NIEDRIGER GELÖSTSAUERSTOFFKONZENTRATION

Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren umfassend eine Kultivierung von Zellen unter niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration. Stand der Technik

Bei der fermentativen Herstellung von Produkten ist man stets bemüht, die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten möglichst zu vermeiden oder auf ein Minimum zu reduzieren. In der Regel kann man so die Produktausbeute erhöhen und auch die Aufreinigung des Endproduktes erleichtern.

Zellen, die als Kohlenstoffquelle anorganischen Kohlenstoff verwenden, um organische Moleküle zu synthetisieren sind insbesondere in Form von Knallgasbakterien bekannt. Organismen, die Polyhydroxyalkanoat produzieren, benutzen als Vorstufe 3- Hydroxyalkanyl-CoA. Dieses Stoffwechselprodukt kann als hervorragende

Ausgangssubstanz dienen, um insbesondere auch durch künstlich eingefügte

Stoffwechselwege zu weiteren, hochwertigen organischen Substanzen verstoffwechselt zu werden.

Insbesondere das Polyhydroxybutyrat produzierende Knallgasbakterium Cupriavidus necator wurde in den letzten Jahren ausführlich charakterisiert und untersucht.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, welches die

Nebenproduktbildung in Fermentationsverfahren reduziert und somit die Ausbeute an Monomereinheiten der in der Biosynthese verminderten Polyhydroxyalkanoats erhöht. Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die der Erfindung gestellte Aufgabe zu lösen vermag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren umfassend eine

Kultivierung von Knallgasbakterien unter niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration.

Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent. Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass durch das limitierte Angebot an Sauerstoff ein Überschussmetabolismus des Mikroorganismus unterbunden wird, bei dem es zur Bildung von unerwünschten Nebenprodukten kommt. Somit für die vorliegenden

Erfindung zu einer Erhöhung der Kohlenstoffselektivität.

Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass durch die verringerte

Nebenproduktbildung die Aufreinigung in Verfahrensschritt C vereinfacht und somit kostengünstiger wird.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass hierfür nur ein geringer Anteil an Sauerstoff im H ₂ -haltigen Substratgas notwendig ist. Somit wird das Risiko der Bildung einer explosionsförmigen Atmosphäre im Inneren des Fermenters minimiert. Somit muss die Apparatur für das vorliegende Verfahren nicht für EX-geschützt ausgelegt sein, wodurch sich beim Bau einer Produktionsanlage deutlich Kosten einsparen lassen.

Gegenstand ist somit ein Verfahren zur Kultivierung von Knallgasbakterien in einem Medium umfassend einen Verfahrensschritt, in dem das Medium mit einem Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine

Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L aufweist.

Unter dem Begriff„Knallgasbakterium" ist ein Bakterium zu verstehen, das in der Lage ist chemolithoautotroph zu wachsen und aus H ₂ und C0 ₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Es können erfindungsgemäß sowohl solche Bakterien eingesetzt werden, die von Natur aus

Knallgasbakterien darstellen, oder aber auch Bakterien, welche durch gentechnische Modifikation zu Knallgasbakterien wurden, wie beispielsweise eine E. coli Zelle, die durch rekombinantes Einfügen der notwendigen Enzyme in die Lage versetzt wurde, aus H ₂ und C0 ₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler

Elektronenakzeptor benutzt wird. Bevorzugt handelt es sich bei den im

erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien um solche, welche bereits als Wildtyp Knallgasbakterien darstellen.

Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Knallgasbakterien sind ausgewählt aus den Gattungen Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena,

Ancyclobacter, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum,

Hydrogenophaga,, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. 01, Kyrpidia, Metallosphaera, Mycobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Seliberia, Streptomyces, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist,

besonders aus den Spezies Cupriavidus necator (alias Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus,

Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Ancyclobacter vacuolatus, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus. , Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Hydrogenophaga

taeniospirales, Hydrogeneophilus thermoluteolus, Hydrogenothermus marinus,

Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. 0-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Myobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans,

Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Thiocapsa roseopersicina, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus,

Xanthobacter flavus, wobei Cupriavidus necator besonders bevorzugt ist, insbesondere aus den Stämmen Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator H1 oder Cupriavidus necator Z-1.

