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Title:
EXTRACT OF THE LEAVES OF COUROUPITA GUIANENSIS, METHOD FOR OBTAINING SAME AND COSMETIC USE THEREOF AS AN ANTIOXIDANT/ANTIRRADICAL/UV FILTER
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/119852
Kind Code:
A1
Abstract:
Extract of Couroupita guianenis leaves, method for obtaining same and cosmetic use thereof as an antioxidant/antiradical/UV (ultraviolet) filter. Extracts obtained from dry, ground and sieved leaves, extraction with water and/or alcohols, evaporation of this solvent, subsequent extraction with water and/or glycols of the dry extract of Couroupita guianenis and filtration; that can be used for care of the skin and/or hair, for example as antioxidants or radical inhibitors, as agents for combatting ageing or solar protectors.

Inventors:
MARTÍNEZ MORÁN, Ana María (2ª Travesía de Guixar, 21 1º, Vigo, E-36207, ES)
Application Number:
ES2008/000178
Publication Date:
October 09, 2008
Filing Date:
March 27, 2008
Export Citation:
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Assignee:
CAROI'LINE COSMÉTICA, S.L. (Prado, A Carrasqueira, Ponteareas, E-36894, ES)
MARTÍNEZ MORÁN, Ana María (2ª Travesía de Guixar, 21 1º, Vigo, E-36207, ES)
International Classes:
A61K36/185; A61K8/97; A61P17/16; A61P39/06; A61Q19/08
Domestic Patent References:
2008-03-27
Other References:
KHAN M.R. ET AL.: 'Antibiotic activity of Couroupita guianensis' JOURNAL OF HERBS, SPICES AND MEDICAL PLANTS vol. 10, no. 3, 2003, pages 95 - 108
ERKNATH A.A. ET AL.: 'Beta amyrin palmitate - Isolation from Couroupita guianensis Aubl. leaves' INDIAN DRUGS vol. 39, no. 4, 2002, pages 213 - 216
GHEETA M. ET AL.: 'Analgesic and anti-inflammatory activity of Couroupita guianensis Aubl' JOURNAL OF NATURAL REMEDIES vol. 4, no. 1, 2004, pages 52 - 55
DESAI S.T. ET AL.: 'Larvicidal property of Couroupita guianensis Aubl' INDIAN DRUGS vol. 40, no. 8, 2003, pages 484 - 486
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Claims:

REVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) Secado, molienda y tamización de las hojas de Couropita guianensis. ii) Extracción sólido-líquido en continuo de las hojas secas, molidas y tamizadas de

Couropita guianensis con disolventes acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos. iii) Evaporación hasta sequedad del disolvente de la extracción de la etapa ii) para la obtención de los extractos secos de Couropita guianensis; o evaporación del disolvente alcohólico de la etapa ii) para la obtención de los extractos acuosos de Couroupita guianensis. iv) Extracción sólido-líquido en continuo de los extractos secos o acuosos de la etapa iii) con disolventes acuosos, glicólicos o hidroglicólicos para la obtención de los extractos líquidos de Couropita guianensis. v) Filtración de los extractos líquidos de la etapa iv) para la obtención de los extractos líquidos filtrados de Couropita guianensis y almacenamiento en frío y ausencia de luz.

2. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa i), caracterizado porque se emplean las hojas secas molidas en un molino de aspas, y se tamizan a tamaño de partícula de 0,6 mm. aproximadamente.

3. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa ii), caracterizado porque el proceso de extracción sólido-líquido en continuo con disolventes se realiza mediante un proceso extractivo por soxhlet; se emplean relaciones líquido:sólido elevadas, preferentemente de 30 g/g; el disolvente es agua, o un alcohol Ci a Gt, preferentemente metanol o etanol, o una mezcla metanol/agua, o etanol/agua; la temperatura de la extracción es la de reflujo del disolvente o mezcla de disolventes de extracción y es^á en el rango de 60-120 0 C; el tiempo de extracción está en el intervalo de 3 horas a 21 días; y el proceso extractivo se realiza protegido de la luz.

4. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 3, caracterizado porque el disolvente de extracción es una mezcla etanol/agua 1:1; y la temperatura de la extracción es la de reflujo de la mezcla de disolventes y está en el rango de 85-95 0 C.

5. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa iii), caracterizado porque la evaporación hasta sequedad del disolvente para la obtención de los extractos secos de Couropita guianensis, se realiza a vacío y el agua se elimina, preferentemente, mediante liofilización.

6. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa iii), caracterizado porque la evaporación del disolvente alcohólico para la obtención de los extractos acuosos de Couropita guianensis, se realiza a vacío.

7. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa iv), caracterizado porque el proceso de extracción sólido-líquido en continuo con disolventes se realiza mediante maceración con agitación; se emplean relaciones líquido: sólido elevadas, preferentemente de 99 g/g; el disolvente es agua, o un glicol C 2 a Ce, preferentemente propilenglicol o butilenglicol, o una mezcla propilenglicol/agua, o butilenglicol/agua; la temperatura de extracción es la temperatura ambiente, 20 0 C aproximadamente; el tiempo de la extracción es prolongado, de 3 a 21 días y se realiza protegido de la luz.

8. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 7, caracterizado porque el disolvente de extracción es una mezcla butilenglicol /agua 1:1. 9. Procedimiento de obtención de extractos de Couropita guianensis, según la reivindicación 1, etapa v), caracterizado porque se filtran los extractos líquidos obtenidos en la etapa iv), preferentemente mediante placa porosa del n° 3 ó 4, o papel de filtro de gramaje 73 g/m 2 , y los extractos líquidos filtrados de Couropita guianensis se almacenan en frío, preferentemente a 4 0 C, y protegidos de la luz. 10. Extractos secos de Couropita guianensis obtenidos según las revindicaciones 2 a 5.

