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Title:
EXTRACT OF BACTERIAL ORIGIN PRODUCED BY THE BACTERIA KOCURIA MARINA SP AND USE THEREOF TO GENERATE POLYMER STRUCTURES WITH BIOACTIVE SURFACES ABLE TO INHIBIT MICROBIAL BIOFILM FORMATION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/126902
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for obtaining a bacterial extract produced by the bacteria Kocuria marina sp., which prevents biofilm formation, to said extract, and to the use thereof for incorporation into natural or synthetic polymers intended to form structures with active surfaces for preventing microbial biofilm formation, whether for biomedical uses, including clinical uses, industrial uses, or even domestic uses.

Inventors:
DINAMARCA, Alejandro (Valparaiso, CL)
IBACACHE, Claudia (Valparaiso, CL)
OJEDA, Juan (Valparaiso, CL)
ROMO, Natalia (Valparaiso, CL)
Application Number:
CL2018/050159
Publication Date:
July 04, 2019
Filing Date:
December 28, 2018
Export Citation:
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Assignee:
FUNDACION COPEC UNIVERSIDAD CATÓLICA (Av.Vicuña Mackena 4860, MaculSantiago, 36, 7820436, CL)
UNIVERSIDAD DE VALPARAISO (Blanco 951, Valparaìso, 45, 2361845, CL)
International Classes:
A01N63/02; A61L27/26; A61L27/54; A61L29/04; A61L29/16; C09D5/16; C12N1/20; A61L101/52; C12R1/01
Attorney, Agent or Firm:
ALBA PROFESIONALES et al. (Lota 2267 oficina 211, ProvidenciaSantiago, 86, 8340386, CL)
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Claims:
PLIEGO DE REIVINDICACIONES

1. Extracto bacteriano que evita la formación de biopelículas CARACTERIZADO porque comprende sobrenadante del cultivo de la bacteria marina Kocuria sp.

2.- Extracto bacteriano de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque comprende sobrenadante del cultivo de la cepa Kocuria sp, cepa MM1A2AB Depósito RGM2414.

3.- Extracto bacteriano de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó 2 CARACTERIZADO porque comprende entre 35 a 45% de ácido palmítico; entre un 18 y 28 % de ácido esteárico y entre un 8 y un 16 % de ácido oleico.

4. -Método para obtener un extracto bacteriano que evita la formación de biopelículas CARACTERIZADO porque el método comprende las siguientes etapas:

a) crecer una bacteria marina Kocuria sp en un medio de cultivo estéril para bacterias marinas conteniendo entre 0,75 a 1 ,5% p/v de una única fuente de carbono escogido entre azúcares, ácidos orgánicos o hidrocarburos aromáticos; conteniendo agua de mar esterilizada al 80 % (vol / vol) o agua bidestilada conteniendo NaCI entre 3 - 5 % p/vol,

b) obtener el sobrenadante del cultivo o extracto microbiano, que comprende entre 35 a 45% de ácido palmítico; entre un 18 y 28 % de ácido esteárico y entre un 8 y un 16 % de ácido oleico.

5.- Método de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque el sobrenadante se separa mediante centrifugación entre 5.000 g a 8.000 g y por filtración por un tamaño de poro de 0,25 pm de modo de quedar sustancialmente libre de células.

6.- Método de acuerdo a la reivindicación 5 CARACTERIZADO porque el sobrenadante sustancialmente libre de células se liofiliza a -80 °C y 10 Mtorr por al menos 24 horas y opcionalmente se tamiza, para obtener el extracto microbiano libre de células (ETA o extracto tenso activo).

7. Método de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque el medio de cultivo empleado en la etapa a) comprende además sales inorgánicas del tipo macro y micronutrientes tales como 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todas estas concentraciones pueden variar en un

20% .

8. Método de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque la incubación para crecer las células se realiza en agitación entre 100 a 400 rpm, durante 24-72 horas bajo condiciones de pH entre 6 y 8; temperatura entre 10° y 35° C; saturación de oxígeno entre 10-21 % .

9.- Método de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque la fuente de carbono se escoge entre azúcares como glucosa o, ácidos orgánicos como ácido cítrico compuestos del tipo hidrocarburos aromáticos como tolueno, benceno o moléculas aromáticas del tipo policíclicas.

10.- Método de acuerdo a la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la fuente de carbono es un hidrocarburo aromático como bifenilo.

1 1 .- Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque se emplea la cepa Kocuria sp. cepa MM1A2AB, Depósito RGM2414.

12.- Uso del extracto microbiano de la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque sirve para inhibir la formación de biopelículas microbianas.

13.- Uso de acuerdo a la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque sirve para generar superficies bioactivas con propiedades anti formación de biopelículas microbianas

14.- Uso de acuerdo a la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque sirve para generar superficies bioactivas que inhiben la formación de biopelículas bacterianas en ambientes inmersos en fluidos líquidos que contienen nutrientes.

15.- Uso de acuerdo a la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque sirve para mezclarse con polímeros de modo de integrarse a dicho polímero manteniendo su propiedad de inhibir la formación de biopelículas bacterianas en contacto con la estructura formada por el polímero.

16.- Uso de acuerdo a la reivindicación 15 CARACTERIZADO porque el polímero se escoge entre silicona, resina vinílica, caucho, poliuretano, resina epóxica, resina alquidica, poliéster y resina alquílica.