Besonders bevorzugt wird der Stamm Cupriavidus necator H 16 PHB-4, DSM 541 eingesetzt. Geeignete Verfahren zur Messung der Gelöstsauerstoffkonzentration sind beispielsweise in Suresh et al. (2009) Techniques for oxygen transfer measurement in bioreactors: a review, J Chem Technol Biotechnol, 84, S. 1091 -1103 beschrieben.

Insbesondere wird die Gelöstsauerstoffkonzentration durch Messung mit einer amperometrischen Gelöstsauerstoffsonde nach dem Clark-Prinzip eingesetzt. Diese Sonde wird unter Prozessbedingungen bei der eingesetzten Sauerstoffkonzentration im Gas auf 100% p0 ₂ und unter Stickstoff auf 0% 0 ₂ kalibriert. Die gemessenen p0 ₂ -Werte sind direkt proportional zur jeweiligen Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium. Die gemessenen p0 ₂ -Werte werden über die entsprechende Henry-Konstante in die jeweilige Gelöstsauerstoffkonzentration umgerechnet. Henry-Konstanten für Gelöstgase finden sich in Wilhelm et al. (1977) Low-pressure solubility of gases in liquid water (77), S. 219-262.

Die Menge an gelöstem Sauerstoff in einem wässrigen Medium ist abhängig von vielen Faktoren, wie beispielsweise Druck, Temperatur und Sauerstoffkonzentration des an das Medium angrenzenden Gases.

Der Fachmann kann somit durch gezielte Veränderung dieser Parameter direkten Einfluss auf die Gelöstsauerstoffkonzentration nehmen.

In einem Fermenter lässt sich die Gelöstsauerstoffkonzentration beispielsweise durch die Fermentergeometrie, die Art des Rührwerkes, die Rührerdrehzahl und die Art des Sauerstoffeintrages regulieren.

Die Gelöstsauerstoffkonzentration lässt sich durch den Einsatz beispielsweise oben genannter Sonden in Echtzeit verfolgen.

Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium, derart gentechnisch verändert wurde, dass es verglichen zu seinem

Wildtyp eine verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese aufweist.

Unter einem„Wldtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der

Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff„Wldtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter

Verfahren verändert worden sind.

Unter dem Begriff„verglichen zum Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass die betrachteten Zellen, wenn unter gleichen Bedingungen kultiviert wie der Wildtyp, weniger

Polyhdroxyalkanoat pro Zellen bilden als der Wildtyp. Die erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzten Knallgasbakterien weisen aufgrund von mindestens einer gentechnischen Veränderung eine verglichen zu ihrem Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese auf. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Knallgasbakterien keine nachweisbaren Mengen an Polyhydroxyalkanoat synthetisieren. Bevorzugt ist das Polyhydroxyalkanoat, dessen Synthese vermindert ist, Polyhydroxybutyrat.

Die verglichen zum Wldtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese lässt sich bevorzugt durch eine gentechnische Veränderung erreichen, so dass die verglichen zum Wldtyp der Zelle verminderte Aktivität mindestens eines Enzyms, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu Polyhydroxyalkanoat, bevorzugt von 3- Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Polyhydroxybutyrat katalysiert.

Unter der verwendeten Formulierung„verminderte Aktivität eines Enzyms" wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0, 1 , darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01 , darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Formulierung„verminderte Aktivität" beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität („Aktivität von null"). Die

Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen.

Verfahren zur Verminderung von enzymatischen Aktivitäten in Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, diese umfassen Insertion von Fremd-DNA in das Gen kodierend für das Zielenzym, Deletion mindestens von Teilen des Gens kodierend für das Zielenzym, Punktmutationen in der Gensequenz kodierend für das Zielenzym, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-R A oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, wie etwa Promotoren und Terminatoren oder von

Ribosomenbindestellen, welche das Gen kodierend für das Zielenzym flankieren. Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehen, die dem Gen (und nicht dem Organismus)„fremd" ist, d.h. auch endogene DNA-Sequenzen können in diesem Zusammenhang als„Fremd-DNA" fungieren.

