Les lignanes ou les néolignanes tels qu'ils sont décrits notamment dans le document Lignans. Chemical, biological and clinical properties. D. C. Ayres and J. D. Loike.

Cambridge University Press. 1990 sont des composés dont le squelette résulte de l'établissement d'une liaison entre les carbones (3 des chaînes latérales de deux unités dérivées du 1-phénylpropane (liaison 8-8').

Les néolignanes sont également des produits de condensation d'unités phénylpropaniques mais la liaison variable n'implique au maximum qu'un seul carbone j3 (liaisons 8-3', 8-1', 3-3', 8-0-4', etc. ). On distingue également d'autres lignanes qui sont improprement appelés"oligomères"et qui résultent de la condensation de deux à cinq unités phénylpropaniques et enfin des norlignanes presque tous décrits dans le document cité précédement qui ont un squelette en C17.

On assimile également aux lignanes hybrides des produits dont la structure est apparentée aux lignanes.

Dans ce qui suit, on désignera par le terme"lignane"aussi bien les lignanes vrais que les composés apparentés mentionnés précédemment.

Certains lignanes sont déjà décrits comme des inhibiteurs d'enzymes, en particulier de la phosphodiestérase de la PMC, notamment le matairésinol ou bien comme inhibiteurs spécifiques du PAF, notamment la Kadsurénone (2).

Or le demandeur a découvert de façon surprenante que les extraits de Pangium edule, avantageusement de graines et les produits de formule générale I, avait une action anti- nécrotique et/ou inhibitrice des cathepsines.

La présente invention concerne donc un extrait de Pangium edule, avantageusement de graines.

De façon avantageuse cet extrait est un extrait de partie de graines (coque ou pulpe) De façon avantageuse cet extrait est un extrait brut ou purifié.

De façon encore plus avantageuse, cet extrait est un extrait organique ou hydrosoluble.

De façon encore plus avantageuse, cet extrait est un extrait sec.

Dans un mode de réalisation avantageux, cet extrait est obtenu par extraction avec un solvant polaire, avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'alcool, avantageusement de l'éthanol, l'eau et leurs mélanges en toutes proportions.

Dans un autre mode de réalisation, cet extrait est purifié par mise en solution dans un solvant polaire, avantageusement de l'eau, suivi d'une extraction avec un solvant organique, avantageusement l'éther diéthylique.

La présente invention concerne également des composés de formule I : dans laquelle A représente : - soit un groupe où RI représente - un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; - ou un groupe - ou un groupe Rs étant un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; - soit un groupe

où RI représente : - un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; -ou un groupe - ou un groupe

Rs étant un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; R2 représente un groupe-CH20H ; R3 ou R6 représente indépendamment l'un de l'autre un groupe ou ou un atome d'hydrogène à la condition que l'un au moins des groupes R3 ou h représente un atome d'hydrogène et que les groupes R3 et h ne représentent pas simultanément un atome d'hydrogène.

* R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy.

Les composés I sont optiquement actifs et peuvent exister sous forme de racémates, d'énantiomères purs ou de mélanges d'énantiomères, qui font tous partie de l'invention.

Ils peuvent être utilisés sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.

Dans un mode de réalisation avantageux, le composé de formule I est choisi parmi les composés suivants :

La présente invention concerne également l'utilisation de fractions riches en lignanes, notamment les fractions alcooliques obtenues à partir de Pangium edule, par exemple les fractions isolées à partir des coques de graines de PaM/K edule utiles comme inhibiteurs des cathepsines et ou médicament anti-nécrotique.

La présente invention concerne également un médicament comprenant un composé de formule générale I selon la présente invention ou un extrait de Pangium edule selon la présente invention.

Dans un mode de réalisation avantageux, le médicament selon la présente invention a une action anti-nécrotique.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, ce médicament est destiné à inhiber les cathepsines, avantageusement les cathepsines B et L.