17.- Uso de acuerdo a la reivindicación 16 CARACTERIZADO porque sirve para obtener estructuras adecuadas para el uso médico, tales como catéteres, sondas, aparatos ortopédicos, implantes, válvulas cardiacas prostéticas, articulaciones prostéticas, implantes ortopédicos, derivaciones, marcapasos y desfibriladores, tubos endo traqueales, dispositivos de hemodiálisis/diálisis peritoneal, implantes dentales y catéteres intra vasculares.

18.- Uso de acuerdo a la reivindicación 16 CARACTERIZADO porque sirve para obtener estructuras adecuadas para el uso en la industria alimentaria, tales como mangueras, cintas, o cámaras que estén en contacto con alimentos o bebidas.

20.- Uso de acuerdo a la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque sirve para obtener formulaciones de recubrimientos bioactivos o pinturas bioactivas para superficies sumergidas en fluidos de origen biológico, alimentarios, aguas contaminadas o agua de mar.

21 .- Uso de acuerdo a la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque sirve para obtener formulaciones de aditivos para aguas para evitar la formación de biopelículas en las cañerías, mangueras y/o contenedores metálicos o plásticos.

Description:
EXTRACTO DE ORIGEN BACTERIANO PRODUCIDO POR LA BACTERIA MARINA KOCURIA SP Y SU USO PARA GENERAR ESTRUCTURAS POLIMÉRICAS CON SUPERFICIES BIOACTIVAS CAPACES DE INHIBIR LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS MICROBIANAS

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención apunta a un método para obtener un extracto bacteriano que evita la formación de biopelículas, a dicho extracto y su uso para incorporarlo en polímeros naturales o sintéticos destinados a formar estructuras con superficies activas para evitar la formación de biopelículas microbianas, ya sea para aplicaciones biomédicas, incluyendo usos clínicos, como para aplicaciones industriales o incluso en aplicaciones domésticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las biopelículas microbianas presentes en superficies son un problema transversal que va desde la salud humana, industria de los alimentos, industria farmacéutica hasta industria pesquera, acuicultura, sistemas de aire acondicionado, tuberías domésticas e instalaciones marinas, lacustres e industriales en general. El problema de la formación de biopelículas microbianas se debe a que determinados microorganismos pueden adherirse a superficies orgánicas vivas o superficies inertes inmersas en medios acuosos o líquidos en donde encuentran condiciones favorables para su crecimiento y diseminación, estructurando un ambiente protegido en donde se concentran nutrientes, se pueden establecer relaciones con otros microorganismos y donde los agentes antimicrobianos (antibióticos, metales, alcoholes y otros) no pueden acceder, lo que ayuda a explicar una mayor resistencia. Las biopelículas microbianas pueden ser perjudiciales para la salud humana y para diferentes actividades productivas. El daño se asocia a que bacterias patógenas pueden diseminarse a partir de las superficies colonizadas hacia otras partes como por ejemplo órganos y tejidos de un individuo, a su vez las bacterias existentes en diversos ambientes, también pueden generar modificaciones físicas en las superficies colonizadas (daños por degradación o corrosión) generando un aumento de concentración de microrganismos y perdida de infraestructura, por lo que resulta relevante controlar la formación de biopelículas microbianas. El control de la contaminación por microrganismos y específicamente de la formación de biopelículas sobre superficies en ambientes acuosos, es un problema que incumbe a todos los campos técnicos en los que hay superficies en contacto con medios acuosos no estériles. Estos campos técnicos van desde aplicaciones tan sofisticadas como dispositivos de uso médico tales como catéteres, implantes, válvulas, sondas u otros elementos en biomedicina que se encuentran en contacto con tejidos o fluidos corporales - los que pueden contaminarse con bacterias generando focos de infección y posterior aparición de patologías - a menos sofisticadas como tuberías, ductos de ventilación, filtros, superficies sumergidas de estructuras marinas, cañerías, mangueras, reactores, peceras, tanques de piscicultura, dispositivos industriales, etc. de industrias tan diversas como de los alimentos, turismo, industrias de energía, minería, navegación, acuicultura y otras.

Dependiendo del campo técnico, existe una variedad de soluciones que se han dado al problema. En las aplicaciones biomédicas se han empleado incluso antibióticos para impregnar catéteres urinarios de modo de prevenir infecciones urinarias y sistémicas. Mientras que para evitar las biopelículas bacterianas sobre estructuras sumergidas en el ambiente acuático marino, tradicionalmente se han empleado pinturas o revestimientos formulados con metales pesados u otro tipo de compuestos biocidas tóxicos y agresivos con el medio ambiente.

En este contexto, hay una necesidad latente de compuestos que sean capaces de inhibir la formación de biopelículas en superficies en contacto con ambientes acuosos, y que al mismo tiempo sean inocuos con el medio ambiente y los seres vivos, que no contengan antibióticos, y que sean seguros en su manipulación, e idealmente que incluso puedan ser usados en aplicaciones clínicas o estar en contacto con alimentos, sin perjuicio a la salud del usuario o consumidor final.

