DESCRIPTION

Domaine technique

La présente invention se rapporte à des extraits de bois durables amazoniens, leur procédé d'obtention, et leur utilisation en tant qu'agent biocide, en particulier comme fongicide.

De préférence, lesdits extraits de bois durables amazoniens sont préparés à partir des espèces Andira surinamensis, Andira coriacea, Andira inermis (sous l'appellation bois de Saint Martin rouge) ; Manilkara huberi, Manilkara bidentata (sous l'appellation bois de balata) ; Tabebuia serratifolia, Tabeluia impetiginosa (sous l'appellation bois d'ébène verte) ; Bagassa guianensis ; Qualea rosea ; Sextonia rubra ; et Vouacapoua americana.

Elle concerne en particulier le domaine de la préservation des bois provenant d'essences insuffisamment ou non durables, et des matériaux dérivés de ceux-ci.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

Le bois est un matériau très compétitif par rapport à d'autres : il est renouvelable, biodégradable, peu consommateur d'énergie lors de sa transformation et il participe au stockage du carbone. Le bois est constitué de plusieurs parties : l'écorce, l'aubier (partie tendre, blanche) qui est le bois jeune physiologiquement actif, et le duramen (bois parfait ou bois de cœur, coloré) formé au cours de la duraminisation qui assure la solidité et la résistance mécanique des bois débités. La durabilité naturelle d'un bois correspond à son aptitude à résister à l'attaque d'agents de dégradation biologique et donc demeurer inaltéré dans un emploi défini pendant une période donnée, en l'absence de tout traitement protecteur (LOUBINOUX et KILBERTUS, La préservation du bois. Techniques et produits de préservation. Le Bois, matériau d'ingénierie, Editions ARBOLOR, 433pp, 1994) [1]. Un bois durable possède également la propriété de durcir en vieillissant. Il se distingue par un faible retrait au séchage, et une bonne stabilité dimensionnelle. En revanche, sous certaines conditions, le bois peut être dégradé par des agents biologiques de dégradation (champignons, insectes, térébrants marins, etc ..) s'il n'est pas suffisamment durable.

Afin d'améliorer la durée de service d'un ouvrage en bois, il est généralement nécessaire de traiter les bois provenant d'essences insuffisamment durables à l'aide de produits de préservation, qui le plus souvent sont (i) des substances organiques de synthèse (pyréthroïdes, azoles, ammoniums quaternaires, carbamates, etc ..) éventuellement solubilisées dans des solvants pétroliers ou sous forme hydrodispersable, ou (ii) des substances minérales (sels ou oxydes organiques) à base de cuivre, de bore, d'arsenic, de zinc, etc.... La fixation des produits à base de sels métalliques dans le bois est assurée par le chrome. Les traitements au cuivre/chrome/arsenic (CCA) permettent d'atteindre des stabilités exceptionnelles dans le temps (bonne activité biologique et délavage très faible), avec cependant un coût environnemental et un coût en terme de toxicité relativement élevés. Parmi les biocides d'origine organiques nous pouvons citer les t azoles comme le tébuconazole ou le propiconazole. Ils ont un large spectre d'activité contre les champignons basidiomycètes et présentent une stabilité et une résistance au délavage acceptables. De plus, ces produits sont souvent assez sélectifs, en empêchant soit uniquement le développement de pourritures, soit uniquement la dégradation induite par des insectes xylophages. En conséquence, ces biocides doivent être formulés en combinaison de deux ou parfois trois dérivés d'activités complémentaires en fonction de la classe de risque du bois traité dans le produit fini, selon la norme NF EN 335 - 2 (Afnor, 2009 « Durabilité du bois et des matériaux dérivés du bois - Définition des classes d'emploi - Partie 2 : application au bois massif »). Il existe également la créosote, une huile visqueuse distillée de la houille bitumineuse. Elle est composée essentiellement d'hydrocarbures aromatiques polycycliques. Ces composés sont hautement cancérigènes ; de ce fait, la créosote aujourd'hui n'est plus autorisée que pour les poteaux téléphoniques et les traverses de chemin de fer.

La préservation des bois à l'aide de ces produits, bien qu'efficace, pose cependant des problèmes tant sur le plan de la mise en œuvre (résistance à l'imprégnation de certaines essences, répartition inégale des produits de protection dans les cellules du bois, etc ..) que d'un point de vue environnemental. En effet, la toxicité des produits de préservation chimiques constitue un facteur de pollution qui préoccupe de plus en plus l'opinion publique dans les pays industrialisés.

Des mesures mises en place par l'Union Européenne à travers la directive biocide 98/8/CE visent à s'assurer que ne restent sur le marché que les substances qui se sont révélées efficaces et non toxiques ni pour l'homme, ni pour l'environnement. A cela s'ajoute la directive COV 99/13/CE qui vise à réduire l'utilisation de solvants organiques et la directive 2003/2/CE qui limite la mise sur le marché et l'emploi de l'arsenic, et interdit notamment l'utilisation du CCA - substances considérées comme dangereuses pour les environnements aquatiques. Les industriels se trouvent face à un certain nombre de contraintes qui nécessitent qu'ils fassent preuve d'innovation pour proposer des matières actives adaptées à ces nouvelles exigences. A ce jour, l'efficacité des produits de traitement du bois repose sur la présence de matières actives organiques ou minérales formulées en solution aqueuse, dans des solvants organiques ou sous forme d'émulsions. La directive biocide a pour but de mettre en place un cadre réglementaire à l'échelle européenne et stipule que ne seront mises sur le marché européen après avoir été inscrite sur une liste dite positive que les matières actives qui se seront révélées efficaces et sans écotoxicité.

