| WO/2004/096984 | PRESERVATION OF RNA IN A BIOLOGICAL SAMPLE |
| JP2638412 | MR IMAGING DEVICE |
| JP3624199 | AUTOMATIC HEMANALYSIS DEVICE |
CAULÍ, Omar (Fundación de la Comunidad Valenciana Centro de Investigación Príncipe Felipe, C)E.P. Avda. Autopista del Saler 16-3, Valencia, E-46012, ES)
MONTOLIU FÉLIX, María del Carmen (Fundación Investigación Clínico de Valencia, Avda. Blasco Ibáñez 17, Valencia, E-46010, ES)
FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA, LA DOCENCIA Y LA COOPERACIÓN INTERNACIONAL Y EL DESARROLLO DEL HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO DE VALENCIA (Avda. Blasco Ibáñez 17, Valencia, E-46010, ES)
FELIPO ORTS, Vicente (Fundación de la Comunidad Valenciana Centro de Investigación Príncipe Felipe C)E.P. Avda. Autopista del Saler, 16-3, Valencia, E-46012, ES)
CAULÍ, Omar (Fundación de la Comunidad Valenciana Centro de Investigación Príncipe Felipe, C)E.P. Avda. Autopista del Saler 16-3, Valencia, E-46012, ES)
MONTOLIU FÉLIX, María del Carmen (Fundación Investigación Clínico de Valencia, Avda. Blasco Ibáñez 17, Valencia, E-46010, ES)
| REIVINDICACIONES Procedimiento ex-vivo para el diagnóstico temprano de la encefalopatía hepática mínima (EHM) en pacientes con enfermedades hepáticas, incluida la cirrosis, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) Obtención de suero ó plasma obtenido de la sangre de los pacientes y de los controles, y b) Determinación de si la medida de la concentración de 3-nitrotirosina obtenida en (a) es superior o no a un nivel determinado. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque los pacientes que poseen una concentración de 3-nitrotirosina igual o superior al valor de la concentración de 3-nitrotirosina de los sujetos control más 2 veces el valor de la desviación estándar se consideran como pacientes con EHM. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque los pacientes que poseen una concentración de 3-nitrotirosina inferior al valor de la concentración de 3-nitrotirosina de los sujetos control más el doble del valor de la desviación estándar se consideran como pacientes sin EHM. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque la 3-nitrotirosina se determina por cromatografía líquida en fase reversa HPLC y se detecta por fluorescencia. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque los pacientes con concentración de 3-nitrotirosina igual o superior a 7.7 nM se consideran como pacientes con EHM. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque los pacientes con concentración de 3-nitrotirosina inferior a 7.7 nM se consideran como pacientes sin EHM. HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) 7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la 3-nitrotirosina se determina por cromatografía líquida en fase reversa HPLC y se detecta con un detector electroquímico. 8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la 3-nitrotirosina se determina por cromatografía de gases y espectrometría de masas. 9. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la 3-nitrotirosina se determina por medio de un ensayo ELISA. 10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la 3-nitrotirosina se determina mediante dot-blot utilizando anticuerpos específicos contra la 3-nitrotirosina. 1 1. Utilización de la 3-nitrotirosina según las reivindicaciones 1-10 como marcador de diagnóstico específico para la determinación de la presencia de EHM en pacientes con cirrosis hepática. HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) |
SUERO SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se incluye en el campo de la Farmacología y Química Médica y se refiere a un método ex-vivo para la detección y diagnóstico temprano de la encefalopatía hepática mínima (EHM) en pacientes con enfermedades hepáticas, incluida la cirrosis, basado en la presencia en suero de biomarcadores específicos, concretamente mediante la determinación de 3-nitrotirosina (3-NT).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La encefalopatía hepática (EH) es un término médico asignado para describir una anormalidad neuropsiquiátrica causada por una alteración previa en la función del hígado. Puede ser un trastorno progresivo y crónico ó de aparición aguda y es en algunos casos reversible. La EH es especialmente frecuente en los cirróticos. El término encefalopatía hepática mínima (EHM) se refiere a los cambios sutiles en la función cognitiva y patrones electroencefalográficos en pacientes con enfermedades hepáticas (incluida la cirrosis), que no muestran una evidencia clínica de encefalopatía hepática. Esta complicación de las enfermedades hepáticas generalmente no es perceptible por el médico. Entre 30% y 50% de los pacientes con cirrosis hepática que no muestran síntomas evidentes de encefalopatía hepática (EH) presentan EHM con deterioro cognitivo leve. La EHM no se detecta en un análisis rutinario pero se puede detectar utilizando pruebas psicométricas o realizando estudios neurofisiológicos (1 -4).
