DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc avec une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent. L'invention concerne également un procédé d'augmentation de la demi-vie d'un fragment Fc. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Les anticorps monoclonaux sont utilisés aujourd'hui en tant qu'agents thérapeutiques pour traiter une variété de pathologies, y compris les cancers, les maladies auto- immunes, les maladies inflammatoires chroniques, le rejet de greffe, les maladies infectieuses et les maladies cardio-vasculaires. Ils constituent donc un enjeu thérapeutique majeur. Nombre d'entre eux est déjà commercialisé, et une proportion toujours croissante est en cours de développement ou d'essais cliniques. Cependant, il existe un besoin important pour optimiser les propriétés structurales et fonctionnelles des anticorps, afin d'en maîtriser les effets secondaires.

Une des questions critiques dans l'utilisation d'anticorps monoclonaux en thérapie est leur persistance dans la circulation sanguine. La clairance de l'anticorps affecte directement l'efficacité du traitement, et par conséquent, la fréquence et la quantité de l'administration du médicament, qui peut entraîner des effets indésirables chez le patient.

Il existe cependant toujours un besoin de trouver des anticorps, ou des fragments d'anticorps, ayant une demi-vie améliorée permettant ainsi de maintenir leur efficacité et leurs propriétés biologiques intéressantes, avec un dosage moins élevé.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

La présente invention fournit des moyens pour obtenir un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc ayant une demi-vie améliorée. Le terme « demi- vie » se réfère à la demi-vie biologique d'un polypeptide d'intérêt dans la circulation d'un patient donné, notamment humain ou murin, tel qu'une souris, et est représentée par le temps nécessaire pour que la moitié de la quantité du polypeptide d'intérêt présente dans la circulation du patient soit éliminée de la circulation et/ou d'autres tissus du patient. La demi-vie est calculée notamment tel que décrit en exemple 2.

En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert qu'un polypeptide Fc, notamment un fragment Fc muté sur des positions spécifiques présente une demi-vie sensiblement augmentée par rapport au fragment Fc non muté. Cela permet ainsi d'augmenter les propriétés thérapeutiques du polypeptide Fc ou du fragment Fc. De plus, les inventeurs ont découvert que certaines combinaisons de mutations particulières avaient un effet synergique sur l'augmentation de la demi-vie, renforçant encore les propriétés avantageuses de polypeptides Fc, notamment de fragments Fc selon l'invention.

En outre, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert que la demi-vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc muté sur des positions spécifiques, augmentée par rapport à celle d'un polypeptide parent non muté, n'est pas corrélée à une augmentation in vitro de la liaison du fragment Fc muté au FcRn par rapport à celle du fragment Fc non muté. Ainsi, l'un des buts de la présente invention est de pouvoir proposer des polypeptides Fc ou fragments Fc présentant une demi-vie augmentée, et ce, indépendamment de la liaison à FcRn.

LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgGI humaine native se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'lgG2 humaine (SEQ ID NO: 7), lgG3 humaine (SEQ ID NO: 8) et lgG4 humaine (SEQ ID NO: 9). Les séquences d'IgGI se réfèrent à l'allotype G1 m1 ,17 (SEQ ID NO: 6) et à l'allotype G1 m3 (SEQ ID NO: 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" d'IgGI commence à la cystéine 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique.

Figure 2 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 (variants T5A 74) produits en cellules YB2/0: La concentration des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques a été évaluée au fil du temps. Figure 3 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 (variants C6A 74) produits en cellules YB2/0: La concentration des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques a été évaluée au fil du temps.

Figure 4 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 (variants T5A 74) produits en cellules YB2/0, avant ou après désialylation: La concentration des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques a été évaluée au fil du temps. Figure 5 : Liaison à hFcRn sur cellules, d'anticorps anti-CD20 (variants T5A 74) produits en cellules YB2/0, avant ou après désialylation.

Figure 6 : Liaison à hFcRn sur cellules, d'anticorps anti-CD20 (variants C6A 74) produits en cellules YB2/0, avant ou après désialylation.

Figure 7 : Liaison à CD20 sur cellules, d'anticorps anti-CD20 (variants T5A 74) produits en cellules YB2/0, avant ou après désialylation.

Figure 8 : Liaison à CD20 sur cellules, d'anticorps anti-CD20 (variants C6A 74) produits en cellules YB2/0, avant ou après désialylation.

Définitions

Tel qu'ils sont utilisés ici, les termes «protéine» et «polypeptide» sont utilisés de manière interchangeable et se réfèrent à une séquence d'au moins deux acides aminés liés de façon covalente, incluant les protéines, polypeptides, oligopeptides et peptides.

Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent notamment les anticorps ou immunoglobulines, notamment entiers, monoclonaux, multi-spécifiques, bi-spécifiques, dual-spécifiques, synthétiques, chimériques, humanisés, humains, les protéines de fusion avec des immunoglobulines, les anticorps conjugués, et leurs fragments.

Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent également les polypeptides Fc définis par un polypeptide comprenant tout ou partie d'une région Fc, notamment les fragments Fc isolés, Fc conjugués, Fc multimériques et les protéines de fusion avec un fragment Fc. Par « fragment Fc » ou « région Fc », on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1 -CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines, en tout ou partie. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, on utilise dans la présente invention un fragment Fc d'une lgG1 , qui se compose d'une partie de la charnière flexible N- terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, on utilise un fragment Fc d'une lgG1 humaine (i.e. acides aminés 226 à 447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat). Dans ce cas, la partie de la charnière flexible N-terminale est la charnière inférieure, qui se réfère aux positions 226 à 230, le domaine CH2 fait référence aux positions 231 à 340 et le domaine CH3 se réfère aux positions 341 -447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Le fragment Fc utilisé selon l'invention peut comprendre en outre la totalité, ou une partie, de la charnière flexible N-terminale (la totalité correspondant aux positions 216 à 230 selon l'index EU), qui inclut la partie supérieure de la région charnière flexible N-terminale, en amont de la position 226. Dans ce cas, de préférence, on utilise un fragment Fc d'une lgG1 humaine comprenant une partie de la région située entre les positions 216 à 226 (selon l'indice EU). Dans ce cas, le fragment Fc d'une lgG1 humaine utilisé correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, le fragment Fc natif utilisé correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, le fragment Fc natif utilisé est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent a pour séquence SEQ ID NO : 1 . Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal.

Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 avec la totalité de leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10.

De préférence, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent a une séquence constituée par les acides aminés aux positions 1 -232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6- 232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 1 1 -232 de la séquence SEQ ID NO : 6.

La définition de « fragment Fc » inclut un fragment scFc pour « single chain Fc ». Par « fragment scFc », on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. De préférence, le fragment Fc utilisé dans le cadre de l'invention est choisi parmi le fragment Fc d'une lgG1 ou lgG2. De préférence encore, le fragment Fc utilisé est le fragment Fc d'une IgG, préférentiellement une lgG1 , plus préférentiellement de séquence SEQ ID NO :1 .

Dans la présente demande, la numérotation des résidus du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (Séquences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 )).

Par « mutation d'acide aminé », on entend ici un changement dans la séquence d'acides aminés d'un polypeptide. Une mutation est choisie notamment parmi une substitution, une insertion et une délétion. Par «substitution», on entend le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent, par le même nombre d'autres acides aminés. De préférence, la substitution est ponctuelle, i.e. elle ne concerne qu'un seul acide aminé. Par exemple, la substitution N434S (appelée aussi 434S) se réfère à un variant d'un polypeptide parent, dans lequel l'asparagine en position 434 du fragment Fc selon l'index EU ou équivalent dans Kabat est remplacé par la sérine. Par « insertion », on entend l'addition d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par « délétion », on entend l'élimination d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294 ; une telle délétion est aussi appelée Del294 ou del294.

Par «polypeptide parent», on entend un polypeptide de référence qui est ensuite modifié pour générer un variant. Ledit polypeptide parent peut être un polypeptide d'origine naturelle, un variant d'un polypeptide d'origine naturelle, une version modifiée d'un polypeptide naturel ou un polypeptide synthétique.

Par «variant», on entend une séquence polypeptidique qui est différente de la séquence du polypeptide parent par au moins une modification d'acide aminé.

De préférence, la séquence du variant est au moins 80% identique avec la séquence du polypeptide parent, et plus préférentiellement au moins 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% identique. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement et sur toute la longueur de la séquence du variant, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le calcul d'identité s'effectue ici sur toute la longueur de la séquence du variant, et exclut un calcul sur une longueur partielle. Par « meilleur alignement» ou « alignement optimal», on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981 , J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). Par « sialylation », on entend le mécanisme de glycosylation correspondant à un ajout, par liaison covalente, d'au moins un acide sialique (i.e. acide N- acétylneuraminique et ses dérivés, comme l'acide N-glycosylneuraminique, l'acide N- acétylglycoylneuraminique) dans la chaîne glycosylée de la protéine. Par « récepteur de la région Fc » ou « FcR » on entend notamment le C1 q et les Récepteurs Fcy (FcyR). Les « Récepteurs Fcy » ou « FcyR » se réfèrent aux récepteurs des Immunoglobulines de type IgG, appelés CD64 (FcyRI), CD32 (FCYRI I), et CD16 (FCYRI I I), en particulier aux cinq récepteurs exprimés FcyRIa, FcyRIla, FcYRIIb, FcYRIIIa et FcvRIIIb. Tous sont des récepteurs activateurs des cellules effectrices porteuses de tels récepteurs Fc, hormis le FcYRIIb humain qui est un récepteur inhibiteur de l'activation des cellules immunitaires (Muta T et al., Nature, 1994, 368 :70-73). Par «FcRn» ou «récepteur Fc néonatal » tel qu'utilisé ici, on entend une protéine qui se lie à la région Fc des IgG et est codée au moins en partie par un gène FcRn. Le FcRn peut être de n'importe quel organisme, y compris, mais sans s'y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes. Comme cela est connu dans la technique, la protéine FcRn fonctionnelle comprend deux polypeptides, souvent désignés sous le nom de chaîne lourde et de chaîne légère. La chaîne légère est la bêta-2-microglobuline et la chaîne lourde est codée par le gène FcRn. Sauf indication contraire ici, FcRn ou protéine FcRn se réfère au complexe de la chaîne a avec la bêta-2-microglobuline. Chez l'homme, le gène codant pour le FcRn est appelé FCGRT.