Ainsi certaines matières bien que très efficaces ont été retirées du marché ou ont vu leur champ d'application restreint. Le CCA par exemple, a été remplacé par des produits mixtes contenant des sels de bores, du cuivre et des fongicides azolés ou des mélanges de sels de cuivre et d'ammoniums quaternaires. Les produits les plus utilisés sont le cuivre à l'ammoniac quaternaire (ACQ) où le cuivre est associé à un ammonium quaternaire biocide, le sulfate de cuivre et le chromate de cuivre acide. Cependant, outre le fait que le cuivre présente une certaine toxicité - inférieur à celle de l'arsenic - à l'égard des écosystèmes aquatiques, ces produits sont aussi relativement corrosifs, principalement vis-à-vis de l'aluminium Pendant longtemps, les industriels ont favorisé l'utilisation de produits à base de bore (comme par exemple l'octaborate disodique), très efficaces vis-à-vis des champignons lignivores et des insectes mais qui présentent l'inconvénient d'être non fixants. Leur utilisation se limite donc à des applications sous abri et sans contact avec le sol afin d'éviter tout risque de délavage. Depuis 2009, les matières actives à base de bore ont été classées toxiques pour le développement et la reproduction.

A terme, la mise en place de ces directives aura pour conséquence, une forte réduction du nombre de matières actives sur le marché et seuls les produits biocides contenant des matières actives inscrites sur des listes dites positives pourront obtenir des autorisations de mise sur le marché. On estime que parmi les matières actives qui seront évaluées, un peu plus de la moitié d'entre elles ne répondront pas aux exigences requises. Ainsi, l'on va vers un marché où les formules sont identiques ou très proches, vendues sous des marques différentes.

De plus, certains champignons sont capables d'attaquer des bois traités à base de cuivre ; on parle alors de tolérance au cuivre qui repose sur une adaptation physiologique du champignon. Les champignons de la pourriture molle et de bleuissement sont plus tolérants à de nombreux composés que ceux de la pourriture brune ou de la pourriture blanche.

Ces matières actives présentent aussi des inconvénients lors de leur utilisation. En effet le cuivre contenu dans certains produits est l'origine d'une corrosion accélérée de visseries ou fixations métalliques si elles ne sont pas en acier inoxydable.

Enfin, la présence de certaines matières actives lors de la phase d'élimination en fin de vie des bois traités est un paramètre à prendre en compte. Par exemple, les bois traités au CCA destinés à des usages en classe d'emploi 3, 4, 5 sont considérés comme des déchets dangereux qui nécessitent une prise en charge particulière et qui a un coût. L'utilisation de matières actives ne posant pas de problèmes lors de la gestion en fin de cycle du bois traité est un gage supplémentaire permettant de s'inscrire dans une démarche respectueuse de l'environnement et de la santé humaine.

De ce fait, la recherche de produits de préservation du bois non polluants ou issus de technologie nouvelle s'est largement développée ces dix dernières années.

Ainsi de nouveaux procédés de préservation du bois qui permettent de lui apporter une résistance à l'attaque d'agents biologiques ont été développés. On peut citer le traitement thermique, qui consiste à placer le bois dans un four à une température comprise entre 170 et 280°C sous atmosphère inerte. Ces conditions induisent la réticulation des lignines et une modification de la structure cristalline de la cellulose. Le traitement permet de rendre le bois moins hydrophile, diminuant ainsi la possibilité de développement de champignons, mais rend également les bois beaucoup plus cassant. On peut encore citer le traitement oléothermique, qui consiste à tremper le bois dans des bains successifs d'huile chaude d'origine végétale à pression atmosphérique. Ces procédés sont encore en cours de développement, mais présenteraint l'avantage de stabiliser les bois et d'améliorer leur durabilité avec des produits respectant les exigences environnementales.

Une autre approche consiste à utiliser les mécanismes de résistance intrinsèques, développés par certaines espèces végétales ou d'arbres capables de spécialiser des bois très résistants contre leurs agresseurs naturels. L'huile de lin, par exemple, est un produit végétal utilisé depuis longtemps pour la protection des bois d'intérieurs et d'extérieurs sous abri. Cette huile naturelle est faiblement antifongique mais procure d'autres avantages. Il existe aussi des peintures dites naturelles, contenant au moins 90% de produit d'origine naturelle. Les peintures sont soit des lasures, qui sont fongicides et anti-bleuissement, soit des topcoats qui sont semi-filmogènes et protègent contre le bleuissement. De plus, depuis une vingtaine d'années quelques produits de préservation à base de molécules ou matières d'origine végétale ont été protégés par brevet. En 1994, une première Demande de Brevet (Demande de Brevet EP 0 591 674) [2] relative à un produit de mélange d'extraits de plusieurs Meliaceaes dont Azadirachta indica a été déposée pour la protection de graines et plantes en agriculture contre les champignons phytopathogènes et les insectes herbivores. Actuellement, cet extrait est très utilisé dans des formulations pour la protection des graines et haricots stockés, contre l'attaque de champignons et insectes. L'espèce Thujopsis dolobrata, une espèce de cyprès japonais dont l'huile essentielle est aussi employée comme matière première pour la fabrication des produits à activité fongicide et insecticide, a été protégée par Brevet depuis 1994 (Brevet KR 100917802) [3] pour son application dans une formulation dans le traitement des bois. Des substances isolées de cette espèce (notamment l'hinokitiol et le carvacrol) sont effectivement bioactives et ont été protégées par Brevet également. Enfin, l'extrait de Callitris columellaris, un cyprès natif d'Australie et de Nouvelle Calédonie a été protégé par Brevet en 2001 (Demande Internationale WO 01/01776) [4] pour la protection des matériaux cellulosiques contre la dégradation fongique. Il existe donc un réel besoin de composé alternatifs non polluants ou de technologie nouvelle palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, et permettant de stabiliser voire d'améliorer la durabilité du bois, de réduire les coûts, tout en respectant les exigences environnementales.

