Fermentative Produktion von Isobutanol mit Hefe

Die Erfindung betrifft einen fermentativen Weg zur Produktion von Isobutanol aus Zuckern.

Isobutanol hat hervorragende Eigenschaften als Kraftstoff. Darüberhinaus ist es auch eine interessante Chemikalie z.B. als Basischemikalien für die Produktion anderer Chemikalien oder als Lösungsmittel. Isobutanol wird heutzutage vornehmlich petrochemisch aus fossilen Ressourcen hergestellt. Wesentlich zukunftsträchtiger wäre dagegen seine Herstellung aus erneuerbaren Ressourcen wie z.B. pflanzlichen Zuckern oder Pflanzenabfällen. Kürzlich wurden zwei mikrobielle, nicht- fermentative Verfahren vorgestellt, mit denen sich Isobutanol aus Zuckern herstellen lässt (Atsumi et al., 2008; Patentanmeldung US 2007/0092957) . In beiden Verfahren wurden Wirtszellen durch Einführung heterologer DNA dazu gebracht, aus dem Stoffwechselintermediat Pyruvat, welches durch den Abbau von Zuckern entsteht, Isobutanol und auch andere verzweigtkettige Alkohole zu produzieren. Beiden beschriebenen Verfahren ist jedoch gemein, dass sie nicht-fermentativ ablaufen, d.h. dass ihre Redoxbalancen beim Abbau der Zucker zum Isobutanol nicht ausgeglichen sind. Daher können sie nur in komplexen Medien, durch gleichzeitige Umsetzung von Cosubstraten, durch die Bildung von Nebenprodukten oder unter aeroben Bedingungen ablaufen. Das schränkt die Ausführbarkeit der Verfahren stark ein bzw. macht sie wirtschaftlich unattraktiv.

Ein Ausweg wäre die Entwicklung eines fermentativen mikrobiellen Prozesses, der in Minimalmedien, ohne Cosubstrate

und auch unter anaeroben oder Sauerstoff-limitierten Bedingungen ablaufen könnte. Dafür würden sich als Mikroorganismen insbesondere Hefen und dabei insbesondere solche der Gattung Saccharomyces wie z.B. Saccharomyces cerevisiae anbieten. Interessanterweise besitzen Hefen bereits alle Enzyme, die für die Bildung von Isobutanol aus Zuckern notwendig sind. Allerdings sind diese Enzyme in verschiedenen Kompartimenten der Hefezellen lokalisiert (Cytosol und Mitochondrien) , sie benutzen verschiedene Cofaktoren, die nicht oder nicht effektiv ineinander überführbar sind

(NADVNADH und NADP ⁺ /NADPH) und die Enzyme werden nur schwach oder unter speziellen Bedingungen exprimiert bzw. besitzen eine niedrige Enzymaktivität. Um eine effektive Produktion von Isobutanol aus Zuckern zu erreichen, müssten die vorhandenen Stoffwechselwege so modifiziert werden, das mit ihrer Hilfe redoxneutral und mit Energiegewinn in Form von ATP Isobutanol produziert werden könnte und das auch unter anaeroben oder Sauerstoff-limitierten Bedingungen. Die Entwicklung eines solchen fermentativen Weges zur Produktion von Isobutanol aus Zuckern ist Aufgabe und Ziel dieser Erfindung.

Zucker wie z.B. Glucose werden in Wirtszellen wie z.B. Hefen vornehmlich durch den Stoffwechselweg der Glykolyse zu Pyruvat abgebaut. Dabei entstehen aus einem Molekül Glucose zwei Moleküle Pyruvat. Zusätzlich entstehen dabei 2 energiereiche Verbindungen in Form von ATP und es werden 2 Moleküle NAD ⁺ zu NADH+H ⁺ reduziert. Pyruvat wird dann normalerweise entweder durch die Pyruvatdecarboxylasen und Alkoholdehydrogenasen zu Ethanol umgewandelt oder es wird in die Mitochondrien transportiert und dort durch die Pyruvatdehydrogenase in Acetyl-CoA umgewandelt und letztendlich in den

Zitronensäurezyklus eingeschleust. Pyruvat kann darüber hinaus auch noch in einigen anderen Reaktionen umgesetzt werden. Einer dieser Reaktionswege ist der Biosyntheseweg zur