En este contexto los inventores han desarrollado un nuevo extracto bacteriano producido en un cultivo de dos fases líquida-sólida usando la bacteria de origen marino Kocuria sp, donde el extracto extracelular producido o la misma bacteria pueden ser adecuadamente incorporado en matrices poliméricas para formar superficies activas capaces de inhibir la formación de biopelículas microbianas. En particular los inventores trabajaron con la cepa obtenida por ellos mismos Kocuria sp MM 1 A2AB, aislada desde el ambiente marino y que degrada hidrocarburos aromáticos, con el registro de depósito RGM2414 en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), no obstante el extracto con las propiedades físicas y biológicas detalladas en la presente invención, pueden ser obtenidos según el método descrito que utiliza cualquier cepa bacteriana de origen marino del tipo y características de la cepa Kocuria sp de la presente invención.

Este extracto puede ser adecuadamente mezclado con polímeros de origen natural o sintético, los cuales al polimerizar y solidificarse generan estructuras cuyas superficies son activas para la inhibición de la formación de biopelículas microbianas. Sin querer limitarnos por la teoría, se postula que este extracto producido por la cepa de la invención tiene la capacidad de modificar la transcripción génica produciendo cambios que afectan la expresión de genes que se relacionan con la formación de biopelículas y en la virulencia bacteriana como por ejemplo, aquellos sistemas de comunicación bacteriana conocidos como Quorum Sensing (QS), sin que otros mecanismos del tipo estrés celular sean también afectados y/o activados.

En el estado del arte previo encontramos algunos documentos con un enfoque cercano a la presente invención, no obstante, ninguno de ellos anticipa la obtención de un extracto desde la bacteria de origen marino Kocuria sp, que inhiba la formación de biopelículas al incorporarse exitosamente en diferentes matrices poliméricas.

Por una parte, los mismos inventores protegieron en Chile y USA (bajo las patentes; CL 50.735 y US 9629882 (B2)) un procedimiento para producir un extracto bacteriano con propiedades tensoactivas de utilidad para la acuicultura que inhibe la virulencia y formación de biopelículas de las bacterias patógenas de peces; Vibrio anguiiiarum y Aeromonas saimonicida utilizando la bacteria Gram negativa Cobetia cepa MM1 IDA2H-1 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el registro: N° 7764. En esta misma línea de desarrollo, la Universidad de Antofagasta tiene un producto anti macro y microfouling protegido en la patente CL47339 (US2008095871 (A1 )) que comprende un extracto extra celular de bacterias marinas, en este caso de la proteobacteria Gram negativa Aiteromonas sp.

Las bacterias del género Kocuria se diferencian de Cobetia y de Aiteromonas en que son bacterias Gram positivas que forma parte del phylum Acti no bacteria. Cobetia y Alteromonas son bacterias Gram negativas del phylum Proteobacteria. Esto indica una diferencia taxonómica y una gran distancia filogenética entre Kocuria y los géneros aludidos. Para el experto en la técnica será evidente que no es posible anticipar que el extracto producido por una especie o género bacteriano, tenga una composición y propiedades físicas, químicas y biológicas similares a los extractos producidos por bacterias de otros géneros, como por ejemplo son Cobetia y Alteromonas. Menos aun considerando los métodos de cultivo o procesos de producción de los extractos, como tampoco la posibilidad de integrar adecuadamente los extractos generados en polímeros de origen sintéticos o naturales para formar estructuras bio-activas, dado que la capacidad de formar emulsiones estables con polímeros no es una propiedad obvia ni generalizada de los extractos biológicos. Por lo que no era posible, hasta la presente invención, anticipar las propiedades físicas, químicas que permiten generar estructuras con superficies anti formación de biopelículas que aquí se describen.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. El extracto bacteriano sobrenadante libre de células de la bacteria Kocuría sp denominado ETA puede ser integrado a polímeros comerciales para crear estructuras sólidas flexibles, cuyo diseño dependerá del molde utilizado. El ETA sobrenadante del cultivo de la cepa Kocuría sp. libre de células y liofilizado es mezclado en una proporción del 0,01 % al 0, 1 % (p/vol.) con silicona líquida libre de agentes antifúngicos o antimicrobianos u otras resinas o polímeros (A). La mezcla obtenida fue puesta en moldes para estructurar su polimerización y posterior solidificación durante 24 a 72 horas (B) y (C), Mediante la integración del ETA a polímeros como silicona es posible generar estructuras tubulares (D) y planas (E).

Figura 2. Las estructuras con el ETA no forman biopelículas microbianas. Al incorporar el ETA a la silicona fue posible generar una estructura que al ser expuesta a microorganismos no se genera la formación de biopelículas. Las estructuras de silicona controles que no contienen ETA muestran la coloración de cristal violeta debido a la formación de biopelículas (control), mientras que las estructuras de silicona con 0,1 % (p/vol.) se mantienen limpias sin formar biopelículas microbianas.

Figura 3. Ensayos de evaluación de las estructuras poliméricas bio-activas en orina. Para evaluar la capacidad de inhibición de biopelículas de bacterias uropatogénicas se fabricaron estructuras bio-activas formuladas en silicona como agente polimerizante y un agente inorgánico de reconocida actividad antimicrobiana (por ejemplo, plata) o ETA (A). Estas estructuras fueron inmersas en orina humana estéril (decantada y filtrada a 0,22 um) conteniendo células de la bacteria Escheríchia coli durante 1 a 10 días (B). Las estructuras finalmente fueron evaluadas para la formación de biopelículas y viabilidad bacteriana a los 10 días. La figura (C) muestra un catéter de sólo silicona a los 10 días teñido debido a la formación de biopelicula y la figura (D) muestra un catéter de silicona+ETA, con una formación de biopelicula sustancialmente menor evidenciada por una menor tinción.