Description de l'invention

Ainsi les Inventeurs ont maintenant découvert de manière tout à fait inattendue de nouveaux produits biocides pour la préservation du bois vis- à-vis d'organismes lignivores, en particulier fongicides, d'origine naturelle, extraits à partir d'une ressource abondante : les déchets d'exploitation forestière de type amazonien. Ces nouveaux produits de préservation du bois permettent de pallier les défauts, inconvénients et obstacles mentionnés ci-dessus, mais également de valoriser les déchets d'exploitation forestière d'espèces très exploitées.

Ces nouveaux produits de préservation, préparés à partir de bois amazoniens durables, ont démontré une activité biocide au moins égale à celle des traitements chimiques actuellement sur le marché pour la protection des bois. En particulier, les extraits de bois de sept espèces amazoniennes spécialisant des bois durables (Andira surinamensis, Bagassa guianensis, Manilkara huberi, Qualea rosea, Sextonia rubra, Tabebuia serratifolia, et Vouacapoua americana) ont été testés et ont démontré leur efficacité dans la préservation ou le traitement de bois, notamment vis-à-vis de champignons, et tout particulièrement vis-à-vis de champignons xylophages. Cette durabilité naturelle de ces bois amazoniens est due essentiellement à la présence de métabolites secondaires (« extractibles » ou « agents biocides» démontrant une toxicité vis-à-vis des agents de dégradation du bois tels que les insectes et les champignons) dans leur tissu végétal.

Dans les exploitations forestières, les arbres ne sont pas toujours parfaitement identifiés. Ainsi il arrive que des espèces très proches soient récoltées sous le même nom, et présentent des activités biologiques identiques. C'est par exemple le cas du bois de Saint Martin rouge qui est un mélange de Andira surinamensis, Andira coriacea, Andira inermis ; du bois appelé balata qui est un mélange de Manilkara huberi, Manilkara bidentata ; et du bois de ébène vert qui est un mélange de Tabebuia serratifolia, Tabeluia impetiginosa.

Lesdits extraits de bois durables amazoniens sont obtenus à partir de déchets d'exploitation forestière par n'importe quel solvant et méthode appropriés, y compris des méthodes d'extraction par solvant, par entraînement à la vapeur d'eau (hydrodistillation), ou de nouvelles technologies d'extraction (CO ₂ , supercritique, micro-ondes, ultrasons, etc .). Le procédé d'extraction n'est pas critique, et peut être sélectionné par l'homme du métier en fonction du bois à partir duquel les extraits doivent être préparés, la concentration en extractibles souhaitée, et le type de produit de préservation attendu, par exemple acide ou neutre. De préférence, les extraits de bois durable amazonien sont obtenus par un procédé d'extraction par solvant. Par exemple, la méthode d'extraction utilisée est la macération dans un solvant (eau ; alcool par exemple méthanol, éthanol ; mélange hydroalcoolique ; ester par exemple acétate d'éthyle, etc .), pendant 12 à 72 heures, de préférence pendant 24 heures, à une température de 22 à 27 °C, de préférence à température ambiante (25°C). Pour ce faire un volume de 2 à 5 litres de solvant, de préférence d'environ 3 litres de solvant est utilisé pour 300 à 1000 g de copeaux de bois, de préférence pour environ 800 g de copeaux de bois.

Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'extraction comprenant au moins les étapes suivantes :

placer au moins une partie de bois durable amazonien dans un solvant polaire,

procéder à l'extraction dudit bois ; et

récupérer l'extrait obtenu à l'étape précédente ; ledit extrait de bois durable amazonien comprenant au moins une partie du solvant, et au moins un agent de préservation du bois (ou « agent biocide »), en quantité efficace pour exercer une activité biocide.

On entend par « partie de bois durable amazonien » au sens de la présente invention un élément de structure du bois comprenant l'aubier et le duramen.

En particulier, la partie de bois durable amazonien est broyée, pulvérisée et/ou hachée. De préférence, elle se présente sous forme de copeaux de bois.

Dans le procédé selon l'invention, le bois durable amazonien est choisi parmi les espèces suivantes : Andira surinamensis, Andira coriacea, Andira inermis (sous l'appellation bois de Saint Martin rouge) ; Manilkara huberi, Manilkara bidentata (sous l'appellation bois de balata) ; Tabebuia serratifolia, Tabeluia impetiginosa (sous l'appellation bois d'ébène verte) ; Bagassa guianensis ; Qualea rosea ; Sextonia rubra ; et Vouacapoua americana.

On entend par « extrait », une composition obtenue à partir d'un bois durable amazonien par une opération physique ou chimique, en particulier par extraction d'au moins une partie du bois par au moins un solvant.

En particulier ledit extrait comprend une quantité efficace d'au moins un agent biocide.

On entend par « solvant polaire » au sens de la présente invention, un solvant présentant un moment dipolaire différent de zéro, et en particulier supérieur à 1 ,5. Par exemple, le solvant polaire est un solvant protique tel que l'eau ou un alcool (méthanol, éthanol, etc ..) ou un mélange de ceux-ci par exemple hydroalcoolique, ou un solvant aprotique tel qu'un ester (acétate d'éthyle, etc .).

L'étape d'extraction du procédé selon l'invention peut comprendre au moins une étape choisie dans le groupe consistant en la macération, la décoction, l'infusion, digestion, et la percolation. On entend par « macération », un procédé comprenant consistant à laisser tremper à froid (généralement de 5 à 15°C) ou à chaud (généralement de 20 à 25°C ou de 40 à 45°C) au moins une partie d'au moins un bois durable amazonien dans un solvant polaire pendant une durée particulière, afin d'en extraire les composés solubles bioactifs. En particulier l'étape de macération a une durée allant de 12 à 72 heures, de préférence de 24 heures. De préférence, elle se fait à une température allant de 22 à 27°C de préférence à 25°C.

