La presente invención se encuadra dentro de los campos de la biotecnología, la medicina y de la nanotecnología y, en concreto se refiere a un conjunto de vectores plasmídicos útiles para el análisis nanomecánico de proteínas, preferentemente proteínas con polimorfismo conformacional, y su aplicación en terapia y diagnóstico de enfermedades conformacionales

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las enfermedades neurodegenerativas (EN), tales como Alzheimer, Parkinson, Huntington o las prionopatías, son desórdenes neurológicos incurables que pertenecen al grupo de enfermedades conformacionales. En ellas, a través de un cambio conformacional que supone la ganancia de función tóxica de una proteína neurotóxica (PN), se desencadena un mecanismo de nucleación/polimerización que acaba en la formación de depósitos amiloides y muerte celular en áreas específicas del cerebro.

Recientemente, se ha demostrado que, al menos en el caso de enfermedades producidas por expansión del triplete CAG, como Huntington, es la especie monomérica la que sufre el cambio conformacional primario (de ovillo estadístico (OE; random coil en inglés) a estructura tipo P.que precede a la agregación y a la citotoxicidad (Nagai, Y., et al., 2007. Nat Struct Mol Biol 14(4), 332-340). Por otro lado, en el estudio (Dougan, L, et al., 2009. Proc Nati Acad Sci U S A 106(31 ), 12605-12610) se cita que las regiones de poliglutaminas (Qn=15-75) adoptan estructuras colapsadas cuya estabilidad mecánica debe superar los 800 pN (estructuras hiper-mecanoestables) y discuten la posibilidad de que estas conformaciones superasen la actividad funcional del proteasoma eucariótico, hipótesis de bloqueo mecánico de proteínas neurotóxicas que fue postulada por primera vez en (Carrión-Vázquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245). Por tanto, se asume que las dianas terapéuticas ideales serían los eventos tempranos en la cascada patogénica.

La alta plasticidad conformacional de las PN y su tendencia a agregar hace que su análisis sea complicado mediante las técnicas biofísicas y estructurales clásicas establecidas. De este modo, las técnicas de molécula individual representan una herramienta muy poderosa para el seguimiento de la actividad y cambios conformacionales de proteínas con plasticidad conformacional. Dentro de ellas, las técnicas de nanomanipulación como la microscopía de fuerza atómica en su variante de espectroscopia de fuerza de moléculas individuales (AFM-SMFS), permiten relacionar la estabilidad mecánica de una PN con una conformación concreta. Este aspecto es muy interesante ya que se sabe que la ganancia de función tóxica de las PN se relaciona con su adquisición de estructura tipo β, estructura mecánicamente más estable que la α-hélice o el OE.

El único vector de expresión disponible para el análisis monomolecular de proteínas desestructuradas, como por ejemplo las PN, es un vector de expresión plasmídico basado en la estrategia de las poliproteínas desarrollado en el año 2002, que contiene secuencias repetidas del dominio 127 de la titina (127, marcador bien caracterizado mediante AFM- SMFS). Dicho vector posee una gran versatilidad, siendo posible reemplazar cada módulo 127 por la proteína a analizar, generando hetero- poliproteínas (Steward, A., et al., 2002. Protein Sci 1 1 (9), 2179-2183). Sin embargo, la zona inicial de los espectros normalmente se encuentra contaminada hasta la aparición de un patrón periódico en forma de "dientes de sierra" y si la proteína de interés muestra fuerzas más bajas que el marcador (como es esperable en las PN) los picos de fuerza de la proteína bajo estudio aparecerían en esta zona contaminada y podrían resultar enmascarados. Por tanto, a pesar de lo exitosa que ha sido la estrategia de las heteropoliproteínas para el análisis nanomecánico de proteínas por AFM-SMFS, para el caso de las PN no es suficiente para asegurarnos el éxito en los experimentos. Además, el clonaje de la proteína de interés flanqueada de módulos 127 podría suponer una libertad conformacional muy reducida, impidiendo que la PN explore el cambio conformacional que desencadena el proceso de agregación y citotoxicidad. De forma que, aunque se ha propuesto que las PN, sustrato de proteasas y chaperonas, las cuales despliegan mecánicamente a sus proteínas sustrato, podrían bloquear mecánicamente estas maquinarias, no se ha podido demostrar ni la plasticidad conformacional ni la existencia de conformaciones mecánicamente hiper-mecanoestables en las PN.

Por todo ello, a pesar de la relevancia que tiene en la búsqueda de nuevas dianas farmacológicas para el tratamiento y/o prevención de EN el seguimiento de los cambios conformacionales de PN, aún no existe un método que permita un correcto análisis monomolecular de los cambios conformacionales en dichas proteínas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un conjunto de vectores de expresión (pFS-1 y pFS-2) optimizados para el análisis nanomecánico de proteínas que constituyen un sistema de gran utilidad para la exploración de las propiedades mecánicas de proteínas, preferentemente proteínas con polimorfismo conformacional, más preferentemente proteínas desestructuradas y aún más preferentemente PN. Debido a que la nanomecánica de proteínas permite descubrir al mínimo detalle, a nivel de molécula individual y en tiempo real, el funcionamiento interno de la maquinaria de las proteínas encargadas de la mayoría de las funciones celulares, la posibilidad de poder manipular y analizar mecano- químicamente las moléculas de proteína una a una nos permitirá conocer los principios fisico-químicos que gobiernan el diseño de la mecánica del funcionamiento interno de las proteínas, abriendo las puertas a una gran cantidad de aplicaciones potenciales en campos tan diversos como la medicina o la industria.

Desde el punto de vista médico, la dilucidación de mutaciones mecánicas y conformaciones o complejos proteicos aberrantes cuya estabilidad mecánica anómala pudiera resultar patológica para el ser humano, resultaría de gran utilidad en el descubrimiento de dianas terapéuticas involucradas en distintas patologías.

Los vectores de la presente invención contienen una serie de elementos que dan lugar a un sistema optimizado para el análisis nanomecánico eficaz de proteínas:

- Módulo espaciador (región N2B de la titina) que se despliega sin ofrecer picos de resistencia mecánica detectables por AFM-SMFS y sirve para alejar los picos de fuerza experimentales de la zona proximal en los espectros fuerza-extensión, habitualmente contaminada.

- Dianas de enzimas de restricción que permiten un proceso de clonaje simple y direccional de cualquier proteína produciendo un sistema de clonaje muy versátil para el análisis nanomecánico de proteínas.

- Etiquetas de purificación por afinidad en cada extremo que favorecen la obtención de preparaciones enriquecidas en especies no truncadas (o full-length en inglés) de la proteína y el anclaje a superficies de AFM-SMFS tratadas mediante métodos establecidos: Histag-ΝΊΑ (de las siglas en inglés, ácido nitrilo triacético-Ni ²⁺ ) y cisteínas-oro.

- El vector pFS-2 además posee un MCS (de las siglas en inglés, sitio de clonaje múltiple) para el análisis nanomecánico y estructural de cualquier proteína con plasticidad conformacional y, preferentemente, las proteínas desestructuradas.

Por tanto, los vectores de la presente invención se presentan como candidatos idóneos para el análisis nanomecánico y estructural de proteínas individuales resolviendo así el problema técnico producido por la dificultad de analizar proteínas y en especial proteínas desestructuradas como las PN con los métodos actuales.

A lo largo de la presente invención se demuestra que el uso de estos vectores resulta altamente eficaz en el análisis de confórmeros o mutantes cuya estabilidad mecánica anómala pudiera resultar patológica dando lugar a enfermedades como ciertas sorderas hereditarias (ejemplo 1 ), EN (ejemplo 2) u otro tipo de enfermedades que cursen con un cambio conformacional que suponga la ganancia de función tóxica de una proteína o una mutación que altere la estabilidad mecánica.

Estos confórmeros detectados, cuya identificación estructural escapa de las estrategias utilizadas hasta el momento, pueden constituir biomarcadores y dianas terapéuticas. De forma, que el uso de estos vectores, combinado con la verificación de los resultados mediante un inhibidor que desplace el equilibrio conformacional desde la conformación de la proteína que produce toxicidad a una conformación donde la proteína es inocua, constituye un método de detección y/o cuantificación de confórmeros tóxicos, donde dichos confórmeros tóxicos pueden ser dianas terapéuticas y biomarcadores.

Además, el polimorfismo conformacional detectado mediante el análisis nanomecánico, podría emplearse para la identificación de nuevos agentes terapéuticos.

Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión, en adelante primer vector de la invención o vector pFS-1 . El primer vector de la invención es un vector de expresión apropiado para su introducción en una célula de expresión adecuada, como por ejemplo pero sin limitarse la cepa C41 (DE3) de Escherichia coli con la secuencia codificante del vector de la invención clonada dentro de un vector comercial como por ejemplo pero sin limitarse, el vector pRSETA, si bien otras combinaciones de vector/cepa bacteriana también son posibles (ver sección de Materiales y Métodos). La introducción de dicho vector en la célula de expresión puede realizarse por cualquier método convencional de transferencia de material genético de bacterias. El primer vector de la invención comprende: una secuencia nucleotídica que codifica para una poliproteína formada por al menos seis proteínas marcadoras, en adelante proteína o proteínas P, donde la poliproteína puede estar formada por repeticiones de la misma o distintas proteínas marcadoras P, una secuencia nucleotídica que codifica para un fragmento de entre 100 y 250 aminoácidos de una proteína espaciadora distinta de P que se sitúa entre dos proteínas P consecutivas, en adelante proteína espaciadora y, al menos, un sitio de restricción situado entre la secuencia nucleotídica que codifica para dos proteínas P o entre una proteína P y la proteína espaciadora, en adelante sitio o sitios de restricción del vector de la invención. En una realización preferida de la presente invención la proteína P es cualquier proteína que presenta, al menos, un pico de fuerza en AFM- SMFS, preferentemente ubicuitina y/o el módulo 127 de la titina (127), y mas preferentemente ubicuitina, proteína que además tiene la ventaja de poseer actividad chaperona mediante la que podría asistir al plegamiento de la proteína de interés cuando se encuentra en el extremo N-terminal de ésta. Así, el vector de la invención está basado en una estrategia de cassette (Steward, A., J. L. Toca-Herrera, Clarke, J. 2002. Protein Sci 11 (9), 2179-2183), empleando repeticiones de ubicuitina.

En otra realización preferida, la proteína espaciadora es cualquier proteína que no presenta picos de fuerza en AFM-SMFS como por ejemplo, pero sin limitarse, la elastina, las regiones PEVK o N2B de la titina humana cardiaca, proteínas en hélice α o mutantes del GB1 . Preferentemente la proteína espaciadora es la región N2B de la titina y más preferentemente, el fragmento de la proteína espaciadora que se sitúa entre dos proteínas P es SEQ ID NO: 1

La proteína espaciadora se despliega sin ofrecer resistencia detectable por AFM-SMFS actuando como un espaciador que aleja los eventos de desplegamiento de la proteína en estudio de la zona proximal de los espectros, evitando posibles contaminaciones de los datos.

El AFM-SMFS permite la manipulación y análisis nanomecánico de moléculas individuales de proteína, a través de un transductor mecanoeléctrico, es decir, un dispositivo que mide fuerzas mediante la conversión de energía mecánica en energía eléctrica. El método AFM- SMFS permite describir a escala nanométrica el despliegue mecánico de una proteína, gracias a la medición directa de las fuerzas (en piconewton, pN) y las distancias implicadas (en nanómetros, nm). El segmento de la proteína a analizar se ancla, mediante procedimientos físicos o químicos, por dos puntos: a un cubreobjetos móvil y a un brazo sensor flexible. Gracias al brazo flexible, con sensibilidad en el rango de los pN, y a un posicionador piezoeléctrico, capaz de producir desplazamientos con precisión por debajo del nanómetro, esta técnica permite detectar y medir la estabilidad mecánica de las barreras de resistencia que presenta una proteína al estiramiento (en la presente invención se empleó una velocidad de estiramiento constante para todos los experimentos de 0.4 nm/ms), así como a su localización. Las proteínas desestructuradas no fibrilogénicas son las que menor estabilidad mecánica presentan, y les siguen por orden creciente de estabilidad las proteínas ricas en hélices α y las proteínas ricas en estructura β. En el caso de proteínas o módulos proteicos con estructura terciaria, como el módulo 127 de la titina o la ubicuitina, el diagrama que representa la extensión de la poliproteína en función de la fuerza de resistencia suele tomar la forma de una sucesión de "dientes de sierra", donde cada pico corresponde al desplegado de cada repetición de que consta la poliproteína. Mientras que, en el caso de proteínas que carecen de estructura terciaria, como la elastina o las regiones PEVK o N2B de la titina, la construcción de poliproteínas híbridas, en las que se incorpora repeticiones de un módulo conocido que presente picos de fuerza, posibilita la identificación inequívoca de esta proteína incorporada.

Por tanto, el término "proteína que presenta, al menos, un pico de fuerza en AFM-SMFS" en la presente invención hace referencia a aquellas proteínas que al ser analizadas mediante AFM-SMFS presentan un diagrama de extensión de la poliproteína en función de la fuerza de resistencia con, al menos, un pico de fuerza, es decir, proteínas estructuradas o parcialmente estructuradas o, como también se describe en la presente invención proteínas mecanoestables, como la ubicuitina o el módulo 127 de la titina (127), o hiper-mecanoestables. El término "proteína que no presenta picos de fuerza en AFM-SMFS" en la presente invención hace referencia a aquellas proteínas que al ser analizadas mediante AFM-SMFS presentan un diagrama de extensión de la poliproteína en función de la fuerza de resistencia sin picos de fuerza, es decir, proteínas desestructuradas o, como también se describe en la presente invención proteínas con baja estabilidad mecánica como la elastina, las regiones PEVK o N2B de la titina humana cardiaca, proteínas en hélice α o mutantes del GB1 .

El término "proteína mecanoestable" tal y como se emplea en la presente invención, define el estado en el que se encuentran las proteínas cuando experimentan valores de F _u superiores a 20 pN, a la velocidad de estiramiento empleada.

El término "proteína hiper-mecanoestable" tal y como se emplea en la presente invención, se define como el estado en el que se encuentran las proteínas cuando experimentan valores de F _u superiores a 400 pN, a la velocidad de estiramiento empleada.

El término "proteína con baja estabilidad mecánica" tal y como se emplea en la presente invención, se define como el estado en el que se encuentran las proteínas cuando experimentan valores de F _u inferiores a los del marcador, a la velocidad de estiramiento empleada.

En la presente descripción, el término "F _u " o "fuerza de desplegamiento" hace referencia a la magnitud de los picos de fuerza en un diagrama fuerza-extensión. Así, a diferencia de otras técnicas estructurales, la AFM-SMFS constituye un método de gran utilidad para la exploración de las propiedades mecánicas de las proteínas con polimorfismo conformacional permitiendo analizar no sólo proteínas con estructura terciaria, sino también proteínas desestructuradas.