Figura 4. Viabilidad en orina de células de la bacteria Escheríchia coli expuestas a las estructuras poliméricas, control de sólo silicona (A), o estructuras bio-activas elaboradas con el ETA (B) o con un compuesto inorgánico de reconocida actividad antimicrobiana: Ag (C). Todas las condiciones se evalúan a tiempo 0 (T0), 8 horas (T8), 16 horas (T16), 24 horas (T24). La evaluación se realizó mediante microscopía de epifluorescencia para lo cual las muestras líquidas obtenidas de cada condición (100 ul) fueron teñidas utilizando Live/Dead Cell Double Staining Kit (Sigma-Aldrich Co, USA) conteniendo los colorantes Calcein-AM y Propidium lodide los que permiten diferenciar respectivamente bacterias vivas en color verde fluorescente (excitación: 490 nm, emisión: 515 nm) y bacterias muertas en color rojo fluorescente (excitación: 535 nm, emisión: 617 nm). Para esto se utilizó un microscopio de epifluorescencia (Leica DM5000 B). En gris claro se destacan los resultados donde la proporción células viables es mayor a las muertas (supera el valor referencial 1 ) y gris obscuro en donde las muertas están en mayor cantidad (inferior al valor referencial 1 ). El valor de corte para la proporción bacterias vivas y muertas en la igualdad corresponde a 1 .

Figura 5. Ensayo de evaluación de diferentes tipos de revestimientos (coatings) bio- activos elaborados en base a diferentes resinas y ETA. La figura esquematiza el ensayo desarrollado en donde portaobjetos fueron cubiertos en su superficies con películas (láminas) milimétricas del respectivo revestimiento conteniendo silicona sola (control) o con silicona-ETA 0,01 % - 0, 1 % (p/vol) (invención). Los portaobjetos conteniendo los diferentes revestimientos se esterilizaron con luz UV y posteriormente se incubaron en un medio de cultivo favorable para el crecimiento microbiano e inoculado con la bacteria fluorescente Escherichia coli transformada con el plásmido pGreenTir, el cual contiene el gen que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP). Durante un período de incubación de 9 días se evaluó la colonización bacteriana sobre los distintos revestimientos de los portaobjetos mediante el recuento a diferentes tiempos de células de E. coli fluorescentes (debido a la presencia de la GFP), utilizando un microscopio de epifluorescencia (Leica DM5000 B) con objetivo 100x y filtro de fluorescencia (excitación: 490 nm, emisión: 515 nm).

Figura 6.. Resultados de la formación de biopelículas por colonización de células de la cepa E. coli GFP sobre superficies de estructuras bio-activas basadas en diferentes tipos de polímeros. Se evalúan la formación de biopelículas sobre distintos sustratos poliméricos, en cada caso se evalúa el control, que corresponde sólo a la resina, la invención que es la resina mezclada con ETA 0,01 % al 0, 1 %, y como comparación se muestra un ejemplo de la respectiva resina mezclada con el compuesto de propiedades antimicrobianas óxido de Zinc al 0,1 %. En la Figura 6-A se estudia la resina vinílica, en la Figura 6-B se estudia la resina caucho, en la Figura 6-C se estudia la resina poliuretano y en la Figura 6-D se estudia la resina poliéster. En todas las resinas de la invención hubo reducción de la formación de biopelículas medida por el número de células fluorescentes adheridas a la superficie del portaobjetos con el respectivo revestimiento.

Figura7. Resultados sobre la formación de biopelículas en ambientes marinos. Para determinar la eficiencia de la invención en ambientes como el marino, en donde la formación de biopelículas microbianas puede llegar a ser un gran problema, se utilizó a la bacteria marina Cobetia marina, la cual es un reconocido modelo para estudiar formación de biopelículas en superficies sumergidas en ambientes marinos. La formación de biopelículas se midió utilizando el método de cristal violeta. Así mismo y considerando el factor biológico de competencia entre especies, en este caso se consideró utilizar células de Kocuria vivas, para evaluar si su presencia limita la capacidad de formar biopelículas en la bacteria Cobetia marina. Se evalúa la formación de biopelícula por Cobetia marina en agua de mar sobre superficies recubiertas con barniz, con barniz mezclado con bacterias Kocuria sp al 0, 1 % p/v, y con barniz mezclado con el extracto ETA al 0, 1 % p/v. Los resultados muestran que ambas condiciones de la invención inhiben significativamente la formación de biopelículas respecto al control.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a un método de obtención de un extracto extracelular producido por el crecimiento en un medio de cultivo de dos fases líquido-sólido de la bacteria marina degradadora de hidrocarburos aromáticos Kocuria sp, al extracto producido, y a sus usos para para inhibir la formación de biopelículas en ambientes acuosos. Las aplicaciones de este uso pueden ser aplicaciones biomédicas, incluyendo usos clínicos, como para aplicaciones industriales o incluso en aplicaciones domésticas. En una realización, el extracto de la invención puede ser incorporado a resinas poliméricas naturales y sintéticas manteniendo su actividad, lo que permite generar dispositivos o estructuras en cuyas superficies se inhibe la formación de biopelículas bacterianas. El extracto de la invención, se ha denominado ΈTA”, que significa Extracto Tenso Activo, y la sigla se utilizará en toda la solicitud, y debe entenderse como el producto de la invención.