On entend par « décoction », un procédé comprenant la mise en ébullition d'un mélange comprenant une partie d'au moins un bois durable amazonien dans au moins un solvant polaire, et le maintien de ladite ébullition pendant une durée particulière, notamment de 1 minute à 2 heures, en particulier d'environ 20 minutes, puis éventuellement un retour à la température ambiante (25°C).

On entend pas « infusion », un procédé consistant à verser au moins un solvant polaire, ledit solvant polaire étant à une température d'ébullition, sur au moins une partie d'au moins un bois durable amazonien, puis à laisser le mélange pendant une période allant de 1 minute à 2 heures.

On entend par « digestion », un procédé consistant à chauffer un mélange comprenant une partie d'au moins un bois durable amazonien dans au moins un solvant polaire à une température inférieure à la température d'ébullition, par exemple dans le cas de l'eau de 10 à 89°C, et en particulier de 25 à 70°C.

On entend par « percolation » ou « lixiviation », un procédé consistant à faire passer un solvant polaire à travers au moins une partie d'au moins un bois durable amazonien.

Le procédé d'extraction selon l'invention peut comprendre en outre une étape de filtration, notamment effectuée sur filtre de cellulose ou sur verre fritée.

Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet un extrait de bois durable amazonien obtenu par un procédé selon l'invention, et comprenant une quantité efficace d'au moins un agent biocide. De préférence, ledit extrait selon l'invention est sous forme liquide.

Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins un extrait de bois durable amazonien selon l'invention.

Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait ou d'une composition selon l'invention, comme agent biocide. De préférence l'agent biocide est un fongicide (ou agent antifongique), et préférentiellement un agent fongicide actif vis-à-vis des champignons lignivores.

Les extraits et compositions selon l'invention sont utilisés pour la préservation des bois et des matériaux dérivés de ceux-ci. Par exemple, les bois à protéger d'une dégradation par un agresseur biologique sont imprégnés avec des extraits de bois durable amazonien.

Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de traitement du bois ou de matériaux dérivés du bois, comprenant l'application d'une quantité efficace d'un extrait ou d'une composition selon l'invention à la surface dudit bois ou matériau dérivé dudit bois.

On entend par « quantité efficace » au sens de la présente invention, une concentration en extrait ou en composition selon l'invention permettant une diminution de la perte de dureté d'un bois après exposition à la microflore du sol pendant plusieurs semaines (ci-après appelé TR50). Par exemple, ladite concentration en extrait doit permettre de viser un taux de rétention théorique d'environ 72 à 2,25 kg/m ³ , de préférence d'environ 72 à 4,5 kg/m ³ , tout préférentiellement d'environ 72 à 18 kg/m ³ .

Les principaux avantages quant à la production et l'utilisation des extraits de bois durable amazonien définis dans l'invention sont multiples : efficacité, caractère renouvelable, meilleure biodégradabilié en général, un bilan CO2 meilleur. Ils présentent une activité biocide selon le champ d'application des bois traités (risque biologique), une faible toxicité pour les organismes non cibles, une faible solubilité dans l'eau, pas de bioaccumulation dans la chaîne alimentaire, pas de persistence dans l'environnement et un rapport prix/performance très acceptable. En outre, ces produits naturels n'induisent pas de surexploitation forestière puisqu'ils peuvent être préparés à partir des déchets d'exploitation forestière qui actuellement ne sont pas valorisés.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures

- La figure 1 représente l'indice d'activité (en %) des extraits aux concentrations de 1 , 0,5 et 0,25 mg/ml, sur Pycnoporus sanguineus.

La figure 2 représente la perte de dureté (en %) subie par les éprouvettes de S. mototoni imprégnées par les extraits méthanoliques de B. guianensis, V. americana, Q. rosea, T. serratifolia, A. surinamensis et M. huberi et l'extrait à l'acétate d'éthyle de S. rubra, au taux théorique de rétention de 72 (T1 ) et 18 (T3) kg/m ³ . Les traitements ont été disposés dans l'ordre croissant des médianes.

La figure 3 représente la perte de dureté (en %) subie par les éprouvettes de V. surinamensis imprégnées par les extraits méthanoliques de B. guianensis, V. americana, Q. rosea, T. serratifolia, A. surinamensis et M. huberi et l'extrait à l'acétate d'éthyle de S. rubra, au taux théorique de rétention de 72 (T1 ) et 18 (T3) kg/m ³ . Les traitements ont été disposés dans l'ordre croissant des médianes.

La figure 4 représente la réduction de la perte de dureté (en %) en fonction du taux de rétention réel sur Schefflera morototoni. La ligne horizontale marque 50% de perte de dureté.

La figure 5 représente la réduction de la perte de dureté (en %) en fonction du taux de rétention réel sur Virola surinamensis. La ligne horizontale marque 50% de perte de dureté. EXEMPLES

Exemple 1 : Récolte et extraction du matériel végétal

Récolte

Le matériel végétal de sept espèces (Andira surinamensis, Bagassa guianensis, Manilkara huberi, Qualea rosea, Sextonia rubra, Tabebuia serratifolia, Vouacapoua americana) a été récolté sur un site d'exploitation forrestière (PK 24, piste de Bélizon, Commune de Régina, Guyane française).

Pour chaque espèce, un arbre a été sélectionné à partir duquel un billon de 20 cm de longueur comprenant l'aubier et le duramen a été découpé. A cette occasion, des herbiers de chaque arbre ont été récoltés, et les identifications botaniques ont été vérifiées à l'herbier de Guyane.