Aminosäure Valin. Andererseits kann Valin aber auch abgebaut werden und zwar u.a. zum Produkt Isobutanol. Wenn es nun gelänge den Biosyntheseweg und den Abbauweg des Valins kurzzuschließen, dann ließe sich direkt aus Zuckern über das Pyruvat Isobutanol produzieren. Solch ein Stoffwechselweg kombiniert die Enzyme, die an der Biosynthese von Valin beteiligt sind (vom Pyruvat zum α-Ketoisovalerat ) mit denen, die am Valin-Abbau beteiligt sind (vom α-Ketoisovalerat zum Isobutanol) . Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt selber alle dazu benötigten Gene. Dabei kodiert ILV2 {YMR108W)

(SEQ. ID. Nr. 1) die Acetolactat Synthase, die zwei Pyruvat- Moleküle zum Acetolactat umwandelt. Das Ilv2-Enzym (SEQ. ID. Nr. 2) wird vom Ilv6-Protein (=YCL009C) (SEQ. ID. Nr. 4) aktiviert. ILV5 (YLR355C) (SEQ. ID. Nr. 5) kodiert die Acetohydroxysäure Reductoisomerase, die Acetolactat zum 2,3- Dihydroxyisovalerat umsetzt. ILV3 (YJROl 6C) (SEQ. ID. Nr. 7) kodiert die Dihydroxysäure Dehydratase, die 2,3- Dihydroxyisovalerat zum 2-Ketoisovalerat umsetzt. 2- Ketoisovalerat wird dann normalerweise zum Valin transaminiert ; durch die Transaminasen Batl (SEQ. ID. Nr. 10) und Bat2 (SEQ. ID. Nr. 12) . Umgeht oder reduziert man diese Reaktion, dann könnte 2-Ketoisovalerat aber auch durch verschiedene 2-Ketosäure Decarboxylasen zum Isobutyraldehyd umgesetzt werden, z.B. durch die Enzyme Pdcl (SEQ. ID. Nr. 14), Pdc5 (SEQ. ID. Nr. 16), Pdcβ (SEQ. ID. Nr. 18), ArolO (SEQ. ID.

Nr. 20), Thi3 (SEQ. ID. Nr. 22) (Dickinson et al . , 1998; 2003) . Diese direkte Umwandlung wird normalerweise unter anderem durch die unterschiedliche Kompartimentierung der Enzyme (Mitochondrien, Cytosol) verhindert. Isobutyraldehyd kann dann durch verschiedene Alcoholdehydrogenasen schließlich zum

Isobutanol reduziert werden (Dickinson et al . , 2003) . Dazu gehören u.a. Adhl-7 (SEQ. ID. Nr. 24), (SEQ. ID. Nr. 26),

(SEQ. ID. Nr. 28), (SEQ. ID. Nr. 30), (SEQ. ID. Nr. 32), (SEQ. ID.

Nr . 34 ) , ( SEQ . I D . Nr . 36 ) , S fa l ( SEQ . I D . Nr . 38 ) , Ypr l ( SEQ . I D . Nr . 4 0 ) .

Die meisten der genannten Enzyme werden jedoch für eine effiziente Produktion von Isobutanol aus Pyruvat bzw. Zuckern nicht stark genug exprimiert bzw. weisen geringe Enzymaktivitäten auf. Ein anderes Problem ist die Cofaktorspezifität und Redoxbilanz. Bei der Reduktion der zwei aus der Glykolyse stammenden Moleküle Pyruvat zu Isobutanol werden ein Molekül NADPH von der Acetohydroxysäure

Reduktoisomerase und ein Molekül NADH oder NADPH von den Verzweigtkettigen Alkoholdehydrogenasen benötigt. In der Glykolyse werden aber aus einem Molekül Glucose zwei Moleküle NADH in der Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase Reaktion produziert. Daher besteht ein Defizit an NADPH und ein