Les cathepsines sont des protéases qui interviennent dans un certain nombre de mécanismes physiologiques chez l'homme, notamment dans le cancer et la formation des métastases, la maladie d'Alzheimer et les phénomènes inflammatoires, l'arthrite rhumatoïde, la dystrophie musculaire, l'arthrose.

Ces cathepsines interviennent également dans les nécroses tissulaires qui peuvent survenir soit sous l'action de privation d'oxygène ou sous l'action de toxiques. Ainsi, les produits et extraits selon la présente invention peuvent être utilisés dans le

traitement de certaines plaies chroniques ou d'ulcères mais également sous forme purifiée dans les accidents vasculaires cérébraux, les infarctus, de même ils peuvent être utilisés pour la protection du foie contre les effets toxiques de l'alcool et dans le traitement des cancers, notamment dans l'inhibition des métastases, la maladie d'Alzheimer et les phénomènes inflammatoires, l'arthrite rhumatoïde, la dystrophie musculaire, l'arthrose. Avantageusement les cathepsines B interviennent dans l'arthrite rhumatoïde, la dystrophie musculaire, l'arthrose, le traitement des cancers, notamment dans l'inhibition des métastases (surexprimées dans les cellules cancéreuses).

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, ce médicament est destiné au traitement des cancers, notamment l'inhibition des métastases, la protection hépatique contre les toxiques tels que l'alcool, le traitement de certaines plaies chroniques ou d'ulcères, dans les accidents vasculaires cérébraux, les infarctus, au traitement de la maladie d'Alzheimer et des phénomènes inflammatoires, de l'arthrite rhumatoïde, de la dystrophie musculaire ou de l'arthrose.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule I selon la présente invention ou de l'isoamericanol A de formule suivante ou d'un extrait de Pangiu7al edule selon la présente invention dans la préparation d'un médicament et ou d'une composition cosmétique destiné à inhiber les cathepsines, avantageusement B ou L, et/ou ayant une action anti-nécrotique et/ou au traitement des cancers, notamment l'inhibition des métastases la protection hépatique contre les toxiques tels que l'alcool, le traitement de certaines plaies chroniques ou d'ulcères, dans les accidents vasculaires cérébraux, les infarctus, au traitement de la maladie d'Alzheimer et des phénomènes inflammatoires, de l'arthrite rhumatoïde, de la dystrophie musculaire ou de l'arthrose.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un extrait de Pangiu7Zl edule selon la présente invention ou d'un composé de formule II : dans laquelle A représente : - soit un groupe

où RI représente - un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; - ou un groupe - ou un groupe R5 étant un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; - soit un groupe

où RI représente : - un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; - ou un groupe - ou un groupe Rs étant un groupe phényle substitué par 1 ou 3 groupe (s) identique (s) ou différent (s) choisi (s) parmi les groupes hydroxy et méthoxy ; 'R2 représente un groupe-CH20H ; R3 etR6 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe ou

ou un atome d'hydrogène à la condition que l'un au moins des groupes R3 ou R6 représente un atome d'hydrogène et que les groupes R3 et R4 ne représentent pas simultanément un atome d'hydrogène. et * R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy pour le traitement des organes humains ou animaux aux fins de transport ou de conservation, par exemple dans le cas de transplantation, et/ou pour la préservation des produits agro-alimentaires contenant des protéines.

La présente invention concerne également une composition cosmétique comprenant un extrait de Pafzgium edule selon la présente invention ou un composé de formule I selon la présente invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Elle concerne en outre l'utilisation de cette composition pour luter contre le vieillissement de la peau, avantageusement sous la forme d'une crème anti-âge.