En otra realización preferida en vector de la invención además comprende al menos en uno de sus extremos una secuencia nucleotídica que codifica para una etiqueta de purificación de proteínas. Preferentemente en cada uno de los extremos hay una etiqueta para la purificación por afinidad de las proteínas, para facilitar el proceso de purificación y aumentar la población de especies no truncadas ni degradadas en la muestra. Así, el vector de la invención contiene una cola de Histidinas (His-tag) que se sitúa en el extremo 5 ^* que se puede emplear también como etiqueta de inmovilización en el sustrato de AFM (Klein, D. C, et al., 2003. Chemphyschem 4(12), 1367-1371 ), mientras que en el extremo 3 ^' contiene una secuencia de 8 aminoácidos (Strep-tag; SEQ ID NO: 2) y dos residuos de cisteína que pueden emplearse para su anclaje covalente a sustratos recubiertos de oro (Rief, M., et al., 1997. Science 276(5315), 1 109-1 1 12).

En otra realización preferida el primer vector de la invención además comprende un sitio de restricción situado en el extremo 5 ^' de cada una de las secuencias nucleotídicas que codifican para cada una de las proteínas P. En una realización más preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína P que se sitúa en el extremo 3' del vector contiene además un sitio de restricción en su extremo 3'. Así, el primer vector de la invención puede contener, pero sin limitarse, sitios de restricción para las enzimas BamHI (GGATCC), Xbal (TCTAGA), Notl (GCGGCCGC), Spel (ACTAGT), BssHI l (GCGCGC), Xhol (CTCGAG) y Kpnl (GGTACC) entre otras (Fig 1 (a)). En la presente invención se ha usado el primer vector de la invención con la protocadherina 15 (PCDH15) de las células ciliadas de la cóclea, una proteína empleada para el análisis de mutaciones con efecto mecánico empleadas en formas hereditarias de la sordera, demostrando la utilidad del vector (ejemplo 1 ).

En otra realización preferida el vector de la invención además comprende una secuencia de clonaje múltiple (MCS, en adelante MCS del vector de la invención) insertada en el interior de una de las secuencias nucleotídicas que codifica para una de las proteínas P. Preferentemente la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína P que alberga el MCS se sitúa: a. entre las secuencias nucleotídicas que codifican para dos proteínas P, y/o

b. entre la secuencia nucleotídica que codifica para una proteína P y la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína espadadora. Dicho MCS está oculto a la fuerza tras la barrera mecánica de la proteína P según se describe en (Carrión-Vázquez, M., et al., 2003. Nat Struct Biol 10(9), 738-743) para clonar la proteína de interés, de tal manera que dicha proteína P debe desplegarse mecánicamente antes que lo haga la proteína de interés albergada dentro de él.

Preferentemente la MCS presente en el vector de la invención es SEQ ID NO: 3. Dicha secuencia contiene los sitios de clonaje para >4gel (ACCGGT), BsiW\ (CGTACG), Mlu\ (ACGCGT) y Sma\ (CCCGGG). En adelante, para hacer referencia al vector que comprende el primer vector de la invención y el MCS del segundo vector de la invención, se puede emplear el término segundo vector de la invención o vector pFS-2.

Por tanto, el segundo vector de la invención contiene un espaciador (el N2B) para evitar contaminaciones de los datos en los espectros de fuerza y una proteína P (preferentemente ubicuitina o 127) que contiene un MCS para albergar la proteína de interés (estrategia de la "proteína hospedadora") si se prevé que su resistencia mecánica será baja y con un patrón variable de incremento de la longitud de contorno de la molécula (ALc) o incluso desestructurada (Fig 2).

En la presente descripción, el término "ALc" o "incremento de longitud de contorno" hace referencia a a la variación en longitud que experimenta la molécula entre dos picos de fuerza consecutivos. En la presente invención se ha aplicado la estrategia de la "proteína hospedadora" con diferentes proteínas estructuradas y desestructuradas, (fibrilogénicas y no fibrilogénicas), en especial con proteínas neurotóxicas, demostrando así la gran utilidad del segundo vector de la invención (ejemplo 2). Así, por ejemplo, cuando se usaban proteínas neurotóxicas, el análisis nanomecánico mostraba un elevado polimorfismo conformacional y la presencia de confórmeros estructurados, es decir confórmeros con una estabilidad mecánica detectable en forma de pico de fuerza por la técnica AFM-SMFS (mecanoestables y/o hiper- mecanoestables).

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula de expresión, trasformada con el primer vector de la invención, en adelante primera célula hospedadora de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a una célula de expresión, trasformada con el segundo vector de la invención, en adelante segunda célula hospedadora de la invención. Cada una de las células de expresión de la presente invención son células de expresión transformadas con el vector de la invención correspondiente. Preferentemente, las células de expresión pertenecen a un microorganismo, más preferentemente a una bacteria.

Aunque en los ejemplos de la presente invención se ha usado la cepa C41 (DE3) de E. coli como cepa de expresión, estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones de la invención que aquí se reivindica, pudiéndose utilizar como células de expresión cualquier otro organismo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular, que comprende la primera célula de expresión de la invención, en adelante primera población celular de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular, que comprende la segunda célula de expresión de la invención, en adelante segunda población celular de la invención.

Las poblaciones celulares según el párrafo anterior estarán formadas por sus respectivas células de expresión en combinación entre sí o en combinación con otras líneas celulares no obtenidas según la presente invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer o segundo vector de la invención y/o primera o segunda célula de expresión de la invención y/o primera o segunda población celular de la invención para el análisis nanomecánico in vitro o ex vivo de proteínas y, preferentemente para la detección y/o cuantificación de proteínas. Más preferentemente de proteínas con polimorfismo conformacional, donde aún más preferentemente las proteínas con polimorfismo conformacional son PN. Preferentemente, las proteínas neurotóxicas se seleccionan de la lista que comprende α-sinucleína, tractos de poliQ, priones, o -amiloide (y sus mutaciones). En una realización preferida, el análisis de dichas proteínas se hace mediante AFM-SMFS. El término "proteína con polimorfismo conformacional" hace referencia a las proteínas que presentan distintos confórmeros, es decir, a las proteínas que presentan distintas estructuras que se obtienen al girar, alrededor de enlaces simples, la parte de la molécula situada a un lado del enlace con respecto a la localizada al otro lado del mismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de análisis nanomecánico de proteínas neurotóxicas, en adelante "primer método de la invención" que comprende: a. Introducir en el primer o segundo vector de expresión de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica para dicha proteína neurotóxica en el sitio de restricción del vector de la invención o en la MCS del vector de la invención,

b. cultivar al menos una célula transformada con el vector según el apartado (a) en medio adecuado para el crecimiento de dicha célula,

c. lisar las células obtenidas en (b) y aislar y/o purificar las proteínas recombinantes,

d. detectar y/o cuantificar la presencia de confórmeros estructurados en la proteína recombinante aislada y/o purificada según el apartado (c).

Donde el método de análisis nanomecánico es un método de detección y/o cuantificación de proteínas neurotóxicas.

En una realización preferida, el primer método de la invención además comprende comparar la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados obtenidos en el paso (d) del primer método de la invención con la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados que se obtienen en una proteína control o proteína tratada.

Preferentemente, la proteína control, en adelante proteína control o proteína tratada de la invención, es la proteína neurotóxica que se desea detectar y que se obtiene en el paso (c) del primer método de la invención a la que se le añade un péptido inhibidor de proteínas neurotóxicas, preferentemente un péptido inhibidor de la la amiliodogénesis y, más preferentemente, el péptido inhibidor QBP1 -M8.

El péptido inhibidor, en la presente invención, es añadido a la proteína neurotóxica que se desea detectar por cualquier método conocido en el estado de la técnica, como por ejemplo pero sin limitarse mediante incubación (ejemplo 2, apartado 2.6).

En la presente invención se demuestra que si se añaden péptidos inhibidores de la amiliodogénesis, como por ejemplo el péptido QBP1 -M8 (SEQ ID NO: 4) a las proteínas neurotóxicas se reduce la presencia de confórmeros proteicos estructurados (mecanoestables y/o hiper- mecanoestables), de forma que se demuestra que existe una buena correlación entre las EN y la existencia de polimorfismo conformacional de sus PN causales. También se comprueba que el equilibrio conformacional existente puede desplazarse en ambos sentidos: hacia mayor número de confórmeros estructurados (por mutaciones que originan EN hereditarias) y hacia mayor número de conformaciones OE (por el péptido QBP1 -M8 y mutaciones no fibrilogénicas) (ejemplo 2, Figura 9). Los efectos inhibidores del péptido QBP1 -M8 (Tomita, K., et al., 2009. Bioorg Med Chem 17(3), 1259-1263) y su capacidad de suprimir la neurodegeneración en Drosophila (Popiel, H. A., et al., 2007. Mol Ther 15(2), 303-309) para el caso de tractos de poliQ han sido ya reportados (US 2003/0229019). El péptido inhibidor puede ser obtenido por cualquier método convencional conocido en el estado de la técnica. Así, el péptido inhibidor pueden ser natural, recombinante o sintético. Preferentemente, dicho péptido es producido a través de síntesis química convencional de péptidos por ejemplo, mediante el método de síntesis en fase sólida en el que los aminoácidos se unen de forma individual y secuencial a la cadena aminoacídica (materiales y métodos, apartado 6).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de screening de nuevos agentes terapéuticos, biomarcadores tempranos o de evaluación de factores de riesgo, en adelante "segundo método de la invención" que comprende los pasos (a) a (d) del primer método de la invención y además: a. detectar y/o cuantificar la presencia de confórmeros proteicos estructurados que se obtienen cuando se analiza la proteína neurotóxica recombinante obtenida según el paso (c) del primer método de la invención a la que se le añade el agente terapéutico y,

b. comparar la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados que se obtienen en el paso (a) con la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados obtenidos en el paso (d) del primer método de la invención o con la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados obtenidos con la proteína tratada de la invención. La detección y/o cuantificación de la presencia de confórmeros proteicos estructurados tanto en el primer como en el segundo método de la invención se realiza mediante AFM-SMFS. El análisis nanomecánico mediante AFM-SMFS de PN (combinado con el uso del inhibidor QBP1 -M8) sería un método de diagnóstico precoz (debido a que funciona a nivel de monómero) y ultrasensible (debido a que la AFM-SMFS es un método monomolecular: sensible a una sola molécula) de EN, puesto que sería capaz de detectar los confórmeros tóxicos (por diferencia entre la proteína tratada y no tratada: la población de confórmeros que desaparece).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del inhibidor QBP1 -M8 para la detección y/o cuantificación de confórmeros de proteínas con polimorfismo conformacional tóxico.

Debido a que la presente invención demuestra que el uso de QBP1 -M8 reduce la cantidad de confórmeros proteicos estructurados en a- sinucleínas, tractos de poliQ y priones, pero por el contrario no afecta a proteínas -amiloides como la proteína A/31 -42 Arctic, mutación implicada en la enfermedad de Alzheimer (ejemplo 2, apartado 2.6), otro aspecto de la invención se refiere al uso del inhibidor QBP1 -M8 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neurodegenerativas a excepción de Alzheimer, donde preferentemente, las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan de la lista que comprende enfermedades poliglutamínicas, Parkinson y enfermedades priónicas.

El término "medicamento" tal como se define en la presente invención, se refiere a una sustancia o conjunto de sustancias que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto y que implique una mejora del estado general de su salud, y, preferentemente un efecto terapéutico es decir, un efecto fisiológico normalizador o curativo en el metabolismo del sujeto. El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento y/o prevención de enfermedades en seres humanos o que puedan usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas y/o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "célula transformada" se refiere a la introducción de al menos uno de los vectores de la invención, en una bacteria. La introducción de dicho vector en la célula de expresión puede realizarse por cualquier método convencional de transferencia de material genético en bacterias (Materiales y Métodos).

El medio de cultivo adecuado de la célula de expresión transformada al que se refiere cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, así como las condiciones de cultivo (como por ejemplo, pero sin limitarse a, nutrientes, pH o T ^a ) se seleccionan en función de la naturaleza de la célula hospedadora (Materiales y Métodos).

La detección y/o cuantificación de los confórmeros proteicos de la proteína recombinante se realiza mediante AFM-SMFS.

La purificación de la/s proteína/s recombinante/s según el paso (c) de cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, se puede llevar a cabo por métodos de purificación conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cromatografía de afinidad (Materiales y Métodos). Las proteínas que se expresan en los métodos de la invención están preferentemente pero sin limitarnos marcadas con una secuencia aminoacídica en al menos uno de sus extremos de manera que puedan ser detectadas y purificadas fácilmente.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de los confórmeros hipermecanoestables y sus precursores como diana terapéutica y biomarcadores en EN. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para clonaje, expresión y purificación de proteínas que comprende el primer vector de la invención, la primera célula de expresión de la invención o la primera población celular de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el segundo vector de la invención, la segunda célula de expresión de la invención o la segunda población celular de la invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra la poliproteína pFS-1.

Fig. 1A. Representación esquemática de la poliproteína pFS-1. Los módulos de ubicuitina se representan por cajas grises y nombrados por una U seguida por el número del módulo en la proteína de fusión. El fragmento de N2B se representa como un polipéptido no plegado en gris. Además contiene 8 sitios de restricción representados por BamHI, Xbal, Salí, Notl, Spel, BssHIl, Xhol y Kpnl. Fig. 1 B. Muestra un especio típico de fuerza-extensión del pFS-1 . La extensión obtenida por el desplegamiento del N2B se marca en gris. Los picos de fuerza de los módulos de ubicuitina se marcan en negro. ALc para esta proteína 23 nm (valor esperado según (Carrion-Vazquez, M., et al., 2003. Nat Struct Biol 10(9), 738-743). En el eje de abscisas se representa la extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza.

FIG. 2. Muestra la poliproteína pFS-2.

Fig. 2A. Representación de la estructura del módulo de ubicuitina (en negro, código PDB: 1d3z) y la estructura de la ubicuitina + MCS (gris). El MCS está insertado en el bucle entre los residuos 9 y 10 de la ubicuitina. Está formado por 14 aminoácidos y contiene 4 sitios de restricción (Smal, Mlul, BsiWI y Agel). Fig. 2B. Representación esquemática de la poliproteína pFS-2. El módulo de ubicuitina que contiene el MCS está coloreado en gris oscuro. U, ubicuitina.

Fig. 2C. Muestra un especio típico de fuerza-extensión para la poliproteína pFS-2. El pico debido al desplegamiento de la ubicuitina + MCS está coloreado en gris. En el eje de abscisas se representa la distancia, en el eje de ordenadas se representa la fuerza.