11. Extractos líquidos de Couropita guianensis obtenidos según las revindicaciones 10, y 6 a 9.

12. Extractos líquidos filtrados de Couropita guianensis, según la reivindicación 11, caracterizados por presentar absorción ultravioleta entre las longitudes de onda de 250 nm a 400 nm; por poseer un alto contenido fenólico; por su capacidad de inhibición del radical DPPH * ; por su capacidad de inhibición de la oxidación del sistema micelar β-caroteno y ácido linoleico; por su capacidad de inhibición del radical ABTS 1+ ; por su capacidad antioxidante o de reducción del hierro.

13. Extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, según la reivindicación 12, caracterizados por presentar a la concentración de 100 ppm a las longitudes de onda de 250 nm (Abs > 1,000), 280 nm (Abs > 0,800), 320 nm (Abs > 0,300) y 400 nm (Abs > 0,100); por poseer un contenido fenólico entre 25-35%; por presentar una IC 50 entre 200 a 400 ppm de inhibición del radical DPPH * ; por presentar un coeficiente de actividad antioxidante

(CAA, %) entre el 35% al 60% del sistema micelar β-caroteno y ácido linoleico; por presentar a 100 ppm una capacidad de inhibición del radical ABTS *+ equivalente entre 0,400 a 0,800 mM de Trolox y por su capacidad antioxidante o de reducción del hierro a 100 ppm de entre un 20% al 40% o una equivalencia entre 0,200 mM a 0,400 mM en ácido ascórbico o vitamina C.

14. Extracto líquido filtrado de Couroupita guianensis, según la reivindicación 13, caracterizado por presentar a la concentración de 100 ppm a las longitudes de onda de 250 nm (Abs = 1,234), 280 nm (Abs = 1,005), 320 nm (Abs = 0,380) y 400 nm (Abs = 0,145); por poseer un contenido fenólico del 32%; por presentar una IC 50 = 205 ppm de inhibición del radical DPPH * ; por presentar un coeficiente de actividad antioxidante (CAA, %) del 58% del sistema micelar β-caroteno y ácido linoleico; por presentar a 100 ppm una capacidad de inhibición del radical ABTS ** equivalente a 0,733 mM en Trolox y por su capacidad antioxidante o de reducción del hierro a 100 ppm de un 32%, lo que equivale a 0,316 mM en ácido ascórbico o vitamina C. 15. Uso de los extractos de Couroupita guianensis, según las reivindicaciones 10 a 14, como agente cosmético para el cuidado de la piel y/o el cabello, destinado a actuar como agente antienvejecimiento y antioxidante, por prevenir las alteraciones derivadas de la oxidación celular o el estrés oxidativo, y por actuar como inhibidor de radicales y protector contra radiaciones ionizantes y radicales libres. 16. Uso de los extractos de Couroupita guianensis, según la reivindicaciones 10 a 14, como agente cosmético para el cuidado de la piel y/o el cabello, destinado a actuar como absorbente de la radiación UV (ultravioleta), lo que le aporta propiedades de filtro solar.

Description:

DESCRIPCIóN

Extracto de las hojas de Couroupita guianensis, procedimiento de obtención y su uso cosmético como antioxidante/antirradicalario/filtro UV.

A principios del siglo XX Mulliken investigó la reactividad fotolumínica demostrando que durante el proceso de peroxidación y fotoexcitación se formaba un estado excitado del oxígeno (oxígeno singlete: '0 * 2 ). El desarrollo de estas investigaciones llevó a la introducción del término de especies reactivas de oxígeno (ERO) y de radicales libres de oxígeno (RLO) en el campo de la biología y a la demostración de que estas especies radicalarias eran las responsables de los efectos tóxicos del oxígeno. Por lo tanto, dado que los ERO/RLO son especies que se generan de forma continuada como productos de la utilización celular del O 2 , en los organismos aerobios se han desarrollado estrategias biológicas para desactivarlos, como el sistema enzimático superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa o catalasa

Con frecuencia, estos mecanismos básicos de defensa no son suficientes para eliminar todas las especies radicalarias generadas de forma endógena (respiración celular y otros procesos fisiológicos) o las de origen exógeno (radiaciones, polución ambiental, fármacos, tóxicos) que desde el entorno inciden en el organismo. La pérdida de equilibrio entre el nivel de prooxidación y el tono antioxidante de un órgano o tejido puede producir daño celular y, secundariamente, condicionar la aparición de estados de enfermedad. Se define el estrés oxidativo como la situación de daño celular que resulta cuando la generación y/o incidencia exógena de RLO supera la capacidad de los diferentes mecanismos fisiológicos del organismo para prevenir o interceptar su acumulación.

Además de los mecanismos de defensa enzimáticos a lo largo de la evolución biológica, los organismos han desarrollado la capacidad de sintetizar moléculas con actividad antioxidante: ubiquinona, glutatión, ceruloplasmina, transferina y ácido úrico en mamíferos; y compuestos como ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), β- caroteno (pro-vitamina A), diversos flavonoides y otros compuestos fenólicos en el caso de los vegetales. Así, es bien conocida la relación entre el contenido fenólico de los extractos vegetales y su actividad antioxidante [Y. S. Velioglu et ai, Journal of Agricultura and Food Chemistry; 1998, 46 (10), 4113-4117].