Variants de fragment Fc

La présente invention a pour objet un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent, et comprenant :

- au moins une mutation du fragment Fc augmentant la sialylation du Fc ; et

- au moins une mutation du fragment Fc augmentant la liaison du Fc au FcRn.

La présente invention concerne également un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent, et comprenant au moins trois mutations par rapport au fragment Fc du polypeptide parent, comprenant :

- une mutation A) d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305 dudit fragment Fc; et - une mutation B) choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S; et

- au moins une mutation C) choisie dans le groupe constitué de 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S,

étant entendu que :

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé, et

la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Par « les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé », on entend que chacune des mutations A, B et C est effectuée sur un acide aminé différent. En d'autres termes, au moins 3 acides aminés distincts sont mutés dans les variants selon l'invention.

Préférentiellement, ladite mutation A) est del294 ou 264E.

En effet, les mutants selon l'invention, notamment comprenant les combinaisons de mutations 294del/N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, V264E/N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y ou 294del/259l/315D/434Y, présentent une demi-vie augmentée, et ce, indépendamment de la liaison à FcRn.

En outre, comme indiqué dans les exemples, la seule mutation Del294 augmente la demi-vie, mais pas la MRT (i.e. temps moyen de résidence dans l'organisme), par rapport au WT. En revanche, la demi-vie et la MRT sont toutes deux fortement augmentées avec un variant comprenant à la fois la mutation Del294 (mutation A), mais aussi une combinaison de mutations B) et C).

Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 IJ264E/378V, 241 IJ264E/434S, 250 A/389 K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Ainsi de préférence, ledit variant comprend :

i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305; et

ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 IJ264E/378V, 241 IJ264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396IJ434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y,

étant entendu que la mutation A ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que l'un des acides aminés de la mutation ii), et

étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend en outre au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231 T, 241 L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421 T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Ainsi de préférence, ledit variant comprend :

i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290,

291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305; et

ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 IJ264E/378V, 241 IJ264E/434S, 250A 389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396IJ434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y,

et au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231 T, 241 L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421 T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R,

étant entendu que la mutation A ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que l'un des acides aminés de la mutation ii), et

étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie dans le groupe constitué de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361 D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428IJ434Y,

241 IJ264E/307P/378V/433R, 250 A/389 K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y,

230T/241 L/264E/265G/378V/421 T, 264E/396L/415N/434S, 227IJ264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y,

230IJ241 IJ243IJ264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y,

290E/315D/342R/382V/434Y, 241 L/315D/330V/392R/434Y, 241 IJ264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K,

230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y,

226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y,

230T/264E/378V/434S, 231 T/241 L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421 T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S,

étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Ainsi de préférence, un variant selon l'invention comprend : i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305; et

ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 307A 315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y,

315D/330V/361 D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428IJ434Y,

241 IJ264E/307P/378V/433R, 250 A/389 K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y,

305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y,

230T/241 L/264E/265G/378V/421 T, 264E/396L/415N/434S, 227IJ264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y,

230IJ241 IJ243IJ264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y,

290E/315D/342R/382V/434Y, 241 L/315D/330V/392R/434Y,

241 IJ264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y,

226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y,

230T/264E/378V/434S, 231 T/241 L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y,

267R/307P/378V/421 T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S,

étant entendu que la mutation A ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que l'un des acides aminés de la mutation ii), et

étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428IJ434Y, 294del/307P/434Y et 315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie parmi 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y et 315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend une mutation A) choisie parmi del294 et 264E, et au moins une combinaison de mutations ii) choisie parmi 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y et 315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, la demi-vie dudit variant est augmentée d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30 par rapport audit polypeptide parent.

De préférence, le variant selon l'invention est obtenu par production dans des cellules, notamment des cellules YB2/0, ou bien par production dans des mammifères transgéniques, comme cela est décrit ci-dessous dans le paragraphe « Procédé d'augmentation de la demi-vie d'un fragment Fc ».

De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc choisi parmi les fragments Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs variants naturels. De préférence, selon une première alternative, le polypeptide parent consiste en un fragment Fc, et de préférence un fragment Fc entier.

De préférence, selon une seconde alternative, le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un fragment Fc. Dans ce cas, avantageusement, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, un polypeptide de fusion Fc ou un conjugué Fc.

De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent consiste en la séquence SEQ ID NO : 1 . Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de la partie supérieure de la région charnière en N- terminal. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10.

Ces séquences sont résumées comme suit:

SEQ Protéine Séquence

ID NO :

1 Région Fc d'IgGl CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV humaine Glml,17 VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ (résidus 226-447 selon YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL l'index EU ou équivalent PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS dans Kabat) sans région LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD charnière supérieure N- SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH terminale NHYTQKSLSLSPGK

2 Région Fc d'IgG2 CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV humaine sans région VVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ charnière supérieure N- FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP terminale APIEKTIS KTKGQPREPQ V YTLPPSREEMTKNQ VS L

TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK

3 Région Fc d'IgG3 CPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC humaine sans région VVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREE charnière supérieure N- QYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA terminale LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPML

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALH

NRFTQKSLSLSPGK

4 Région Fc d'IgG4 CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV humaine sans région VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ charnière supérieure N- FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP terminale SS IEKTIS KAKGQPREPQ V YTLPPS QEEMTKNQ VS L

TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSLGK

5 Région Fc d'IgGl CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV humaine Glm3 sans VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ région charnière YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL supérieure N-terminale PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK

6 Région Fc d'IgGl EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL humaine G 1ml, 17 avec MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH région charnière NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY supérieure N-terminale KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR (résidus 216-447 selon DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN l'index EU ou équivalent YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC dans Kabat) S VMHEALHNH YTQKS LS LSPGK

7 Région Fc d'IgG2 ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR humaine avec région TPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK charnière supérieure N- TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCK terminale VSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLS LSPGK

8 Région Fc d'IgG3 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKS humaine avec région CDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVF charnière supérieure N- LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFK terminale WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTV

LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQP

REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD

KSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLS LSPGK

9 Région Fc d'IgG4 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR humaine avec région TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK charnière supérieure N- TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK terminale VSNKGLPS S IEKTIS K AKGQPREPQ V YTLPPS QEEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM

HE ALHNH YTQKS LS LS LGK

10 Région Fc d'IgGl EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL humaine Glm3 avec MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH région charnière NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY supérieure N-terminale KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK

Alternativement, le polypeptide parent consiste en une immunoglobuline, un anticorps ou encore en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un anticorps ou une immunoglobuline. De manière préférée, ledit polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps.

Procédé d'augmentation de la demi-vie d'un fragment Fc La présente invention a également pour objet un procédé d'augmentation de la demi- vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc, comprenant les étapes suivantes:

- insertion d'au moins une mutation du fragment Fc augmentant la sialylation du Fc ; et

- insertion d'au moins une mutation du fragment Fc augmentant la liaison du Fc au FcRn.

La présente invention a également pour objet un procédé d'augmentation de la demi- vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc, comprenant les étapes suivantes: i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305;

ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et

insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G,

228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V,

378T, 389T, 389K, 434Y et 434S;

étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé,

et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, ladite étape i) est une étape de délétion de l'acide aminé en position 294 ou une étape d'insertion d'une mutation 264E, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 378T/396L, 378V/416K, 378V/434S, 396L/434S, 307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de

226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 IJ264E/378V, 241 IJ264E/434S, 250A 389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396IJ434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y,

315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y. Dans un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend en outre une étape iii) d'insertion d'au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231 T, 241 L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421 T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R,

étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 307A 315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 294del/307P/434Y et

315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y et

315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, le procédé d'augmentation de la demi-vie selon l'invention est tel que l'étape i) est une étape de délétion de l'acide aminé en position 294, et l'étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations 315D/330V/361 D/378V/434Y.

Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées sont applicables Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, de préférence une IgG, et le variant selon l'invention est alors choisi parmi les variants d'IgG. Plus préférentiellement, le variant selon l'invention est choisi parmi les variants d'IgGI , lgG2, lgG3 et lgG4 humaines.

De manière préférée, le procédé d'augmentation de la demi vie d'un fragment Fc selon l'invention permet une augmentation de la demi vie d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30, par rapport à la demi- vie dudit polypeptide comprenant un fragment Fc avant les étapes de mutation dudit procédé. Plus préférentiellement, l'étape de mutation du procédé est obtenue comme suit :

a) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ;

b) on modifie la séquence nucléique fournie en a) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et

c) on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte, et on récupère le variant.

Une telle étape de mutation est donc effectuée en utilisant une séquence nucléique (polynucléotide ou séquence nucléotidique) codant pour ledit polypeptide parent (étape a)). La séquence nucléique codant pour le polypeptide parent peut être synthétisée par voie chimique (Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 1 5;32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut être également amplifiée par PCR en utilisant des amorces adaptées. La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut également être clonée dans un vecteur d'expression. L'ADN codant pour un tel polypeptide parent est inséré dans un plasmide d'expression et inséré dans une lignée cellulaire ad hoc pour sa production (par exemple la lignée HEK-293 FreeStyle, la lignée YB2/0, ou la lignée CHO), la protéine ainsi produite étant ensuite purifiée par chromatographie. Ces techniques sont décrites en détails dans les manuels de référence : Molecular cloning : a laboratory manual, 3 ^ieme édition-Sambrook and Russel eds. (2001 ) et Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007). La séquence nucléique fournie en a) (polynucléotide), qui code pour le polypeptide parent, est ensuite modifiée pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant. C'est l'étape b).

Cette étape est l'étape de mutation à proprement parler. Elle peut être effectuée par toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par mutagénèse dirigée ou par mutagénèse aléatoire. De préférence, la mutagénèse aléatoire telle que décrite dans la demande WO02/038756 est utilisée : il s'agit de la technique Mutagen. Cette technique utilise une ADN mutase humaine, notamment choisie parmi les ADN polymérases β, η et i. Une étape de sélection des mutants ayant conservé la liaison au FcRn est nécessaire pour retenir les mutants d'intérêt.

Alternativement, les substitutions d'acides aminés sont de préférence réalisées par mutagénèse dirigée, par la technique de PCR d ^' assemblage utilisant des oligonucléotides dégénérés (voir, par exemple, Zoller et Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488). Enfin, dans l'étape c), on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte, et on récupère le variant ainsi obtenu.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes.