La EHM es la primera fase del espectro de la EH (5,6) y lleva asociada una disminución de la calidad de vida de los pacientes y de su habilidad para realizar tareas de la vida diaria, incluyendo la conducción de vehículos (7,8). La EHM aumenta el riesgo de padecer accidentes laborales y de tráfico (9), predice la aparición de EH clínica (10) y se asocia con una menor supervivencia (1 1 ). La detección temprana de la EHM permitiría su tratamiento y mejoraría su calidad de vida, prevendría o retrasaría la aparición de la EH clínica y aumentaría la supervivencia de los pacientes. Es por tanto necesario disponer de procedimientos sencillos para el diagnóstico de la EHM en pacientes con enfermedades hepáticas. En el estado de la técnica, Hernandez-Avila et al. 2001 , (12) revisan los distintos marcadores diagnósticos y mecanismos neuroquímicos de la encefalopatía secundaria a la insuficiencia hepática. El documento indica como la génesis de la encefalopatía hepática (EH) es multifactorial, y que es el resultado de la incapacidad del hígado para eliminar del plasma las sustancias con propiedades neuromoduladoras. Concretamente, en el apartado dedicado a la hipótesis del amonio, el documento señala cómo es conocido que un aumento en los niveles de amonio en sangre tiene como consecuencia una mayor captación del mismo por parte del cerebro generando el efecto neurotóxico.
Marco Sezolo et al. 2004, (13) diagnostican la EHM por medio de pruebas neuropsicológicas y neurofisiológicas en pacientes con cirrosis hepática y comparan los distintos métodos de diagnóstico (PSE, presión parcial de NH3 [pNH3] y pruebas neurofisiológicas) para evaluar su eficiencia frente al diagnóstico de encefalopatías hepáticas.
Keiding et al. 2006, (14) estudian mediante la tomografía por emisión de positrones (TEP) el metabolismo del amonio ( 13 N-Ammonia) cerebral en pacientes con cirrosis y encefalopatía hepática (EH) aguda, en pacientes con cirrosis sin encefalopatía hepática y en pacientes sanos. De los estudios realizados se concluye que los pacientes con cirrosis y encefalopatía hepática aguda muestran un aumento en la captación de amonio por parte del cerebro debido principalmente a un aumento de los niveles de amoniaco en sangre y no tanto a un cambio en la cinética cerebral del amoniaco. Suarez et al. 2006, (15) intentan determinar si las alteraciones en la astroglía y las neuronas está mediada por el oxido nítrico (NO) en modelos experimentales de HE (provocado por una anastomosis porta-cava [PCA]). Concretamente, se estudió la expresión de las NO sintasas (nNOS e ¡NOS) y la nitrosilacion de proteínas en tirosina en el cuerpo estriado de ratas expuestas a PCA durante 1 y 6 meses. Y los resultados de la investigación muestran como en el modelo animal de encefalopatía hepática los niveles de ¡NOS y la nitrosilacion de proteínas en tirosina se ven aumentados en los astrocitos a medida que la exposición a PCA aumenta.
Górg et al. 2006, (16) estudian los efectos de las citoquinas inflamatorias sobre la nitración de la tirosina en astrocitos cultivados de rata y en cerebros de ratas vivas y concluye que puede ser importante para estos y para la patogénesis de EH y otras enfermedades que impliquen la exposición del cerebro a las citoquinas. Rabbani, N. y Thornalley, P.J. 2008, (17) describen un ensayo para determinar la 3-NT libre en tejidos y fluidos biológicos por medio de cromatografía líquida conjuntamente con la detección por espectrometría de masas. Se comparan los resultados obtenidos de 3- NT en pacientes con diabetes, cirrosis, fallo renal crónico y agudo, y enfermedades neurológicas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, obtenidos por su método y otras mediciones independientes.
Y más recientemente, Bragagnolo Jr M A et al. 2009 (18) expone que la EHM consiste en un conjunto de alteraciones neuropsiquiatricas en individuos con insuficiencia hepática y/o hipertensión portal. Su fisiopatología es compleja y muy posiblemente multifactorial, aunque los niveles de amonio parecen ser los que mejor explican las alteraciones neuropatológicas y clínicas observadas. De la lectura del documento se concluye que la concentración arterial de amonio no juega un papel importante en el diagnóstico de la EHM.