Les billons récoltés ont été sciés en chevrons, séchés à l'air pendant deux semaines, puis transformés en copeaux, sans séparation entre l'aubier et le duramen.

Extraction

La méthode d'extraction utilisée a été la macération ou le trempage.

Elle a consisté à laisser macérer les copeaux de bois dans du méthanol, ou de l'acétate d'éthyle dans le cas de l'extraction du S. rubra.

Les solvants utilisés étaient de qualité technique (VWR), et l'extraction a été menée pendant 24 heures, à température ambiante (25°C), avec agitation. Un volume approximatif de 3 litres de solvant a été utilisé pour 800 g de copeaux.

A la fin de la macération, les solutions extractives ont été filtrées, le solvant a été évaporé sous vide, à 30°C (évaporateur rotatif), et les rendements d'extraction ont été calculés (tableau 1 ). Tableau 1

dans des flacons ambrés jusqu'à la réalisation des essais biologiques. Exemple 2 : Activité antifongique in vitro des extraits végétaux

Test de perforation d'aqar

La méthode de perforation en agar a permis de mesurer la capacité de chaque extrait à inhiber la croissance de souches de champignons lignivores par la formation d'une zone d'inhibition autour du dépôt de chaque extrait, et d'identifier ainsi les extraits fongicides.

Chaque extrait produit a été testé sur deux souches de champignons lignivores, Pycnoporus sanguineus (270 CTFT) et Trametes versicolor L. ex Fr Quélet (CTB 863 A).

Les champignons lignivores ont été cultivés sur un milieu gélosé stérile, constitué d'extrait de malt (40 g/1) et d'agar (20 g/1) (milieu malt- agar), dans des boîtes de Pétri (90 mm de diamètre). Lorsque le champignon a envahi toute la boîte, il a été repiqué ou utilisé pour un test. Le test a été réalisé dans des boîtes de Pétri dans lesquelles le même milieu gélosé a été versé.

Les boîtes de Pétri ont été ensemencées avec une solution d'inoculum préparée en récupérant le mycélium d'une boîte de culture avec de l'eau distillée stérile (2 ml). Cette suspension (200 μΙ) a ensuite été étalée à la surface des boîtes test, puis après séchage, des puits de 6 mm de diamètre ont été réalisés avec un emporte-pièce (pipette pasteur stérile).

Les extraits à tester ont été dissous à une concentration de 100 mg/ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) stérile, et un volume de 50 μΙ de cette solution a été placé dans les puits. Des témoins avec du DMSO pur ont été réalisés afin de contrôler l'innocuité du sovant. Les essais ont tous été réalisés en double.

Le diamètre d'inhibition a été mesuré 5 jours après l'ensemencement. Ce délai correspond à une croissance maximale obtenue pour chaque champignon dans des boîtes de Pétri exemptes d'extrait.

Les résultats des mesures des zones d'inhibition pour chaque espèce intéressante dans une optique de valorisation, sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

Ces résultats ont permis de confirmer que les extraits obtenus à partir d'espèces durables ont une activité antifongique.

Cependant, les tailles de halos d'inhibition ne dépendent pas exclusivement de l'activité des molécules présentes dans un extrait. D'autres paramètres entrent en jeu comme par exemple la capacité de diffusion de ces molécules actives ou la stabilité des extraits dans un milieu ouvert et non protégé de la lumière (les extractibles sont à l'abri de la lumière dans le bois). Pour cette raison une deuxième série de mesure a été conduite afin de quantifier l'activité in vitro des extraits. Mesure d'indice d'activité

Cette méthode a permis de mesurer la capacité d'inhibition de la croissance radiale du mycélium de P. sanguineus sur un milieu gélosé contenant les extraits à tester.

Les extraits ont été dissous dans du DMSO (100 mg/ml), et cette solution a été diluée dans le milieu malt-agar stérilisé encore tiède (qsp 6 ml) afin d'obtenir une concentration d'extrait de 1 mg/ml. Cette solution mère a permis de préparer des solutions filles de 0,5 et 0,25 mg/ml par dilution successive avec du milieu malt-agar tiède.

3 ml de ces différentes solutions ont versés dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre. Chaque test a été réalisé en triple. Des témoins de référence sans extrait ont également été réalisés. Par ailleurs la validité de la mesure a été confirmée avec un antimycotique de référence (le chlorothalonile) présentant dans les conditions du test un indice d'activité de 50% à la concentration de 0,06 mg/ml.

Après solidification du milieu, un carré de 6 mm de mycélium a été placé au milieu de chaque boîte de Pétri, puis celles-ci ont été incubées à 27°C. la durée de l'essai correspond au temps nécessaire pour que le mycélium recouvre la totalité de la surface de la boîte de Pétri.

L'indice d'activité (IA) a alors été calculé à partir de l'équation suivante :

IA (%) = [1 - (D-6) / (D _réf - 6)] x 100 où

D représente le diamètre de la zone de croissance du mycélium dans les boîtes test (en mm) ; et

D _réf représente la zone de croissance dans les boîtes de Pétri des témoins de référence (35 mm).

IA a été exprimé en pourcentage. Lorsque IA = 0, l'extrait n'avait pas d'activité antifongique, et lorsque IA = 100%, l'extrait avait une forte activité antifongique. Les résultats d'indice d'activité (IA) des extraits à tester aux concentrations de 1 , 0,5 et 0,25 mg/ml, sur P. sanguineus, sont représentés dans la figure 1 .

Ces résultats ont permis d'évaluer ΙΊΑ50, à savoir la concentration en extrait capable d'inhiber 50% de la croissance du champignon. La mesure de cette activité inhibitrice a permis de démontrer que tous les extraits obtenus à partir d'espèces durables sont actifs vis-à-vis de P. sanguineus.