FIG. 3. Muestra la estrategia de la "proteína hospedadora". Fig. 3A. Muestra un especio típico de fuerza-extensión de la proteína pFS-2 + 127. La región N2B inicial se dibuja en gris, los picos de fuerza debidos al desplegamiento de las repeticiones de ubicuitina en negro, el de la ubicuitina hospedadora en gris (ALc= 27 nm) y el del 127 en gris oscuro (ALc= 28 nm). El recuadro muestra una representación de la proteína de fusión ubicuitina (en gris) incorporando dentro de su plegamiento el módulo 127 (en gris oscuro, código PDB: 1 tit). En el eje de abscisas se representa la extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. Fig. 3B. Muestra un análisis de ALc de los elementos de esta proteína de fusión. Todos los histogramas están normalizados. En el eje de abscisas se representa el ALc, en el eje de ordenadas se representa la frecuencia.

Fig. 3C. Muestra los histogramas de Fuerza de desplegamiento (F _u ) de los módulos de la proteína de fusión (valores comparables a los descritos para dichas proteínas (Carrion-Vazquez, M, et al., 2000. Prog Biophys Mol Biol 74, 63-91 ; Carrion-Vazquez, M., et al., 2003. Nat Struct Biol 10(9), 738-743). En el eje de abscisas se representa la fuerza, en el eje de ordenadas se representa la frecuencia. Todos los histogramas están normalizados. Fig. 3D. Muestra el típico espectro fuerza-extensión de la proteína pFS-2 + sinaptobrevina (o VAMP2). En gris se muestra el desplegamiento del módulo ubicuitina hospedador que se continúa con el desplegamiento sin fuerza de la sinaptobrevina (valor de longitud de contorno es 63 nm (-26 nm correspondientes al desplegamiento del módulo ubicuitina hospedador más 37 nm correspondientes al desplegamiento de la sinaptobrevina, considerando un aumento en longitud de 0.4 nm/aminoácido desplegado). En el eje de abscisas se representa la extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. El recuadro muestra una representación del módulo ubicuitina hospedador con la sinaptobrevina incluida dentro de él (código PDB: 2kog).

FIG. 4 Muestra la estrategia de la proteína hospedadora para el análisis nanomecánico de las PN.

Fig. 4A. Representaciones de la estrategia de la proteína hospedadora empleando los módulos ubicuitina e 127 como hospedadores y la proteína sinaptobrevina como huésped. Fig. 4B. Muestra un espectro de DC (dicroísmo celular) de UV-lejano para las proteínas: 1 . ubicuitina; 2. MCS; 3. α-sinucleína wt.; 4. a-sinucleína A30P; 5. α-sinucleína A53T; 6. ubicuitina+a-sinucleína wt.; 7. ubicuitina+a- sinucleína A30P; 8. ubicuitina+a-sinucleína A53T. En el eje de abscisas se representa la longitud de onda, en el eje de ordenadas se representa la elipticidad.

Fig. 4C. Muestra la región a <0.6 ppm de un espectro de RMN monodimensional de ¹ H para la ubicuitina-MCS (1 ), α-sinucleína A53T (2) y ubicuitina + α-sinucleína A53T (3). En el eje de abscisas se representa desplazamiento del protón, en el eje de ordenadas se representa intensidad. DSS, Sal de sodio de 2,2-Dimetil-2-silapentano- 5-sulfonato. Fig. 4D. Muestra una imagen de AFM de las fibras amiloides formadas por la proteína 127 + Sup35NM. Las fibras son de varios cientos de nanometros de longitud y -15 nm de altura. La barra de escala se corresponde con 0.5 μηπ.

Fig. 4E. Muestra una imagen de MET de las fibras amiloides formadas por la proteína I27 + Sup35NM. Las fibras son de varios cientos de nanometros de longitud y de 20-23 nm de anchura. La barra de escala se corresponde con 0.5 μηπ. La imagen se tomó a 50000X aumentos.

FIG. 5. Muestra un análisis de las PN mediante AFM-SMFS.

Fig. 5A. Representación esquemática del vector pFS-2 hospedando una PN (en gris) en el módulo hospedador (H, puede ser ubicuitina o 127). U, ubicuitina.

Fig. 5B. Muestra varios espectros fuerza-extensión mostrando la elevada variabilidad mecánica del prión Sup35NM hospedado dentro del módulo hospedador 127 del pFS-2. Se muestran desde conformaciones tipo OE de Sup35NM (en gris claro en el espectro de arriba), hasta diferentes conformaciones estructuradas con diferente intensidad de estabilidad mecánica (en gris oscuro en el resto de los espectros), con F _u incluso mayores de 400 pN (confórmeros hiper-mecanoestables). En el eje de abscisas se representa la extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. A la derecha se muestra una explicación esquemática de los diferentes espectros mostrados. Las flechas negras indican la adquisición de estructura tipo β.

a, ALCH; b, ALCPN(OE)! C,ALCPN( ).

H, módulo hospedador; PN, proteína neurotóxica; OE, ovillo estadístico; β (estructura tipo β). Fig. 5C. Muestra varios confórmeros hiper-mecanoestables formados por las diferentes PN analizadas en nuestro estudio. En el eje de abscisas se representa la extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. 1 , Q ₆ 2¡ 2, sinucleína-A30P; 3, a P42artic; 4, sinucleína-A53T

FIG. 6. Muestra histogramas de F _u (arriba) y de ALc (abajo) de las proteínas pFS-2 + Q19 (n _m0 iécuias= 111), pFS-2 + α-sinucleína wt (rimoiécuias = 98), pFS-2 + Sup35NM (n _m0 iécuias = 100), pFS-2 + ΑβΪ42 (rimoiécuias = 116) y pFS-2 + VAMP2 (n _mo , _écu , _as = 234).

Los confórmeros de las PN que adoptan una conformación OE (barras grises claras) se representan en los histogramas de F _u por debajo del valor de sensibilidad de fuerza del AFM (-20 pN). Las barras gris oscuro representan las conformaciones estructuradas de las PN (estructura β (β)), algunas de las cuales son hiper-mecanoestables (>400 pN, confórmeros tóxicos putativos). La proteína VAMP2 sirve de control de proteína desestructurada no fibrilogénica que no muestra plasticidad conformacional, y todas las conformaciones presentadas por ella son de tipo OE. En el eje de abscisas se representa la fuerza F _u (arriba) o el ALc (abajo), en el eje de ordenadas se representa la frecuencia.

1 , Qi 9. Abajo: 100% OE.

2, α-sinucleína. Arriba: 2% hipermecanoestable. Abajo: 55% OE, 45% β.

3, SUP35NM. Arriba: 9% hipermecanoestable. Abajo: 36% OE, 64 % β.

4, Αβ1 -42. Abajo: 67% OE, 33% β.

5, VAMP2. Abajo: 100% OE.

FIG. 7. Muestra histogramas de F _u (arriba) y de AL _C (abajo) de las proteínas pFS-2 + Q ₃₅ (n _m oiécuias= 100), pFS-2 + Q ₆₂ (n _m oiécuias = 107), pFS-2 + α-sinucleína A30P (n _m0 iécuias = 92), pFS-2 + α -sinucleína A53T (n _m oléculas = 96), pFS-2 + Αβ1 -42 Arctic (n _m0 iécuias = 102) y pFS-2 + Αβ1 - 42-DM (n _m0 | _écu ias = 396). En todos los casos las mutaciones patogénicas aumentan el porcentaje de confórmeros estructurados, así como el de confórmeros hiper- mecanoestables. ΑβΙ -42-DM (doble Muíante, F19S/L34P) incluye dos mutaciones puntuales (F19S, L34P) que inhiben la plasticidad estructural y la agregación de la proteína Αβ1 -42, y aquí se observa que no presenta conformaciones estructuradas en ningún caso. Las barras gris claro representan las conformaciones OE Las barras gris oscuro representan las conformaciones estructuradas de las PN (estructura β (β)). En el eje de abscisas se representa la fuerza F _u (arriba) o el ALc (abajo), en el eje de ordenadas se representa la frecuencia.

1 , Q.35. Arriba: 1 % hipermecanoestable.Abajo: 95% OE, 5% β.

2, Q _62. Arriba: 3% hipermecanoestable.Abajo: 92% OE, 8% β.

3, α-sinucleína A30P. Arriba: 3% hipermecanoestable.Abajo: 41 % OE, 59% β.

4, α-sinucleína A53T. Arriba: 5% hipermecanoestable. Abajo: 40% OE, 60% β.

5, Αβ1 -42 Artic. Arriba: 1 % hipermecanoestable.Abajo: 38% OE, 62% β.

6, ΑβΙ -42-DM. Abajo: 100% OE. FIG. 8. Muestra histogramas de F _u (arriba) y de AL _C (abajo) de las proteínas pFS-2 + Q ₆ 2 (n _m oiécuias= 124) en presencia de QBP1 , pFS-2 + α-sinucleína A53T en presencia de QBP1 (n _m0 iécuias = 124), pFS-2 + Sup35NM en presencia de QBP1 (n _m0 iécuias = 100), pFS-2 + Αβί-42 Arctic en presencia de QBP1 (n _m0 iécuias = 108), pFS-2 + Αβ1 -42 en presencia de SV111 (n _m0 iécuias = 128.

Los datos mostrados aquí son comparables a los mostrados en el panel quinto de la Fig. 7. QBP1 reduce la adquisición de estructura tipo β en todos los casos excepto en Αβ1 -42. El péptido SV1 1 1 interacciona con el monómero estructurado de Αβ1 -42, inhibiendo su oligomerización y fibrilogénesis. Las barras gris claro representan las conformaciones OE. Las barras gris oscuro representan las conformaciones estructuradas de las PN (estructura β (β)). En el eje de abscisas se representa la fuerza F _u (arriba) o el ALc (abajo), en el eje de ordenadas se representa la frecuencia.

1 , Q.62+QBP1 _. Abajo: 97% OE, 3% β.

2, α-sinucleína A53T+QBP1 . Arriba: 1 % hipermecanoestable. Abajo: 86% OE, 14% β.

3, SUP35NM+QBP1 . Arriba: 1 % hipermecanoestable. Abajo: 73% OE, 27% β.

4, Αβ1 -42 Artic+QBP1 . Abajo: 43% OE, 57% β.

5, ΑβΙ -42+SVI H . Arriba: 1 % hipermecanoestable. Abajo: 70% OE, 30% β-

FIG. 9. Muestra la hipótesis mecánica de la causa primaria de las EN.

Las diferentes PN muestran un elevado polimorfismo conformacional, incluyendo desde confórmeros con baja estabilidad mecánica (que no muestran picos de fuerza en el AFM) hasta confórmeros hiper- mecanoestables. El efecto de los dos péptidos inhibidores empleados en el presente documento se indica en la Figura: el péptido QBP1 desplaza el equilibrio OE-confórmero estructurado hacia la forma OE, y por tanto interrumpe la cascada patogénica presentada en la Figura; y el péptido SV1 1 1 inhibe la oligomerización de los monómeros β-estructurados.

1 , AFM; 2, confórmeros monoméricos; 3, maquinaria de procesado de proteínas de la célula; 4, oligómeros; 5, fibras amiloides; N, normalidad; E, enfermedad.

FIG. 10. Muestra el proceso de clonaje del pFS-1.

Los diferentes pasos secuenciales se describen en el texto principal. FIG. 11. Muestra la inserción del MCS en el módulo de ubicuitina.

Fig. 1 1 A. Muestra el alineamiento de las secuencias de DNA del módulo de ubicuitina, y con la inserción del MCS.

Ubi, SEQ ID NO: 78

Ubi+MCS, SEQ ID NO: 79

Fig. 1 1 B. Muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos, en código de una letra. Los alineamientos se realizaron mediante BOXSHADE.

Ubi, SEQ ID NO: 80

Ubi+MCS, SEQ ID NO: 81

FIG. 12. Muestra que la mutación G267D puede tener efecto mecánico, y esto ser una causa de la enfermedad.

Fig. 12A. Arriba, empleo del pFS-1 donde los módulos ECi-3 de PCDH15 que portan la mutación G267D (en el módulo EC ₂ ) se insertan entre los sitios de restricción Spel y BssHI l . Abajo, muestra un espectro fuerza- extensión, se observa que el módulo EC ₂ que porta la mutación no ofrece resistencia mecánica a su desplegamiento, en el eje de abscisas se representa extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. AL _C (ECi )= 31 nm; AL _C (EC ₂ )= 34nm; AL _C (EC ₃ )= 34nm. Fig. 12B. Muestra histogramas de AL _C (arriba) y de F _u (abajo). Se diferencia el módulo ECi de los demás debido a su menor AL _C . El 83% de los módulos EC ₂ G267D muestran valores de Fu menores a 20 pN (n=35). Arriba, en el eje de abscisas se representa AL _C , en el eje de ordenadas se representa frecuencia Abajo, en el eje de abscisas se representa fuerza, en el eje de ordenadas se representa la frecuencia. Fig. 12C. Muestra un análisis de la proteína pFS-1 +ECi _-2 para poder caracterizar el módulo EC ₂ . Izquierda, espectro fuerza-extensión en el eje de abscisas se representa extensión, en el eje de ordenadas se representa la fuerza. Medio, histograma de F _u (ECi (49 ± 4 pN) El 57% de los módulos EC _2G 267D muestran valores de F _u menores a 20 pN (n=82). Derecha, histograma de F _u (ECi (39 ± 1 1 pN)). El 27% de los módulos EC ₂ muestran valores de F _u menores a 20 pN (n=101 ). Se comprueba que este módulo (EC ₂ ) habitualmente no ofrece resistencia a su desplegamiento.

Fig. 12D. Muestra un modelo de los módulos ECi-3 de PCDH15 y la localización de la mutación G267D.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, donde se pone de manifiesto la efectividad de los vectores diseñados para la detección y/o cuantificación de los distintos cambios conformacionales que puede experimentar una proteína con plasticidad conformacional, como por ejemplo las PN.

A lo largo de estos ejemplos se demuestra que los vectores plasmídicos pFS-1 y pFS-2 descritos en esta invención están optimizados para el análisis nanomecánico de proteínas con baja estabilidad mecánica siendo de gran utilidad para evaluar las distintas conformaciones que adoptan dichas proteínas.

Además, se ha comprobado que la detección de confórmeros con estabilidad mecánica combinado con la verificación mediante un péptido inhibidor como el QBP1 -M8, constituiría un método de diagnóstico precoz y ultrasensible (se trata de un método de molécula individual) de EN cuyo pre-requisito sería el desarrollo de una metodología adecuada para un análisis similar al realizado en esta patente pero a nivel de fluidos corporales en los que se han detectado las PN (como líquido cefaloraquídeo y sangre).

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. Procedimiento de generación del vector pFS-1 y su uso. 1 .1 . Generación del vector pFS-1 .

El proceso de clonaje, expresión y purificación del pFS-1 se explica en la sección de Materiales y métodos. 1 .2. Clonaje en el vector pFS-1 .

Se clonó el fragmento ECi _-3 de la protocadherina 15 (PCDH15 ECi _-3 ) de las células ciliadas de la cóclea, una proteína empleada para el análisis de mutaciones con efecto mecánico implicadas en formas hereditarias de sordera.