Los antioxidantes naturales además de proteger al organismo del daño producido por los radicales libres, responsables de las enfermedades degenerativas como el cáncer, arterioesclerosis, artritis y procesos neurodegenerativos y de envejecimiento; pueden presentar actividad antibactericida, antivírica, antimutagénica, antiúlcera o anticarlogénica.

HOJA DE SUSTITUCIóN (REGLA 26)

Además, si los antioxidantes naturales absorben radiación ultravioleta pueden ser empleados como filtros solares [EP0781544B1]. La radiación UV (ultravioleta) puede ser clasificada en UV-C (longitud de onda menor de 280 nm); UV-B (longitud de onda entre 280 nm y 320 nm) y UV-A (longitud de onda entre 320 nm y 400 nm). De estas radiaciones ultravioletas, la más letal es la radiación UV-C, aunque la mayoría de la misma es absorbida por el ozono. Por ello, las que pueden tener mayor influencia sobre la piel son las radiaciones UV-A y UV-B.

Estado de la técnica Couroupita guianensis (Lecitidaceaé) es un árbol original de la alta selva tropical que se extiende desde el Amazonas hasta Venezuela. También se encuentra en Panamá y Costa Rica y en la India y Sri Lanka.

Couroupita guianensis es una planta utilizada en la India para el tratamiento de enfermedades de la piel [a) A. S. R. Anjaneyulu et al, Indian Journal ofChemistry, Section B; 1998, 37B(4), 382-386. b) The useful plants of India; Publications & Information

Directorate; CSIR, New Delhi, 1986, 144. c) J. Anjaria et al., Nature Helas, A glossary of selected indigenous medicinal plants of India; SRISTI Innovations, 1997, 23].

Se ha determinado actividad antimicrobiana, antibacteriana y antibiótica de extractos de hojas, tallos, flores, frutos, raíces y corteza de Couroupita guianensis y actividad antifúngica de extractos de tallos, corteza y flores [a) S. J. Vahanwala et al., Indian Drugs;

2000, 37, 343-345. b) M. R. Khan et al, Journal ofherbs, spices & medicinal plants; 2003,

10 (3), 95-108. c) M. Poonkothai et al., Plant Archives; 2005, 5 (1), 93-95].

Por otra parte, se ha estudiado la actividad antilarvaria de extractos de flores y frutos de Couroupita guianensis [S. T. Desal et al., Indian Drug; 2003, 40 (8), 484-486]. Asimismo, se ha determinado la actividad analgésica y antiinflamatoria de extractos de flores y corteza de Couroupita guianensis [M. Geetha et al, Journal of Natural Remedies; 2004, 4 (1), 52-55].

Por otra parte, hay estudios sobre el efecto de extractos de corteza y flores de

Couroupita guianensis en el ciclo reproductivo en ratas [M. Geetha et al, Journal of Natural Remedies; 2005, 5 (2), 121-125] y estudios sobre el efecto de extractos de semillas de Couroupita guianensis en la reproducción de peces [G. R. Dave et al, Indian Botanical

Contactor; 1991, 8 (3), 99-106].

También, se ha determinado la actividad analgésica y antiinflamatoria de dos extractos, butanólico y acuoso, de las hojas de Couroupita guianensis obtenidos tras un

fraccionamiento entre disolventes orgánicos de diferente polaridad (metanol, hexano, diclorometano y acetona) [λ. M. Martínez Moran; Estudio químico de la Couropita guianensis y de la Ilex guayosa y nuevas aplicaciones sintéticas de las l-(3- feniletil)isoquinolinas y de las 2-bencilidén-l-indanonas: síntesis total de benzofluorenos y de benzofuronaftalenos, Tesis doctoral, 1999],

Por último, hay bastantes estudios de actividad de los alcaloides indólicos, de tipo indolo[2,l-6]quinazolo-6,12-dionas, aislados de los frutos de Couroupita guianensis, y en concreto del tryphantrin y sus derivados. Estos alcaloides presentan actividad antibacteriana, antituberculosa [a) L. A. Mitscher et al., Puré & Applied Chemistry; 1998, 70 (2), 365-371. b) WO951380], antimalárica [US2006160827 Al] y actividad antiinflamatoria, por actuar como inhibidores de prostaglandinas y leucotrienos [H. Danz et al., Planta Medica; 2001, 67, 411-416].

Hay diversos estudios sobre la composición fitoquímica de Couroupita guianensis.

Se han aislado de los frutos de Couroupita guianensis los ácidos cítrico, málico e isocítrico [a) E. K. Nelson et al., Journal of the American Chemical Society; 1937, 59, 2499-2500. b) T. R. Soderstrom, American Journal of Botany; 1962, 49(8), 850-855], ácidos clorogénicos [P. V. Pontes et al, Journal of the Science of Food and Agricultura; 2002, 82(10), 1177-1181], los esteróles estigmaesterol y camfesterol; y los alcaloides indólicos tryptanthrina, couropitina A, couropitina B o indirrubina, índigo e isatina [a) J. Bergman et al, Tetrahedron; 1985, 41(14), 2879-2881. b) J. Bergman et al, Tetrahedron Letters; 1977, 30, 2625-2626. c)A. K. Sen et al, Tetrahedron Letters; 1974, 7, 609-610. c) A. L Dyakonov et al, Chemistry of Natural Compounds; 1997, 33 (3), 221-267].