überschuss an NADH. NADH ist aber nicht ohne weiteres in NADPH zu überführen. Andererseits befinden sich die Enzyme Ilv2/Ilv6, Ilv5 (SEQ. ID. Nr. 6) und Ilv3 (SEQ. ID. Nr. 8) zumindest hauptsächlich in den Mitochondrien der Hefezellen. Deshalb muss zunächst das Pyruvat in die Mitochondrien hinein und letztendlich das 2-Ketoisovalerat aus den Mitochondrien heraus ins Cytosol transportiert werden. Da Transport über Membranen oft limitierend auf Stoffflüsse wirken kann, wäre es deshalb wünschenswert, alle Reaktionen ins Cytosol zu verlagern. Ebenso nachteilig für eine effiziente Produktion von Isobutanol ist, dass einige Intermediate auf dem Weg vom Zucker zum Produkt für andere Stoffwechselreaktionen abgezogen werden. Das gilt vor allen Dingen für das Pyruvat, das durch die Pyruvatdecarboxylasen und Alkoholdehydrogenasen zu einem großen Teil in Ethanol umgewandelt wird. Daher ist es für eine effizientere Produktion von Isobutanol wichtig, diese Nebenreaktionen zu reduzieren bzw. ganz auszuschalten.

Aufgabe und Ziel dieser Erfindung ist es daher, einen fermentativen Weg zur Produktion von Isobutanol aus Zuckern zur Verfügung zu stellen, bei dem (i) die eigene Enzymausstattung der Hefe für den Stoffwechselweg vom Pyruvat zum Isobutanol genutzt wird, indem ihre Expression bzw.

Aktivitäten gesteigert werden, d.h. ohne das heterologe Gene in die Hefe eingeführt werden müssen, (ii)a) die Kofaktorspezifität der Acetohydroxysäure Reduktoisomerase so geändert wird, dass dieses Enzym bevorzugt NADH anstelle von NADPH als Kofaktor benutzt, oder (ii)b) die Kofaktorspezifität der Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase so geändert wird, dass dieses Enzym bevorzugt NADP ⁺ anstelle von NAD ⁺ als Kofaktor benutzt bzw. eine heterologe NADP-Glycerinaldehyd-3- Phosphat Dehydrogenase in den Hefezellen exprimiert wird, (iii) die Bildung von Nebenprodukten wie z.B. Ethanol minimiert ist und (iv) bei dem möglichst alle beteiligten Enzyme im Cytosol der Hefezellen lokalisiert sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch überexpression der Enzymaktivitäten von Ilv2 mit oder ohne seinen Aktivator Ilvβ, Ilv5, Ilv3, mindestens einer 2-Ketosäure Decarboxylase wie z.B. ArolO und mindestens einer Alkoholdehydrogenase, die auch Isobutyraldehyd reduzieren kann (bevorzugt Adhl oder Adhβ, aber auch Adh2-5, Sfal, Yprl oder andere) . Dieses geschieht zum einen durch den Austausch der jeweiligen

Promotoren der entsprechenden Gene gegen stärkere Promotoren, bevorzugt, aber nicht ausschließlich, konstitutive Promotoren. Bevorzugterweise aber nicht ausschließlich sind Promotorsequenzen ausgewählt aus HXT7, verkürzter HXT7, PFKl, FBAl, TPIl, PGKl, PMAl, ADHl, TDH3. Weiterhin werden die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen der Gene abgewandelt in codon-optimierte Allele. Jede Aminosäure wird auf Genebene durch ein Codon verschlüsselt. Jedoch gibt es für die meisten Aminosäuren mehrere verschiedene Codons, die für eine einzelne