Para el análisis nanomecánico de las mutaciones patológicas de la PCDH15 se emplearon como marcadores de monomolecularidad las repeticiones de ubicuitina del vector pFS-1 (Fig. 1 a). Para las mutaciones R139G y G267D de la PDH15, aunque ambas se localizan en los módulos ECi-2 de la PCDH15, la estrategia empleada fue el clonaje de los tres primeros módulos de la PCDH15 en el vector pFS-1 , tanto con la secuencia wt (de las siglas en inglés, tipo silvestre) como con cada una de las mutaciones para poder hacer un análisis comparativo de su estabilidad mecánica (Fig. 12), ya que la mutación G267D se localiza cerca del extremo C-terminal del módulo EC ₂ (Fig. 12d) y la conformación de este extremo podría verse afectada por contener un módulo ubicuitina contiguo en ese extremo perteneciente al pFS-1 en lugar del módulo contiguo natural EC3. Se escogieron los sitios de clonaje Spel y BssHI l del vector pFS-1 para el clonaje de todos los constructos de los ECs descritos anteriormente. Como molde para la amplificación de las secuencias por PCR se empleó un plásmido que contiene el ectodominio completo de la PCDH15 de ratón descrito en Kazmierczak. P., et al., 2007. Nature 449(7158), 87-91 . Los oligonucleótidos empleados se recogen en la Tabla 1 . Se empleó la polimerasa Phusion (Finnzymes) para la PCR, que amplifica secuencias con extremos romos. Una vez amplificadas, se clonaron en el vector pT7blue (Novagen) digerido con Smal, que corta liberando igualmente extremos romos. Se verificaron las secuencias de ECi-3 de la PCDH15 en el vector pT7blue, tras lo que se empleó el kit de mutagénesis QuickChange (Stratagene) para introducir las mutaciones R139G y G267D en ECi_3 de la PCDH15. Una vez verificadas las secuencias de todos los constructos se liberaron del vector pT7blue digiriendo mediante Spel y BssHI l y se clonaron en el vector pFS-1 para su expresión.

Los límites de los módulos se escogieron de acuerdo con los depositados en la base de datos Swiss-Prot (código UniProtKB/Swiss-Prot Q99PJ1 ). De la secuencia de la PCDH15 se escogieron los aminoácidos 45-400 como límite de los módulos ECi-3. Para los procesos de clonaje se empleó la cepa de E. coli XL1 -blue (Stratagene). Todas las secuencias fueron convenientemente verificadas por secuenciación de las dos hebras del DNA del inserto (Secugen).

Tabla 1. Oligonucleótidos empleados para la síntesis de las poliproteínas pFS-1 + EC1 -3.

Todos los oligonucleótidos fueron adquiridos a Sigma-Aldrich. En cursiva se destacan los sitios de restricción introducidos mediante los oligonucleótidos en la secuencia amplificada resultante de la PCR. En los oligonucleótidos que introducen mutaciones, en negrita se destacan las mutaciones introducidas. La secuencia extra en los extremos de las dianas de restricción fue diseñada en base a las recomendaciones de New England Biolabs para aumentar la eficiencia de corte en secuencias lineales de DNA. 1 .3. Uso del vector pFS-1 para análisis monomolecular en AFM-SMFS. • Expresión y purificación de las poliproteínas pFS-1 + ECi-3.

Dado que de los dos mutantes descritos, el único que claramente no disminuye la interacción para la formación del conector apical de las células ciliadas de la cóclea (y por tanto tendrá más interés para comprobar si afecta a las propiedades mecánicas) es el G267D del módulo EC2 de la PCDH15, fue el primero en el que se realizaron los análisis de AFM-SMFS. Todas las proteínas (pFS-1 + ECi _-3 , pFS-1 + ECi_ 3R139G y pFS-1 + ECi-3G267D) fueron expresadas en la cepa de E. coli C41 (DE3) (Miroux, B. y J. E. Walker, 1996. J Mol Biol 260(3), 289-298). Las células fueron cultivadas a 37°C en agitación hasta conseguir una OD595 de 0,6-0,8, a la que se indujo la sobre-expresión de las proteínas recombinantes con 1 mM IPTG durante 4 horas. Las células bacterianas fueron posteriormente centrifugadas, lisadas con lisozima 1 mg/ml y Tritón X-100 al 1 %, como se describe en (Sambrook, J., 1989. New York, 2 ^a Ed., Cold Spring Harbor).

Las proteínas recombinantes fueron purificadas por cromatografía de afinidad de Ni ²⁺ en un aparato FPLC ÁKTA Purifier (GE Healthcare) empleando columnas Histrap HP (GE Healthcare), usando como tampón 50 mM TrisHCI/500 mM NaCI/50 mM imidazol pH 7,5 (el tampón de elución contenía 500 mM de imidazol). La muestra además contenía 1 mM CaCI ₂ . Las fracciones con la proteína recombinante purificada fueron concentradas mediante ultrafiltración empleando filtros Amicon 10K (Millipore). Posteriormente se realizó una purificación de exclusión molecular mediante una columna Hiload 16/60 (GE Healthcare) empleando el tampón 50 mM TrisHCI/150 mM NaCI/1 mM CaCI ₂ pH 7,5, que es también el tampón experimental, y a un flujo de 0.5 ml/min. Las proteínas purificadas se concentraron a aproximadamente 0.3 mg/ml empleando filtros Amicon 10K (Millipore) y fueron almacenadas a 4°C con la adición de 1 mM DTT como agente reductor. La concentración de proteína se estimó mediante espectrofotometría empleando el coeficiente de extinción molar.

• Análisis mediante AFM-SMFS de las proteínas.

Para la adsorción de la muestra al sustrato del AFM, se depositaron aproximadamente 20 μΙ de muestra de proteína a una concentración de aproximadamente 0.3 mg/ml sobre el sustrato, dejándolo incubar durante 15 minutos. Posteriormente, los sustratos eran lavados con 50 mM TrisHCI/150 mM NaCI/1 mM CaCI ₂ pH 7.5. Finalmente, este sustrato se introdujo en el AFM para su análisis (Carrión-Vázquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245). Los experimentos sólo se realizaron en condiciones de 1 mM CaCl ₂ para poder determinar la posible alteración en las propiedades mecánicas de dichos módulos en la concentración de Ca ²⁺ habitual del espacio extracelular (Fig. 12).

Todos los experimentos de AFM-SMFS se realizaron en el modo de longitud constante (o length-clamp en inglés) a una velocidad constante de estiramiento de 0.4 nm/ms (Carrion-Vazquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245). Dado que los módulos ECi-3 de PCDH15 son mecánicamente poco estables, y teniendo en cuenta que lo que se observó fue una desestabilización mecánica del módulo con la mutación (Fig. 12a-c), el único criterio para identificar qué módulo se desestabilizaba fue el valor de AL _C calculado en base a la diferente longitud de los módulos. Sin embargo, a pesar de esta diferencia de longitudes, muchas veces el único criterio de selección era la superposición con curvas que sí que mostraran picos de fuerza correspondientes al desplegamiento de los dos módulos. Únicamente se seleccionaron espectros que mostraron el evento de desplegamiento del módulo con estabilidad mecánica anterior al que no la tiene (esto es, sólo se seleccionaron espectros con un pico de fuerza y un AL _C correspondiente a dos módulos por la falta del segundo pico de fuerza). Este comportamiento implica una dependencia estructural de algún tipo entre los dos módulos, de manera que el de menor estabilidad mecánica se despliega después que el de mayor estabilidad mecánica. El criterio seguido disminuye el número de espectros seleccionados aunque aumenta su fiabilidad ya que el evento de baja fuerza (procedente del módulo que porta la mutación) sale alejado de la zona proximal ruidosa y es fácilmente identificable, ya que el AL _C aumenta prácticamente al doble. De esta forma se evita la posible inclusión en los análisis de espectros artefactuales gracias a que se emplea como poliproteína de fusión el pFS- 1 que contiene un módulo espaciador de la zona inicial de los espectros fuerza-extensión (N2B). Todos los valores medios de fuerza y AL _C se acompañan del SEM. Todos los histogramas están normalizados.

Así, se ha comprobado que el uso del pFS-1 se muestra extremadamente útil debido a las bajas estabilidades mecánicas mostradas por los módulos ECi-3. De haberse usado la estrategia disponible en el campo (hetero-poliproteínas de módulos I27), hubiera existido el riesgo de introducir contaminaciones de los resultados debido al ruido de la zona proximal de los espectros, que podría haber enmascarado los picos de fuerza de los ECs.

EJEMPLO 2. Procedimiento de generación del vector pFS-2 y su uso.

2.1 . Generación del vector pFS-2. El proceso de clonaje, expresión y purificación del pFS-2 se explica en la sección de Materiales y métodos. 2.2. Clonaie en el pFS-2.

Se realizaron dos tipos de clonajes, el clonaje de las PN en el pFS-2, y por otra parte el clonaje del 127 en el pFS-2, ambas expuestas a continuación.

• Clonaje de pFS-2 + PN .

Para el clonaje de la cr-sinucleína humana (UniProtKB/Swiss-Prot P37840, de los residuos 1 -140) se empleó una genoteca de cDNA de cerebro humano completo (Clontech, USA). El péptido Αβ1 -42 humano (UniProtKB/Swiss-Prot P05067) se obtuvo mediante PCR empleando como molde el plásmido pcDNA3-APP, que fue proporcionado por el Prof. Fernando Valdivieso (CBMSO-CSIC). El prión de levadura Sup35NM (residuos 1 -253, UniProtKB/Swiss-Prot Q8TFB8) se obtuvo a partir del plásmido pJCSUP35 {Addgene, USA). Los tractos de poliQ se obtuvieron a partir de plásmidos que contenían 19, 35 y 62 repeticiones de Glutamina proporcionados por el Prof. Yositaka Nagai (Universidad de Osaka). Finalmente, la región citoplásmica (residuos 1 -94) de la proteína sinaptobrevina o VAMP2 {UniProtKB/Swiss-Prot P63045) de rata {Rattus norvegicus) se obtuvo a partir de un clon que contenía la secuencia de la sinaptobrevina completa, proporcionado por el Dr. Richard Scheller {Genentech). Todas las secuencias se clonaron inicialmente en el vector pCR2.1 (Invitrogen) para la secuenciación de las dos cadenas del DNA. Una vez comprobada su secuencia, se empleó el kit QuickChange {Stratagene) para la inserción de las mutaciones A30P y A53T en la α-sinucleína, y las mutaciones Arctic (E22G) y el doble muíante (DM: F19S, L34P) en Aβ^ - 42. Finalmente, todas las secuencias se clonaron en el vector pFS-2 empleando los sitios de restricción Agel-Smal presentes en el MCS del módulo hospedador (tanto ubicuitina como 127).

Para el análisis por AFM-SMFS de Αβ1 -42, Sup35NM, poliQ y VAMP2 se empleó una modificación del pFS-2 en la que el módulo hospedador consiste en la proteína I27, en vez de la ubicuitina (Fig. 4a). Para ello, se reemplazó dicha ubicuitina con el MCS del pFS-2 mediante Spel-BssHIl por un I27 que había sido modificado de la siguiente manera: entre los residuos Ala42-Ala43 del bucle CD del módulo I27 se insertó una secuencia que contenía las dianas de restricción Agel y Smal. De esta forma, la cr-sinucleína y VAMP2 se hospedaban en el módulo ubicuitina, de forma que se mantenían las secuencias GGTG (SEQ ID NO: 1 1 ) y PGTRGG (SEQ ID NO: 12) a ambos lados de ellas (Fig. 11 ); mientras que para todas las demás PN (y VAMP2), que se hospedaban en el I27, se mantenían las secuencias TG y PG a ambos lados de la proteína huésped.

Los oligos mutagénicos empleados para la inserción del MCS en I27 fueron: gaaaggacagcctttgGCAaccggttcatcccgggGCTtcccctgactgtgaaatc (SEQ ID NO:13)

gatttcacagtcaggggaAGCcccgggatgaaccggtTGCcaaaggctgtcctttc (SEQ ID NO:14)

Para los análisis estructurales (RMN, DC) y de agregación/fibrilogénesis (turbidez, Rojo Congo y análisis de imagen por MET e iAFM) de las proteínas de fusión, se clonaron las siguientes secuencias: ubicuitina {UniProtKB/Swiss-Prot P62988), ubi-MCS, σ-sinWT, cr-sinA30P, o- sinA53T, ubi+cr-sinWT, ubi+cr-sinA30P y ubi+cr-sinA53T en el vector pET28a (Novagen) empleando los sitios de restricción Nhel y Salí; y las secuencias I27 (UniProtKB/Swiss-Prot Q8WZ42), I27-MCS _A4 , I27 + Αβ1 - 42, 127 + Api -42 _ARCTIC( E22G), I27 + A^1 -42 _DM (FI 9S,L34P), I27 + Q19, I27 + Q ₃₅ , I27 + Q ₆₂ , Sup35NM, I27 + Sup35NM, I27 + VAMP2 y VAMP2 en el vector pET28a (Novagen) empleando los sitios de restricción Nhel y Xhol . Esta estrategia de clonaje mantiene la secuencia MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMAS (SEQ I D NO:15) en el extremo N- terminal de las proteínas. Todas las proteínas de poliQ (tanto en el vector pET como en el pFS-1 ) están flanqueadas por las secuencias MVSTHHHHHHQQ (SEQ ID NO: 16) y HHGNSGPP (SEQ ID NO: 17) (N- y C-terminal, respectivamente), que corresponden al plásmido original empleado para su obtención (Nagai, Y., et al., 2000. J Biol Chem 275(14), 10437-10442).

Para todas las etapas de clonaje/mutagénesis se emplearon las cepas DH5-cr (Invitrogen) y XL1 -blue (Stratagene). Todas las secuencias se verificaron por secuenciación de las dos hebras del inserto. En la Tabla 2 se lista una relación de todos los oligonucleótidos empleados para todos los clonajes mencionados anteriormente. Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para la síntesis de las poliproteínas pFS-2 + PN.