Bei dem Enzym, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu

Polyhydroxyalkanoat handelt es sich vorzugsweise um eine Polyhydroxyalkanoat Synthase, besonders bevorzugt um eine Polyhydroxybutyrat Synthase. Dieses Enzym wird insbesondere vorzugsweise von den Genen phbC oder phaC kodiert, wobei phaC besonders bevorzugt ist. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Medium mit einem Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ in Kontakt gebracht.

Hierdurch wird dem Knallgasbakterium das H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltende Gas als

Kohlenstoffquelle bereitgestellt. Das Knallgasbakterium synthetisiert mindestens teilweise aus dieser Kohlenstoffquelle Acetoacetyl-CoA, welches zu weiteren organischen

Verbindungen verstoffwechselt werden kann. Anders als in einem acetogenen

Verfahrensprozess, der unter streng anaeroben Bedingungen stattfindet, wird der hier beschriebene Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

Bevorzugt beträgt der Partialdruck des Wasserstoffes in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂

enthaltenden Gas 0, 1 bis 100 bar, bevorzugt 0,2 bis 10 bar, besonders bevorzugt 0,5 bis 4 bar.

Der Partialdruck des Kohlendioxids in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,03 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 bar, insbesondere 0,05 bis 0,3 bar

Der Partialdruck des Sauerstoffs in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,04 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,04 bis 1 bar, insbesondere 0,04 bis 0,5 bar Als Quelle für das H ₂ und C0 ₂ ist insbesondere Synthesegas geeignet, welches mit Sauerstoff versetzt eingesetzt wird; daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ Synthesegas enthält.

Synthesegas kann z. B. aus dem Nebenprodukt der Kohlevergasung bereitgestellt werden. Das Knallgasbakterium wandelt folglich eine Substanz, die ein Abfallprodukt ist, in einen wertvollen Rohstoff um.

Alternativ kann Synthesegas durch die Vergasung von weit verfügbaren, preiswerten landwirtschaftlichen Rohstoffen für das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt werden. Es gibt zahlreiche Beispiele an Rohstoffen, die in Synthesegas umgewandelt werden können, da fast alle Vegetationsformen zu diesem Zwecke genutzt werden können. Bevorzugte Rohstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend

perennierende Gräser wie Chinaschilf, Getreiderückstände, Verarbeitungsabfälle wie Sägemehl. Im Allgemeinen wird Synthesegas in einer Vergasungsapparatur aus getrockneter Biomasse gewonnen, hauptsächlich durch Pyrolyse, partielle Oxidation und Dampfreformierung, wobei die Primärprodukte CO, H ₂ und C0 ₂ sind.

Normalerweise wird ein Teil des Produktgases aufbereitet, um Produkterträge zu optimieren und Teerbildung zu vermeiden. Das Cracken des unerwünschten Teers in Synthesegas und CO kann unter Einsatz von Kalk und/oder Dolomit durchgeführt werden. Diese Prozesse werden im Detail in z. B. Reed, 1981 beschrieben (Reed, T.B., 1981 , Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.) Es können auch Mischungen verschiedener Quellen zur Generierung von

Synthesegas eingesetzt werden.

Insbesondere ist es bevorzugt, dass der im Synthesegas enthaltene Kohlenstoff mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% des Kohlenstoffs aller Kohlenstoffquellen, die dem

Knallgasbakterium durch das Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ zur Verfügung stehen, ausmacht, wobei sich die Gewichtsprozente des Kohlestoffs auf die Kohlenstoffatome beziehen. Die restlichen Kohlenstoffquellen können beispielsweise in Form von

Kohlenhydraten im wässrigen Medium enthalten sein oder aber auch C0 ₂ aus einer anderen Quelle als Synthesegas darstellen.

Weitere C0 ₂ -Quellen stellen Abgase wie beispielsweise Rauchgas, Erdölraffinerieabgase, durch Hefegärung oder clostridielle Gärung entstandene Gase, Abgase aus der

Vergasung zellulosehaltige Materialien oder der Kohlevergasung dar.