Hay estudios sobre el contenido en ácidos grasos, proteínas, terpenos, esteróles, y aminoácidos de las semillas de Couroupita guianensis. [a) E. H. A. Andrade et al, Journal of Food Composition and Analysis; 1999, 12(1), 37-51. b) R. C. A. Lago et al, Acta Amazónica; 1987, Volunte Date 1986, 16-17(1), 369-376. c) G. R. Dave et al, Fette, Seifen, Anstrichmittel; 1985, 87(3), 111-112. d) N. S. Bai, BuIl Central Research Inst. Univ. Travancor, Trivandrum; 1954, 3, 114-117. e) W. N. Zuo et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry; 1996, 44(5), 1206-1210]. Se ha determinado la presencia de taninos, de terpenos, esteroides, ketosteroides y esteróles en la composición química de la corteza [a) A. S. R. Anjaneyulu, op. cited (1998). b) L. R. Row et al, Current Science; 1966, 35(6), 146-147].

Se ha determinado la presencia de antocianinas, flavonoides, ácidos cinámicos y compuestos de naturaleza lipídica, en los estigmas [F. W. Martin, American Journal of Botany; 1969, 56(9), 1023-1027].

De las flores de Couroupita guianensis se han identificado, entre los componentes volátiles, linalool, eugenol, nerol, geraniol y (£,£>farnesol [a) E. H. A. Andrade et al, Journal ofEssential OiI Research; 2000, 12(2), 163-166. b) K. C. Wong et al, Journal of Essential OiI Research; 1995, 7(2), 225-227. c) Y. S. Lewis et al, Perfumery and Essential OiI Record; 1969, 60(1), 23-24. d) J. T. Knudsen et al, Biotropica; 1996, 28, 42-6O]. Asimismo, se han aislado de las flores de Couroupita guianensis un hidrocarburo alifático y estigmasterol [J. B. Rane et al, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences; 1994, 56, 72-73].

De las hojas de Couroupita guianensis se han aislado el éster triperpénico β-amirin palmitato [A. A. Eknath et al, Indian Drugs; 2002, 39(4), 213-216], el kaemferol-3-0- neohesperidósido, y dos ácidos hidroxicinámicos, el ácido cafeico y un derivado del mismo, el ácido rosmarínico [A. M. Martínez Moran, op. cited (1999)].

Descripción

La presente invención describe extractos de las hojas de Couroupita guianenis, su procedimiento de obtención y su uso cosmético como antioxidantes/antirradicalarios/filtros UV (ultravioleta).

Se describe, entre otras cosas, un nuevo procedimiento para la obtención de extractos de Couroupita guianensis a partir de las hojas, que permite emplear disolventes inocuos, como son agua, glicoles y otros alcoholes, de bajo coste y operación segura para obtener un producto estable, fácil de manejar, de adicionar a diferentes productos y que puede ser empleado como ingrediente de la industria cosmética. También describe dichos extractos de Couroupita guianensis, obtenidos por el procedimiento descrito, es decir, los propios extractos de Couroupita guianensis, caracterizados por presentar, entre otros, elevado contenido fenólico y relevantes propiedades antioxidantes, antirradicalarias y de protección UV, que hace que puedan ser utilizados para el cuidado de la piel y/o el cabello, por ejemplo como antioxidantes o inhibidores de radicales, como agentes para combatir el envejecimiento o protectores solares. Los extractos presentan frecuentemente mayor actividad antioxidante que antioxidantes sintéticos como el BHT (butirohidroxitolueno), el BHA (butirohidroxianisol) o Trolox (equivalente soluble del α-tocoferol o vitamina E). La práctica de la presente invención implica:

Procedimiento de obtención i) Preparación de las hojas de Couroupita guianensis:

Se emplean las hojas secas de Couroupita guianensis molidas y tamizadas. Se someten a un molido, preferentemente en un molino de aspas, y se tamiza, preferentemente a tamaño de partícula de 0,6 mm. aproximadamente. ii) Extracción de las hojas de Couroupita guianensis con disolventes: Las hojas secas, molidas y tamizadas de Couroupita guianensis se someten a un proceso de extracción sólido-líquido en continuo con disolventes, preferentemente se realiza una extracción por soxhleL Se emplean relaciones líquido:sólido elevadas, preferentemente de 30 g/g.

Como disolvente a extractar se emplean agua y/o disolventes hidroalcohólicos y/o alcohólicos. Se elige ventajosamente alcoholes Ci a C 4 y, preferentemente, etanol o metanol. Entre ellos, se elige ventajosamente una mezcla etanol/agua 1:1.

La temperatura de la extracción es la de reflujo del disolvente o mezcla de disolventes de extracción y está en el rango de 60-120 0 C y, preferentemente, entre 85-95 0 C. El tiempo de extracción está en el intervalo de 3 horas a 21 días. El proceso extractivo se realiza protegido de la luz para evitar posibles alteraciones. El rendimiento del proceso extractivo oscila entre el 15% y el 40% (g/g). iii) Obtención de los extractos secos o extractos acuosos de Couroupita guianensis: Los extractos acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos obtenidos de las hojas de Couroupita guianensis se someten a evaporación a vacío para eliminar el disolvente y obtener los extractos secos de Couroupita guianensis.

El agua se elimina mediante evaporación a vacío, preferentemente mediante liofilización. Si, para la obtención de los extractos líquidos de la etapa iv), se emplean como disolventes de extracción agua o hidroglicoles, en algún caso puede eliminarse a vacío sólo el disolvente alcohólico de la etapa ii) y no eliminar el agua, obteniéndose extractos acuosos de Couroupita guianensis. iv) Obtención de los extractos líquidos de Couroupita guianensis: Los extractos secos o los extractos acuosos de Couroupita guianensis obtenidos en la etapa iii), se someten a un nuevo proceso extractivo sólido-líquido en continuo con disolventes, preferentemente mediante maceración con agitación.