En ¡a actualidad el diagnóstico de la EHM sólo puede ser establecido mediante pruebas neuropsicológicas y neurofisiológicas (electroencefalograma). El diagnóstico temprano de la EHM puede tener implicaciones de pronóstico y terapéuticas en pacientes cirróticos. Por lo tanto sería muy conveniente y útil en la práctica clínica
disponer de un biomarcador periférico, que pudiera ser medido ex-vivo en sangre de los pacientes y que refleje la presencia de EHM en pacientes con enfermedades hepáticas, tales como la cirrosis hepática.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico realizado ex-vivo en pacientes con cirrosis que permite, a través de la detección de un biomarcador concreto como es la 3-NT, determinar la presencia de EHM, contribuyendo de esta forma a su tratamiento precoz y mejorando la calidad de vida de estos pacientes.
Actualmente el procedimiento de referencia para la detección de la EHM es una batería de 5 pruebas psicométricas denominada en inglés "Psychometric hepatic encephalopathy score" (PHES) (2). Sin embargo, este procedimiento no se utiliza rutinariamente en la práctica clínica porque consume tiempo y requiere ajustes en función de la edad y el nivel educativo de los individuos.
Los autores de la presente solicitud han demostrado que la presencia de EHM se correlaciona con un aumento de la activación de la guanilato ciclasa soluble por óxido nítrico en linfocitos (3) y que los niveles de las citocinas pro-inflamatorias IL-6 e IL-18 en suero también se correlacionan con la EHM (4). Sin embargo, estos parámetros no se están utilizando en el diagnóstico de la EHM. Por ese motivo, han continuado buscando otros biomarcadores en suero que pudieran detectar la EHM con un mejor valor predictivo. Estudios en modelos animales de EH han mostrado que algunos factores que contribuyen al deterioro cognitivo son las alteraciones en el óxido nítrico y GMP cíclico en cerebro (19,20) y la neuroinflamación (21 ). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El procedimiento ex-vivo para el diagnóstico temprano de la encefalopatía hepática mínima (EHM) en pacientes con cirrosis hepática, según la presente invención, comprende las siguientes etapas:
a) obtención de suero ó plasma obtenido de la sangre de los pacientes y de los controles, y
b) determinación de si la medida de la concentración de 3-nitrotirosina obtenida en (a) es superior o no a un nivel determinado.
Para ello, se ha analizado en el suero de 43 sujetos control sin enfermedad hepática; 44 pacientes cirróticos sin EHM y 47 pacientes con EHM una serie de parámetros, incluyendo los niveles de GMP cíclico, nitritos/nitratos (metabolitos estables del óxido nítrico), y 3-NT (que se forma a partir de peroxinitrito, un metabolito más tóxico que el óxido nítrico). Como el fallo hepático altera el metabolismo de aminoácidos, también se han determinado los niveles de algunos aminoácidos. Se ha analizado si alguno de los parámetros determinados es útil para diagnosticar la presencia de EHM. Para cada parámetro se ha analizado la sensibilidad, especificidad y los valores predictivos positivo y negativo como indicador de la presencia de EHM evaluada mediante la batería de pruebas psicométricas PHES.
SUJETOS Y METODOS
Pacientes y controles.
Se han considerado "pacientes" a los sujetos diagnosticados de cirrosis hepática tras un estudio histológico y "controles" a los sujetos en los que se ha descartado la presencia de enfermedad hepática. Se ha realizado un estudio con pacientes y con sujetos control, es decir, se ha realizado un estudio con pacientes diagnosticados de cirrosis hepática tras un estudio histológico y con sujetos control en los que se ha descartado la presencia de enfermedad hepática. Ninguno de los pacientes estaba en tratamiento con antibióticos ni había sufrido anteriormente peritonitis bacteriana ni TIPS ("transjugular intrahepatic portosystemic shunt").
Tras un examen físico se les tomó sangre para la determinación de los parámetros bioquímicos rutinarios y para las determinaciones descritas más adelante. El protocolo del estudio se ajusta a las normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 (22) y fue aprobado por los Comités Ético y Científico del Hospital.
Tras realizar la batería de pruebas psicométricas, los pacientes se clasificaron en pacientes sin y con EHM (ver mas adelante). Por tanto el estudio incluye tres grupos: 1 ) sujetos control; 2) pacientes sin EHM; y 3) pacientes con EHM.
La composición de los grupos, edad y etiología de la enfermedad hepática se indican en la Tabla 1 .