Nombre (M: mutagénico) SEQ ID

Secuencia 5'→3'

4CCGG7ATGGATGTATTCATG

SIN_pFS_5' SEQ ID NO: 18

AAAGGACTTTCAAAGGC

CCCGGGGGCTTCAGGTTCGT

SIN_pFS_3' SEQ ID NO: 19

AGTCTTGATACCCTTCC

GGTGTGGCAGAAGCACCdGG

A30P_SIN_5' (M) SEQ ID NO:20

AAAGACAAAAGAGG

CCTCTTTTGTCTTTCCTGGTGC

A30P_SIN_3' (M) SEQ ID NO:21

TTCTGCCACACC

GTGGTGCATGGTGTGdCdACA

A53T_SIN_5' (M) SEQ ID NO:22

GTGGCTGAGAAG

A53T_SIN_3 ^' (M) SEQ ID NO:23 CTTCTCAGCCACTGT7G7CAC ACCATGCACCAC

UBISIN/UBIA30P/UBIA53T GAATTCGGCTTGCLAGCATGC

SEQ ID NO:24

pET 5' AAATC

UBISIN/UBIA30P/UBIA53T G AATTCG GCTT G TCGA CTCAT

SEQ ID NO:25

_ΡΕΤ_3' CACCCACCTCTGAGAC

GCLAGCATGGATGTATTCATG

SIN/A30P/A53T_pET_5' SEQ ID NO:26

AAAGG

G TCGA CTCATCAGCTTCAG GT

SIN/A30P/A53T_pET_3' SEQ ID NO:27

TCGTAGTCTTG

ATG4CCGG7ATGGTTTCCACC

(Q)n_pFS_5 ^' SEQ ID NO:28 CATCACCATCACCACCAGCAA

C

TATCCCGGGCGGCGGACCAG

(Q)N_pFS_3 ^' SEQ ID NO:29

AGTTACCGTGATGCTGCTGC

CCAA4CCGGT

VAMP2_pFS_5 ^' SEQ ID NO:30 ATGTCGGCTACCGCTGCCACC

G

TCCCCCGGGCTTGAGGTTTTT

VAMP2_pFS_3 ^' SEQ ID N0:31

CCACCAG

>4CCGG7ATGTCGGATTCAAAC

SUP35NM_pFS_5 SEQ ID NO:32

CAAGGC

CCCGGGATCGTTAACAACTTC

SUP35NM_pFS_3 ^' SEQ ID NO:33

GTCATCC

4CCGGTGATGCAGAATTCCGA

Αβ1-42_ρΡ5_5 ^' SEQ ID NO:34

CATGACTCAGG

CCCGGGCGCTATGACAACAC

Αβ1-42_ρΡ5_3 ^' SEQ ID NO:35

CGCCCACC

ARCTIC MUT Αβ1 -42 5 ^' GGTGTTCTTTGCAGGdGATGT

SEQ ID NO:36

(M) G G GTTC AAACAAAG G

ARCTIC MUT Αβ1 -42 3 ^' CCTTTGTTTGAACCCACATC TC

SEQ ID NO:37

(M) CTGCAAAGAACACC

CATCATCAAAAATTGGTGTCCT

Ρ195_Αβ1 -42_5 ^' (M) SEQ ID NO:38

TTGCAGAAGATGTGGG

CCCACATCTTCTGCAAAGGAC

Ρ195_Αβ1 -42_3 ^' (M) SEQ ID NO:39

ACCAATTTTTGATGATG

GGTGCAATCATTGGACCCATG

Ι_34Ρ_Αβ1 -42_5 ^' (M) SEQ ID NO:40

GTGGGCGGTGTTGTC

GACAACACCGCCCACCATGG

Ι_34Ρ_Αβ1 -42_3 ^' (M) SEQ ID N0:41

GTCCAATGATTGCACC

GGACAGCCTTTGGCAACCGGT

I27MCSA4_5 ^' (M) SEQ ID NO:42

Í44 CCCGGGGCTTCCCC

GGGGAAGCCCCGGG^d4JACC

I27MCSA4_3 ^' (M) SEQ ID NO:43

GGTTGCCAAAGGCTGTCC

CTAGCLAGCATGTCGGCTACC

VAMP2_pET_5 SEQ ID NO:44

GCTGCCACCG

Δ4, delección de 4 nucleótidos.

Todos los oligonucleótidos fueron adquiridos a Sigma-Aldrich. En cursiva se destacan los sitios de restricción introducidos mediante los oligonucleótidos en la secuencia amplificada resultante de la PCR. En los oligonucleótidos que introducen mutaciones, en negrita, se destacan las mutaciones introducidas. La secuencia extra en los extremos de las dianas de restricción fue diseñada en base a las recomendaciones de New England Biolabs para aumentar la eficiencia de corte en secuencias lineales de DNA.

• Clonaje de pFS-2 + 127. Para el clonaje dentro del MCS del módulo 127 (pFS-2 + 127), se seleccionaron los sitios de corte BsiWI y Mlul. De esta manera se mantienen las secuencias de aminoácidos GGTGRS (SEQ ID NO: 50) y TRPGGG (SEQ ID NO: 51 ) pertenecientes al MCS en cada extremo del módulo I27 (Fig. 1 1 ). Como molde para la amplificación por PCR de la secuencia del 127 se empleó un plásmido que contiene 12 repeticiones de I27 (Carrión-Vázquez, M., et al., 1999. Proc Nati Acad Sci U S A 96(7), 3694-3699). 2.3. Uso del vector pFS-2 para análisis monomolecular en AFM-SMFS.

• Expresión y purificación de las poliproteínas pFS-2 + PN.

Las proteínas basadas en el pFS-2 se expresaron en la cepa de E. coli C41 (DE3) (Miroux, B. y J. E. Walker, 1996. J Mol Biol 260(3), 289-298), mientras que las proteínas monoméricas para ensayos estructurales y de fibrilogénesis se expresaron en la cepa BL21 (DE3) (Invitrogen). Las células se cultivaron a 37°C hasta una OD595 de 0,5-0,8, tras lo que se indujo la sobre-expresión de las proteínas recombinantes mediante la adición de 1 mM IPTG durante 4 horas.

Los procesos de lisis y purificación de las proteínas se realizaron de idéntica forma a como se expone anteriormente, con determinadas peculiaridades que se detallan a continuación.

La proteína pFS-2 + cr-sinucleína se purificó, tras el paso de afinidad por His-tag (GE Healthcare), mediante afinidad por Strep-tag empleando columnas de afinidad Streptrap HP (GE Healthcare). Para ello, las fracciones previamente purificadas se concentraron y el tampón se cambió a PBS mediante ultrafiltración empleando filtros Amicon 10K (Millipore). Tras un breve pulso de sonicación, las muestras se purificaron empleando las columnas Streptrap HP, usando como tampón de unión PBS y como tampón de elución PBS/2.5 mM destiobitina. Para el caso de pFS-2 + Αβ1 -42, Sup35NM, poliQ y VAMP2, en lugar de la purificación por Strep-tag se realizó una purificación por exclusión molecular en presencia de 1 ,25-1 ,5 M cloruro de guanidinio (GdmCI, esta concentración no desnaturaliza los módulos de 127 o ubicuitina, (Carrión-Vázquez, M., et al., 1999. Proc Nati Acad Sci U S A 96(7), 3694-3699; Went, H. M., et al. ,2004. FEBS Lett 567(2-3), 333-338) pero permite la eliminación de contaminantes que co-eluyen con la proteína recombinante) empleando una columna Hiload 16/60 (GE Healthcare, el tampón empleado fue TrisHCI 100 mM pH 7.5/1 .25-1 .5 M GdmCI). Para todas las proteínas, todos los procesos de purificación anteriormente mencionados proporcionaron una pureza de las muestras del -90%, tal y como se evaluó mediante electroforesis en SDS-PAGE. Finalmente, las fracciones con proteína purificada se concentraban y el tampón se cambiaba a Tris 10 mM/5 mM DTT pH 7,5 mediante ultrafiltración con filtros Amicon 10K (Millipore) para realizar los experimentos de AFM-SMFS.

Para el caso de las proteínas monoméricas, después de un paso de purificación de cromatografía de afinidad de Ni ²⁺ , se realizó una cromatografía de exclusión molecular en el tampón 100 mM TrisHCI pH 7.5 /1 .25-1 .5 M GdMHCI. Todas las preparaciones alcanzaron una pureza de proteína recombinante >90% tal y como se monitorizó en electroforesis en SDS-PAGE. Las fracciones con proteína purificada se concentraron y el tampón se cambió al adecuado a cada aplicación mediante ultrafiltración empleando filtros Amicon 3K (Millipore).

En todos los casos (poliproteínas y monómeros) la concentración se determinó por espectrofotometría empleando su coeficiente de extinción molar.

• Análisis AFM-SMFS de las proteínas pFS-2 + PN

Una gota de la preparación de proteína (aproximadamente 2-8 μΙ a 3-5 μΜ) se depositaba sobre una gota del tampón Tris 10 mM pH 7.5 que previamente se había depositado sobre el sustrato (tanto portas recubiertos de oro como funcionalizados con NTA-Ni ²⁺ ), y se dejaba adsorber durante 10 min, aproximadamente. Ambos sustratos mostraron idénticos resultados. Para todas las proteínas, los datos se recogieron a lo largo de periodos de 20-30 días después de la purificación de la proteína (la cual se almacenaba a 4°C durante este periodo). Las muestras que se incubaban con los péptidos inhibidores (20 μΜ QBP1 -M8, disuelto en DMSO; o 100 μΜ SV1 1 1 , disuelto en PBS), también se almacenaban a 4°C durante estas incubaciones.

Gracias al empleo del vector pFS-2, se han podido seguir unos criterios de selección de espectros estricto que permite asegurarse que se están estirando moléculas individuales. Estos criterios se pueden resumir como sigue.

2.3.1 . Criterios de asignación de picos de fuerza en las PN:

- Una zona proximal de los espectros preferentemente limpia para evitar contaminaciones en los datos aunque este punto no es estrictamente necesario debido a las ventajas del pFS-2.

- La distancia (AL _C ) entre los picos de fuerza de las repeticiones de ubicuitina debe ser reproducible.

- La poliproteína no debe mostrar más picos que los esperados por su estrategia de clonaje. Esto es únicamente aplicable a las repeticiones del marcador de ubicuitina, debido al polimorfismo conformacional de las PN.

- La longitud total de la molécula no debe ser mayor que la longitud del polipéptido extendido. - Las curvas seleccionadas deben mostrar al menos 4 picos de ubicuitina, para asegurarnos de que hemos estirado el módulo hospedador (Fig. 2b, 5a).

- El módulo hospedador debe desplegarse necesariamente antes que la proteína huésped.

Empleando estos criterios se posee un alto grado de certeza de que se ha analizado una única molécula, y que la proteína en estudio ha sido estirada.

Un posible problema adicional en el caso de las PN es su tendencia a oligomerizar. Así, se han realizado experimentos de control (con el péptido SV1 1 1 y el muíante A/31 -42DM) que impiden la oligomerización, lo que permite comparar los resultados obtenidos en estas condiciones con el resto de condiciones y determinar que todos los resultados provienen del estiramiento de moléculas individuales.

2.4. Validación del uso del vector pFS-2 con proteínas neurotóxicas. Para el análisis nanomecánico por AFM-SMFS de las PN, se hizo uso de la estrategia de la proteína hospedadora, es decir, mediante técnicas de ADN recombinante se clonó la PN en estudio (en concreto para el análisis nanomecánico se empleó tractos de poliQ, cr-sinucleína, el péptido A/31 -42 implicado en la enfermedad de Alzheimer y el prión de levadura Sup35NM) dentro del módulo ubicuitina o I27 hospedador, que constan de un diseño de protección mecánica según el cual siempre debe desplegarse dicho módulo hospedador antes de que lo pueda hacer la proteína huésped (ver la sección Materiales y Métodos para una descripción detallada de los métodos de clonaje de las PN dentro del pFS-2). La Fig. 3 muestra que la estrategia de la proteína hospedadora no altera las propiedades mecánicas de los módulos implicados. Todos los histogramas están normalizados. Cuando se introduce VAMP2 (sinaptobrevina) en el módulo hospedador, (Fig 3d) debido a que esta molécula no muestra estabilidad mecánica, el desplegamiento del módulo ubicuitina hospedador se continua con el desplegamiento sin fuerza de la streptobrevina, adquiriendo un valor de extensión de 63 nm (aproximadamente 26 nm correspondientes al desplegamiento del módulo ubicuitina hospedador más 37 nm correspondientes al desplegamiento de la sinaptobrevina, considerando un aumento en longitud de 0.4 nm/aminoácido desplegado).

El primer paso de validación de la estrategia de la proteína hospedadora para análisis por AFM-SMFS de las PN consistió en la comprobación de que dicha estrategia no afecta las capacidades amiloidogénicas de las PN, así como la comprobación de que no existen interacciones entre el módulo hospedador y la PN que pudieran inducir la formación de conformaciones artefactuales en las PN. Para todos estos ensayos de control se emplearon sólo proteínas de fusión que constaban del módulo hospedador que incorporaba en su plegamiento la PN correspondiente, obviando el resto de las repeticiones constituyentes del pFS-2 para minimizar la complejidad de las medidas. Inicialmente se evaluó la preservación estructural de todas las PN analizadas mediante técnicas estructurales de media (dicroísmo circular, DC, Fig. 4 (b)) y alta resolución (análisis de RMN monodimensionales, Fig. 4 (c)). En todos los casos se observó que la PN mantiene su estructura mayoritariamente tipo OE y que no existen interacciones considerables con el módulo hospedador. La agregación se monitorizó tanto en ensayos de turbidez a 405 nm como en electroforesis en PAGE en condiciones nativas y en inmunoblots empleando anticuerpos específicos contra los oligómeros de todas las PN {A11, Biosource, Camaríllo, CA, USA; (Kayed, R., E. et al., 2007. Mol Neurodegener 2, 18)). Ambas técnicas revelaron que las PN incluidas dentro de los módulos hospedadores eran capaces de agregar en plazos comparables a los mostrados por las PN en estado aislado. La formación de fibras amiloides por las PN incluidas dentro de los módulos hospedadores se monitorizó mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (MET, Fig. 4 (d)) y AFM en su modo de imagen (Fig. 4(e)). También se comprobó que el pFS-2 completo (incluyendo la región de las repeticiones) hospedando el prión Sup35NM era capaz de formar fibras amiloides.

Una vez comprobada la preservación estructural de las PN dentro del módulo hospedador, se analizó la nanomecánica de las PN anteriormente mencionadas: Q19, Q35, Q.62, σ-sinucleína (la tipo wt (de las siglas en inglés, silvestre) y con las mutaciones A30P y A53T), A/31 -42 (la wt y con la mutación Arctic (E22G)) y Sup35NM mediante AFM-SMFS empleando el pFS-2 (Fig. 5a). Para ello, se depositó una gota (habitualmente entre 10 y 30 μΙ) de una preparación pura de proteína (0.2-0.5 mg/ml) en un tampón TrisHCI 10 mM pH 7.5 bien sobre un porta de vidrio funcionalizado con NTA-Ni ²⁺ siguiendo el protocolo de (Klein, D. C, et al., 2003. Chemphyschem 4(12), 1367-1371 ), o bien sobre una superficie de oro (ambas superficies mostraron idénticos resultados). En dichas superficies previamente se había depositado una gota (habitualmente entre 10 y 30 μΙ) del tampón anteriormente mencionado. Se empleó el AFM en su modo de longitud constante (Carrion-Vazquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245) a una velocidad de estiramiento constante de 0.4 nm/ms.