El método de la invención se basa en el cultivo de una bacteria aislada por los inventores e identificada por su 16S rDNA como del género Kocuria sin una especie asignada y de la familia de las Micrococaceaeas gram positivas, phylum Acti no bacteria. Esta bacteria fue aislada desde el ambiente marino como degradadora de hidrocarburos aromáticos del petróleo. Esta cepa particular Kocuria sp tiene el número de Depósito RGM2414 en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), de fecha 20 de diciembre de 2017.

Para obtener el extracto de la invención estas bacterias, Kocuria sp marinas, deben ser cultivadas en medios para bacterias marinas. Preferentemente, el medio de cultivo empleado es un medio adecuado para bacterias marinas heterótrofas degradadoras de hidrocarburos, conteniendo agua de mar esterilizada al 80 % (vol / vol) o agua bidestilada conteniendo NaCI entre 3-5 % p/vol), y una fuente de carbono escogida entre azúcares, ácidos orgánicos y/o hidrocarburos aromáticos en una concentración entre 0,75 a 1 ,5 % p/v. Adicionalmente, se agrega una fuente de material inorgánico particulado a escala micrométrica en una cantidad no superior al 0.01 % (p/vol) para generar un cultivo de dos fases sólido-líquido. Las bacterias se crecen hasta alcanzar la fase estacionaria del cultivo. El sobrenadante del cultivo constituye el extracto microbiano con propiedades que inhiben la formación de biopelículas y que comprende entre 35 a 45% de ácido palmítico; entre un 18 y 28 % de ácido esteárico y entre un 8 y un 16 % de ácido oleico.

Entre las fuentes de carbono que se pueden utilizar están los azúcares como glucosa o, ácidos orgánicos como ácido cítrico compuestos del tipo hidrocarburos aromáticos como tolueno, benceno o moléculas aromáticas del tipo policíclicas, tal como bifenilo.

El medio de cultivo también debe contener sales inorgánicas tales como sulfato de magnesio; de cloruro de calcio; fosfato de monopotasio; fosfato de di-amonio hidrógeno; nitrato de potasio y de cloruro férrico y con un pH final de entre 6 y 8. Preferentemente, el medio comprende 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todas estas concentraciones pueden variar en un 20%. Las condiciones de incubación para el crecimiento son agitación entre 100 a 400 rpm, durante 24-72 horas; temperatura entre 10° y 35° C; y saturación de oxígeno entre 10-21 % .

Posteriormente se obtiene el extracto de la invención, el que preferentemente es el sobrenadante del cultivo. El procesamiento del extracto depende de la aplicación que este tendrá, por ejemplo para aplicaciones biomédicas o de inhibición de biopelículas en objetos de contacto directo con personas o alimentos, el extracto es sustancialmente libre de células, y de modo preferente completamente libre de células. En este caso la extracción se basa en la separación mediante centrifugación entre 5.000 g a 8.000 g de células dejando un sobrenadante enriquecido en el extracto, que es el extracto bacteriano de la invención. Este producto obtenido puede ser posteriormente concentrado mediante liofilización o separado mediante extracción química, obteniéndose un extracto en forma de polvo seco y libre de células.

Para otras realizaciones como inhibición de formación de biopelículas en superficies sumergidas, tales como barcos u otros, el extracto de la invención puede contener las células de la bacteria marina Kocuria sp. Disminuyendo los costos de los extractos de la invención, al evitarse una etapa de purificación, obteniéndose los mismos resultados en la inhibición de formación de biopelículas.

El producto de la invención corresponde a una mezcla de compuestos orgánicos del tipo ácidos grasos, los cuales otorgan propiedades emulgentes a dicha mezcla e inhiben la formación de biopelículas. Los inventores han determinado que el extracto de la invención puede ser mezclado con diferentes resinas poliméricas naturales o sintéticas para generar estructuras o superficies de cobertura bioactivas que inhiben la formación de biopelículas. Donde estas superficies inhiben la formación de biopelículas bacterianas en ambientes inmersos en fluidos líquidos que contienen nutrientes.

Esta propiedad se ha evaluado determinando la formación de biopelículas empleando Escherichia coli como inoculo modelo de formación de biopelículas, en diferentes condiciones ambientales, como por ejemplo, inmersión en orina humana, agua destilada y agua de mar.