Se tomó suero, para determinar las sustancias seleccionadas (ver mas adelante), de 43 controles, 44 pacientes sin EHM y 47 pacientes con EHM. El número de muestras analizadas para cada compuesto se da en la Tabla 2. Detección de la presencia de EHM utilizando la batería de pruebas psicométricas PHES. La presencia de EHM se determinó utilizando la batería PHES, recomendada como procedimiento de referencia para la detección de EHM (2,16,17). La puntuación se calculó ajustándola en función de la edad y el nivel educativo utilizando las Tablas de normalidad para la población española, disponibles en www.redeh.org. Se consideró que tenían EHM aquellos pacientes con una puntuación de -4 ó inferior (23,24).
Obtención de suero. Se tomaron 5 mi de sangre en tubos BD Vacutainer y se centrifugaron a 500g, 10 min. Se recogió el sobrenadante y se guardó a -80 5 C en alícuotas de 500 μΙ. Activación de la guanilato ciclasa soluble por el agente generados de óxido nítrico S-nitroso-N-acetil penicilamina (SNAP) en linfocitos intactos. Los linfocitos se prepararon como describen Kimura et al (25) y la activación de la guanilato ciclasa se analizó como se describe en (26). El GMP cíclico (GMPC) se determinó utilizando el BIOTRAK cGMP kit de inmunoensayo enzimático de Amersham (GE Healthcare, Life Sciences, UK).
Determinación de aminoácidos y de 3-nitrotirosina en suero. 100 μί. de una mezcla de metanol/cloroformo (1 :2) fría se mezclaron con 50 μΙ_ de suero y se centrifugaron a 4 5 C, 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se congelaron a -80 5 C.
Las concentraciones de aminoácidos y de 3-nitrotirosina se midieron en 50 μΙ de sobrenadante por HPLC utilizando un sistema de HPLC en fase reversa con derivatizacion pre-columna con o-ftalaldehído y detección por fluorescencia como se describe en (27).
Análisis estadístico. Los resultados se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (one-way ANOVA), seguidos de post-hoc Newman-Keuls-test, utilizando el software GraphPad PRISM Versión 3.0. El nivel de probabilidad aceptado como significativo es p <0.05. El límite superior de normalidad de cada variable se calculó de acuerdo con el criterio habitual, considerando la media ± 2 veces la desviación estándar de los valores de los controles. Este valor se consideró como el punto de corte en los análisis de sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo de los diferentes parámetros. Para estos cálculos, los datos se procesaron con el software SPSS versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, USA).
RESULTADOS
Como ya se sabía, los pacientes presentaron un patrón alterado de aminoácidos en sangre (Tabla 2), con un aumento significativo de los aminoácidos aromáticos tirosina y fenilalanina, un aumento notable (mas de 2 veces) de metionina, homocisteína y homoserina, y ligeros aumentos de asparagina, citrulina, isoleucina y alanina.
Los niveles de los aminoácidos ramificados leucina y valina y de glutamato están significativamente disminuidos (Tabla 2). Cuando se comparan los niveles de aminoácidos en pacientes sin y con EHM, se observan ligeras diferencias en glutamina, homocisteina e isoleucina. Las diferencias son mas notables para citrulina y, especialmente, para metionina.
La citrulina aumenta en pacientes cirróticos sin EHM al 161 ±17% de los sujetos control, alcanzando 29±3 μΜ (Tabla 2). En pacientes con EHM, la citrulina está significativamente aumentada (p=0.002) comparada con pacientes sin EHM, alcanzando 50±5 μΜ (172±17% de los pacientes sin EHM y 278±28% de los controles). La metionina aumenta en pacientes sin EHM al 232±19% de los controles, alcanzando 44±3 μΜ (Tabla 2). En pacientes con EHM, la metionina está significativamente aumentada (p<0.0002) comparada con pacientes sin EHM, alcanzando 73±7μΜ (166±16% de los pacientes sin EHM y 384±36% de los controles).
Es especialmente notable el aumento en 3-nitrotirosina. La concentración en suero de este derivado de tirosina es muy bajo en sujetos control (3.3±2.2 nM), aumenta significativamente (p<0.01 ) en pacientes sin EHM a 6.0±4.2 nM y está muy aumentado en pacientes con EHM, alcanzando 48±24 nM. Esto representa un aumento de 8 veces respecto a los pacientes sin EHM y de 15 veces respecto a los controles (Tabla 2).
Se determinaron también, en los mismos individuos, parámetros relacionados con la homeostasis del GMPc. Los niveles se dan en la Tabla 3.