Se emplean relaciones líquido:sólido elevadas, preferentemente de 99 g/g.

Como disolvente a extractar se emplea agua y/o disoluciones hidroglicólicas y/o glicólicas. Se elige ventajosamente glicoles Cz a Ce. Entre estos glicoles se prefiere utilizar propilenglicol y bútilenglicol. Entre ellos, se elige ventajosamente una mezcla butilenglicol/agua 1:1. La temperatura de extracción es la temperatura ambiente, 20 0 C aproximadamente.

El tiempo de extracción es prolongado, de 3 a 21 días.

El proceso extractivo se realiza protegido de la luz para evitar posibles alteraciones, v) Obtención de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis: Los sólidos de los extractos líquidos de Couroupita guianensis, obtenidos en la etapa iv), se separan por filtración, preferentemente mediante placa porosa del n° 3 ó 4, o papel de filtro de gramaje 73 g/m 2 , obteniéndose los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis.

Estos extractos se almacenan refrigerados, preferentemente a 4 0 C, y protegidos de la luz para evitar posibles alteraciones. Caracterización de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis i) Determinación de la absorción UV (ultravioleta) de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis:

La radiación UV (ultravioleta) se clasifica en UV-C (longitud de onda menor de 280 nm); UV-B (longitud de onda entre 280 nm y 320 nm) y UV-A (longitud de onda entre 320 nm y 400 nm), por ello, si un producto absorbe radiación entre 250 a 400 nm puede ser empleado como filtro solar.

Se mide la absorbencia (Abs) de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, a la concentración de 100 ppm en etanol entre las longitudes de onda de 250 a 400 nm frente a un blanco de etanol. Todos presentan máximos de absorción en la región UV (ultravioleta). Así a la longitud de onda de 250 nm presentan Abs > 1,000; a 280 nm presentan Abs > 0,800; a 320 nm presentan Abs > 0,300 y a 400 nm presentan Abs > 0, 100. ii) Determinación del contenido fenólico de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis: Los compuestos fenólicos presentan una elevada actividad antioxidante [Y. S. Velioglu, op. cited (1998)]. Por ello, se determina el contenido fenólico de los extractos líquidos de Couroupita guianensis según el método de Folin Ciocalteu's [A. Escarpa et al., Analytica Chinaca Acta; 2001, 427(1), 119-127]. Se mide la absorbancia a 765 nm de una disolución de 0,5 mL del extracto antioxidante, 3,75 mL de agua destilada, 0,25 mL del reactivo de

Folin Ciocalteau's (1:1 con agua destilada) y 0,5 mL de Na 2 CO 3 al 10 %; después de 1 hora a temperatura ambiente, frente a un blanco sin extracto. Se determina el contenido fenólico del extracto comparando la absorbencia con un recta patrón de ácido gálico (0-100 ppm). Los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan, según el procedimiento descrito, un alto contenido fenólico, entre 25-35%. iii) Determinación de la actividad captadora del radical OC, a-difenil-β-picrilhidracilo (DPPVt) y de su equivalencia en BHT y BHA de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis:

Para medir la actividad captadora del radical α,α-difenil-β-picrilhidracilo (DPPH * ) //.

Parejo et ai, Journal ofAgricultural and Food Chemistry; 2002, 50, 6882-6890], se mide la disminución de la absorbancia a 515 nm, después de 16 minutos, de una disolución de 2 mL de DPPH * 6 10 "5 M en metanol y 50 μL del extracto antioxidante. El porcentaje de inhibición se calcula según la siguiente fórmula:

PI (Porcentaje de Inhibición) PI(%): [(Abs t=0min-Abs t=16 min)/Abs t=0min)]*100

Se mide la IC 50 o concentración que inhibe el 50% del radical DPPH * . Los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan una IC 50 entre 200 a 400 ppm. La IC 50 del BHA, medida según el mismo procedimiento, es de 240 ppm y la del BHT de 2790 ppm. iv) Determinación de la actividad inhibitoria de la oxidación en medio emulsionado, basada en la inhibición de la oxidación de una emulsión de β-caroteno y ácido linoleico, y de su equivalencia en BHA, de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis:

Para medir la actividad inhibitoria de la oxidación en medio emulsionado, basada en la inhibición de la oxidación de una emulsión de β-caroteno (pro-vitamina A) y ácido linoleico [G. /. Marco, Journal American OiI Chemists' Society; 1968, 45, 594-8], se prepara una disolución de β-caroteno (2 mg en 10 mL de cloroformo). Se añade 1 mL de esta disolución en un tubo con 20 mg de ácido linoleico y 200 mg del emulgente Tween 40. Se homogeniza. Se elimina el cloroformo a vacío. Se añaden 50 mL de agua destilada saturada de oxígeno. Se agita a 6000 rpm para formar la emulsión. Se miden las absorbancias a 470 nm de la muestra del extracto antioxidante (200 μL del extracto en 5

mL de emulsión) y del control (200 μL de etanol absoluto en 5 mL de emulsión) después de 2 horas a 50 0 C. Se hace un blanco siguiendo el mismo procedimiento pero sin añadir β- caroteno. Se mide el coeficiente de actividad antioxidante (CAA, %), que es la relación de oxidación del β-caroteno en presencia y ausencia de antioxidante.