El criterio de selección de registros se basa en la estrategia de la proteína hospedadora, que permite seleccionar únicamente registros monomoleculares y demostrar inequívocamente por una parte la plasticidad conformacional de las PN en base al amplio espectro de conformaciones mecánicas que muestran, y por otra parte la existencia de conformaciones con hiper-estabilidad mecánica (Fig. 5b-c).

Dado que se conoce la secuencia de aminoácidos de las PN analizadas, y dado que en AFM-SMFS se ha establecido que un polipéptido extendido ofrece un aumento en la longitud de contorno de la molécula de 0.4 nm/aminoácido extendido en base a ese aumento se puede asignar una región específica del espectro fuerza-extensión al desplegamiento de las PN (Fig. 5b). No obstante, dado que las PN muestran polimorfismo conformacional, y esto se traduce en una amplia variabilidad en conformaciones mecánicas (o polimorfismo conformacional, esto es, diferentes patrones de picos de fuerza), únicamente si se observa inicialmente el desplegamiento del módulo hospedador (letra a en Fig. 5b) se puede estar seguro de haber estirado la PN (letras b y c en Fig. 5b, se pueden observar inequívocamente desde conformaciones tipo OE, la cual se despliega sin ofrecer resistencia mecánica, hasta diferentes conformaciones estructuradas que muestran diferente intensidad de estabilidad mecánica, las cuales pueden mostrar incluso F _u mayores de 400 pN (confórmeros hiper-mecanoestables que presentan la F _u más elevada reportada en la bibliografía)). En la Figura 5b el módulo H se despliega completamente ("a" en los espectros) siempre antes que la PN hospedada dentro de él ("b" y "c" para las conformaciones OE y con estructura tipo β de la PN, respectivamente). El uso del vector pFS-2 nos permite evitar que los datos relevantes respecto a la PN caigan en la región proximal de los espectros, habitualmente ruidosa).

Sólo si se observa este suceso se pueden adscribir regiones concretas del espectro al desplegamiento de las PN mediante un proceso de adición de las extensiones mostradas (todo aquello que sume el valor de AL _C correspondiente al desplegamiento de la PN completa después del AL _C debido al desplegamiento del módulo hospedador puede adscribirse a su desplegamiento).

Además, los espectros deben mostrar los picos de fuerza del marcador de monomolecularidad (ubicuitina) presente en el pFS-2, la poliproteína no debe mostrar más picos que los esperados por la estrategia de clonaje, y la longitud total de la proteína desplegada no debe ser mayor que la calculada para el polipéptido extendido, para asegurarse de incluir en los análisis únicamente resultados provenientes del desplegamiento de moléculas individuales.

2.5. Descripción de las propiedades mecánicas de las PN caracterizadas gracias al uso del vector pFS-2 y su relación con enfermedades neurodegenerativas.

Gracias al uso del vector pFS-2, se observó un amplio rango de estabilidad mecánica (F _u ) y de AL _C en las PN (Fig. 6). Por otra parte, también fue probable observar más de un pico de fuerza por molécula, lo que indica que las PN son capaces de adquirir diferentes grados de estructura tipo β. La F _u observada va desde valores en el límite de sensibilidad de la técnica de AFM-SMFS: <20 pN a una velocidad de estiramiento de 0.4 nm/ms (Fig. 6, barras grises), hasta valores extremadamente elevados (hasta 1000 pN; Fig. 6), mayores que los correspondientes a las proteínas mecánicamente más estables reportadas, las escafoldinas.

Como se ha dicho, basándose en la resolución de la SMFS, se procedió a plantear la siguiente definición operativa de los confórmeros observados: de baja estabilidad mecánica (<20 pN) y confórmeros mecanoestables (>20 pN). Considerando que la estabilidad mecánica de las proteínas eucariotas se ha observado que en general es inferior a 400 pN (Oberhauser, A. F. y M. Carrión-Vázquez, 2008. J Biol Chem 283(1 1 ), 6617-6621 ), y que las distribuciones de los datos obtenidos de F _u tienden a presentar un espacio despoblado aproximadamente alrededor de este valor (Fig. 6), en la última clase mencionada (confórmeros mecanoestables) se define una subclase a partir del valor F _u de 400 pN, donde los eventos son definidos como hiper-mecanoestables. Estos eventos son muy poco probables, como se verá más adelante (0-8 %), y por tanto están fuera del alcance de las técnicas estructurales y bioquímicas clásicas, que están basadas en grandes poblaciones moleculares y pueden generar únicamente datos promediados.

Basándose en lo establecido en el campo de la AFM-SMFS (que las estructuras tipo β tienden a ser mecánicamente más estables que las hélices a o los OEs; (Carrión-Vázquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245), en lo establecido para la estructura de las PN monoméricas y en la ganancia en estructura β para dichas proteínas en la vía de amiloidogénesis, es razonable asumir que la clase de baja estabilidad mecánica se corresponda probablemente a confórmeros en OE de las PN (Fig. 5b), mientras que las otras dos clases probablemente sean confórmeros con diferente grado de estructura tipo β. La frecuencia de observación de dicho confórmero con estructura tipo β abarca desde el 0% (Qi ₉ ; Q.21 es el mínimo umbral patológico detectado en enfermedades por expansión de glutaminas, específicamente en la ataxia espinocerebelar tipo 6, SCA6; hasta el 63% (Sup35NM) para las PN wt (Fig. 6), lo cual correlaciona adecuadamente con la densidad de fibras amiloides encontradas en el MET. La Tabla 3 resume las frecuencias de cada tipo de confórmero para cada PN analizada.

Por otra parte, como un control negativo para nuestros experimentos se empleó una proteína desestructurada no fibrilogénica (VAMP2). En ninguna de las dos proteínas analizadas (correspondientes a los dos módulos hospedadores empleados en el presente estudio, ubicuitina e 127) se observó polimorfismo conformacional (todas las moléculas mostraban un comportamiento mecánico atribuible a conformaciones en OE) ni hiper-mecanoestabilidad (Fig. 6, Tabla 3). Resultados similares se observaron en el análisis de un doble muíante del péptido Αβ1 -42 que suprime la heíerogeneidad conformacional y fibrilogénesis (F19S/L34P, Fig. 7; Tabla 3, (Wuríh, C, eí al. 2002. J Mol Biol 319(5), 1279-1290)). Dado que esíe muíanle no puede formar oligómeros, esíos resulíados desearían el posible origen de nuesíros daíos en iníeracciones iníermoleculares. Además íambién descartan que nuestros daíos pudieran sean debidos a un posible desanclaje de la molécula del sustraío (sea vidrio u oro).

En resumen, el análisis por SMFS de las cuaíro PN esíudiadas muesíra un comporíamienío similar para íodas ellas: un elevado polimorfismo conformacional y la presencia de confórmeros con hiper-meconesíabilidad mecánica. Se asume que esíos confórmeros hiper-mecanoesíables puedan represeníar confórmeros alíameníe esírucíurados cenírales en la vía de fibrilogénesis, y que esíos confórmeros, o un precursor de ellos, podrían ser la conformación causal de la enfermedad neurodegeneraíiva correspondieníe (medíanle el bloqueo de los moíores moleculares de la maquinaria de procesamienío proíeico).

O O O

Tabla 3. Resumen de los resultados de las propiedades mecánicas de las PN.

Tabla 3 (cont). Resumen de los resultados de las propiedades mecánicas de las PN.

Así, sería esperable que las mutaciones de EN familiares, responsables de una manifestación temprana de la enfermedad, que además exacerban las EN haciéndolas más agresivas y acelerando la tasa de amiloidogénesis, aumenten la formación de confórmeros estructurados y altamente estructurados (o hiper-mecanoestables). Se comprobó esta predicción mediante un análisis de mutaciones representativas de las cuatro PN estudiadas. Para las enfermedades por expansión de poliQ se analizó la proteína Q35 (límite inferior de expansión en la enfermedad de Huntington) y una mutación patológica para esta enfermedad (Q.62), para cr-sinucleína se analizaron las mutaciones de Parkinsonismo familiar A30P y A53T, mientras que para el -amiloide se analizó la mutación Arctic (E693G en la proteína precursora amiloide, APP) que acelera la fibrilogénesis in vitro. Se encontró que todas las mutaciones patogénicas aumentan la frecuencia de confórmeros estructurados (poliQ: de 0% en Q19 a 5, 1 % en Q ₃ s y 7,5% en Q ₆ 2¡ cr-sinucleína: de 44,9% en wt a 59,0% en A30P y 60,4% en A53T; A/31 -42: de 32,8% en wt a 62, 1 % en la mutación Arctic, Fig. 7; Tabla 3).

Asimismo, todas las mutaciones patogénicas analizadas aumentaron la frecuencia de confórmeros hiper-mecanoestables (poliQ: de 0% en Q19 a 1 ,0% en Q ₃₅ y 2,8 % en Q ₆₂ ; cr-sinucleína: de 2,0% en wt a 3,0% en A30P y 5,2% en A53T; A/31 -42: de 0% en wt a 1 ,0% en la mutación Arctic, Fig. 7; Tabla 3). De igual forma, el número de conformaciones por confórmero estructurado (esto es, el número de picos de fuerza por molécula que los muestra) también se incrementó en todas las mutaciones (poliQ: de 0 en Q19 a 1 ,41 en Q ₃ s y 1 ,40 en Q ₆ 2¡ cr-sinucleína: 1 ,52 en wt, 1 ,62 en A30P y 1 ,67 en A53T; Αβ1 -42: de 1 ,43 en wt a 1 ,45 en las mutación Arctic, Tabla 3), lo que parece significar que las mutaciones patogénicas aumentan la adquisición de contenido en estructura tipo β en las PN, además de la formación de confórmeros hiper-mecanoestables. 2.6. Uso del vector pFS-2 con proteínas neurotóxicas y péptidos inhibidores.

Con el fin de comprobar la hipótesis anterior, se repitieron los experimentos pero empleando péptidos inhibidores de la amiliodogénesis. Inicialmente se empleó el péptido QBP1 -M8 (Fig. 8, (Tomita, K., et al., 2009. Bioorg Med Chem 17(3), 1259-1263), un péptido de unión a tractos de poliQ que se ha observado que inhibe el cambio conformacional a β, y por tanto la posterior oligomerización, amiloidogénesis y citotoxicidad de dichos tractos (Nagai, Y., et al., 2007. Nat Struct Mol Biol 14(4), 332-340), así como la supresión in vivo de la neurodegeneración inducida por poliQ (Popiel, H. A., et al., 2007. Mol Ther 15(2), 303-309). Como se muestra en la Fig. 8 y en la Tabla 3, la incubación de Q.62 con QBP1 -M8 reduce efectivamente la frecuencia de confórmeros estructurados (de un 7,5 a un 3,3%), así como la frecuencia de los confórmeros hiper-mecanoestables detectados (de un 2,8 a un 0%). El número de conformaciones por confórmero estructurado también se redujo (de 1 ,40 a 1 ,07), por lo que aparentemente el QBP1 -M8 impide la adquisición de estructura β por parte de Q.62, confirmando la hipótesis anterior.

Como lo que en principio iba a ser un control negativo adicional, se comprobó la actividad de este péptido con las otras tres PN en su forma más severa (Sup35NM, A/31 -42 Arctic y cr-sinucleína A53T, Fig. 8). Sorprendentemente, en lugar del resultado negativo que cabría esperar, la frecuencia de confórmeros hiper-mecanoestables se redujo considerablemente: del 5,2 al 0,4% para α-sinucleína A53T; y del 8,0 al 1 ,0% para Sup35NM. Como se muestra en la Tabla 3, la agregación y fibrilogénesis también se redujeron (o suprimieron) consecuentemente por el QBP1 -M8 en estas dos PN, así como en Q ₆ 2- Sin embargo el QBP1 -M8 con A/31 -42 Arctic no tuvo un efecto similar, ya que aparentemente no impide su polimorfismo conformacional ni su agregación y fibrilogénesis (Tabla 3).

Por todo ello, el efecto común del péptido inhibidor QBP1 -M8 en (al menos) tres de las cuatro PN analizadas sugiere que debe existir una estructura común en dichas proteínas reconocida por este péptido. Por tanto, estos resultados apoyan la observación previa de la existencia de mecanismos moleculares comunes al final del proceso de amiloidogénesis, como la formación de estructuras oligoméricas similares (basadas en la reactividad cruzada del anticuerpo A1 1 contra todas las PN aquí analizadas (Kayed, R., E. et al., 2007. Mol Neurodegener 2, 18), así como la adquisición de una estructura cross- similar en las fibras amiloides. Los resultados presentados en el presente documento sugieren que, además, existen mecanismos moleculares comunes en los primeros pasos de la fibrilogénesis, también al nivel del monómero. Cuanto más temprano es el evento identificado en esta cascada patogénica, más interesante resulta como diana terapéutica.

Finalmente, también se analizó el efecto del péptido inhibidor SV1 11 (Arslan, P.E., et al., 2010. J Mol Biol 12, 1284-1294) en A/31 -42 (Fig. 8). Este péptido inhibe la oligomerización de la proteína A/31 -42, pero se asume que no afecta las fluctuaciones conformacionales del monómero. Consecuentemente, no se observó efecto ni a nivel de polimorfismo conformacional ni en el de frecuencia de confórmeros hiper- mecanoestables (del 32,8 y 0% al 30,2 y 0,8%, respectivamente), lo que apoya la interpretación de que los datos obtenidos de AFM-SMFS se deben a cambios estructurales exclusivos del monómero (Tabla 3) y no son debidos a posibles interacciones intermoleculares. Los tractos de poliQ que causan enfermedad (Q35 y Q.62; los umbrales patológicos en SCA6 y la enfermedad de Huntington están alrededor de 21 -30 y 36-40 residuos de glutamina, respectivamente) permiten la detección y/o cuantificación mediante AFM-SMFS de sus fluctuaciones estructurales, incluyendo la formación de confórmeros hiper- mecanoestables. Este polimorfismo correlaciona tanto con la longitud de poliQ, como con el grado de enfermedad: cuanto más largo es el tracto de poliQ, mayor es la severidad de los síntomas y más temprana es su manifestación y mayor es la frecuencia de confórmeros estructurados y de confórmeros hiper-mecanoestables. Resulta interesante que el tratamiento de Q.62 con el péptido inhibidor QBP1 -M8 reduzca dramáticamente la frecuencia de confórmeros estructurados y de los hiper-mecanoestables. Aunque la naturaleza molecular de los cambios conformacionales que ocurren durante la amiloidogénesis por poliQ permanecen desconocidos, los resultados de la presente invención (para las cuatro PN analizadas, pero en mayor medida para las poliQ) apoyan la denominada hipótesis conformacional en el mecanismo de formación de fibras amiloides, la cual postula que el cambio conformacional del monómero es anterior y desencadenante de su oligomerización.