Análisis de la utilidad diagnóstica de los parámetros determinados Se ha analizado la utilidad diagnóstica de cada uno de los parámetros determinados para discriminar que pacientes tienen EHM y cuales no. Se han utilizado los resultados de la batería de pruebas psicométricas PHES como criterio para definir qué pacientes tienen EHM y cuales no. Se consideró que tienen EHM los pacientes que obtienen un resultado igual o inferior a -4. Se determinaron los siguientes parámetros: Sensibilidad: la proporción de pacientes con EHM que se identifican correctamente como tales.
Especificidad. La proporción de pacientes sin EHM que se identifican correctamente. Valor predictivo positivo: la proporción de pacientes con resultado positivo en la prueba que se diagnostican correctamente
Valor predictivo negativo: la proporción de pacientes con resultado negativo en la prueba que se diagnostican correctamente.
Los valores de dichos parámetros se dan para cada sustancia analizada en la Tabla 4.
Los resultados muestran que la 3-nitrotirosina es un buen indicador de la presencia de EHM en los pacientes, con buena sensibilidad (82%) y especificidad (71 %) y valores predictivos positivos y negativos del 75 y 79%, respectivamente (Tabla 4).
La metionina también tiene buena sensibilidad (82%), pero menor especificidad (56%) y valores predictivos positivos y negativos del 65 y 75%, respectivamente (Tabla 4).
Cuando realizamos los análisis combinando dos sustancias, la especificidad y el valor predictivo positivo aumentan, pero la sensibilidad disminuye (Tabla 4).
DISCUSION
La 3-NT se forma a partir de peroxinitrito, un metabolito del óxido nítrico. Es bien conocido que el óxido nítrico está aumentado en sangre de pacientes con cirrosis hepática. Sin embargo, este aumento es similar en los pacientes con EHM y sin EHM (3,4). Esto mismo se confirma en el presente estudio. Los niveles de nitritos+nitratos, metabolitos estables del óxido nítrico, no son estadísticamente diferentes en pacientes con y sin EHM (Tabla 3).
Por tanto resulta imposible predecir, a partir de los datos en la literatura, que la 3- nitrotirosina (o cualquier otro metabolito del óxido nítrico) podría ser un buen indicador de la presencia de EHM.
Se ha encontrado que los niveles de 3-NT están aumentados de modo significativo en sangre de los pacientes cirróticos con EHM comparados con los niveles de los pacientes sin EHM y que los niveles de 3-NT en suero tienen valor predictivo de la presencia de EHM en los pacientes (Tabla 4).
Los mecanismos que conducen a esta alteración en los niveles de 3-NT en pacientes con EHM no se conocen por el momento.
Hasta el momento no se ha descrito ningún biomarcador, medible ex-vivo en muestras de sangre, de la presencia de EHM. Esta se detecta únicamente mediante pruebas psicométricas o neurofisiológicas.
Aunque nuestro grupo ha encontrado correlaciones entre la activación de la guanilato ciclasa soluble por óxido nítrico (3) y los niveles de IL-6 e IL-18 (4) con el grado de EHM, estos parámetros no se utilizan para el diagnóstico de la EHM por no tener valores predictivos, de sensibilidad y especificidad adecuados. Los datos de la presente solicitud muestran que la 3-NT tiene un mayor valor predictivo para el diagnostico de la presencia de EHM (Tabla4). Por lo tanto, teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se puede diagnosticar ex-vivo el diagnóstico temprano de la encefalopatía hepática mínima mediante la determinación de 3-nitrotirosina en suero.
Para la obtención del suero de los pacientes y controles se puede seguir el mismo protocolo que se ha seguido en la presente solicitud, y una vez obtenido el suero a partir de la sangre de los mismos, determinar la concentración de 3-nitrotirosina.
En el ejemplo, para determinar la 3-NT se ha utilizado la técnica de cromatografía líquida en fase reversa (HPLC) para separarla, y se ha detectado posteriormente por fluorescencia como se incida arriba. Igualmente se podría detectar con un detector electroquímico después de su separación por HPLC, ó mediante otros procedimientos, como por ejemplo identificando la 3-NT por cromatografía de gases y espectrometría de masas, o incluso por medio un ensayo de ELISA utilizando anticuerpos específicos contra 3-nitrotirosina. Utilizando anticuerpos específicos contra la 3-NT, esta se puede determinar mediante dot-blot. Aquellos pacientes cuyo nivel de 3-nitrotirosina sea superior a la media de los sujetos controles más dos desviaciones estándares serán considerados como pacientes con EHM.
En el estudio realizado los niveles de 3-nitrotirosina en suero de sujetos control alcanzaron una media de 3.3 nM con una desviación estándar de 2.2 nM. Por esta razón, el punto de corte para diagnosticar la presencia de EHM sería 7.7 nM. Aquellos pacientes con concentración de 3-nitrotirosina mayor de 7.7 nM se considerarían como pacientes con EHM y aquellos con 7.7 nM o menor, sin EHM.