Aminosäure codieren. Der genetische Code ist folglich degeneriert. Die bevorzugte Codonwahl für eine entsprechende Aminosäure ist von Organismus zu Organismus verschieden. So kann es bei heterolog exprimierten Genen zu Problemen kommen, wenn der Wirtsorganismus bzw. die Wirtszelle einen sehr unterschiedlichen Codon-Gebrauch aufweist. Das Gen kann überhaupt nicht oder nur langsam exprimiert werden. Aber auch in Genen von verschiedenen Proteinen und Stoffwechselwegen innerhalb einer Zelle ist ein unterschiedlicher Codon-Gebrauch festzustellen. Von den Glykolyse-Genen aus S. cerevisiae ist bekannt, dass sie stark exprimiert werden. Sie weisen einen stark restriktiven Codon-Gebrauch auf, der in etwa den Mengenverhältnissen der entsprechenden tRNAs entspricht. Die Anpassung des Codon-Gebrauchs der Gene ILV2, {ILV6) (SEQ. ID. Nr. 3), ILV5, ILV3, eines der oben genannten 2-Ketosäure Decarboxylase-Gene und eines der oben genannten Alkoholdehydrogenase-Gene an den bevorzugten Codon-Gebrauch von S. cerevisiae führt zu einer Verbesserung der Isobutanol- Bildungsrate in Hefe. Der bevorzugte Codon-Gebrauch kann definiert sein wie in Wiedemann und Boles (2008) für die glykolytischen Gene beschrieben, muss aber nicht notwendigerweise auf diese Beispiele beschränkt sein. Die überexprimierten, möglicherweise codon-optimierten Gene können entweder auf Plasmiden kloniert in die Hefezellen eingebracht werden, sie können ins Genom der Hefezellen integriert werden oder sie können die natürlich vorkommenden Allele genomisch ersetzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer ersten Ausführungsform eine Hefezelle, die Isobutanol produziert, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle einen gesteigerten metabolischen Stofffluss vom Pyruvat über Acetolactat, 2,3- Dihydroxyisovalerat , 2-Ketoisovalerat , Isobutyraldehyd zum Isobutanol aufweist, indem mindestens eins der Gene, die für

die Enzyme kodieren, die an dieser Umsetzung beteiligt sind, überexprimiert ist und ohne dass eins dieser Gene heterolog zu der besagten Hefezelle ist, wobei Ilv2 (=YMR108W) die Acetolactat Synthase Reaktion vom Pyruvat zum Acetolactat katalysiert, Ilv5 (=YLR355C) die Acetohydroxysäure Reductoisomerase Reaktion vom Acetolactat zum 2,3- Dihydroxyisovalerat katalysiert, Ilv3 (=YJR016C) die Dihydroxysäure Dehydratase Reaktion vom 2,3- Dihydroxyisovalerat zum 2-Ketoisovalerat katalysiert, eine 2- Ketosäure Decarboxylase die Reaktion vom 2-Ketoisovalerat zum Isobutyraldehyd katalysiert, und eine Alkoholdehydrogenase die Reaktion vom Isobutyraldehyd zum Isobutanol katalysiert, wobei entweder mindestens einer der Promotoren dieser Gene gegen mindestens einen stärkeren Promotor ausgetauscht wird oder die Nukleinsäuresequenzen dieser Gene in Codon-optimierte Allele abgewandelt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine stärkere Promotor ein konstitutiver Promotor ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HXT7, verkürzter HXT7, PFKl, FBAl, TPIl, PGKl, PMAl, ADHl und TDH3.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die 2- Ketosäure Decarboxylase ausgesucht ist aus mindestens einem der Enzyme Pdcl, Pdc5, Pdcβ, ArolO oder Thi3.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die

Alkoholdeyhdrogenase ausgewählt ist aus mindestens einem der Enzyme Adhl (SEQ. ID. Nr. 24), Adh2 (SEQ. ID. Nr. 26), Adh3 (SEQ. ID. Nr. 28), Adh4 (SEQ. ID. Nr. 30), Adh5 (SEQ. ID. Nr. 32), Adhβ (SEQ. ID. Nr. 34), Adh7 (SEQ. ID. Nr. 36), Sfal (SEQ. ID. Nr. 38) oder Yprl (SEQ. ID. Nr. 40) .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass das überexprimierte Gen in einer codon-optimierten Variante überexprimiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass das überexprimierte Gen in einer codon-optimierten Variante überexprimiert wird, wobei die Codon-Optimierung am Codon- Gebrauch der hochexprimierten Glykolysegene der Hefe ausgerichtet ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Gene aller Enzyme, die an der Umsetzung vom Pyruvat zum Isobutanol beteiligt sind, überexprimiert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass alle diese Gene in codon-optimierten Varianten überexprimiert werden .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass alle diese Gene in codon-optimierten Varianten überexprimiert werden, wobei die Codon-Optimierung am Codon-Gebrauch der hochexprimierten Glykolysegene der Hefe ausgerichtet ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Acetohydroxysäure Reductoisomerase exprimiert, die eine erhöhte Spezifität für NADH gegenüber NADPH aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, das diese NADH-bevorzugende Acetohydroxysäure Reductoisomerase eine mutierte Variante des Ilv5-Enzyms der Hefe ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig eine NADH-bevorzugende Alkoholdehydrogenase der Hefe überexprimiert wird, die Isobutyraldehyd in Isobutanol umwandelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle zusätzlich eine phosphorylierende Glycerinaldehyd-3- Phosphat Dehydrogenase exprimiert, die eine erhöhte Spezifität für NADP ⁺ gegenüber NAD ⁺ aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass diese NADP-bevorzugende Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase heterolog zur Hefewirtszelle ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass diese NADP-Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase durch mutierte Allele eines, zweier oder aller drei TDH1-3 (SEQ. ID. Nr. 41), (SEQ. ID. Nr. 43), (SEQ. ID. Nr. 45) Gene der Hefe kodiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass diese NADP-Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase in einer Hefezelle exprimiert wird, die keine oder eine reduzierte Expression oder Aktivität der NAD-Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenasen aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig eine NADPH-bevorzugende Alkoholdehydrogenase überexprimiert wird, die Isobutyraldehyd in Isobutanol umwandelt .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Acetolactat Synthase, Acetohydroxysäure