Ainsi, la présente invention concerne les compositions suivantes : - composition pharmaceutique pour le traitement des cancers, notamment l'inhibition des métastases et la protection hépatique contre les toxiques contenant à titre de principe actif un composé de formule I selon la présente invention ou un extrait de Paiigiuin edule selon la présente invention ; - composition destinée au traitement des organes humains ou animaux aux fins de transport ou de conservation contenant au moins un composé de formule II selon la présente invention ou un extrait de Pangium edule selon la présente invention ; - composition destinée à la préservation des produits agro-alimentaires contenant des protéines, cette composition contenant au moins un composé de formule II

selon la présente invention ou un extrait de Pangium edule selon la présente invention ; Enfin, les composés de formule II selon la présente invention ou l'extrait de Pazlgium edule selon la présente invention selon la présente invention peuvent être utilisés en cosmétologie pour lutter contre le vieillissement et également pour conserver des préparations qui contiennent des protéines.

Les exemples ci-après sont donnés à titre indicatif et non limitatif et permettront de mieux comprendre la présente invention.

EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UN EXTRAIT BRUT DE COQUES DE GRAINES DE PANGIUMEDULE 740 g de coques sont coupées en petits morceaux (afin d'augmenter la surface de contact) que l'on dépose dans 7, 4 1 d'une solution éthanolique à 50%.

Le mélange hétérogène est porté au reflux du solvant pendant 45 minutes, puis tamisé sur 100 microns à température ambiante. Cette opération d'extraction est répétée 3 fois. Les solutions extractives sont réunies puis évaporées sous pression réduite pour conduire à 27,63 g d'extrait sec.

EXEMPLE 2. PREPARATION D'UN EXTRAIT PARTIELLEMENT PURIFIE DE COQUES DE GRAINES DE PANGIUM EDULE L'extrait sec obtenu dans l'exemple 1 est placé en solution dans 900 mL d'eau distillée et cette solution aqueuse est extraite trois fois de suite à contre courant par 700 mL d'éther diéthylique dans une ampoule à décanter.

1. phase organique Les phases organiques sont regroupées, séchées sur sulfate de sodium puis concentrées sous vide. On obtient 6,50 grammes d'un solide orange soluble dans l'éther éthylique.

2. Phase aqueuse-extrait hydrosoluble On récupère la phase aqueuse qui est évaporée sous pression réduite afin d'éliminer l'éther, puis lyophilisée. On obtient 21, 1g d'un extrait sec hydrosoluble.

EXEMPLE 3 : SEPARATION DES LIGNANES On réalise une colonne de gel de silice (Merck 60A°) de 5 cm de diamètre et 35 cm de long dans un mélange dichlorométhane-méthanol 95/5 (v/v). Le résidu organique issu

des phases organiques selon l'exemple 2 est repris par 4 mL de dichlorométhane et élué par un mélange dichlorométhane-méthanol 95/5 (v/v).

Les fractions 1 et 2 sont éluées avec ce solvant. On élue ensuite les fractions 3,4 et 5 par le solvant 90/10 (v/v).

Les cinq fractions sont analysées en HPLC sur une colonne ODS2 5um 3X250 mm en présence d'un solvant selon le gradient A = eau-acide acétique 1%, B = acétonitrile- acide acétique 1% avec 95% de A à 25% de A en 45 min. La détection est réalisée en UV 240 nm.

On constate que la fraction 1 contient deux composants distincts alors que les autres fractions correspondent à des produits purs.

La fraction 1 est chromatographiée sur plaque préparative (Analtech ref. 02013, 20X20 cm, épaisseur 1 mm) avec le solvant acétate d'éthyle-dichlorométhane 80/20 (v/v). Les deux composants de la fraction 1 migrent au Rf 0,39 et Rf 0,50. Ils sont prélevés sur la plaque par grattage et extraction de la silice par le dichlorométhane, On obtient les fractions 1.1 et 1.2.

EXEMPLE 4 : CARACTERISATION ET IDENTIFICATION DES FRACTIONS ELUEES Fraction 1.1 : <BR> 4- [3-hydroxyméthyl-7- (3-hydroxy-propényl)-2, 3-dihydro-benzo [, 4] dioxin-2-yl]-2-<BR> méthoxy-phénol.

On a obtenu 19, 5 mg d'une poudre beige, soit 0,3 % de rendement.