Este punto de corte podría modificarse ligeramente al aumentar el número de individuos estudiados, si se modificara la media y/o la desviación estándar de los valores de los controles.
TABLA 1. Etiología de la enfermedad hepática y datos analíticos
Rango Controles Pacientes sin Pacientes con Normal EHM EHM
N 5 Total individuos 43 44 47
Edad 51 ± 16 54+10 63 + 10
Alcohol 44 47
Ascitis 6 10
Child Pugh A/B/C 36/ 8/ 0 33/ 14/0
MELD 8.4 + 3.0 9.3 + 2.5
GOT (mU/ml) (1 - 37) 20 ±4 73156 c 83158 c
GPT (mU/ml) (1 - 41) 18 ± 6 77124 c 90124 c
GGT (mU/ml) (10- 49) 27 ±5 87160 c 106 + 64 c
Ácido úrico (mg/dl) (2.5 -7) 4.0 ± 1.0 6.2 + 2.0 5.7 + 2.3
Creatinina (mg/dl) (0.5- -1.3) 0.910.1 1.1 +0.2 1.2 + 0.2
Colesterol (mg/dl) (140- -200) 172122 175 + 44 167155
Triglicerides (mg/dl) (40- 160) 95 + 32 111164 119 + 64
Bilirubina (mg/dl) (0.1 -1) 0.6 + 0.2 1.7 + 0.7 c 2.3 + 0.6 c
Albúmina (g/dl) (3.5 -5) 4.4 + 0.2 3.7 + 0.6 c 2.910.6 c§
Protrombina time (sec) 13 + 1.3 24 + 4 c 30+ 4 C
Fibrinogeno (g/l) (2- -4) 3.111.0 3.3 + 1.3 3.6+1.2
Ale. fosfatasa (mU/ml) (50- 250) 147 + 53 216 + 77 b 314 + 96 c§
Eritrocitos (4.2- -6.1) 4.6 + 0.4 4.3 + 0.7 3.4 + 0.6
Leucocitos (4.8- 10.8) 6.5+1.3 6.0 + 2.6 5.5 + 2.0
Neutrofilos (%) (55- -75) 55 + 7 54 + 6 59 + 9
Linfocitos (%) (17- -45) 35 + 6 29 + 10 27 + 9
Monocitos (%) (2- -8) 6.0 + 1.3 8.4 + 3.0 b 10 + 2.6 C
Eosinofilos (%) (1 - -4) 3.3 + 2.0 2.4+1.2 1.7+1.0
Basofilos (%) (0.05- -0.5) 0.5 + 0.2 0.6 + 0.3 0.6 + 0.1 Los valores se dan como media ± SD. Los valores significativamente diferentes de los controles se indican con superíndices: a p < =.05; b p < 0.01; c p < 0.001. Los valores significativamente diferentes en pacientes sin y con EHM se indican como §, p < 0.05.
TABLA 2. Concentraciones de aminoácidos en suero.
COMPUESTO Controles Pacientes sin Pacientes Pacientes con
EHM con EHM EHM p vs. Control P vs. P vs. sin EHM control
3-Nitrotirosina (nM) 3.3 ± 0.35 6.0 ± 0.7** 48 ± 6*** p<0.0001
(n=41) (n=42) (n=43)
Tirosina (μΜ) 65 ±6 96 ± 6 ** 104 ±8 ** NS
(n=42) (n=43) (n=29)
Fenilalanina (μΜ) 50 ±4 103 ±8 *** 91 ± 7 *** NS
(n=43) (n=43) (n=43)
Glutamato (μΜ) 79 ±7 60 ±5 * 48 ± 4 ** NS
(n=43) (n=40) (n=42)
Glutamina (μΜ) 406 ± 28 409 ± 33 516135 * p= 0.027
(n=41) (n=43) (n=43)
Aspartato (μΜ) 4.410.5 3.610.4 4.710.6 NS
(n=43) (n=43) (n=43)
Asparagina (μΜ) 36 ±3 54± 5 ** 6616 *** NS
(n=43) (n=43) (n=43)
Citrulina (μΜ) 18±2 29 ±3* 50 ± 5*** p= 0.002
(n=41) (n=43) (n=43)
Alanina (μΜ) 238 ± 20 336 ± 44 * 269126 NS
(n=41) (n=43) (n=43)
Leucina (μΜ) 72 ±4 51 ± 4 *** 48 + 4*** NS
(n=43) (n=43) (n=43)
Isoleucina (μΜ) 37 ±4 49 + 4* 30 + 3 p=0.002
(n=43) (n=43) (n=43)
Valina (μΜ) 76 ±5 53 ± 3 *** 4614 *** NS
(n=41) (n=43) (n=43) Metionina (μΜ) 19 ± 2 44 ± 3*** 73 ± 7** J p<0.0002
(n=43) (n=43) (n=43)
Homocisteina (μΜ) 4.6 1 0.5 13 1 2 *** 19 + 2 **J p= 0.017
(n=33) (n=43) (n=42)
Homoserina (nM) 2.3 1 0.3 4.6+ 0.8 ** 4.2 + 0.5 NS
(n=43) (n=43) (n=43)
Los valores se dan como media + SEM. Los valores significativamente diferentes de los controles se indican con asteriscos: * p < 0.05; ** p < 0.01 ; *** p < 0.001 .