CAA = [(Abs extract 120 min - Abs control 120 min)/(Abs control 0 min - Abs control 120 min)]*100

Los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan a 250 ppm de concentración actividad inhibitoria de la oxidación de entre el 35% al 60%. Los valores de CAA para el BHA a 250 ppm, según el mismo procedimiento, fueron de 80%. v) Determinación de la actividad inhibitoria del radical ABTS ** y de su equivalente en Trolox, de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis: Para medir la capacidad de inhibición del radical ABTS * * y determinar su equivalente en Trolox (equivalente soluble de la vitamina E o α-tocoferol) [R. Re et al, Free Radical Biology and Medicine; 1999, 26, 1231-1237], se prepara un tampón de PBS pH 7,4 (8,0 g NaCl, 0,2 g KH 2 PO 4 , 1,15 g Na 2 HPO 4 , 0,2 g KCl, 0,2 g azida sódica). Se prepara el reactivo de TEAC (38,4 mg ABTS ** 7 mM, 6,62 mg persulfato potásico 2,45 mM en 10 mL de tampón PBS). Se agita durante 16 horas en ausencia de luz. Se lee la absorbancia a 734 nía Se diluye el reactivo hasta que presente una absorbancia próxima a 0,7. Se añaden 20 μL del extracto antioxidante a 2 mL del reactivo. Se calienta a 30 0 C y se mide la absorbancia 734 nm a los 10 minutos. Se hace un control con etanol y un blanco con el tampón PBS. Se compara la absorbancia con los valores de una recta patrón con Trolox (0,1 a 1 mM en agua destilada).

Los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan a una concentración de 100 ppm una capacidad de inhibición del radical ABTS * * equivalente a entre 0,400 a 0,800 mM de Trolox. Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis /Trolox de 1/1 a 1/2 (g/g). v) Determinación de la actividad antioxidante o de reducción del hierro y de su equivalencia en ácido ascórbico o vitamina C de los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis:

Se determina el poder reductor del hierro o actividad antioxidante de los extractos líquidos de Couroupita guianensis según el método de Oyaizu [Af. Oyaizu, J apáñese Journal of Nutrition; 1986, 44, 307-315]. El extracto antioxidante se diluye en etanol, a 1 mL del mismo se le añaden 2,5 mL de tampón fosfato pH 6,6 0,2 M y 2,5 mL de ferrocianuro potásico al 1%. Se incuba a 50 °C durante 20 minutos. Se añaden 2,5 mL de ácido tricloroacético al 10%. Se pipetean 2,5 mL del sobrenadante y se mezclan con 2,5 mL de agua destilada y 0,5 mL de cloruro férrico al 0,1%. Se mide la absorbencia a 700 nm y se comparan los resultados con un a recta patrón de ácido ascórbico o vitamina C (0,1- 1 mM). Los extractos líquidos filtrados de Couroupita guianensis, obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan a una concentración de 100 ppm un poder reductor del hierro de entre el 20% al 40% y una equivalencia entre 0,200 mM a 0,400 mM en ácido ascórbico o vitamina C. Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis/áddo ascórbico o vitamina C entre 1/0,35 a 1/0,70 (g/g).

Ejemplo 1

Preparación del extracto hidrobutilenglicólico de Couroupita guianensis. Las hojas secas de Couroupita guianensis, molidas y tamizadas a tamaño de partícula de 0,6 mm aproximadamente, se someten a un proceso extractivo sólido-líquido en continuo, con una relación líquido: sólido de 30 g/g, mediante un soxhlet, con una mezcla etanol/agua 1:1, a la temperatura de reflujo del disolvente (85-95 0 C), durante 12 días y protegido de la luz. Se evapora hasta sequedad, a vacío, el disolvente del extracto obtenido. El rendimiento de la extracción es del 36% (g/g).

El extracto seco de Couroupita guianensis obtenido se somete a un nuevo proceso extractivo sólido-líquido en continuo, mediante maceración con agitación, con una relación líquido: sólido de 99 g/g, a temperatura ambiente y protegido de la luz, durante 16 días con una mezcla butilenglicol/agua 1:1. El extracto líquido de Couroupita guianensis obtenido se filtra, mediante placa porosa del n° 3, y el producto final, el extracto líquido filtrado de

Couroupita guianensis, se almacena refrigerado a 4 0 C y protegido de la luz para evitar su alteración.

- Se midió la absorbancia de este extracto a la concentración de 100 ppm en etanol a las longitudes de onda de 250 nm (Abs = 1,234), 280 nm (Abs = 1,005), 3^0 nm (Abs = 0,380) y 400 nm (Abs = 0,145) frente a un blanco de etanol.

- Contenido fenólico según el método de Folin Ciocalteu's [A. Escarpa, op. cited (2001)]. Se mide la absorbencia a 765 nm de una disolución de 0,5 mL del extracto antioxidante, 3,75 mL de agua destilada, 0,25 mL del reactivo de Folin Ciocalteau's (1: 1 con agua destilada) y 0,5 mL de Na 2 Cü3 al 10 %; después de 1 hora a temperatura ambiente, frente a un blanco sin extracto. Se determina el contenido fenólico del extracto comparando la absorbancia con un recta patrón de ácido gálico (0-100 ppm).

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 1 presenta un contenido fenólico del 32%.