Reductoisomerase und Dihydroxysäure Dehydratase im Cytosol der Zelle lokalisiert sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich das Ilvβ-Protein (=YCL009C) im selben Zeilkompartiment wie Ilv2 überexprimiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Expression der Gene PDCl (SEQ. ID. Nr. 13), PDC5 (SEQ. ID. Nr. 15) und PDC6 (SEQ. ID. Nr. 17) bzw. die Aktivität der kodierten Enzyme reduziert bzw. ausgeschaltet ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Mutationen die Produktion von Isobutanol steigern.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Mutationen die Resistenz gegenüber toxischen Konzentrationen von Isobutanol steigern.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ausgewählt ist aus folgender Gruppe: Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Yarrowia und Saccharomyces .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Hefezelle dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle Saccharomyces cerevisiae ist.

In einer möglichen Ausführungsform der Erfindung (s. Abb. 1) wird das Enzym Ilv5 (Acetohydroxysäure Reduktoisomerase) so verändert, dass es bevorzugt NADH anstelle von NADPH als Cofaktor verwendet. Gleichzeitig wird bevorzugt aber nicht notwendigerweise eine Alkoholdehydrogenase überexprimiert , die auch NADH als Cofaktor verwendet (z.B. Adhl oder Adh2-5 oder

Sfal) . Ilv5 katalysiert die Reduktion von Acetolactat zum 2,3- Dihydroxyisovalerat bei gleichzeitiger Oxidation von NADPH+H ⁺ zum NADP ⁺ . Durch den glykolytischen Abbau von Zuckern entsteht jedoch kein oder nur in geringen Mengen NADPH. Es entsteht jedoch NADH. NADH ist aber nicht ohne weiteres in NADPH umzuwandeln (Boles et al . , 1993) . Deshalb wäre es wünschenswert, die Kofaktorspezifität der Acetohydroxysäure Reduktoisomerase so zu verändern, dass dieses Enzym NADH anstelle von NADPH bevorzugt. Dieses kann erreicht werden, indem bestimmte Aminosäuren von Ilv5, die für die ausschließliche Verwendung des NADPH benötigt werden durch andere ersetzt werden, die auch oder die bevorzugt eine Verwendung von NADH zulassen. Solche Aminosäuren sind bevorzugt aber nicht ausschließlich die Aminosäuren Argl08,

Glylll, Alall2 und/oder Serll3 des nicht-prozessierten Vorläuferenzyms, die sich durch einen Vergleich des Hefe-Ilv5 Enzyms mit der Struktur der Acetohydroxysäure Reduktoisomerase von Spinat ableiten lassen (Biou et al . , 1997) . ArglO8 kann dabei bevorzugt aber nicht ausschließlich in Met, Trp, Phe, GIu oder Asp umgewandelt werden, Glylll bevorzugt aber nicht ausschließlich in GIu oder Asp, Alall2 bevorzugt aber nicht ausschließlich in Ser oder GIy und Serll3 bevorzugt aber nicht ausschließlich in GIu oder Asp. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch der Austausch weiterer oder anderer Aminosäuren zu einer Veränderung der Kofaktorspezifität von Ilv5 zugunsten von NADH führt.

