ccacgtgaga 1800 tccctgtgcc tgctggcctg gcacaacggt aagcaggagt acgagaagtt cgtgtctacc 1860 atcagatccg tgccagtggg tagagccctg gccatcccaa actacgagaa cctgagaaga 1920 aactggctgg agctgttcta atag 1944

400 4

Met Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn lie

1 5 10 15

Arg Gin Val Gin Thr Asp Gin Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg

20 25 30

Asp Arg Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gin Pro Gly Lys Thr lie

35 40 45

Trp lie Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val

50 55 60

Asp Glu Gin Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu lie Thr Leu Asp Thr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Arg Asp lie Thr Lys Phe lie Pro Glu Asn lie Ser

85 90 95

Thr Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val lie Asn Thr Glu His Met Pro Ser

100 105 110 Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gin Tyr Gly Phe Leu Asn Leu 115 120 125

Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys 130 135 140

Ala Gly Gin Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Val Val Gly 145 150 155 160 lie His lie Gly Gly Asn Gly Arg Gin Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys

165 170 175

Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gin Gly Glu lie Gin Trp Val Lys Pro

180 185 190

Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn lie Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys 195 200 205

Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp lie Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro 210 215 220

Ala Val Leu His Ser Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gin 225 230 235 240 Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu

245 250 255

Tyr lie Lys Glu Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gin Leu Lys Gin Leu

260 265 270

Glu lie Asn Thr Ser Gin Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr 275 280 285

Glu Asn Leu Glu Ala lie Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr 290 295 300

Ser Ala Leu Gly lie Lys Lys Arg Asp lie Leu Asp Pro Thr Thr Arg 305 310 315 320 Asp Val Ser Arg Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu

325 330 335

Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser lie Asp Lys lie

340 345 350

Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu lie Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser 355 360 365

Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly His Leu Tyr Glu Ala Phe His Ala 370 375 380

Asn Pro Gly Thr lie Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Thr 385 390 395 400 Phe Trp Ser Lys Leu Pro lie Leu Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe

405 410 415

Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala

420 425 430

Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu lie Gly Tyr Ser Glu Glu Ala lie Ser 435 440 445

Leu lie Glu Gly lie Asn His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr 450 455 460

Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser lie 465 470 475 480 Phe Asn Ser Met lie Asn Asn lie lie lie Arg Ala Leu Leu lie Lys

485 490 495

Thr Phe Lys Gly lie Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly

500 505 510

Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro lie Asp Cys Leu Glu Leu

515 520 525

Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys

530 535 540

Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn Trp Gly Asn Ala Thr Phe Leu Lys

545 550 555 560

Arg Gly Phe Leu Pro Asp Glu Gin Phe Pro Phe Leu lie His Pro Thr

565 570 575

Met Pro Met Arg Glu lie His Glu Ser lie Arg Trp Thr Lys Asp Ala

580 585 590

Arg Asn Thr Gin Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His

595 600 605

Asn Gly Lys Gin Glu Tyr Glu Lys Phe Val Ser Thr lie Arg Ser Val

610 615 620

Pro Val Gly Arg Ala Leu Ala lie Pro Asn Tyr Glu Asn Leu Arg Arg

625 630 635 640

Asn Trp Leu Glu Leu Phe

645

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgagctcctc gaggcggaga acgatctcct cgagctgct 39

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttccacgtc tccgaattcc cgggatccgt ttttgtactt tag 43

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagtacaaaa acggatcccg cggaattcgg agacgtggaa g 41

<210> 8

<211> 38 <212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctatggccg acgtcgacct gctcaatctc cggaatgg

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgagctccag ctgagggcgc tgagccgcaa gtg

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtcaaccca attcttatga ccagctgttt gggcgca

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgcgcccaaa cagctggtca taagaattgg gttgacg

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctaaagggaa gaaaagctgg taaatgaata ttatgtc

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgacataata ttcatttacc agcttttgtt ccctttag

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctatggccg acgtcgactt aacgcttaca atttag gg actcctatt tcacttttc atctc 25

g caaaac

ggg caccctt c

gggg atttttcc ctacttatc aca 24

¾ AJH