Tabla 3. Valores de diferentes parámetros en controles y pacientes sin o con EHM.
PARAMETRO Controles Pacientes sin Pacientes Pacientes con
EHM con EHM EHM p vs. Control P vs. control P vs. sin EHM
GMPc basal en 0.23 +0.03 0.12 +0.01 ** 0.06 +0.01 *
linfocitos
(n=43) (n=44) (n=44)
(pmol/mg prot)
Activación de 14+1 24+2 *** 33+3 *** p=0.05 guanilato ciclasa
(n=43) (n=44) (n=44)
óxido nítrico
linfocitos (veces)
GMPc em plasma 5.9+0.9 15+2 *** 21 +2 * p=0.05 cGMP
(n=43) (n=44) (n=44)
(nM) Nitratos + Nitritos (μΜ) 19±4 25±5 * 31 ±7 **
(n=43) (n=36) (n=34)
Los valores se dan como media ± SD. Los valores significativamente diferentes de los controles se indican con asteriscos: * p < 0.05; ** p < 0.01 ; *** p < 0.001 .
Tabla 4. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo de diferentes compuestos o combinaciones, para la detección de la EHM
PARAMETRO SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD( VALOR VALOR
(%) %) PREDICTIVO PREDICTIVO
POSITIVO (%) NEGATIVO (%)
3-Nitrotirosina 82 71 75 79
Metionina 82 56 65 75
Citrulina 59 72 68 63
Activación de la 46 66 56 56 guanilato ciclasa
3-Nitrotirosina + 68 88 86 72 Metionina
3-Nitrotirosina + 45 88 80 61 Citrulina
Citrulina+ 48 91 84 63 Metionina
3-Nitrotirosina + 38 98 94 60
Metionina+
Citrulina REFERENCIAS
1. Amodio P, Montagnese S, Gatta A, et al. Characteristics of minimal hepatic 3encephalopathy. etab Brain Dis. 2004; 19:253-267.
2. Ferenci P, Lockwood A, Mullen K, et al. Hepatic encephalopathy. Definition, Nomenclatura, Diagnosis and Quantification: Final report of the working party at the
11 Word Congress of Gastroenterology, Vienna, 1998. Hepatology 2002; 35: 716- 721.
3. Montoliu, C, Piedrafita, B., Serra, M.A., del Olmo, JA, Ferrandez, A., Rodrigo, J.M. and Felipo, V., (2007) Activation of soluble guanylate cyclase by nitric oxide in lymphocytes correlates with minimal hepatic encephalopathy in cirrhotic patients. J Mol Med. 85(3):233-241
4. Montoliu, C, Piedrafita, B., Serra, M.A., del Olmo, JA, Urios, A., Rodrigo, J.M.and Felipo, V. (2009) IL-6 and IL-18 in blood may discrimínate cirrhotic patients with and without minimal hepatic encephalopathy. J Clin Gastroenterol 43 (3): 272-279 5. Romero-Gómez M, Boza F, García Valdecasas MS, et al. Subclinical hepatic encephalopathy predicts the development of overt hepatic encephalopathy. Am J Gastroenterol 2001 ;96:2718-2723.
6. Das A, Dhiman RK, Saraswat VA, et al. Prevalence and natural history of subclinical hepatic encephalopathy in cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol 2001 ;16:531 -535. 7. Groeneweg M, Quero JC, De Bruijn I, et al. Subclinical hepatic encephalopathy impairs daily functioning. Hepatology 1998;28:45-49.