RMN lH (400 MHz, CD30D) : 6,97 (1H, d, H2'), 6,91 (1H, dd, 8Hz et 2Hz, H6'), 6, 89 (2H, m, Hs, H5), 6,76 (1H, m, H6), 6,61 (1H, d, 8Hz, Hα), 6,42 (1H, d, 16Hz, Ha), 6,19 (1H, dt, 16Hz, Hp'), 4,17 (1H, dd, Hr), H, dd, H2), 4,07 (1H, dt, Hγ'), 4,04 (1H, m, Hop), 3,79 (3H, s, OCH3).

RMN 13C (100 MHz, CD30D) : 149,3 (C3), 145,0 (C3'), 144,5 (C4', C1'), 137,1 (C4), 131,3 (Ca'), 128,5 (Cl), 128,1 (Cp'), 120,9 (C6'), 117, 9 (C5'), 117,3 (C5), 115,6 (C2'), 105,9 (C2), 104,3 (C6), 78,1 (Cß), 76,1 (Cα), 63,7 (Cy'), 60,1 (Cy), 56,2 (OCH3).

Spectrométrie de Masse : APCI : C19H20O6 344 (M+), 711 (2M+Na).

Fraction 1.2 : 4-[3-hydroxyméthyl-7-(3-hydroxy-propényl)-2,3-dihydro-benz o[1, 4] dioxin-2-yl]-2, 6- diméthoxy-phénol.

On a obtenu 26 mg d'une poudre beige, soit 0, 4 % de rendement.

RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : 6,97 (1H, d, H2,), 6,91 (1H, dd, 8Hz et 2Hz, 1-16'), 6,89 (1H, dd, H5), 6,72 (1H, dd, 8Hz, H6-H2), 6,48 (1H, d, 8Hz, Hat), 6,42 (1H, d, 16Hz, Ha), 6,19 (1H, dt, 16Hz, Hp), 4,17 (1H, dd, Hy), 4, 07 (1H, dt, Hγ'), 4, 04 (1H, m, Hp), 3,85 (6H, s, OCH3).

RMN 13C (100 MHz, CD30D) : 149,3 (C3), 149,1 (C5), 145,0 (C3'), 144,5 (C4', C1'), 137,1 (C4), 131,3 (Cα'), 128, 5 (Cl), 128,1 (Cp'), 120,9 (C6'), 117,9 (C5'), 115,6 (C2'), 105,9 (C6, C2), 78, 1 (Cp), 76,1 (Cα), 63,7 (Cγ'), 60,1 (Cγ), 56,8 (OCH3).

Spectrométrie de Masse : APCI : C20H2207

374 (M+), 771 (2M+Na).

Fraction 2 : Américanin D On a obtenu 130 mg d'une poudre beige, soit 2 % de rendement.

Point de fusion : 195 °C.

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) : 9, 58 (1H, s, CHO), 7,50 (1H, d, 16Hz, Hp'), 6, 80-7, 75 (5H, massif, H aromatique), 6,44 (1H, dd, 16Hz, Ha), 4, 50 (1H, m9 Ha) 3, 3,55 (4H, m, CH2OH), 2,91 (1H, m, Hß).

RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) : 193,5 (Cγ'), 154,5 (Cß'), 149.2 (C4'), 145,20 (C4, C3), 141.0 (C3'), 132,90 (C5'), 129,6 (C1), 127,4 (C1'), 125,9 (Ça'), 117,1 (C2'), 116,1 (C6', C6), 113, 8 (C2), 115,87 (C5), 53,8 (Cß), 86,65 (Cα), 62, 87 (Cy).

Spectrométrie de masse : APCI : Cl8Hl606 328 (M+), 679 (2M+Na) Fraction 3 : Américanin B On a obtenu 110 mg d'une poudre beige claire, soit 1,70 % de rendement.

Point de fusion : 257-261 °C.