En una realización, la invención apunta a estructuras poliméricas que comprenden el extracto de la invención y que pueden ser utilizadas con diferentes finalidades, desde dispositivos médicos hasta pinturas o revestimientos de superficies y que son capaces de inhibir la formación de biopelículas microbianas. Las estructuras poliméricas contienen el extracto de la invención (ETA), el que puede ser obtenido en una forma seca en polvo y libre de células. Este polvo ETA de la invención puede ser incorporado en polímeros naturales o sintéticos, tales como silicona, caucho, poliuretano, poliéster, resina vinílica, resina epóxica, resina alquídica u otras resinas, manteniendo su actividad, de modo que permite formar distintas estructuras poliméricas con diferentes usos que tendrían propiedades anti formación de biopelículas. Por ejemplo, se pueden obtener estructuras del tipo catéteres de silicona u otro polímero con propiedades anti-biopelículas, lo que permite que al ser inmersos en ambientes complejos, tales como fluidos que contienen orina humana y bacterias, estos no sean contaminados por las bacterias, ya que estas verían afectada su capacidad de formar biopelículas, sin poder colonizar la estructura del catéter manteniéndolo seguro y aséptico. El extracto de la invención, sustancialmente libre de células, y de modo preferente completamente libre de células, permite obtener estructuras de silicona u otra resina adecuadas para el uso médico, tales como catéteres, sondas, aparatos ortopédicos, implantes, válvulas cardiacas prostéticas, articulaciones prostéticas, implantes ortopédicos, derivaciones, marcapasos y desfibriladores, tubos endo traqueales, dispositivos de hemodiálisis/diálisis peritoneal, implantes dentales y catéteres intra vasculares.

Por otra parte, el extracto de la invención, sustancialmente libre de células permite obtener estructuras de silicona u otra resina adecuadas para la industria alimentaria, tales como mangueras, cintas, o cámaras que estén en contacto con alimentos o bebidas.

En otra realización el extracto de la invención, permite obtener formulaciones de recubrimientos bioactivos o pinturas bioactivas para superficies sumergidas en fluidos de origen biológico, alimentarios, aguas contaminadas o agua de mar. En estos casos no es necesario que el extracto esté libre de células.

En otra realización, el extracto de la invención, permite obtener formulaciones de aditivos para aguas, como por ejemplo la de enfriamiento de reactores, para evitar la formación de biopelículas en las cañerías, mangueras y/o contenedores metálicos o plásticos. Dependiendo del uso posterior del agua se puede emplear extracto libre de células o no libre de células, donde el extracto se agrega al agua en una proporción entre 0,01 % al 10% del agua a tratar.

A continuación, se describe un modo preferente de realización de la invención propuesta, sin que ello limite las variantes técnicas que un experto en la materia pueda incorporar o modificar, y que quedan dentro del alcance del concepto inventivo que reivindicamos en esta solicitud.

EJEMPLOS

1. Obtención del extracto libre de células de la invención

i) Fermentación o bioproceso. El proceso para la obtención de un extracto libre de células desde la cepa de la presente invención se inició creciendo un inoculo puro de la cepa de bacteria de origen marino degradadora de hidrocarburos aromáticos Kocuria sp, deposito RGM2414 en una condición de dos fases líquida-sólida utilizando un medio de cultivo estéril conteniendo 1 ,2 % p/v de bifenilo como fuente de carbono y sales inorgánicas tales como: 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de di-amonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todo ellos disueltos en agua destilada y con un pH final de entre 6 y 8. Como medio acuoso de disolución se usó agua de mar filtrada a un tamaño de poro de 0,22 pm. Las condiciones de incubación para el crecimiento fueron agitación a 300 rpm, durante 48 horas; a una temperatura de 25° C; y saturación de oxígeno de 15 %.

¡i) Obtención de extracto libre de células desde Kocuria sp cepa MM1A2AB.

La separación de sobrenadante conteniendo moléculas de interés y las células de la cepa se realizó mediante centrifugación y filtración, donde la centrifugación se llevó a cabo a 5.000g durante 15 minutos; donde tras descartar la fase sedimentada, se recuperó el sobrenadante, el cual fue filtrado por filtro de corte de 0,22 pm; el sobrenadante filtrado es libre de células

iii) Recuperación de extracto libre de células en forma de sólido

El sobrenadante libre de células obtenido en el punto anterior, denominado extracto líquido ETA, contiene moléculas generadas por el metabolismo bacteriano que dan las propiedades anti formación de biopelículas al producto de la invención. El filtrado obtenido se sometió a liofilización a -80°C y 10 Mtorr, posteriormente se realizó un tamizado del polvo obtenido, bajo agitación en posición horizontal, para desprender impurezas y sales. Finalmente, el polvo tamizado fue secado a 40° C por 24 horas.

2. Caracterización del extracto de la invención

Se realizó una caracterización química sobre el extracto libre de células producido por la bacteria Kocuria sp cepa MM1A2AB, y se determinó que su composición corresponde a una mezcla de moléculas orgánicas con la predominancia relativa de: ácido palmítico (C16:0) con un 39 %; ácido esteárico (C18:0) con un 23 % y; ácido oleico (C18:1 ) con un 12 % según análisis de cromatografía gaseosa acoplada a masas (GC-MS). Estos resultados fueron complementados y corroborados en términos de análisis cualitativos mediante análisis de Resonancia Magnética Nuclear de protones (RMN-H) y de carbono (RMN-C), además de análisis de Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR).