Diese Abgase müssen nicht notwendigerweise als Nebenerscheinungen anderer

Prozesse entstanden sein, sondern können extra für den Einsatz in dem

erfindungsgemäßen Verfahren produziert werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch insbesondere Generatorgas eingesetzt werden, so dass das Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ Generatorgas enthält

Zum Erreichen einer hohen Zelldichte in einem kurzen Zeitraum kann es

erfindungsgemäß vorteilhaft sein, wenn man zunächst eine größere Menge an

Knallgasbakterien mit Hilfe einer Vorkultur anzieht. Somit ist eine bevorzugte

Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch gekennzeichnet, dass es die Verfahrensschritte umfasst

A) Vermehren von Knallgasbakterien in einem Medium bis zu einer Zelldichte X Zellen/Liter und

B) Kultivierung der Knallgasbakterien in einem Medium, wobei das Medium mit einem Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine

Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L aufweist.

In diesem Fall entspricht Verfahrensschritt B) dem eingangs erläuterten Verfahrensschritt, in dem das Medium mit einem Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L aufweist.

In Verfahrensschritt A) kann erfindungsgemäß jegliche Form von Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, also auch beispielweise Zucker. Auch die niedrige

Gelöstsauerstoffkonzentration ist in Verfahrensschritt A) nicht zwingend vorgeschrieben, erfindungsgemäß bevorzugt ist es gar, die Zellen bezüglich jeglichen Nährstoffes nicht zu limitieren.

Die Zelldichte X in Verfahrensschritt A beträgt bevorzugt mindestens 1x10 ⁵ , besonders bevorzugt mindestens 1x10 ⁷ , insbesondere mindestens 1x10 ⁸ Zellen/ml Gesamtkultur. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in

Verfahrensschritt B) die Zelldichte 2 X Zellen/ml, insbesondere 1 ,5 X Zellen/ml, besonders bevorzugt 1 ,2 X Zellen/ml nicht übersteigt. Verfahrensschritt B) wird vorteilhaft und somit bevorzugt mindestens über einen

Teilzeitbereich hinweg zur Produktproduktion genutzt.

Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukt ist bevorzugt ausgewählt aus Substanzen umfassend drei oder vier Kohlenstoffatome, insbesondere Butanol, Buten, Propen, Aceton, 2-Hydroxyisobuttersäure und 2-Propanol.

Alternativ bevorzugte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukte sind ausgewählt aus Substanzen, dessen Bildung über das Zwischenprodukt Acetyl- Coenzym A erfolgt; solche Zielprodukte sind beispielsweise Fettsäuren, Fettsäureester, Fettalkohole, Fettaldehyde sowie substituierte Derivate der vorgenannten Verbindungen, wobei als Substitutionsreste insbesondere Amino-, Hydroxyl- und Keto-Gruppen in Frage kommen, bevorzugt ist in diesem Zusammenhang eine omega-Substitution, insbesondere einer Aminogruppe.

Weitere alternativ bevorzugte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukte sind ausgewählt aus Substanzen, dessen Bildung über Metabolite des Zitronensäurezyklus, wie z. B. Succinat erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Verfahrensschritt B) durch die Knallgasbakterien Zielprodukte synthetisiert, dessen Bildung über das Zwischenprodukt 3-Hydroxyalkanyl-CoA, insbesondere

3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, erfolgt.

Der Begriff„Zwischenprodukt" definiert in diesem Zusammenhang eine chemische Verbindung, die durch den Einsatz mindestens eines Enzymes auf enzymatischem Weg zu dem gewünschten Produkt umgesetzt werden kann, wobei als„chemische Verbindung" solche mit oder ohne Coenzym A-Thioester-Funktionalisierung als gleichwertig betrachtet werden sollen und somit die Thioester bildenden bzw. -spaltenden Enzyme nicht mitgezählt werden. Es kann vorteilhaft sein, wenn die Knallgasbakterien entsprechend des gewünschten Zielproduktes durch genetische Modifikation derart verändert wurden, dass das

Zielprodukt verstärkt durch die Knallgasbakterien gebildet wird.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes Zielprodukt 2- Hydroxyisobuttersäure. Für dieses Zielprodukt ist es bevorzugt, wenn die im

erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Knallgasbakterien derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität des Enzyms Ei aufweisen, welches die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert. Bei dem Enzym Ei handelt es sich

vorzugsweise um eine Hydroxyl-lsobutyryl-CoA Mutase, um eine Isobutyryl-CoA Mutase (EC 5.4.99.13) oder um eine Methylmalonyl-CoA Mutase (EC 5.4.99.2), jeweils bevorzugt um eine Coenzym B12-abhängige Mutase.