Así, las PN (y las proteína tipo PN) que causan EN esporádicas (cr- sinucleína, -amiloide y priones) fluctúan nativamente, de tal forma que su polimorfismo conformacional es relativamente alto incluyendo confórmeros estructurados y confórmeros hiper-mecanoestables de baja frecuencia incluso en su forma wt (en diferencia al caso de las poliQ). En las formas familiares de las EN, la presencia de mutaciones en las PN que exacerban la enfermedad (tanto la severidad de los síntomas como su manifestación) aumentan tanto la frecuencia de confórmeros estructurados como la frecuencia de confórmeros hiper-mecanoestables. Asimismo, el tratamiento con el péptido QBP1 -M8 reduce dramáticamente la frecuencia de confórmeros estructurados y de hiper-mecanoestables tanto en α-sinucleína como en Sup35NM. No obstante, el equilibrio conformacional del -amiloide no se vio alterado ni por el QBP1 -M8, ni por el péptido SV1 1 1 (que inhibe la oligomerización pero no el polimorfismo conformacional).

En general, existe una buena correlación entre las EN y la existencia de polimorfismo conformacional (incluyendo confórmeros hiper- mecanoestables) de sus PN causales. En el presente documento se muestra que el hipotético equilibrio conformacional existente puede desplazarse en ambos sentidos: hacia mayor número de confórmeros estructurados (por mutaciones patogénicas) y hacia mayor número de conformaciones OE (por el péptido QBP1 -M8 y mutaciones no fibrilogénicas). La frecuencia tanto de confórmeros estructurados como de hiper-mecanoestables se reduce dramáticamente con QBP1 -M8, por lo que estos confórmeros y/o sus precursores son buenos candidatos como causa primaria de la enfermedad: el hipotético intermedio mal plegado (Fig. 9). En base a la inhibición de la formación de este confórmero intermedio, se puede concluir que son intermedios constituyentes de la vía de amiloidogénesis y neurotoxicidad. La observación de que el polimorfismo conformacional y la hiper-mecanoestabilidad son comunes en todas las PN analizadas indican que también existen mecanismos moleculares relativamente comunes en los pasos iniciales de la amiloidogénesis, y no sólo en las etapas finales, como se creía hasta ahora.

En resumen, en el presente documento se ha desarrollado una nueva estrategia de detección y/o cuantificación inequívoca del polimorfismo de las PN. Esta metodología ha permitido la detección y/o cuantificación de confórmeros hiper-mecanoestables "raros", los cuales se postula que serían los eventos primarios (tanto ellos como sus precursores, Fig. 9) en la cascada patogénica de la EN. Se ha comprobado esta idea empleando mutaciones patogénicas y un inhibidor del cambio conformacional (QBP1 -M8). Los resultados obtenidos apoyan la hipótesis del cambio conformacional anterior a la oligomerización. Los confórmeros hiper- mecanoestables, o quizás mejor sus precursores, podrían constituir una diana farmacológica ideal y un biomarcador de la propensión a las EN. También, se ha identificado que el inhibidor QBP1 -M8 parece bloquear la vía que desemboca en la formación de estos confórmeros hiper- mecanoestables en poliQ, cr-sinucleína y el prión Sup35NM. Mecanísticamente, los confórmeros hiper-mecanoestables podrían bloquear las desplegases de la maquinaria de procesado de la célula, lo que aumentaría su concentración citosólica, afectando a diferentes procesos celulares, y finalmente desembocando en la formación de oligómeros, y posteriormente, fibras amiloides (Carrión-Vázquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245).

EJEMPLO 3. Método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas.

En el presente ejemplo se demuestra como el uso del inhibidor QBP1 -M8 puede ser empleado en un método de diagnóstico precoz y ultrasensible (monomolecular) de EN. Esta metodología requiere el desarrollo de una metodología similar a la documentada aquí pero a nivel de fluidos corporales humanos (líquido cefalorraquídeo y sangre). Así, para la realización de la metodología se purifica una PN de una muestra biológica aislada de un sujeto mediante anticuerpos o cualquier otro método conocido en el estado de la técnica. Esta PN se une covalentemente a al menos dos proteínas P marcadoras de la presente invención en cualquier disposición teniendo en cuenta el diseño descrito en cualquiera de los vectores de la invención, dando lugar a una poliproteína, en adelante poliproteína de la invención. Posteriormente se detectan y/o cuantifican mediante AFM-SMFS la presencia de confórmeros proteicos estructurados de la poliproteína de la invención sola y cuando se le añade un péptido inhibidor de la amiliodogénesis, donde preferentemente ese péptido inhibidor es el péptido QBP1-M8 y se comparan la cantidad y/o tipo de confórmeros proteicos estructurados que se obtienen con y sin la adición del inhibidor. Finalmente se asigna la desviación significativa obtenida de la comparación anterior a la propensión al desarrollo de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Construcción del vector pFS-1 . Para el diseño del pFS-1 nos basamos en la estrategia de cassette descrita en (Steward, A., J. L. Toca-Herrera, Clarke, J. 2002. Protein Sci 11 (9), 2179-2183). Como secuencia molde para la amplificación por PCR del módulo ubicuitina (Ubi) se empleó un clon que contiene el cDNA de 9 repeticiones contiguas de ubicuitina humana (Carrión-Vázquez, M., et al., 2003. Nat Struct Biol 10(9), 738-743).

Con respecto a la secuencia N2B, se decidió no emplear la secuencia completa sino un fragmento de ésta por dos motivos: primero para reducir el tamaño de la poliproteína final (un tamaño de proteína mayor de 100 kDa normalmente reducirá la eficiencia de su expresión en E. coli), y segundo para evitar la formación de enlaces disulfuro dentro de la misma. Sin embargo, el fragmento elegido no debe formar ningún plegamiento, como sucede con el N2B completo. Para asegurarnos de esto, basándonos en las predicciones de estructura secundaria de las diferentes secuencias candidatas de N2B reportadas por PROF (Secondary Structure Prediction System. Aberystwyth University Computational Biology Group. Department of Computer Science, Aberystwyth SY23 3DB, Wales, UK) se seleccionó el fragmento de N2B que comprende desde el residuo D145 hasta el L349 de la proteína completa (ambos inclusive).

Todas las enzimas de restricción elegidas (BamHI, Xbal, Salí, Notl, Spel, BssHIl, Xhol, Kpnl) digieren liberando extremos cohesivos y codifican para dos aminoácidos (GS, SR, VD, TS, AR, LE, GT, respectivamente; en código de una letra), excepto Notl que requiere la introducción de un nucleótido extra para no alterar el marco de lectura (en nuestro caso se introdujo una timina extra). De esta manera, el sitio de corte de Notl codifica para tres aminoácidos (AAA).

El proceso de clonaje secuencial del pFS-1 fue el siguiente (Fig. 10):

1 ) El primer módulo de ubicuitina se clonó en el vector pT7blue (Novagen, Darmstadt, Alemania) via BamHI-Xbal.

2) El fragmento de N2B se insertó en el constructo resultante a continuación del módulo ubicuitina anterior via Xbal-Sall.

3) Para el clonaje del siguiente módulo de ubicuitina, el fragmento de DNA BamHI-Ubi-N2B-Sall se clonó en el vector pET24d (Novagen). A continuación, como los sitios de corte de Salí y Notl se encuentran muy cerca en la secuencia de este vector, y la digestión con cualquiera de estas dos enzimas podría resultar problemática, se insertaron oligonucleótidos sintéticos para separar estos sitios de corte y facilitar dicha digestión. Estos oligonucleótidos contenían las secuencias 5'- GGCCGCCACTGAACCTGC-3' (SEQ ID NO: 52) y 5'- GGCCGCAGGTTCAGTGGC-3' (SEQ ID NO: 53), de tal manera que al ser hibridados (200 μΙ de ambos oligonucleótidos a 100 μΜ se calentaron al baño maría y se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente), se formó un oligonucleótido de doble hebra con extremos cohesivos Notl. Estos oligonucleótidos están fosforilados en el extremo 5' para su ligación con un plásmido digerido con los mismos extremos cohesivos. Por tanto, digerimos mediante Notl el plásmido pET24d que contiene BamHI-Ubi- N2B-Sall e insertamos a continuación este oligonucleótido de doble hebra. A continuación se clonó la siguiente ubicuitina via Sall-Notl.

4) El siguiente módulo ubicuitina se clonó inicialmente en el vector pT7blue (Novagen) via BamHI-Notl-Ubi-Spel. Luego se liberó este fragmento via Notl-Spel, y el fragmento BamHI-Ubi-N2B-Ubi-Notl también se liberó del plásmido pET24d via BamHI-Notl. Ambos fragmentos se clonaron simultáneamente en el vector pT7blue via BamHI-Spel. 5) El siguiente paso de clonaje se refiere al módulo de ubicuitina en la posición 3' de la secuencia de la poliproteína pFS-1 completa. El fragmento BamHI-Xhol-Ubi-Kpnl se clonó en pT7blue via BamHI-Kpnl.

6) A continuación se digirió el plásmido mediante Hindll l-Xhol, y el módulo ubicuitina anterior del pFS-1 se clonó aquí via Hindll l-BssHI l-Ubi-

Xhol. De esta manera obtuvimos la secuencia BssHIl-Ubi-Ubi-Kpnl clonada en el vector pT7blue.

7) Luego se liberó este fragmento mediante BssHIl-Kpnl. El fragmento de PCR Spel-Ubi-BssHIl y la secuencia de DNA anterior se clonaron simultáneamente en el vector pT7blue via Spel-Kpnl.

8) Finalmente, esta secuencia se liberó usando Spel-Kpnl, y la secuencia BamHI-Ubi-N2B-Ubi-Ubi-Spel también se liberó del vector pT7blue usando BamHI-Spel. Ambos fragmentos entonces se clonaron simultáneamente en pRSETA (Stratagene, Texas, USA) o pQE80L (Qiagen, Duesseldorf, Alemania) via BamHI-Kpnl.

Todas las enzimas de restricción utilizadas fueron de Fermentas (Maryland, USA) y New England Biolabs (Massachusetts, USA), la T4 DNA ligasa de Fermentas, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de Roche (Basilea, Suiza) y las DNA polimerasas fueron Taq (Fermentas) y Phusion como polimerasa de alta fidelidad (Finnzymes, Espoo, Finlandia). La relación de los oligonucleotidos empleados para la amplificación de cada unidad del pFS-1 se da en la Tabla 4. Tabla 4. Oligonucleotidos empleados para las diferentes etapas de clonaje del pFS-1.

Nombre Secuencia 5'→3' SEQ ID

CGGGA TCCATGCAAATCTTCG

BamHI-UBI-Xbal 5' SEQ ID NO:54

TGAAGACACTCAC

BamHI-UBI-Xbal 3' GCTCL4G/ACCCACCTCTGAGA SEQ ID NO:55 CGGAGCACC

GCTCL4G/AGATACCGAGAAAA

Xbal-N2B-Sall 5' SEQ ID NO:56

TCTTCCCAAGTG

ACGCGTCG/ACCAAGCTTTCCT

Xbal-N2B-Sall 3' SEQ ID NO:57

TAGAAAGAAGGTCC

CG GGA TCCGTCGACAJGCAA

BamHI-Sall-UBI-Notl 5' SEQ ID NO:58

ATCTTCGTGAAGACACTCAC

AAGGAAAAAAGCGGCCGCCC

BamHI-Sall-UBI-Notl 3' SEQ ID NO:59

CACCTCTGAGACGGAGCACC

CG GGATCCGCGGCCGCTMG

BamHI-Notl-UBI-Spel 5' CAAATCTTCGTGAAGACACTC SEQ ID NO:60

AC

GACTAG TCCCACCTCTG AGAC

BamHI-Notl-UBI-Spel 3' SEQ ID NO:61

GGAGCACC

G CT4 G TATGCAAATCTTCGT

Spel-UBI-BssHII 5' SEQ ID NO:62

GAAGACACTCAC

TTGGCGCGCCCCACCTCTGA

Spel-UBI-BssHII 3' SEQ ID NO:63

GACGGAGCACC

CCCA4GCTTGCGCGCATGCA

Hindlll-BssHII-UBI-Xhol 5' SEQ ID NO:64

AATCTTCGTGAAGACACTCAC

CCGCTCG \GCCCACCTCTGA

Hindlll-BssHII-UBI-Xhol 3' SEQ ID NO:65

GACGGAGCACC

CG GGA TCCCTCGA GATGCAA

BamHI-Xhol-UBI-Kpnl 5' SEQ ID NO:66

ATCTTCGTGAAGACACTCAC

GGGGL4CCTTATTAACAACAC

BamHI-Xhol-UBI-Kpnl 3' CCACCTCTGAGACGGAGCAC SEQ ID NO:67

C

GGTGCTCCGTCTCAGAGGTG G GTG GTCACACCCACAATTC

Inserción Streptag 5' SEQ ID NO:68

GAGAAGTGTTGTTAATAAGGT ACC

G G TA CCTTATTAACAAC ACTT CTCGAATTGTGGGTGTGACCA

Inserción Streptag 3' SEQ ID NO:69

CCCACCTCTGAGACGGAGCA CC

CGTG AAG ACACTCACT GGTG

Inserción MCS 1 5' GAACCGGTCGTACGTCAGGC SEQ ID NO:70

AAGACCATCACCCTTG

CAAGGGTGATGGTCTTGCCT

Inserción MCS 1 3' GACGTACGACCGG TTCCA CC SEQ ID NO:71

AGTGAGTGTCTTCACG

GAACCGGTCGTACGTC4TG4

Inserción MCS 2 5' CCCGGGACGCGTGGAGGkG SEQ ID NO:72

GCAAGACCATCACC

Inserción MCS 2 3' GGTGATGGTCTTGCCTCCTCC SEQ ID NO:73 ACGCGTCCCGGGTGATGACG

TACGACCGGTTC

CG77\CGCTAATAGAGGTGGA

127 5' SEQ ID NO:74

AAAG

ACGCG TCAATTCTTTCACTTT

127 3' SEQ ID NO:75

CAGATTGG

Todos los oligonucleótidos fueron adquiridos a Sigma-Aldrich (Missouri, USA). En cursiva se marcan los sitios de restricción introducidos mediante los oligonucleótidos en la secuencia amplificada resultante de la PCR, y en los oligonucleótidos de inserción del MCS, marca la secuencia insertada en cada caso. En los oligonucleótidos de inserción del Streptag se incluyeron dos codones de terminación de la traducción inmediatamente anteriores a la secuencia de la enzima de restricción. La secuencia extra en los extremos de las dianas de restricción fue diseñada en base a las recomendaciones de New England Biolabs para aumentar la eficiencia de corte en secuencias lineales de DNA. En negrita se resalta el nucleótido T añadido para no alterar el cuadro de lectura con Notl.