En particulier, l'extrait de S. rubra est resté très actif à une concentration de 0,25 mg/ml. Dans ce cas, cet extrait a présenté un IA50 < 0,25 mg/ml sans pouvoir évaluer cet IA plus précisément.

Les deux extraits de B. guianensis et de S. rubra ont présenté des valeurs d'activité du même ordre de grandeur que le chlorothalonile.

Pour tous les autres extraits, ΙΑ50 s'est situé autour de 1 mg/ml. Exemple 3 : Transfert de durabilité - Essais sol

Les extraits issus de 7 espèces durables ont été utilisés pour imprégner des éprouvettes en bois non durables. Ces dernières ont été exposées à la microflore naturellement présente dans le sol durant 6 semaines, à température ambiante (28±5°C). Ces champignons du sol, appartenant aux familles des ascomycètes et des champignons imparfaits, dégradent la cellulose et la lignine entraînant une perte des propriétés mécaniques du bois (résistance à la compression, à la flexion, ténacité, élasticité et dureté). La perte de ces propriétés mécaniques est proportionnelle à la dégradation.

La mesure de la perte de la dureté des éprouvettes de bois après exposition à la microflore du sol a donc permis de mesurer le niveau de dégradation des bois afin d'évaluer l'importance relative de trois paramètres : l'essence utilisée pour la réalisation de l'essai, l'activité biocide de l'extrait, et le taux de rétention de cet extrait dans l'éprouvette. Imprégnation des éprouvettes Le test a été réalisé sur deux espèces ligneuses tropicales non durables (classe 5) : Virola surinamensis (densité de 0,5 g/cm ³ ) et Schefflera morototoni (densité 0,7 g/cm ³ ). Avant le traitement, les éprouvettes (radial x tangentiel x longitudinal = 20 x 20 x 5 mm) ont été stabilisées à une humidité de 12% (70±5% humidité relative de l'air).

Ces essais d'imprégnation ont été réalisés avec des extraits méthanoliques de T. serratifolia, V. americana, A. surinamensis, B. guianensis, M. huberi et Q. rosea, et avec l'extrait à l'acétate d'éthyle de S. rubra. Cinq taux de rétention différents ont été visés pour chaque extrait utilisé : 72, 36, 18, 4,5 et 2,25 kg/m ³ de bois pour S. morototoni, et 89,6, 44,8, 22,4, 5,6 et 2,8 kg/m ³ pour V. surinamensis. Ces taux d'imprégnation théoriques ont été numérotés de T1 à T5, de la plus forte à la plus faible imprégnation.

Pour l'imprégnation, les extraits ont été dissous dans du méthanol ou dans de l'acétate d'éthyle pour l'extrait de S. rubra, et les solutions ont été déposées de façon homogène de chaque côté des éprouvettes sur les faces de 20x20 mm. Après le traitement, les éprouvettes ont été séchées et stabilisées en salle climatisée (25±3°C) pendant 7 jours.

Taux de rétention

Le taux de rétention réel a été calculé après séchage, et correspondait à la quantité de produit retenu par unité de volume. Les taux de rétention était dépendant de l'imprégnabilité des espèces utilisées, de la nature de l'extrait et de l'affinité de ses constituants à l'égard des éléments structuraux du bois (parois cellulaires, lumens, ponctuations...).

Les antimycotiques, tébuconazol et chlorotalonile, ont été utilisés comme contrôles positifs, pour valider la méthode appliquée. Les taux de rétention visés ont été de 0,5, 0,25 et 0,125 %, correspondant aux taux de 2,6, 1 ,3 et 0,65 kg/m ³ pour les éprouvettes de V. surinamensis (d = 0,52) et 2,75, 1 ,38 et 0,69 kg/m ³ pour les éprouvettes de S. morototoni (d = 0,55). Chaque essai a été répété 6 fois, alors que la dégradation des témoins non imprégnés, qui sert à contrôler la virulence du sol, est une moyenne sur 9 éprouvettes.

Les résultats de la moyenne des taux de rétention mesurés avec les différents extraits sur V. surinamensis et S. morototoni, sont représentés dans le tableau 3 ci-dessous, et sont comparés aux taux de rétention théoriques visés.

Tableau 3

^* extrait méthanolique (MeOH)

extrait d'acétate d'éthyle (AcOEt) Globalement, les résultats ont montré que les taux de rétention mesurés étaient assez proches des taux de rétention attendus pour les traitements T1 et T3. Cependant, une certaine variabilité a été observée qui a résulté probablement de l'affinité des différents extraits pour le bois imprégné. Par exemple, les extraits méthanoliques de Q. rosea, T. serratifolia et B. guianensis ont conduit à des taux d'imprégnation particulièrement élevés lorsque le bois imprégné était le bois de V. surinamensis.

A la concentration T4, les taux d'imprégnation mesurés ont été compris entre 0,3 et 4,6 kg/m ³ pour des écarts-types compris entre 0,3 et 1 ,5 kg/m ³ . En conséquence, la valeur des moyennes est restée supérieure à l'écart-type, mais il est évident que la mesure du taux d'imprégnation n'a pas été aussi précise que celle aux concentrations plus fortes. Par ailleurs, les taux d'imprégnation ont été généralement inférieurs au taux visé de 4,5 kg/m ³ ; ce qui tend à démontrer que la valeur mesurée a sans doute été sous-évaluée par rapport à la valeur réelle, peut-être du fait de la perte d'une partie du produit de traitement lors du séchage à 103°C.

Cette hypothèse permet de rendre compte des disparités dans les valeurs de taux d'imprégnation à la concentration T5, pour laquelle les taux d'imprégnation mesurés ont été très faibles et les écarts-types élevés. Il est vraisemblable que ces valeurs mesurées pour T5 ne sont pas utilisables, mais à cette concentration, aucun traitement n'a présenté d'activité significative.