Les cellules hôtes préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lec13, PER.C6™ (Crucell), les cellules HEK notamment HEK293 (ATCC # CRL1573), T1080, EB66, K562, NS0, SP2/0, les cellules HeLa, BHK ou COS. De préférence encore, on utilise la lignée de rat YB2/0.

La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport au polypeptide parent, comprenant les étapes suivantes: a) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ;

b) on modifie la séquence nucléique fournie en a) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et

c) on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte YB2/0, et on récupère le variant, dans lequel l'étape b) comprend :

i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305;

ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et

insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G,

228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378T,

389T, 389K et 434S;

étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé,

et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Préférentiellement, un tel procédé de production comprend, dans l'étape b) :

i) l'insertion d'une mutation A choisie parmi del294 et 264E;

ii) l'insertion d'une mutation B choisie parmi 378V et 434Y, et

l'insertion d'au moins une mutation C choisie parmi 315D et 330V, de préférence l'insertion d'au moins les mutations C, 315D et 330V,

étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé,

et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Plus préférentiellement, un tel procédé de production comprend, dans l'étape b), l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 2591/315D/434Y et 315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire le polypeptide dans le lait. Dans ce cas, l'expression d'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et la séquence d'ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L'animal peut ainsi être choisi parmi le mouton, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.

La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport au polypeptide parent, comprenant les étapes suivantes: a) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ;

b) on modifie la séquence nucléique fournie en a) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et

c) on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte choisie parmi des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire le polypeptide dans le lait, et on récupère le variant, dans lequel l'étape b) comprend :

i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305;

ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et

insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378T, 389T, 389K et 434S; étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé que la mutation B, et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Préférentiellement, un tel procédé de production comprend, dans l'étape b) :

i) l'insertion d'une mutation A choisie parmi del294 et 264E;

ii) l'insertion d'une mutation B choisie parmi 378V et 434Y, et

l'insertion d'au moins une mutation C choisie parmi 315D et 330V,

étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé,

et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index

EU ou équivalent dans Kabat.

Plus préférentiellement, un tel procédé de production comprend, dans l'étape b), l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 2591/315D/434Y et

315D/330V/361 D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, le procédé de production selon l'invention est tel que l'étape i) est une étape de délétion de l'acide aminé en position 294, et l'étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations 315D/330V/361 D/378V/434Y.

Le polynucléotide codant pour le variant obtenu à l'étape b) peut également comprendre des codons optimisés, notamment pour son expression dans certaines cellules (étape c)). Par exemple, lesdites cellules comprennent les cellules YB2/0, les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK, les cellules BHK, les cellules PER.C6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, 293 (ATCC # CRL1573), des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de codons joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de codons a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel de traduction (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934). L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence. De préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules HEK, telles que des cellules HEK293, les cellules CHO, ou les cellules YB2/0. Plus préférentiellement, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules YB2/0. Alternativement, de préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules d'animaux transgéniques, de préférence la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.

Procédé de production d'un variant

Dans un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport au polypeptide parent, comprenant les étapes suivantes:

i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241 , 242, 243, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305;

ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K 434Y et 434S;

étant entendu que :

les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide parent,

les mutations A, B et C n'ont pas lieu sur le même acide aminé,

et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index

EU ou équivalent dans Kabat. Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées sont applicables ici.

Composition pharmaceutique

Le variant obtenu selon l'invention peut être combiné avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intra- oculaire, intra-cérébrale, transdermique, pulmonaire, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale.

De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables. Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons.

Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.

Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine.

Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaCI isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.

EXEMPLES

Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.

Exemple 1 : Production des variants selon l'invention

La mise au point des variants de l'invention « optimisés FcRn » peut se faire selon les méthodes décrites dans l'art antérieur, en particulier la demande de brevet européen EP 0 233 500, qui décrit l'obtention de tels mutants selon la technique dite Technique MutaGen™.

Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes : A/ Construction d'une banque de Fc

Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1 ) dérivé de la chaîne lourde d'une lgG1 humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles standards bien connus de l'homme du métier.

B/ Mutagenèse

Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol β, η et ι) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires.

C/ Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants présentant une demi-vie améliorée

Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément aux protocoles connus de mesure de demi-vie.

Cette méthode a permis l'identification de variants Fc d'intérêt présentant une liaison améliorée au FcRn, et caractérisés, tels que T5A-74 (N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y) et C6A-74 (2591/315D/434 Y). D/ Production des variants selon l'invention sous forme d'Ig entière

Plusieurs combinaisons de mutations ont été sélectionnées pour servir de base à la production de mutants selon l'invention.

Les combinaisons suivantes selon l'invention ont été sélectionnées :

- T5A-74Del294 : E294del/N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y

- T5A-74H: V264E/N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y

mais aussi :

- C6A-74Del294 : 259l/del294/315D/434Y

1 - Production des variants IgG dans les cellules HEK

La séquence de fragment Fc SEQ ID NO : 1 a été clonée dans un vecteur d'expression eucaryote générique dérivé de pCEP4 (Invitrogen) et contenant la chaîne lourde d'un anticorps chimérique anti-CD20 selon des protocoles de PCR standard. La chaîne légère de cet anticorps a été insérée dans un vecteur dérivé de pCEP4 semblable. Toutes les mutations d'intérêt dans le fragment Fc ont été insérées dans le vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-CD20 par PCR de chevauchement. Par exemple, le variant Del294 a été obtenu en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la délétion en position 294 sur la chaîne lourde contenue dans le vecteur d'expression.

Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gels d'agarose 1 % (w/ v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression de la chaîne lourde anti-CD20.

Les cellules HEK 293 ont été cotransfectées avec les vecteurs d'expression de la chaîne légère et de la chaîne lourde de l'IgG anti-CD20 en des quantités équimolaires selon des protocoles standard (Invitrogen). Les cellules ont été cultivées de manière à produire les anticorps de manière transitoire. Les anticorps produits ont pu être isolés et purifiés selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.

2- Production des variants IgG dans les cellules YB2/0

Les variants Fc ont été préparés dans un format IgG entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-CD20. Pour cela, la chaîne lourde et légère des IgG ont été clonées dans un vecteur bicistronique HKCD20 optimisé pour la production dans YB2/0. La production a été réalisée dans des pools stables de cellules YB2/0.

Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.

Les polypeptides suivants ont été développés (Anti-CD20 IgG variants) :

Nom Mutations

Anti-CD20 C6A-66 E294del/T307P/N434Y

Anti-CD20 Del294 Del294

Anti-CD20 T5A-74 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y

Anti-CD20 T5A-74Del294 E294del/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y

Anti-CD20 T5A-74H V264E/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y

Anti-CD20 WT / Le variant T5A-74H diffère du variant parent T5A-74 par la mutation V264E. Le mutant T5A-74Del294 diffère du variant parent T5A-74 par la délétion de l'acide aminé en position 294.

Le mutant C6A-74Del294 diffère du variant parent C6A-74 par la délétion de l'acide aminé en position 294.

Exemple 2 : Analyse de la demi-vie des IqG selon l'invention

Des expériences de pharmacocinétique ont ainsi été effectuées chez la souris hFcRn qui sont homozygotes KO pour un allèle du FcRn murin et hétérozygote pour un transgène de FcRn humain (m FcRn hFcRnTg). Pour ces études pharmacocinétiques, chaque animal a reçu une seule injection intraveineuse d ^' IgG à 5 mg / kg au niveau du sinus rétro-orbital, dans un protocole similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human lgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006).

Généralement la demi-vie est calculée à partir des concentrations plasmatiques mesurées durant la phase d'élimination.

Le temps de demi-vie peut être ainsi obtenu :

- par résolution d'équation:

T1/2 = (Ln2 x Vd) / CL, avec

Vd = volume de distribution = Dose / concentration plasmatique initiale

CL = Clairance = Dose / AUC (aire sous la courbe)

- par analyse graphique en déterminant sur l'axe des ordonnées (concentration en μg ml) l'intervalle de temps écoulé entre la concentration C1 et la concentration C2. Il est impératif de tracer cette courbe en échelle semi-logarithmique afin de s'assurer de l'alignement des points expérimentaux dans cette dernière phase dite d'élimination. La durée d'exploration de cette pente doit être suffisamment longue pour permettre une estimation précise de la demi-vie.

Une fois la pente de la phase d'élimination mesurée (k _e ou constante d'élimination), la demi-vie peut être calculée comme suit :

T1/2 = Ln2 / k _e = 0.693 / k _e

Par ailleurs, le MRT ou le temps moyen de résidence peut être estimé. Il traduit la durée de présence du polypeptide Fc dans l'organisme.

Le MRT peut être obtenu comme suit :

MRT = AUC / AUMC, avec

AUC = moment d'ordre 0 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps

AUMC = moment d'ordre 1 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps.

Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrées par ELISA. Résultats :

Variants T5A-74 :

Dans cet essai, les deux IgG T5A-74 et Del294 ont montré une augmentation de la demi-vie (Figure 2). De façon avantageuse, la combinaison des mutations T5A-74 et Del 294 d'une part, et T5A-74 et V264E, a permis d'observer un effet synergique sur l'augmentation de la demi-vie des IgG T5A-74Del294 et T5A-74H.

Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :

T l/2 Cmax AUCinf Vd Cl MRT mAb_ID

(h) (Mg/mL) (h* g/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h) anti-CD20 WT (YB2/0) 34.2 72.2 1478 167 3.38 17.7 anti-CD20 DEL294 (YB2/0) 54.4 75.3 1471 267 3.40 15.0 anti-CD20 C6A66 (YB2/0) 74.2 79.0 4261 126 1.17 83.1 anti-CD20 T5A74 (YB2/0) 64.1 76.9 3118 148 1.60 64.7 anti-CD20 T5A74H (YB2/0) 178 85.7 10234 126 0.489 228 anti-CD20 T5A74DEL294 (YB2/0) 154 81.9 7755 143 0.645 191 Les paramètres analysés sont définis ci-dessous :

T1/2 : demi-vie

Cmax: concentration maximale obtenu à un temps donné, correspondant au temps de concentration plasmatique maximale (Tmax)

AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de T0 à l'infini

Vd : Volume de distribution

Cl : Clairance

MRT: temps moyen de résidence Variants C6A-74 :

L'IgG C6A-74Del294 montre également une augmentation de la demi-vie. De façon avantageuse, la combinaison des mutations C6A-74 et Del 294 a permis d'observer une augmentation de la demi-vie. Les résultats sont illustrés dans la figure 3, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Les paramètres analysés sont définis ci-dessous :

T1/2 : demi-vie

Cmax: concentration maximale obtenu à un temps donné, correspondant au temps de concentration plasmatique maximale (Tmax)

AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de T0 à l'infini

Vd : Volume de distribution

Cl : Clairance

MRT: temps moyen de résidence Exemple 3 : Analyse de l'impact de la sialylation des IqG selon l'invention Les mêmes paramètres pharmacocinétiques que ceux étudiés dans l'exemple 2 ont été étudiés pour les IgG Del294, T5A_74, T5A_74Del294 et T5A_74Del294 désialylée, selon le même procédé que celui décrit en exemple 2.