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6 : 9,54 (1H, s, CHO), 7,55 (1H, d, 16Hz, Hß'), 6,60-7, 40 (9H, massif, H aromatique), 6,58 (1H, dd, 8Hz et 16Hz, Hα'), 5, 98 (2H, m, Hp, Hp"), 4,10 (2H, m, Ha Ha"), 3,55 (4H, m, CH20H).

RMN C (100 MHz, DMSO-d6) : 194,6 (Cγ'), 153,78 (Cß'), 145,68 (C4', C4", C2"), 145, 95 (C4), 145,51 (C3', C3), 132,96 (Cα'), 129,64 (C1), 127,94 (C1', C1"), 123,53 (C6'), 120,31 (C6), 119,00 (C6"), 117,22 (C5'), 116, 68 (C5, C2', C2), 115, 87 (C5"), 114,95 (C2"), 78, 2 (CßCß"), 77,65 (Cα, Cα"), 61,87 (Cγ, Cγ").

Spectrométrie de Masse : APCI : C27H24O9 492 (MF).

Fraction 4 : Isoaméricanol A : On a obtenu 795 mg d'une poudre jaune claire, soit 12,35 % de rendement.

Point de fusion : 159-160 °C.

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) : 6,96 (d, 1H, 2Hz, H2'), 6,93 (dd, 1H, 8Hz et 2Hz, H6,), 6,87 (d, 1H, 8Hz, H7), 6, 70 (dd, 1H, 8Hz et 2Hz, H6), 6,42 (d, 1H, 16Hz, H7), 6,20 (dt, 1H, 16Hz et 5Hz, Hg.), 4,81 (d, 1H, H2), 4,07 (t, 1H, Hg'), 4,03 (m, 1H, H8), 3,51-3, 32 (dd, 2H, 12,3Hz et 5Hz, H9).

Spectrométrie de Masse : APCI : Cl8HI806 330 (M+), 683 (2M+Na).

Fraction 5 : On a obtenu 455 mg d'une poudre jaune claire, soit 7 % de rendement.

Il y a une ambiguïté sur la position du cycle furannique, ce qui explique les deux hypothèses de structure : 4-{3-hydroxymethyl-6-[3-hydroxymethyl-6-(3-hydroxy-propenyl) -2, 3-dihydro- benzofuran-2-yl] 2, 3-dihydro-benzo [1, 4] dioxin-2-yl}-benzene-l, 2-diol. r 4k"Il, 6 Pl , w Hz au or. oEi 6 I 4 a"6\ oH ohm hypothèse A 3"OH \4RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) : 7,0-6, 60 (9H, massif, H aromatique), 6,59 (1H, m, Ha'), 6,19 (1H, m, Hp'), 4,79 (1H, dt, Ha"), 4,62 (1H, m, Ha,), 4,12 (1H, m, Hy), 4,07 (1H, dd, Hy'), 4,05 (1H, m, Hp"), 3,71 (1H, m, Hp), 3,52 (1H, m, (1H, d, Hγ").

RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) : 146,41 (C4'), 145, 83 (C4'), 145,13 (C3"), 144,83 (C3), 144,5 (C3'), 144,0 (C4), 131,32 (Ca) 7 129, 84 (C6"), 129,54 (Cp), 129, 4 (C1), 121,78 (C6'), 120,42 (C6), 118,87

(C1'), 117,25 (C5'), 116,35 (C2'), 116,24 (C2), 115,79 (C5), 115,64 (C2"), 115,55 (C5"), 87,39 (Ca), 77, 58 (Cp), 77,20 (Cα"), 62,06 (Cy, Cul), 59,8 (Cα'), 55, 37 (Cp).

4- {3-hydroxyméthyl-[3-hydroxyméthyl-7-(3-hydroxy-propényl)- 2, 3-dihydro-benzo [1, 4] dioxin-2-yl-2, 3-dihydro-benzofuran-2-yl}-benzène-1, 2-diol.