2. Construcción del vector pFS-2 y clonaie de las proteínas huésped.

La siguiente modificación del vector pFS-1 fue la inserción del MCS en un módulo de ubicuitina. Para prevenir una posible alteración del plegamiento del módulo, se eligieron los bucles naturales de esta estructura como los mejores candidatos como sitios de inserción del MCS. Según estudios previos sobre los efectos de inserciones de secuencias de diferente número de aminoácidos en los diferentes bucles del módulo de ubicuitina sobre su estabilidad termodinámica, (Ferrara, D. M. y A. D. Robertson, 2008. J Mol Biol 375(3), 764-772), se escogió el bucle formado por los aminoácidos 9-10 de la proteína porque era el que mostraba mayor tolerancia en términos de plegamiento global, estabilidad y pérdida de enlaces de hidrógeno. Para insertar el MCS, se eligió el módulo ubicuitina presente en posición 4 del vector pFS-1 porque aparece en una posición central y de esta forma se pueden aprovechar todas las ventajas del vector (Fig. 5a).

Los enzimas de restricción empleados fueron: Agel, BsiWI, Mlul y Smal, que codifican para los aminoácidos TG, RS, TR y PG, respectivamente. Además se insertaron dos residuos de glicina en cada extremo del MCS (GGTGGA y GGAGGA) para hacer la inserción más flexible y tratar de minimizar los posibles efectos sobre el plegamiento del módulo de ubicuitina. Asimismo, se insertó una secuencia espaciadora entre los sitios de corte de las enzimas de restricción para aumentar la eficiencia de la digestión enzimática en el MCS (TCATCA, que codifica para SS). La secuencia completa del MCS fue

CTG4CTGGTGGAACCGGTCGTACGTCATCACCCGGGACGCGTGGAG GAGGC (SEQ ID NO: 3) en cursiva se resaltan los nucleótidos pertenecientes al módulo ubicuitina, y en negrita los nucleótidos pertenecientes a los sitios de corte de las enzimas de restricción mencionadas anteriormente, Fig. 1 1 ).

El proceso de clonaje fue como sigue: el fragmento de DNA Spel-Ubi- BssHI l se clonó inicialmente en el vector pCR2.1 (Invitrogen). A continuación, utilizando el sistema QuickChange (Stratagene) se insertó la secuencia del MCS en dos etapas: primero la secuencia GGTGGAACCGGTCGTACGTCA (SEQ ID NO:76), y una vez que se consiguió esta inserción, se introdujo a continuación la secuencia TCACCCGGGACGCGTGGAGGA (SEQ ID NO: 77). Finalmente se clonó el fragmento de DNA Spel-Ubi+MCS-BssHI l en el vector pFS-1 via Spel- BssHI l .

Para todas las etapas de clonaje se empleó la cepa de E. coli XL1 -blue (Stratagene). Todas las secuencias fueron convenientemente verificadas por secuenciación de las dos hebras del DNA del inserto (Secugen, Madrid, España).

3. Expresión y purificación de los vectores pFS-1 y pFS-2. Inicialmente se probó una batería de cepas de E. coli para comprobar cuál producía la mayor inducción de la expresión, así como la menor degradación de las proteínas pFS-1 y pFS-2. Específicamente, empleamos las cepas C41 (DE3) (Miroux, B. y J. E. Walker, 1996. J Mol Biol 260(3), 289-298), BL21 star (DE3) (Invitrogen) y M15 [pREP4] (Qiagen) con la secuencia del pFS-1 introducida tanto en el vector pRSETA (Invitrogen) como en el pQE80L (Qiagen). Los cultivos bacterianos fueron crecidos a 37°C hasta que alcanzaban una OD ₅₉₅ de 0,5-0,8. La inducción de la expresión se llevó a cabo añadiendo 1 mM IPTG durante 4 horas. La mejor combinación de las probadas fue el plásmido pRSETA y la cepa C41 (DE3).

Las células bacterianas se lisaron mediante tratamiento con 1 mg/ml lisozima y 1 % Tritón X-100 (Sambrook, J., 1989. New York, 2 ^a Ed., Cold Spring Harbor). Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad de Ni ²⁺ usando columnas Histrap HP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) en un aparato FPLC (ÁKTA Purifier, GE Healthcare), y empleando el tampón 50 mM fosfato sódico/500 mM NaCI, pH 7.4 con 50 mM imidazol en el tampón de unión y 500 mM en el de elución. Las fracciones eluídas se concentraron mediante ultrafiltración en filtros Amicon 10K (Millipore, Massachusetts, USA), y el tampón se cambió a PBS/5 mM DTT. Después de un pulso de sonicación, la muestra se purificó de nuevo por afinidad de Strep-tag usando columnas Streptrap HP (GE Healthcare). El tampón de unión aquí fue PBS, y el tampón de elución PBS/2.5 mM destiobiotina. Las fracciones purificadas fueron de nuevo concentradas empleando filtros Amicon 10K (Millipore), y el tampón cambiado a PBS/5 mM DTT/0.2 mM EDTA. Aunque el rendimiento final de proteína recombinante pura no fue muy alto (~1 mg de proteína pura por litro de cultivo bacteriano), se consiguió una elevada pureza de la muestra. De hecho, se observaba una banda única del tamaño esperado tanto en tinción de geles SDS-PAGE con azul de Coomassie como en Western-blots utilizando anticuerpos monoclonales contra las dos etiquetas de purificación presentes en las proteínas pFS-1 y pFS-2 (anti-Histag y anti-Streptag, ambos obtenidos en ratón, Novagen). La dilución empleada de ambos anticuerpos fue 1 :2000. El sistema de detección empleado fue ECL Plus (GE Healthcare), con anticuerpo secundario anti IgG de ratón (Novagen).

4. AFM-SMFS de las proteínas pFS-1 v pFS-2. Se emplearon dos tipos de sustratos para comparar la eficiencia de los estiramientos. El pFS-1 puede anclarse a sustratos recubiertos de oro por los residuos cisteína presentes en su extremo C-terminal (Rief, M., et al., 1997. Science 276(5315), 1 109-1 1 12) o a cubreobjetos de vidrio funcionalizados con Ni ²⁺ -NTA (Klein, D. C, et al., 2003. Chemphyschem 4(12), 1367-1371 ) por el His-tag presente en su extremo N-terminal. Para proceder al experimento se depositaba una gota de una preparación de proteína pura (-2-8 μΙ, -0,2-0,5 mg/ml) sobre una gota del tampón correspondiente previamente depositada sobre el sustrato, y se dejaba adsorber durante aproximadamente 10 minutos. Todos los experimentos fueron llevados a cabo a una velocidad de estiramiento constante de 0,4 nm/ms. Tanto la eficiencia de obtención de espectros de estiramiento adecuados como los resultados obtenidos en ambos sustratos resultaron absolutamente comparables. Para la validación del pFS-1 únicamente se seleccionaron espectros de fuerza-extensión que mostraran una región inicial espaciada de 50-80 nm proveniente del desplegamiento del fragmento N2B seguida de no más de 6 picos de fuerza correspondientes al desplegamiento de los módulos de ubicuitina presentes en el pFS-1 (Fig . 1 b). Para el pFS-2 con proteínas huésped, los espectros seleccionados mostraban, además de la región espadadora y los picos de fuerza de los módulos ubicuitina, un pico de fuerza proveniente del desplegamiento del módulo ubicuitina con el MCS (el módulo hospedador, fácilmente reconocible por su mayor AL _C , Fig. 2c), siempre anterior al pico de fuerza proveniente del desplegamiento de la proteína huésped (Fig. 3a, d). Todos los valores expuestos están expresados como valor medio ± SEM.

5. Controles estructurales de los monómeros de hospedador+PN.

5.1 . Dicroísmo Circular (PC).

Se adquirieron espectros de UV-lejano de DC para monitorizar los cambios estructurales sufridos por las PN y por la proteína control VAMP2 (en ausencia y presencia de 20 μΜ QBP1 -M8 y de 100 μΜ SV1 1 1 ; la concentración final de DMSO en la muestra con QBP1 -M8 se redujo al 0,01 % para minimizar los posibles efectos del DMSO en las medidas) en estado individual y fusionadas al módulo hospedador ubicuitina/127 (Fig. 4b). Los espectros de elipticidad se obtuvieron en KH2PO4 10 mM pH 4,7 a 20°C en un espectropolarímetro JASCO-J810 (JASCO Inc., Japón) equipado con una unidad Peltier de control de temperatura, empleando cubetas de cuarzo de 1 mm de paso de luz. La concentración para todas las proteínas fue 0,2 mg/ml. Las medidas se iniciaron con proteína almacenada a 4°C (día 0), y posteriormente las muestras se incubaron a 37°C sin agitación para caracterizar el aumento en estructura tipo β de las muestras. Las siguientes medidas se realizaron los días 2, 5, 7 y 12, con 0,02% azida sódica (NaN ₃ ) añadido como preservante. La contribución del tampón se sustrajo de los espectros y posteriormente la elipticidad de éstos fue convertida a elipticidad molar empleando la masa molecular media por residuo calculada mediante el programa Spectra Manager Analysis (Jasco Inc.). El contenido en estructura secundaria y su evolución con respecto al tiempo de incubación para cada proteína se estimó mediante la deconvolución de los espectros usando el programa de análisis CDNN (Bóhm, Muhr et al. 1992).

5.2. RMN de protón (RMN ¹ H). Para comprobar la posible existencia de interacciones entre el hospedador y la proteína huésped se realizaron experimentos de RMN monodimensionales de protón ( ¹ H) para todas las PN, tanto individuales como fusionadas al hospedador (Fig. 4c). Para ello, las muestras con concentración elevada (0.1 -1 mM) fueron dializadas contra ΚΗ ₂ Ρ0 ₄ 10 mM pH 4,6-4,7 con 10% D ₂ 0. Las medidas se obtuvieron a 25°C usando un espectrómetro Bruker AV 800 (Bruker BioSpin, Alemania) equipado con una criosonda con un gradiente en Z. La temperatura se calibró empleando una muestra de etanol. Se empleó Sodio 2,2-dimetil-2- silapentano-5-sulfonato [(CH ₃ ) ₃ -Si-CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -S0 ₃ -Na ⁺ , DSS] como referencia interna de desplazamiento químico. Los espectros monodimensionales se analizaron empleando el programa TopSpin 2,0 (Bruker BioSpin). Se realizó una pre-saturación selectiva para reducir la señal del agua. 5.3. AFM (de las siglas en inglés, Microscopía de Fuerza Atómica).

Para la adquisición de imágenes de AFM del proceso de oligomerización y fibrilogénesis, se partía de unas muestras de proteínas monoméricas concentradas (desde 0, 1 a 0,9 mM) en PBS + 0,02 % de NaN ₃ que habían sido incubadas a 37°C sin agitación (Fig. 4d). Para la obtención de la imagen primero se realizaron imágenes de control de mica recién exfoliada en presencia de tampón PBS filtrado. Una vez que se observaba que la superficie estaba suficientemente plana para la adquisición de imágenes con resolución óptima, se recogía una alícuota de la muestra incubada mediante suave resuspensión del precipitado. Se incubaron 20 μΙ de esa suspensión sobre la misma superficie de mica seca y se dejó adsorber durante 15 minutos. Después se secaba mediante un flujo muy suave de N ₂ , y una vez seco se rehidrataba con tampón PBS presente en la celda de fluidos. Este procedimiento es el mismo que emplearon en (Conway, K. A., et al., 1998. Nat Med 4(1 1 ), 1318-1320) para la obtención de imágenes de fibras de cr-sinucleína. Las imágenes se obtuvieron en el modo de tapping y de jumping (Carrión-Vazquez, M., et al., 2006. Springer-Verlag, Heidelberg, 163-245).

5.4. MET (Microscopía Electrónica de Transmisión).

Las muestras monoméricas (en presencia y ausencia de los péptidos inhibidores QBP1 -M8 y SV1 1 1 ) se incubaron a 37°C durante 20-30 días en el tampón TrisHCI 10 mM pH 7.5 con 0,02% de NaN ₃ . Después de este periodo se dejaba adsorber 10 μΙ. de determinadas diluciones de las muestras (50-500 jug/ml) en rejillas de cobre recubiertas de carbono de 300 mallas (Ted Pella, USA). Posteriormente se realizaba una tinción de contraste negativo mediante la adición de 1 -2% de acetato de uranilo (previamente filtrado para evitar agregados) durante 30 segundos. Inmediatamente antes de su uso las rejillas se sometían a un proceso de glow-discharge para aumentar su hidrofilicidad usando un aparato Emitech K100X (Quorum Technologies, UK). La formación de fibras amiloides se comprobó empleando un microscopio electrónico JEOL 1200EX I I {Jeol Limited, Japón) empleando voltajes de 80 kV, equipado con una cámara CCD Megaview II I . Las imágenes se adquirieron a unos aumentos de 30.000-150.000 x (Fig. 4e).

5.5. Turb¡dez y ensayos de Rojo Congo. Las medidas de turbidez de las proteínas monoméricas se realizaron de muestras a concentraciones de 0,5 mg/ml incubadas a 37°C sin agitación en el tampón TrisHCI 10 mM pH 7,5 con 0.02% de NalSh (en presencia o ausencia de los péptidos inhibidores QBP1 -M8 y SV1 1 1 ), y su absorbancia se monitorizó a 405 nm de longitud de onda usando un espectrofotometro UV-visible Nanodrop (Thermo Scientific, USA) como una medida indirecta del proceso de agregación. Los ensayos de Rojo Congo se realizaron de muestras incubadas durante 30 días sin agitación en el tampón TrisHCI 10 mM pH 7.5 con 0.02% NalSh. Para realizar las medidas, una solución 10 μΜ de proteína se añadía a una de 30 μΜ de Rojo Congo (disuelto en tampón fosfato 5 mM/300 mM NaCI pH 7.5, previamente filtrado en un filtro de 0,22 μηι para desechar las posibles micelas de Rojo Congo) y posteriormente se incubaba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los espectros UV- visible de estas preparaciones se obtuvieron en un espectrofotometro Nanodrop (Thermo Scientific). La unión de Rojo Congo a las fibras amiloides se determinó empleando la siguiente ecuación: Rojo Congo (μιτιοΙ/Ι) = A540/22,295 - A480/46,306. Las muestras que tenían amiloides presentaron los efectos batocrómico e hipercrómico típicos. Los agregados fueron observados mediante un microscopio óptico invertido Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Alemania) y presentaron la típica fluorescencia del Rojo Congo así como su característica birrefringencia verde-naranja al ser observados bajo un microscopio óptico de luz polarizada.

6. Síntesis de los péptidos inhibidores QBP1 y SV1 1 1 . El peptido QBP1 se sintetizó en el Servicio de Proteómica y Síntesis Química del CBMSO/CSIC-UAM mediante química en fase sólida Fmoc con el grupo amino N-terminal acetilado. El péptido SV111 lo sintetizó GenScript USA, Inc. La pureza de los dos péptidos fue >95 %, estimada por HPLC. La identidad de los péptidos fue testada y confirmada mediante espectrometría de masas (QBP1 y SV111) y espectroscopia NMR (SV111).