5 Les IgG T5A_74Del294 désialylées sont préparées comme suit :

4mg d'échantillons à désialyler ont été incubés avec 160 μ\- de Sialidase A (tel que GK80040 de Prozyme) pendant 24h à 37°C. Les échantillons ont ensuite été purifiés sur protéine A, dialysés en PBS et concentrés sur Vivaspin 30kDa et filtrés stérilement.

10 Variants T5A-74 :

Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 4, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Ces résultats montrent qu'une mutation augmentant la sialylation telle que Del294 (voir

15 l'exemple 6) confère une bonne demi-vie.

La seule mutation Del294 augmente la demi-vie, mais pas la MRT par rapport au WT. En revanche, la demi-vie et la MRT sont toutes deux augmentées avec le variant T5A_74Del294 (par rapport à Del294, mais aussi à WT). Notamment la demi-vie de T5A_74Del294 est très fortement augmentée, par rapport à celle du mutant Del294 ou

20 du mutant T5A-74.

Enfin, la demi-vie et la MRT sont diminuées avec le variant T5A_74Del294 désialylé par rapport au variant T5A_74Del294, ce qui confirme l'impact de la sialylation.

Exemple 4 : Liaison sur cellules hFcRn

25

La liaison au récepteur FcRn a été étudiée par un test de compétition utilisant le Rituxan marqué au A488 et des cellules Jurkat exprimant stablement le FcRn humain (hFcRn) en surface (Jurkat-FcRn). Les cellules Jurkat-FcRn ont été incubées 20 minutes à 4°C avec des concentrations variables (500; 250; 125; 62; 31 ; 15; 8; 4; 2; 0 μg/ml) d'anticorps Del294, T5A_74, T5A_74Del294, T5A_74Del294 désialylée, C6A_74, C6A_74Del294 et C6A_74Del294 désialylée, dilués dans du PBS à pH6, simultanément avec Rituxan-A488 utilisé à une concentration fixe.

Après lavage, la fixation de Rituxan-A488 au FcRn exprimé par les cellules Jurkat- FcRn a été évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyenne (MFI) observes sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan- A488 seul et 0% la valeur obtenue en l'absence de Rituxan-A488.

Variants T5A-74 :

Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 5, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Variants C6A-74 :

Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 6, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Ces résultats montrent une faible diminution de la liaison à hFcRn induite par l'ajout de la mutation Del294. Ces variations restent très faibles, comparées aux augmentations obtenues par les mutations propres à T5A_74 (i.e. N315D, A330V, N361 D, A378V et N434Y) et à C6A_74 (i.e. 259I, 315D et 434Y), et sont inverses à ce qui est observé in vivo.

Dans tous les cas, ces tests montrent une liaison équivalente ou faiblement diminuée à hFcRn, et aucune augmentation significative de la liaison à hFcRn. Exemple 5 : Liaisons sur cellules CD20

Les cellules Raji exprimant CD20 et les anticorps Del294, T5A_74, T5A_74Del294, T5A_74Del294 désialylée, C6A_74, C6A_74Del294 et C6A_74Del294 désialylée ont été dilués dans du PBS avec 1 % FCS.

1 x 10 ⁵ cellules ont été incubées avec 100 μΙ d'anticorps (variants anti-CD20 Del294, T5A_74, T5A_74Del294, T5A_74Del294 désialylée, C6A_74, C6A_74Del294, C6A_74Del294 désialylée, ou contrôle négatif) à différentes concentrations finales (0 ; 0.1 ; 0.5; 1 ; 2 ; 10 μg/ml) à 4°C sur glace pendant 20 minutes.

Après lavage par le diluant, les anticorps ont été visualisés avec un F(ab')2 de chèvre anti-fragment Fc d'IgG humain, couplé à la phycoérythrine (par exemple, Ref : Jackson 109-1 16-098 lot 122690, 100 μΙ of a dilution of 1 :100 in diluant) à 4°C sur glace pendant 20 minutes. Les cellules ont été lavées et l'intensité moyenne de fluorescence a été évaluée avec un cytomètre en flux (FC500, Beckman Coulter). Les valeurs arbitraires de Kd ont été calculées en utilisant le logiciel PRISM.

Variants T5A-74 :

Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 7, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Variants C6A-74 :

Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 8, et sont résumés dans le tableau ci- dessous:

Les résultats montrent une bonne liaison à CD20, quels que soient les variants.

Les mutations, seules ou en combinaison, n'impactent pas la liaison de l'anticorps muté à son antigène. Il n'y a donc pas d'impact sur l'efficacité in vivo dépendant de la liaison antigénique.