RMN H (400 MHz, DMSO-d6) : 7, 0-6, 60 (9H, massif, H aromatique), 6,59 (1H, m, Ha), 6,19 (1H, m, Hp), 4, 79 (1H, m, Ha), 4,62 (1H, dt, Hα"), 4,12 (1H, m, Hγ"), 4,07 (1H, dd, Hurl), 4,05 (1H, m, Hp), 3,71 (1H, m, Hß"), 3,52 (1H, m, (1H, d, Hγ).

EXEMPLE 5: PREPARATION D'UN EXTRAIT BRUT DE GRAINES DE PANGIUM EDULE.

900 g de graines sont coupés en peits morceaux et pulvérisés grossièrement dans un broyeur à couteaux (afin d'augmenter la surface de contact) que l'on dépose dans 10 1 d'une solution éthanolique à 50 %.

Le mélange hétérogène est porté au reflux du solvant pendant 60 minutes, puis tamisé sur 100 microns à température ambiante. Cette opération d'extraction est répétée 3 fois. Les solutions extractives sont réunies puis évaporées sous pression réduite pour conduire à 34,6g d'extrait sec.

EXEMPLE 6 : PREPARATION D'UN EXTRAIT BRUT DE PULPE DE GRAINES DE PANGIUMEDULE 500 g de pulpe de graines sont obtenus en cassant des graines et en en prélevant la pulpe manuellement en petits morceaux que l'on dépose dans 5 1 d'une solution éthanolique à 50 %.

Le mélange hétérogène est porté au reflux du solvant pendant 45 minutes, puis tamisé sur 100 microns à température ambiante. Cette opération d'extraction est répétée 3 fois. Les solutions extractives sont réunies puis évaporées sous pression réduite pour conduire à 14,7g d'extrait sec.

EXEMPLE 7 : ESSAIS SUR LA CONSERVATION DU POISSON DES DIFFERENTES MOLECULES EXTRAITES DE PANGIUM EDULE ET DES DIFFERENTS EXTRAITS Le processus de putréfaction des aliments fait intervenir deux grandes phases. Les enzymes lysosomiales (cathepsines en particuliers) sont libérées dans les tissus dès la mort cellulaire et digèrent progressivement les protéines structurales. Cette digestion aboutit à la création d'un environnement propice à la croissance des bactéries endogènes (présence de substrats, température et degré d'oxygène). Une chaîne trophique est alors mise en place et aboutit à la putréfaction totale. Cette putréfaction s'accompagne de libération d'amines responsable des odeurs caractéristiques. La dégradation des tissus donne un aspect jaunâtre et « mou » au tissu.

Des morceaux de poisson (lieu noir chair/350 à 390 mg) sont incubés à 37°C pendant 48 h en présence ou non des produits à tester (25 à 40 mg). Après 48h, une analyse qualitative de l'odeur est réalisée. Les produits les plus actifs sont ceux qui préservent une odeur proche de celle du poisson frais.

On constate une action conservatrice très forte pour les extraits préparés selon les exemples 1,5, et 6 et pour les extraits issus des phases organiques ou hydrosolubles selon l'exemple 2 En ce qui concerne les composés issus des phases organiques de l'exemple 2 et caractérisés selon l'exemple 4, les résultats sont exprimés du produit qui conserve le plus l'odeur initiale du poisson à celui qui n'a pas d'effet (=témoin) Fraction 5 = fraction 2 (Americanin D) = fraction 3 (Americanin B) > fraction 1. 2 = fraction 4 (IsoAmericanol A) > Fraction 1.1 >Témoin.

Ainsi, les fractions 5,2 et 3 sont les produits les plus actifs.

EXEMPLE 7 : ESSAI SUR LES CATHEPSINES Les cathepsines sont des protéases cellulaires largement répandues dans les différents compartiments cellulaires et dans les tissus et au travers des espèces. Ces protéases sont impliquées dans la dégradation des protéines lors de processus pathologiques comme les nécroses, l'inflammation, etc., et les maladies dégénératives comme la maladie d'Alzheimer et les cancers. Ces protéases sont de plus libérées lors de processus invasifs comme les blessures. On les retrouve enfin très impliquées dans les premières étapes des processus de putréfaction où elles libèrent des aminoacides et des micronutriments qui sont métabolisés par les bactéries responsables des étapes ultérieures de la putréfaction.