Contrôle de l'efficacité des traitements - Mesure des pertes de dureté

La dureté des éprouvettes a été mesurée à l'aide d'un duromètre

(Hardmatic HH-300 ^® , Mitotoyo, Japon). Le poinçon de l'appareil avait un diamètre de 1 ,25±0,15 mm, avec une pointe semi-sphérique de 0,79±0,01 mm de diamètre.

La dureté a été mesurée par le poinçonnement des éprouvettes en 4 points sur la surface exposée au sol pendant le test. Pour chaque traitement, cinq éprouvettes ont été réalisées. Trois ont été mises en contact avec le sol pendant 6 semaines alors que les deux autres ont été utilisées pour étalonner la perte de dureté liée à l'augmentation de l'humidité du bois au cours du test. En effet, la dureté initiale a été mesurée après imprégnation et après stabilisation des bois dans une pièce climatisée (25°C, 70% d'humidité de l'air), et il est raisonnable de postuler que les bois exposés au sol aient tous une teneur en eau au-delà du point de saturation de a fibre à la fin du test. En conséquence, la dureté initiale, pour pouvoir être comparée à la dureté initiale, a du être corrigée. Pour cela, les deux éprouvettes témoins ont été maintenues sur un papier fibre humide, à 8°C, pendant 7 jours ; ce qui a permis de calculer le facteur correctif k à appliquer à la dureté initiale pour rendre compte de la différence d'humidité des bois avant et après le test.

k = DPSF -témoins / DItémoins

OÙ

DpsF-témoins représente la dureté du bois des témoins lorsque son humidité relative est supérieure au point de saturation de la fibre (PSF) ; et

DItémoins représente la dureté initiale du bois lorsque celui-ci était dans la même pièce que les éprouvettes utilisées pour le test.

De cette façon, la perte de dureté (PD, exprimée en pourcentage) a pu être calculée en comparant la dureté finale des éprouvettes de test (ayant un taux d'humidité au-delà du PSF) à leur dureté initiale (en salle climatisée) selon l'équation suivante :

PD = [(DF - k.DI) / (k.DI)] x 100

OÙ

DF représente la dureté finale ; et

Dl représente la dureté initiale.

Pour ce test, des témoins de virulence ont également été réalisés. Il s'agit de six éprouvettes de Virola surinamensis et de six éprouvettes de Schefflera morototoni qui ont permis de contrôler la virulence du sol forestier utilisé dans le test, et d'étalonner la vitesse de dégradation du bois lorsqu'il n'a pas été traité. Pour les témoins de virulence, les mesures de perte de dureté ont été réalisées - comme pour les échantillons - avant (70% d'humidité relative de l'air et 25°C) et immédiatement après l'exposition, où la dureté avant exposition a été corrigée de la perte de dureté enregistrée pour la simple augmentation d'humidité relative du bois lors du test.

Les valeurs de perte de dureté obtenues avec les éprouvettes traitées ont été comparées aux pertes subies par les éprouvettes témoins de virulence. Les résultats pour S. morototoni et V. surinamensis sont représentés respectivement dans les figures 2 et 3, à l'aide du logiciel GraphPad prism 5. Les résultats des traitements T5 et T6 n'ont pas été représentés car ils ne sont pas significativement actifs.

Ces résultats ont été comparés par une analyse des variances, et les éprouvettes pour lesquelles la perte de dureté a été significativement plus faible que celle enregistrée sur les témoins ont été considérées comme protégées par l'extrait avec lesquelles elles avaient été imprégnées.

L'analyse statistique a été réalisée comme suit :

Test de Kruskal-Wallis

L'analyse de variance a été calculée par la méthode de Kruskal- Wallis (ANOVA non paramétrique) avec l'outil XLSTAT pour Microsoft excel. Avec le logiciel, les niveaux de signification ont été corrigés par la méthode de Bonferroni.

Le niveau de significativité de la variance a été lu dans le tableau des χ ² de Pearson à la valeur standard de 0,05. Les résultats sont représentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4

a la valeur P est une estimation gaussienne

^*** : très significatif

c chaque traitement a constitué un groupe

Les résultats ont permis de mettre en évidence que la variance était bien supérieure à la valeur χ ² du tableau ; ce qui implique que les échantillons n'ont pas été homogènes vis-à-vis de la dégradation fongique. Les traitements ont donc eu un impact sur la durabilité.

Les différences significatives liées aux traitements ont alors pu être comparées par une analyse de comparaisons multivariées.

Analyse de comparaison multiple - S. morototoni

Puisque le test précédent a démontré que les traitements ont induit des modifications de perte de dureté dans le test sol, les traitements ont alors été comparés deux à deux par la procédure de Dunn/test bilatéral en utilisant là encore l'outil XLSTAT. L'arrangement par groupes de perte de dureté des éprouvettes de S. morototoni a été représenté dans le tableau 5 ci-dessous.