Bei dem Enzym Ei handelt es sich bevorzugt um solche Enzyme, die sich aus den Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM 18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM 1 , Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893,

Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen, besonders bevorzugt um die in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Coenzym B12-abhängigen Mutase, sowie Enzyme, die in mindestens einer ihrer

Teilsequenz eine Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz der kleinen bzw. großen Untereinheit der in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Mutase (accession number

DQ436457.1 und DQ436456.1 ) von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 99% auf Aminosäureebene aufweisen, bestimmt nach dem blastp Algorithmus mit einem expect threshold von 10, einer word size von 3, einer blosum62 Matrix mit gap costs von existence: 1 1 und extension: 1 und einem conditional compositional score matrix adjustment.

Der Begriff„gesteigerte Aktivität eines Enzyms", wie er vorstehend im Zusammenhang mit dem Enzym Ei und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit den Enzymen E ₂ usw. verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen. Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.

Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und

gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Insbesondere wird somit das für das Enzym E _x kodierende Gen überexpremiert, was zu einer gesteigerten Aktivität durch Überexpresssion führt. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.

Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur

Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.

Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1 - und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1 - oder 2- dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wldtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001 ) beschriebene Vorgehensweise. Die

Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al. , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39;

Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 11 : 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als

Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of

Bacteriology, 183: 2151-2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach

verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284;

Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 1 11 : 2630-2647 (1999) und Wlson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151 -2155 (2001) beschriebenen Methoden.

Wrd die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens

bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch

mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wldtyp-Enzym vermindert feedback-inhibierbar sind.

Wrd die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Synthese eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken

Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische

Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte

Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine

Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in EP-A-0 472 869, im US 4,601 ,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of

Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A-96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.

Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-Ill, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.

Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E _x " ist

vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E _x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche„eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E _x " aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wldtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E _x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E _x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wldtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Synthese des Enzyms E _x induziert wird.

Es kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine verglichen zu ihrem Wldtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₂ , welches die

Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert, aufweisen.

Bei dem Enzym E ₂ handelt es sich vorzugsweise um ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:

eine 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase (EC 1.1.1.35),

eine Acetoacetyl-Coenzym A Reduktase (EC 1.1.1.36),

eine Long-Chain-3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase ((EC 1.1.1.21 1) und

eine 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157).

Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phaB, phbB, fabG, phbN1 , phbB2 oder, wobei phaB, phbB besonders bevorzugt sind. Die Nukleotidsequenz dieser Gene können beispielsweise der„Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-Datenbank), den Datenbanken des

National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren weist bevorzugt einen Verfahrensschritt C)

Aufreinigung des Zielproduktes auf.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten

Ausführungsformen beschränkt sein soll.

Beispiele: Beispiel 1 Autotrophe Kultivierung von C. necator bei unterschiedlichen Rührerdrehzahlen im Rührkesselreaktor

Im folgenden Beispiel wird der gentechnisch veränderte Stamm

C. necator H16 PHB-4 pBBR1 MCS-2::hcmA-hcmB(lac) (im Folgenden RITA genannt), der zur Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) eingesetzt wird, autotroph kultiviert.

Es wurde ein definiertes Medium eingesetzt, bestehend aus 9 g/l Na ₂ HP0 ₄ x 12 H ₂ 0, 1 ,5 g/l KH ₂ P0 ₄ ,1 g/l NH ₄ CI,0,2 g/l MgS0 ₄ , 0,2 g/l CaCI ₂ , 6 mg/l FeCI ₃ , 0,1 mg/l ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,03 mg/l MnCI ₂ x 4 H ₂ 0, 0,3 mg/l H ₃ B0 ₃ , 0,2 mg/l CoCI ₂ x 6 H20, 0,01 mg/l CuCI ₂ x 2 H ₂ 0, 0,02 mg/l NiCI ₂ x 6 H ₂ 0 und 0,03 mg/l Na ₂ M04 x 2 H ₂ 0.