Exemple 6 : Etude de la sialylation par HPCE-Lif des variants T5A 74Del294 et

T5A 74H

Les polypeptides suivants produits dans YB2/0 (obtenus à l'exemple 1 .2) ont été analysés :

Mode opératoire : préparation de l'échantillon

1 Dessalage et N-déglycosylation

Dans un premier temps, l'échantillon à analyser a été dessalé selon des protocoles standards de façon à éliminer tous les glucides réducteurs libres potentiellement présents ainsi que les substances susceptibles d'interférer durant les étapes ultérieures (sels et excipients). Après dessalage, l'échantillon a été séché puis les glycannes ont été libérés par l'action enzymatique de la N-Glycannase en conditions dénaturante et réductrice, afin de maximiser le rendement de N-déglycosylation. Pour la N-déglycosylation des Ig, l'échantillon sec a été repris par 45 μ\- de la solution de digestion PNGase F diluée au 1 /5. 1 ,5 μ\- d'une solution de β-mercaptoéthanol 10 % (v/v) dans l'eau ultra-pure a été ajouté avant agitation et incubation 15 minutes à température ambiante. Ensuite, 1 μ\- de la solution de PNGase F (2.5 ηιΙΙ/μί) a été ajoutée avant agitation et incubation au bain-marie à 37° C durant 12 à 18 heures. Puis les glycannes ont été séparés des protéines déglycosylées par précipitation à l'EtOH froid.

L'extrait glycannique obtenu a alors été reparti en 4 fractions avant d'être traité par des exoglycosidases. Chaque N sous-fraction alcoolique séchée, renfermant l'équivalent de 100 μ9 de glycoprotéine, a été respectivement digérée (1 ) par les oc-sialidase, β-galactosidase et N-acétyl-3-hexosaminidase, afin de déterminer le taux de fucosylation ; (2) par les oc- sialidase, β-galactosidase et oc-fucosidase, pour le calcul du taux de GIcNAc intercalaire; et (3) par les oc-sialidase et oc-fucosidase, pour déterminer l'indice de galactosylation.

Ces déglycosylations ont été effectuées à 37°C pendant 12 à 18 heures.

L'isolement des produits de dégradations exoglycosidasiques a été réalisé par extraction alcoolique à froid par ajout de 60 μΙ_ (3 volumes) d'éthanol absolu équilibré à - 20°C, avant agitation puis incubation à - 20°C durant 15 minutes. Une centrifugation à 10000 rpm a été réalisée pendant 10 minutes à + 4°C, et le surnageant a été immédiatement transféré dans un microtube de 0.5 ml_ avant d'être séché sous vide. Les oligosaccharides obtenus ont ensuite été marqués par un fluorochrome, l'APTS, puis séparés et quantifiés en HPCE-LIF.

2 Exploitation des résultats

L'identification des pics de N-glycannes est réalisée à l'aide d'un étalon glycoprotéinique de référence dont la N-glycosylation est parfaitement connue, par comparaison des temps de migration de ses N-glycannes avec ceux des espèces observées sur les profils électrophorétiques des échantillons à analyser. De plus, les temps de migration des oligosaccharides étalons sont convertis en unités de glucose (GUs) après analyse d'un mélange hétérogène d'un homopolymère de glucose (Glc ladder). Ces valeurs de GUs seront ensuite comparées à celles de quelques oligosaccharides standards de GUs connues, et permettront d'augmenter l'indice de confiance des identifications.

L'identification des pics de N-glycannes obtenus sur les différents profils électrophorétiques, permet d'identifier un profil glycanique complet, et notamment d'évaluer le pourcentage de formes sialylées.

Les résultats sont les suivants :

Anti-CD20 WT

La majorité des structures sont des formes courtes afucosylées (G0+G1 = 74,7%). Le taux de sialylation observé est très faible (1 ,81 % d'acides sialiques). Anti-CD20 Del294 :

Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.

87.98% des structures semblent sialylées. A2 11.9

Ai

Al F

GO 0.84

GOB 0.96

G1(1.6)+G0F 0.53

Gl(1.3) + 60BF 0.19

G1{1.6)B 2.44

G1(1.6)F 0.14

G2 + G if 1.3) F 2.09

G2S 0.51

GIF 0.16

G2FB

Structures sialylées non identifiées 49.18

%tage de structures sialylées : S7.fi

%tage de fucosy fat fort ; 48,24

Anti-CD20 T5A-74Del294 :

Les électrophorégrammes des structures natives et désialylées de l'échantillon testé montrent que 96,5% des structures sont sialylées.

Anti-CD20 T5A-74H :

Les électrophorégrammes des structures natives et désialylées de l'échantillon testé montrent que 100% des structures présentent au moins un résidu d'acide sialique.

En conclusion, la molécule WT YB2/0 présente un profil de glycosylation classique dans YB2/0, avec un profil de sialylation bas.

Les molécules T5A-74H et T5A_74Del294 présentent des profils très similaires : ils comportent essentiellement des structures sialylées.

La forte sialylation observée pour la délétion Del294 seule ou pour la mutation V264E seule (non montrée) n'est pas impactée lorsque ces mutations uniques sont combinées avec celles d'un mutant tel que T5A-74.