8. Wein C, Koch H, Popp B, et al. Minimal hepatic encephalopathy impairs fitness to drive. Hepatology 2004;39:739-745.
HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26) 9. Bajaj JS, Saeian K, Schubert CM, et al Minimal hepatic encephalopathy is associated with motor vehicle crashes: the reality beyond the driving test. Hepatology. 2009 ;50(4):1 175-1 183
10. Romero-Gómez M, Boza F, Garda Valdecasas MS, et al. Subclinical hepatic encephalopathy predicts the development of overt hepatic encephalopathy. Am J
Gastroenterol 2001 ;96:2718-2723.
11. Romero-Gómez M, Grande L, Camacho I. Prognostic valué of altered oral glutamine challenge in patients with minimal hepatic encephalopathy. Hepatology. 2004;39(4):939-943.
12. Hernandez-Avila, Carlos A. y Ortega-Soto, Héctor A. "Marcadores diagnósticos y mecnismos neuroquímicos de la encefalopatía secundaria a la insuficiencia hepática". Salud mental, 2001 vol.24, N 9 1 , p.48-59.
13. Marco Senzolo et al. "Minimal hepatic encephalopathy diagnosed by neuropsychological and nerourophysiological tools in patients with liver cirrhosis". Digestive Disease Week/105 ,h Annual Meeting of the American-Gastroenterological- association, USA, May 16-20,2004. Pub: Gastroenterology, Apr 2004, Nr.4, Suppl.2, vol.126, p.A729. ISSN 0016-5085.
14. Keiding, Susanne et al. "Brain Metabolism of 3 N-Ammonia During Acute Hepatic Encephalopathy in Cirrosis Measured by Positrón Emission Tomography". Hepathology, Jan. 2006, vol.43, p.42-50.
15. Suarez, I. et al. "Induction of NOS and nitrotyrosine expression in the rat striatum following experimental hepatic encephalopathy". Metab Brain Dis. 2009, Sep. 24(3):395-408.
HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26) 16. Boris Górg et al. "Inflammatory cytokines induce protein tyrosine nitration in rat astrocytes". Archives of Biochemistry and Biophysics. 2006.Vol.449, p.104-1 14. ISSN 0003-9861. Available online at www.sciencedirect.com 9 March 2006.
17. Rabbani, Naila and Thomalley, Paul J. "Assay of 3-Nitrotyrosine in Tissues and Body Fluids by Liquid Chromatography with Tándem Mass Spectrometric Detection". ethods in enzymology. Vol.440, 2008 Elsevier Inc. p. 337-359. ISSN 0076-6879.
18. Mauricio Augusto Bragagnolo Jr. et al. "Minimal hepatic encephalopathy detection by neuropsychological and neurophysiological methods and the role of ammonia for its diagnosis". Arquivos de Gastroenterologia, vol.46, Jan/march 2009, p.43-49.
19. Erceg, S., Monfort, P., Hernández- Viadel, M., Rodrigo, R., Montoliu, C. and Felipo, V. Oral administraron of sildenafil restores learning ability in rats with hyperammonemia and with portacaval shunt. Hepatology. 2005; 45, 2-10
20. Erceg, S., Monfort, P., Hernandez-Viadel, M.,Llansola, M., Montoliu, C, and Felipo, V. Restoration of learning ability in hyperammonemic rats by increasing extracellular cGMP in brain. Brain Res. 2005; 1036, 115-121
21. Cauli, O., Rodrigo, R., Piedrafita, B., Boix, J. and Felipo, V. Inflammation and hepatic encephalopathy: ibuprofen restores learning ability in rats with porto-caval shunts. Hepatology 2007; 46, 514-519.
22. World Medical Organization. Declaration of Helsinki. BMJ 1996; 313:1448-1449. 23. Weissenborn K, Ennen JC, Schomerus H, Rückert N, Hecker H. Neuropsychological characterization of hepatic encephalopathy. J Hepatol 2001 ; 34:768-773
24. Schomerus H, Weissenborn K, Hámster W, Rückert N, Hecker H PSE syndrome test manual. Swets Test Services, Frankfurt, 1999.
25. Kimura M. Metallothioneins of monocytes and lymphocytes. Methods Enzymol 1989;
205:291-302.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Corbalán, R., Miñana, MD, Del Olmo, JA, Serra, MA, Rodrigo JM and Felipo, V. Altered modulation of soluble guanylate cyclase in lymphocytes from patients with liver disease J. Mol Med 2002; 80:117-123
Hubbard WC, Bickel C, Schleimer RP. Simultaneous quantitation of endogenous levéis of cortisone and cortisol in human nasal and bronchoalveolar lavage fluids and plasma via gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Anal Biochem. 1994; 221 {1):109-17.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)