Es wurden zwei identische autotrophe Kultivierungen in Biostat B 2L-Rührkeselreaktoren von Sartorius gefüllt mit 1 L Medium durchgeführt, einmal bei 1000 min ^"1 und einmal ohne Rühren. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch einen Begasungsfritte mit einer Porengröße von 20 μηι, die zentral unter der Rührwelle der Reaktoren angebracht war. Die Kultivierungen erfolgten bei 28 °C ohne Kontrolle des pH.

Begast wurden die Reaktoren mit einem vorgemischtem, nicht-explosiven Gasgemisch der Zusammensetzung H ₂ 90 %, C0 ₂ 6 %, 0 ₂ 4 % bei Atmosphärendruck mit einer Begasungsrate von 0,25 vvm.

Bei Versuchsstart wurde der Reaktor mit 2 Kolonien von einer Agarplatte (300 mg/L Kanamycin) angeimpft. Bei Probenahme wurden jeweils 10 ml Probe entnommen zur Bestimmungvon OD ₆ oo, Biotrockenmasse und des Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgte mittels quantitativer ¹ H-NMR-Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard diente Trimethylpropionsäure.

Es wurde festgestellt, dass in der Kultivierung ohne Rühren die Geschwindigkeit des

Wachstums deutlich reduziert war gegenüber der Kultivierung mit 1000 min ^"1 . Im Vergleich wurde jedoch keine Bildung der Nebenprodukte Acetat, Pyruvat, 3-Methyl-Butyrat und iso- Butyrat festgestellt.

Versuch 1 (ohne Rüh Produktbildung

NMR-Analytik

3-

OD Methyl-

Gelöst-0 ₂ , (600 BTM, 3HB, 2HIB, Acetat, Pyruvat, Butyrat, iso-Butyrat,

Zeit, h mg/L pH nm) g/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L

0,0 1,56 6,92 0,00 0,00 0 0 0 0 0 0

46,4 0,006 6,90 0,35 0,28 0 0,87 0 0 0 0

54,8 0,006 6,87 0,46 0 2,51 0 0 0 0

70,3 0,006 6,83 0,92 0,50 0 11,33 0 0 0 0

78,6 0,006 6,79 0,95 0 18,07 0 0 0 0

95,6 0,006 6,74 1,29 0,67 0 32,16 0 0 0 0

102,8 0,006 6,71 1,45 0 33,82 0 0 0 0

166,7 0,006 6,51 2,41 1,15 5,02 57,94 0 0 0 0

197,7 0,006 6,43 2,79 0 69,85 0 0 0 0

219,5 0,006 6,40 3,35 1,63 0 60,01 0 0 0 0

242,6 0,006 6,32 3,79 0 55,54 0 0 0 0

268,5 0,006 6,23 4,22 2,02 0 49,51 0 0 0 0

295,0 0,006 6,17 4,41 3,37 59,15 0 0 0 0

316,8 0,006 6,14 4,51 2,13 6,82 63,91 0 0 0 0

335,5 0,006 6,13 4,44 5,71 68,96 0 0 0 0

357,8 0,006 6,13 4,60 2,22 0 69,55 0 0 0 0 Versuch 2 (bei 1000 rpm gerührt) Produktbildung

NMR-Analytik

3-

OD Methyl-

Gelöst-0 ₂ , (600 BTM, 3HB, 2HIB, Acetat, Pyruvat, Butyrat, iso-Butyrat,

Zeit, h mg/L pH nm) g/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L

0,0 1,56 6,88 0,00 0,00 0 0 0 0 0 0

46,4 1,42 6,83 0,73 0,40 0 1,06 0 0 0 0

50,8 1,33 6,77 1,19 0 2,4 0 0 0 0

54,8 1,09 6,67 2,21 1,03 0 3,92 0 0 0 0

70,3 0,94 5,90 5,06 2,10 10,76 15,32 15,55 44,19 12,37 10,35

74,9 0,85 5,86 4,90 14,27 20,71 27,82 30,29 17,56 17,37

78,6 0,83 5,89 4,86 2,08 23,29 21,91 24,72 9,97 26,57 17,58

95,6 0,73 5,98 4,51 1,93 44,55 37,11 0 5,85 41,42 25,27

102,8 0,74 5,99 4,14 1,95 30,19 36,05 0 4,52 31,87 14,11