- Actividad captadora del radical α,α-difenil-β-picrilhidracilo (DPPH * ) //. Parejo, op. cited ( 2002)]. Se mide la disminución de la absorbancia a 515 nm, después de 16 minutos, de una disolución de 2 mL de DPPH * 6 10 "5 M en metanol y 50 μL del extracto antioxidante. El porcentaje de inhibición se calcula según la siguiente fórmula:

PI (Porcentaje de Inhibición) PI(%): [(Abs t=0min-Abs t=16 min)/Abs t=0min)]*100

Se midió la IC50 o concentración que inhibe el 50% del radical DPPH * . El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 1 presenta una IC 50 = 205 ppm. La actividad inhibitoria del BHA, medida según el mismo procedimiento, es menor, pues presenta una IC 50 = 240 ppm, al igual que la del BHT con una IC 50 = 2790 ppm.

- Actividad inhibitoria de la oxidación en medio emulsionado, basada en la inhibición de la oxidación de una emulsión de β-caroteno (pro-vitamina A) y ácido linoleico [G. J.

Marco, op. cited (1968)]. Se prepara una disolución de β-caroteno (2 mg en 10 mL de cloroformo). Se añade 1 mL de esta disolución en un tubo con 20 mg de ácido linoleico y 200 mg del emulgente Tween 40. Se homogeniza. Se elimina el cloroformo a vacío. Se añaden 50 mL de agua destilada saturada de oxígeno. Se agita a 6000 rpm para formar la emulsión. Se miden las absorbancias a 470 nm de la muestra del extracto antioxidante (200 μL del extracto en 5 mL de emulsión) y del control (200 μL de etanol absoluto en 5 mL de emulsión) después de 2 horas a 50 0 C. Se hace un blanco siguiendo el mismo procedimiento pero sin añadir β-caroteno. Se mide el coeficiente de actividad antioxidante

(CAA, %), que es la relación de oxidación del β-caroteno, o pro-vitamina A, en presencia y ausencia de antioxidante.

CAA = [(Abs extract 120 min - Abs control 120 min)/(Abs control 0 min - Abs control 120 min)]* 100

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 1 presenta a 250 ppm de concentración un CAA de 58%. Los valores de CAA para el BHA a 250 ppm, según el mismo procedimiento, fueron de 80%.

- Actividad capacidad de inhibición del radical ABTS ** y determinación de su equivalente en Trolox (equivalente soluble de la vitamina E) [R. Re, op. cited (1999)]. Se prepara un tampón de PBS pH 7,4 (8,0 g NaCl, 0,2 g KH 2 PO 4 , 1,15 g Na 2 HPO 4 , 0,2 g KCl, 0,2 g azida sódica). Se prepara el reactivo TEAC (38,4 mg ABTS * * 7 mM, 6,62 mg persulfato potásico 2,45 mM en 10 mL de tampón PBS). Se agita durante 16 horas en ausencia de luz. Se lee la absorbancia a 734 nm. Se diluye el reactivo hasta que presente una absorbancia próxima a 0,7. Se añaden 20 μL del extracto antioxidante a 2 mL del reactivo. Se calienta a 30 0 C y se mide la absorbancia 734 nm a los 10 minutos. Se hace un control con etanol y un blanco con el tampón PBS. Se compara la absorbancia con los valores de una recta patrón con Trolox (0,1 a 1 mM en agua destilada).

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 1 presenta a 100 ppm de concentración una equivalencia de 0,733 mM en Trolox. Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis /Trolox de 1/1,84 (g/g).

- Poder reductor del hierro o actividad antioxidante según el método de Oyaizu y determinación de su equivalencia en ácido ascórbico o vitamina C [M Oyaizu, op. cited (1986)]. El extracto antioxidante se diluye en etanol, a 1 mL del mismo se le añaden 2,5 mL de tampón fosfato pH 6,6 0,2 M y 2,5 mL de ferrocianuro potásico al 1%. Se incuba a 50 0 C durante 20 minutos. Se añaden 2,5 mL de ácido tricloroacético al 10%. Se pipetean 2,5 mL del sobrenadante y se mezclan con 2,5 mL de agua destilada y 0,5 mL de cloruro férrico al 0,1%. Se mide la absorbancia a 700 nm y se comparan los resultados con un a recta patrón de ácido ascórbico o vitamina C (0,1- 1 mM).

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 1 presenta a 100 ppm un 32% de poder reductor que equivale a 0,316 mM en ácido ascórbico o vitamina C.

Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis /ácido ascórbico o vitamina C de 1/0,56 (g/g).

Ejemplo 2 Preparación del extracto hidropropilenglicólico de Couroupita guianensis.

Las hojas secas de Couroupita guianensis, molidas y tamizadas a tamaño de partícula de 0,6 mm aproximadamente, se someten a un proceso extractivo sólido-líquido en continuo, con una relación líquido: sólido de 30 g/g, mediante un soxhlet, con una mezcla etanol/agua 1:1, a la temperatura de reflujo del disolvente (85-95 0 C), durante 12 días y protegido de la luz. Se evapora hasta sequedad, a vacío, el disolvente del extracto obtenido. El rendimiento de la extracción es del 36% (g/g).

El extracto seco de Couroupita guianensis obtenido se somete a un nuevo proceso extractivo sólido-líquido en continuo, mediante maceración con agitación, con una relación líquido: sólido de 99 g/g, a temperatura ambiente y protegido de la luz, durante 16 días con una mezcla propilenglicol/agua 1:1. El extracto líquido de Couroupita guianensis obtenido se filtra, mediante placa porosa del n° 3, y el producto final, el extracto líquido filtrado de Couroupita guianensis, se almacena refrigerado a 4 0 C y protegido de la luz para evitar su alteración.