Tableau 5

Traitement Effectif Somme Moyenne groupes

des rangs des rangs

1. S. rubra T1 1 1 684,500 62,227 A

2. B. guianensis T1 12 762,000 63,500 A

3. B. guianensis T2 12 766,500 63,875 A

4. B. guianensis T3 12 774,000 64,500 A

5. T. serratifolia T2 12 880,000 73,333 A B

6. V. americana T2 12 901 ,500 75, 125 A B

7. A surinamensis T2 12 917,500 76,458 A B

8. V. americana T1 12 953,500 79,458 A B C

9. Q. rosea T2 12 1025,000 85,417 A B C

10. Q. rosea T1 12 1486,000 123,833 A B C D

1 1. 7. serratifolia T1 12 1488,000 124,000 A B C D

12. S. rubra J3 12 1609,000 134,083 A B C D

13. A surinamensis T1 12 1620,500 135,042 A B C D E

14. T. serratifolia T3 12 1759,500 146,625 A B C D E

15. S. rubra J2 12 1887,000 157,250 A B C D E

16. V. americana T3 12 1890,000 157,500 A B C D E

17. A surinamensis T3 12 2193,500 182,792 B C D E

18. Q. rosea T3 12 2325,000 193,750 C D E

19. témoins 12 2565,000 213,750 D E

20. M. huberi T' 12 2606,500 217,208 D E

21. M. huberi l 12 2625,000 218,750 D E

22. M. huberi T3 12 2996,500 249,708 E

Dans cette analyse, les témoins ont été classés dans le groupe de durabilité D/E. Jusqu'à la ligne 9, les traitements ont été considérés comme nettement plus efficaces parce qu'aucun d'eux ne possédait le caractère D. En conséquence, les extraits de S. rubra, B. guianensis, T. serratifolia, V. americana, A. surinamensis et Q. rosea ont été les plus efficaces pour protéger le bois de S. morototoni de la dégradation fongique.

Analyse de comparaison multiple - V. surinamensis Les traitements réalisés sur V. surinamensis ont également été regroupés par classe d'efficacité en utilisant le même test bilatéral de Dunn. Les résultats sont représentés dans le tableau 6 ci-dessous.

Tableau 6

Dans cette analyse, la distribution des populations a été moins nette que précédemment. Peu de traitements ont été très différents des témoins. Seuls les traitements des lignes 1 à 4 ne possèdent pas de caractère E. Ici, les extraits qui ont donné des protections satisfaisantes ont été les extraits de B. guianensis, T. serratifolia et Q. rosea comme précédemment, ainsi que l'extrait de M. huberi. Il semble donc plus difficile de protéger le bois de V. surinamensis, d'autant que des taux de rétention supérieurs aux taux de rétention enregistrés pour S. morototoni ont été mesurés dans ce bois.

Mesure des seuils d'efficacité de chacun des traitements

Il a été supposé que l'activité fongique d'un extrait était proportionnelle à sa capacité à réduire la perte de dureté subie par les éprouvettes exposées, et que cette activité était dépendante du taux de rétention réellement obtenu pour chaque traitement.

De ce fait une courbe dose-réponse a été proposée pour la détermination de l'efficacité de chaque traitement, dans laquelle la dose considérée a été le taux réel d'imprégnation.

Il a été considéré que le traitement était efficace (seuil d'efficacité) s'il permettait de réduire de 50% la perte de dureté par rapport à la moyenne des témoins. Ainsi, le traitement le plus efficace a été celui qui avec le plus faible taux de rétention réel a permis d'observer une réduction de la perte de dureté de 50%.

La réduction de la perte de dureté R a été calculée comme suit, à partir de la perte de dureté (PD) définie précédemment :

R = (PDtémoins - PDtraitement) / PDtémoins où

PDtémoins représente la moyenne des pertes de dureté enregistrées sur les témoins ; et

PDtraitement représente la moyenne des pertes de dureté enregistrées sur le bois avec un traitement donné.

S. morototoni

Les réductions de perte de dureté enregistrées pour S. morototoni sont représentés dans la figure 4. A partir de la figure 4, il a été possible de mesurer les concentrations pour lesquelles chaque traitement a induit une réduction de 50% de la perte de dureté Les résultats sont représentés dans le tableau 7 ci-dessous. Tableau 7

a les mesures pour lesquelles un point correspondait précisément au TR50 ont été indiquées entre parenthèses.

En terme d'efficacité pour la protection du bois de S. morototoni, ces extraits ont pu être classés en trois groupes. B. guianensis a été très actif, M. huberi a été le moins actif, et les cinq autres extraits ont été moyennement actifs.

Dans le cas de l'extrait de B. guianensis, les valeurs exactes du taux de rétention capable de réduire de 50% la perte de dureté (TR50) ont pu être identifiées. Il est de 2 kg/m ³ , ce qui est équivalent au TR50 du chlorotalonile, un antifongique de référence. Le TR50 du tébuconazole est légèrement inférieur à 0,69 kg/m ³ , et n'a donc pas pu être mesuré avec les concentrations choisies pour ce test.

Dans le cas de l'extrait de T. serratifolia, le TR50 est de 25kg/m3 (valeur exacte extraite de la figure 4) ; ce qui est approximativement 10 fois plus que le TR50 du chlorotalonile.

Cela implique que l'on puisse envisager d'utiliser cet extrait ainsi que les autres extraits moins actifs pour la protection des bois. Par ailleurs, il est raisonnable de penser que ces extraits classés comme moins actifs contiennent bien des molécules antifongiques.

V. surinamensis Les réductions de perte de dureté enregistrées pour V ; surinamensis sont représentés dans la figure 5, et le TR50 est représenté dans le tableau 8 ci-dessous.

Tableau 8

a les mesures pour lesquelles un point correspondait précisément au TR50 ont été indiquées entre parenthèses.

Dans le cas de la protection du bois de V. surinamensis, l'extrait le plus actif a été l'extrait de Q. rosea, dont le TR50 était proche de celui du chlorotalonile. Deux autres extraits (B. guianensis et T. serratifolia) ont été assez actifs et pourraient être utilisées préférentiellement pour la protection de ce bois.

Listes des références LOUBINOUX et KILBERTUS, La préservation du bois. Techniques et produits de préservation. Le Bois, matériau d'ingénierie. Editions ARBOLOR. 433pp, 1994

Demande de Brevet EP 0 591 674

Brevet KR 100917802

Demande Internationale WO 01/01776