3. Elaboración de estructuras con superficies inhibitorias de biopelículas microbianas mediante el uso del extracto de la invención

Diferentes formulaciones antimicrobianas basadas en polímeros como silicona y el extracto sobrenadante libre de células de la cepa de la invención, Kocuria (ETA) fueron elaboradas para generar superficies bio-activas. De acuerdo al estado del arte, como ejemplos de comparación se utilizaron formulaciones en base a reconocidos agentes antimicrobianos tales como: elementos inorgánicos como Plata (Ag), Zinc (Zn) y Cobre (Cu) y compuestos orgánicos como Saponina. Para ampliar las posibles aplicaciones, el ETA se incorporó con diferentes polímeros o resinas para formar estructuras con superficies bioactivas. Los productos utilizados fueron: resina vinílica, caucho, poliuretano, resina epóxica, resina alquidica, poliéster y resina alquílica. La incorporación del ETA se realizó mediante la mezcla y homogeneización manual en una proporción de entre 0,01 % al 1 % (p/vol.). La polimerización se realizó mediante el secado a temperatura ambiente de 20 °C por al menos 72 horas. De acuerdo a la aplicación se fabricaron moldes para generar estructuras tubulares del tipo“catéteres” o por el depósito en una superficie de vidrio para generar un revestimiento o “coating”. La Figura 1 muestra el proceso de mezcla y fabricación de estructuras en base al ETA. En Figura 1 -D se muestra una estructura tubular obtenida mediante el uso de un molde de vidrio y que se define como “catéter”. En la Figura 1 -E se aprecia la formación de una película depositada sobre un portaobjetos y que se define como un“coating” o“revestimiento”.

Para los ensayos de evaluación, las estructuras con superficies bio-activas elaborados en base a diferentes formulaciones con el extracto bacteriano libre de células de la presente invención (ETA), fueron sometidas a esterilización por autoclavado a 121 °C y 1 PSI por 15 minutos y además las superficies fueron tratadas con luz ultravioleta durante 5 minutos. 4. Formación de biopelículas bacterianas y viabilidad en presencia de estructuras con superficies bio-activas conteniendo el ETA

El estado del arte y de la técnica indica que la formación de biopelículas es fundamental para la sobrevivencia de microorganismos en un ambiente determinado. Formar biopelículas genera un ambiente de protección en donde los microorganismos encuentran nutrientes, pueden reproducirse, colonizar y resistir el efecto de agentes antimicrobianos. Para evaluar la utilidad de las estructuras basadas en el extracto producido por la presente invención (ETA), se procedió a evaluar el efecto de la inhibición de la formación de biopelículas y la viabilidad de bacterias en presencia de las estructuras con superficies bio-activas. Para esto se utilizaron cepas de bacterias y condiciones que permiten comprobar la eficiencia de las estructuras en condiciones según diferentes aplicaciones en las cuales pueden ser utilizadas.

4.1. Evaluación de formación de biopelículas y viabilidad bacteriana en estructuras del tipo catéteres y revestimientos basados en ETA

Los resultados de formación de biopelículas en los “catéteres”, se muestran en las Figuras 2 y 3. Por su parte los ensayos de viabilidad de las bacterias en el ambiente de orina con los“catéteres” se analizan en la Figura 4

4.1 .1 . Formación de biopelículas en catéteres formados con ETA

La Figura 2 muestra un ensayo de formación de biopelículas con E. coli utilizando “catéteres” formulados en base al ETA y su control. El ensayo fue realizado mediante la técnica de tinción con cristal violeta y es posible verificar la formación de biopelículas por un aumento de la intensidad de color en los“catéteres” sometidos a un ambiente líquido conteniendo un número determinado de bacterias por al menos 48 horas. Se aprecia que los“catéteres” de silicona conteniendo ETA (0,01 % al 0, 1 % p/vol.) sumergidos en un medio de cultivo Luria Bertani conteniendo células de la bacteria E. coli, e incubados a 37 °C no presentan coloración por cristal violeta, mientras que los“catéteres” control sin el ETA sumergidos en el mismo medio de cultivo Luria Bertani e incubado a 37 °C conteniendo células de la bacteria E. coli , presentan un intenso color debido a la formación de biopelículas.

La orina tiene una composición química y características físicas y químicas que pueden favorecer la proliferación de agentes patógenos. Para evaluar la utilidad de las estructuras basadas en el extracto producido por la presente invención ETA, se simuló la condición de formación de biopelículas en catéteres urinarios para lo que se utilizaron bacterias modelos de patologías infecciosas en un ambiente de orina, es decir bacterias de géneros que son reconocidos por generar infecciones urinarias en pacientes que son cateterizados por la vía urinaria. En este caso se utilizó a la bacteria E. coli y en particular para una evaluación de viabilidad se empleó una tinción que permite mediante el uso de técnicas microscópicas de fluorescencia, determinar la viabilidad de bacterias en una muestra. El método permite determinar la cantidad de bacterias vivas y muertas mediante observación microscópica. A su vez se empleó la técnica de tinción con cristal violeta para determinar la presencia de biopelículas en superficies. La Figura 3-A muestra distintas estructuras del tipo “catéteres” formulados en base diferentes componentes y al ETA de la cepa Kocuria de la Presente invención. La Figura 3-B muestra los ensayos de inmersión en orina conteniendo a células de la bacteria E. coli, los cuales fueron incubados a 37 °C. La Figura 3 C y D muestra“catéteres” obtenidos al cabo de 10 días y teñidos por el método de cristal violeta para ver la formación de biopelículas. La imagen C muestra superficie de catéter con mayor tinción (obscura) debida a la formación de biopelículas de E. coli en orina. Por su parte la imagen D muestra la superficie de un catéter fabricado usando ETA y silicona (imagen clara con menor tinción) en donde es posible apreciar una menor formación de biopelículas.