- Se midió la absorbancia de este extracto a la concentración de 100 ppm en etanol a las longitudes de onda de 250 nm (Abs = 1,049), 280 nm (Abs = 0,806), 320 nm (Abs = 0,377) y 400 nm (Abs = 0,154) frente a un blanco de etanol.

- Contenido fenólico según el método de Folin Ciocalteu's [A. Escarpa, op. cited (2001)]. Se mide la absorbancia a 765 nm de una disolución de 0,5 mL del extracto antioxidante, 3,75 mL de agua destilada, 0,25 mL del reactivo de Folin Ciocalteau's (1:1 con agua destilada) y 0,5 mL de NaaCCb al 10 %; después de 1 hora a temperatura ambiente, frente a un blanco sin extracto. Se determina el contenido fenólico del extracto comparando la absorbancia con un recta patrón de ácido gálico (0-100 ppm). El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 2 presenta un contenido fenólico del 26%.

- Actividad captadora del radical α,α-difenil-β-picrilhidracilo (DPPH * ) [I. Parejo, op. cited C 2002)]. Se mide la disminución de la absorbancia a 515 nm después de 16 minutos

de una disolución de 2 mL de DPPH" 6 10 "5 M en metanol y 50 μL del extracto antioxidante. El porcentaje de inhibición se calcula según la siguiente fórmula:

PI (Porcentaje de Inhibición) PI(%): [(Abs t=0min-Abs t=16 min)/Abs t=0min)]*100

Se midió la IC 50 o concentración que inhibe el 50% del radical DPPH * . El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 2 presenta una IC 50 = 327 ppm. La actividad inhibitoria del BHA, medida según el mismo procedimiento, es mayor pues presenta una IC 50 = 240 ppm, y la del BHT, con IC 50 = 2790 ppm, menor.

- Actividad inhibitoria de la oxidación en medio emulsionado, basada en la inhibición de la oxidación de una emulsión de β-caroteno y ácido linoleico [G. /. Marco, op. cited (1968)]. Se prepara una disolución de β-caroteno (2 mg en 10 mL de cloroformo). Se añade 1 mL de esta disolución en un tubo con 20 mg de ácido linoleico y 200 mg del emulgente Tween 40. Se homogeniza. Se elimina el cloroformo a vacío. Se añaden 50 mL de agua destilada saturada de oxígeno. Se agita a 6000 rpm para formar la emulsión. Se miden las absorbancias a 470 nm de la muestra del extracto antioxidante (200 μL del extracto en 5 mL de emulsión) y del control (200 μL de etanol absoluto en 5 mL de emulsión) después de 2 horas a 50 0 C. Se hace un blanco siguiendo el mismo procedimiento pero sin añadir β-caroteno. Se mide el coeficiente de actividad antioxidante (CAA, %), que es la relación de oxidación del β-caroteno en presencia y ausencia de antioxidante.

CAA = [(Abs extract 120 min - Abs control 120 min)/(Abs control 0 min - Abs control 120 min)]*100

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 2 presenta a 250 ppm de concentración un CAA del 40%. Los valores de CAA para el BHA a 250 ppm, según el mismo procedimiento, fueron de 80%.

- Actividad capacidad de inhibición del radical ABTS 1+ y determinación de su equivalente en Trolox (equivalente soluble de la vitamina E) [R. Re, op. cited (1999)]. Se prepara un tampón de PBS pH 7,4 (8,0 g NaCl, 0,2 g KH 2 PO 4 , 1,15 g Na 2 HPO 4 , 0,2 g

KCl, 0,2 g azida sódica). Se prepara el reactivo TEAC (38,4 mg ABTS ** 7 mM, 6,62 mg persulfato potásico 2,45 mM en 10 mL de tampón PBS). Se agita durante 16 horas en ausencia de luz. Se lee la absorbancia a 734 nm. Se diluye el reactivo hasta que presente una absorbancia próxima a 0,7. Se añaden 20 μL del extracto antioxidante a 2 mL del reactivo. Se calienta a 30 "C y se mide la absorbancia 734 nm a los 10 minutos. Se hace un control con etanol y un blanco con el tampón PBS. Se compara la absorbancia con los valores de una recta patrón con Trolox (0,1 a 1 mM en agua destilada).

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 2 presenta a 100 ppm de concentración una equivalencia de 0,525 mM en Trolox. Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis /Trolox de 1/1,32 (g/g).

- Poder reductor del hierro o actividad antioxidante según el método de Oyaizu [M Oyaizu, op. cited (1986)]. El extracto antioxidante se diluye en etanol, a 1 mL del mismo se le añaden 2,5 mL de tampón fosfato pH 6,60,2 M y 2,5 mL de ferrocianuro potásico al 1%. Se incuba a 50 0 C durante 20 minutos. Se añaden 2,5 mL de ácido tricloroacético al 10%. Se pipetean 2,5 mL del sobrenadante y se mezclan con 2,5 mL de agua destilada y 0,5 mL de cloruro férrico al 0,1%. Se mide la absorbancia a 700 nm y se comparan los resultados con un a recta patrón de ácido ascórbico o vitamina C (0,1- 1 mM).

El extracto obtenido según el procedimiento descrito en este ejemplo 2 presenta a 100 ppm un 23% de poder reductor que equivale a 0,316 mM en ácido ascórbico o vitamina C. Esto implica una relación peso/peso del extracto seco de Couroupita guianensis/ácido ascórbico o vitamina C de 1/0,40 (g/g).