Le test consiste à faire réagir la cathepsine B et la cathepsine L sur un substrat artificiel, le chlorhydrate de Z-Phe-Arg-7-amido-4-méthylcoumarine. L'enzyme libère la méthyl-coumarine qui est dosée par fluorescence.

Dans ce test, on a évalué l'effet inhibiteur des molécules extraites de Patagium edule et de trois lignanes disponibles dans le commerce, l'Eusiderine, le Matairesinol et le Secoisolariciresinol 3. 1 Mode opératoire : Les produits utilisés sont disponibles commercialement auprès des sociétés suivantes : Sigma/Aldrich : Sodium Acétate (S7670) ; Acetic Acid glacial (A0808) ; EDTA (ED).

Acros : DTT (165680050). Calbiochem : Cathepsin B Human Liver (219362) ; substrat : Z-Phe-Arg-7-amido-4-Methylcoumarin, hydrochlorid (03-32-1501) cathepsin inhibitor 1 (219415). Thermolabsystem : plaques 96 puits (9502867) ; fluoroscan Ascent FL. Fluka BiochemiKa : Secoisolariciresinol (60372) ; Matairesinol (40043) Volume réactionnel : 87 u. l tampon : 340 nM d'acétate de sodium ; 60 mM d'acide acétique ; 8 mM DTT ; 4 mM EDTA, pH6,8.

3 til de substrat (0,6 I1M final) 10 111 d'enzyme (72,27. 10' ug/ul) A ce volume réactionnel sont rajoutés 2 uM d'inhibiteur spécifique ou 10 pg/ml des produits à tester.

Incubation/mesure : plaques 96 puits ; 37°C ; 30 mesures toutes les 30 secondes ; excitation 355 nm et émission 460 nm.

Les valeurs obtenues sont comparées au témoin (cinétique enzymatique sans inhibiteur) et exprimées en pourcentage d'inhibition.

3.2 Résultats : Les résultats sont exprimés selon deux critères : l'inhibition de la vitesse initiale (pente) et l'inhibition de l'hydrolyse maximale du substrat (plateau) Cathepsine B : Inhibiteur spécifique : 31 % (plateau) 44,5 % (pente) IsoAméricanol A : 17 % (plateau) 26,1 % (pente) Fraction 6 : 24,6% (plateau) 30,2 % (pente) Américanin D : 11,9 % (plateau) 2,1 % (pente) Fraction 5 : 18 % (plateau) 28, 5 % (pente) Fraction 4 : 5 % (plateau) 32,5 % (pente) Américanin B : 13,4 % (plateau) 26,2 % (pente) Secoisolariciresinol : 15,7 % (plateau), 21,1 % (pente) Matairesinol : 10 % (plateau) 4,1 % (pente) Eusidérine A : 11.6 % (plateau) 8, 8 % (pente) Cathepsine L Inhibiteur spécifique : 77 % (plateau) 71,4% (pente) IsoAméricanol A : 5 % (plateau) 5, 8 % (pente) Fraction 6 : 9, 1% (plateau) pente (0 %) Américanin D : 17,7 % (plateau) 4,8 % (pente) Fraction 5 : 14, 2 % (plateau) 4,8 % (pente) Fraction 4 : 11, 7 % (plateau) 1,7 % (pente) Américanin B : 0 % (plateau) 22,9 % (pente) Secoisolariciresinol : 1,9 % (plateau), 2,5 % (pente) Matairesinol : 7,1 % (plateau) 10 % (pente) Eusidérine A : 15, 8 % (plateau) 18, 2 % (pente) 3.3 Conclusions On constate que les différents lignanes ont des efficacités très variables selon la cathepsine considérée. Les lignanes du commerce ont des efficacités comparables à certains lignanes extraits de Paiigium edule.