4.1 .2. Viabilidad bacteriana en condición de exposición a catéteres fabricados con ETA

Los resultados de viabilidad de E. coli en orina en el tiempo (0, 8, 16 y 24 horas) con algunos de los diferentes“catéteres” elaborados en base al polímero silicona según la Tabla 1 se muestran en la serie de figuras 4. La Figura 4-A corresponde a la condición control en donde el “catéter” se fabricó en base a sólo silicona, sin incorporar ningún agente antimicrobiano o ETA. Como muestra la gráfica de columnas la proporción de células vivas/muertas está alrededor del valor 1 al tiempo 24 horas, lo cual muestra una reducción en el tiempo debida al ambiente orina. En relación a las estructuras fabricadas con el ETA de Kocuria de la presente invención, es posible apreciar que, en relación al control (esto es silicona sin agentes antimicrobianos), existe un efecto a partir de las horas 16 y 24 horas (Figura 4-B). Estos resultados muestran que la incorporación del ETA de la invención permite reducir significativamente la formación de bio películas en silicona expuesta a orina, en comparación con otro compuesto conocido por sus propiedades biocidas, como son partículas de plata Ag, las que no inhibe el crecimiento de E. coli en orina (Figura 4-C).

4.2. Evaluación de formación de biopelículas sobre revestimientos o “coatings” fabricados con ETA

Para esto, se fabricaron diferentes superficies de las estructuras utilizando polímeros sintéticos o naturales. Las resinas utilizadas fueron: 1 .- Resina Vinilica; 2.- Caucho; 3.- Resina Epóxica; 4.- Resina Poliuretano; 5.- Resina Alquídica; 6.- Resina Poliéster. En cada caso se evaluó el control, que comprende sólo la resina, la resina mezclada con el extracto ETA de la invención en una concentración de 0,1 % (p/vol.). Y la resina mezclada con otro compuesto biocida, como es óxido de zinc (ZnO) en concentración 0, 1 % (p/vol.). Con cada mezcla se generó un film milimétrico sobre un portaobjeto. Los distintos portaobjetos conteniendo los respectivos films de los revestimientos o coatings fueron expuestos a luz ultravioleta durante 15 minutos de modo de esterilizarlos. Luego fueron expuestos por inmersión en un medio de cultivo a la presencia de una bacteria fluorescente Escherichia coli conteniendo el plásmido pGreenTir, el cual contiene el gen de la GFP. El ensayo se esquematiza en la Figura 5.

La Figura 6 muestra los resultados de la formación de biopelículas de la cepa E. coli GFP sobre superficies de estructuras bio-activas de la invención basadas en diferentes tipos de polímeros o resinas. Los resultados están expresados como número de bacterias fluorescentes por campo, utilizando un microscopio de epifluorescencia (Leica DM5000 B). Como se puede apreciar en relación al control, la incorporación del ETA en los diferentes revestimientos logró reducir el número de bacterias absorbidas a la superficie. Y en la mayoría de los casos ETA tuvo un rendimiento mejor al Zinc (oxido de Zinc). De esta forma es posible concluir que el incorporar ETA en un revestimiento o coating con diferentes materiales poliméricos, tales como vinilo, caucho, poliuretano y poliéster, por ejemplo, permite inhibir el desarrollo de biopelículas.

4.3. Evaluación de la capacidad de inhibición de formación de biofilms en ambientes marinos sumergidos.

Las superficies marinas sumergidas son normalmente afectadas por la formación de biopelículas microbianas que inician el proceso de microfouling para luego finalizar en el macrofouling. Esta situación es negativa cuando las superficies afectadas corresponden a materiales o instalaciones productivas. Por estas razones numerosas estrategias para evitar la formación de micro y macrofouling se han desarrollado, siendo las más eficaces aquellas que utilizan pinturas o recubrimientos basados en metales pesados. Lamentablemente estas soluciones son tóxicas para especies nativas y significan una contaminación ambiental, por lo cual en la actualidad existe la necesidad de buscar nuevas alternativas.

En este escenario es que se evaluó al ETA generado por Kocuria de la presente invención para ver si su incorporación permite la inhibición de biopelículas microbianas en el ambiente marino. El ensayo utilizó a la cepa Cobetia marina como modelo de bacteria marina de formación de biopelículas en el ambiente marino. La literatura señala a este microorganismo como un modelo de estudio de la formación de biopelículas. Para el ensayo se prepararon superficies con una cobertura de barniz comercial conteniendo un cultivo de Kocuria es decir sobrenadante ETA y las células presentes (Barniz Kocuria) en una concentración 0, 1 % (p/vol).y un el mismo barniz conteniendo sólo el sobrenadante del cultivo (Barniz ETA) en una proporción 0, 1 % (p/vol). Los ensayos se realizaron por inmersión de las superficies en agua de mar conteniendo al menos 1 x 10 6 células de Cobetia marina durante una semana. Al cabo de este tiempo se ensayó la capacidad de formación de biopelículas de la bacteria Cobetia marina expuesta mediante tinción con cristal violeta y por la visualización microscópica. Los resultados se muestran en la Figura 7, e indican que el Barniz ETA y el Barniz Kocuria de la presente invención, inhiben la formación de biopelículas de Cobetia marina en una condición de agua de mar.