In einer anderen möglichen Ausführungsform der Erfindung (s. Abb. 2) wird die Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase

(GAPDH) der Hefe so verändert, dass sie NADP ⁺ anstelle von NAD ⁺ bevorzugt, oder durch eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase ersetzt bzw. ergänzt, die NADP ⁺ gegenüber NAD ⁺ bevorzugt. Gleichzeitig wird bevorzugt aber nicht notwendigerweise eine Alkoholdehydrogenase überexprimiert, die NADPH als Cofaktor bevorzugt (z.B. Adh6 oder Yprl) . GAPDH wird z.B. in S. cerevisiae von den Genen TDHl (SEQ. ID. Nr. 41), TDH2 (SEQ. ID. Nr. 43) und TDH3 (SEQ. ID. Nr. 45) kodiert und katalysiert die Oxidation von Glycerinaldehyd-3-Phosphat bei gleichzeitiger Phosphorylierung zum 1, 3-Diphosphoglycerat .

Beim glykolytischen Abbau von Zuckern wird dabei normalerweise NAD ⁺ als Kofaktor verwendet, und es entsteht NADH+H ⁺ . NADH ist nicht ohne weiteres in NADPH umzuwandeln (Boles et al . , 1993) . Da jedoch die Acetohydroxysäure Reduktoisomerase NADPH als Kofaktor verwendet, wäre es wünschenswert, die

Kofaktorspezifität der GAPDH so zu verändern, dass dieses Enzym NADP ⁺ anstelle von NAD ⁺ bevorzugt. Eine änderung der Kofaktorspezifität der Hefe-GAPDH kann erreicht werden, indem bestimmte Aminosäuren von Tdhl (SEQ. ID. Nr. 42), Tdh2 (SEQ. ID.

Nr. 44) und/oder Tdh3 (SEQ. ID. Nr. 46), die für die ausschließliche Verwendung des NAD ⁺ benötigt werden, durch andere ersetzt werden, die auch oder die bevorzugt eine Verwendung von NADP ⁺ zulassen. Solche Aminosäuren sind bevorzugt aber nicht ausschließlich die Aminosäuren Asp33 und/oder Glyl88-Prol89, die sich durch einen Vergleich der Hefe-GAPDH Enzyme mit der Struktur von NADP ⁺ -bevorzugenden GAPDH ableiten lassen (Filiinger et al . , 2000) . Asp33 kann dabei bevorzugt aber nicht ausschließlich in Asn, GIy, AIa oder Ser umgewandelt werden, Glyl88-Prol89 bevorzugt aber nicht ausschließlich in Ala-Ser, Val-Arg, Asn-Pro oder Thr- Lys . Es soll jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch der Austausch weiterer oder anderer Aminosäuren zu einer Veränderung der Kofaktorspezifität von Tdhl-3 zugunsten von NADP ⁺ führt. Alternativ könnte eine heterologe GAPDH in Hefe überexprimiert werden, die bevorzugt NADP ⁺ verwendet, z.B. aber nicht ausschließlich Gdpl (SEQ. ID. Nr. 48) aus Kluyveromyces lactis (Verho et al . , 2002) oder GapB (SEQ. ID. Nr. 50) aus Bacillus subtilis (Filiinger et al . , 2000) . Die NADP-GAPDH kann in einer bevorzugten Ausführungsform codon-optimiert überexprimiert werden. Die mutierten oder heterologen NADP- GAPDHs können dabei zusätzlich zu den vorhandenen NAD-GAPDHs exprimiert werden oder in einer bevorzugten Ausführung in Hefemutanten mit reduzierter oder ausgeschalteter NAD-GAPDH Expression bzw. Aktivität.

Proteine, die in die mitochondriale Matrix transportiert werden, werden als Vorläuferproteine im Cytosol synthetisiert und dann über Translocasen in die mitochondriale Matrix transportiert. Die N-terminalen Presequenzen werden von einer mitochondrialen Peptidase während der Translocation abgespalten. In einer bevorzugten Ausführungsform, aber nicht notwendigerweise, werden die Gene ILV2, (ILV6) , ILV5 bzw. IiV5 ^fWADHmut - ^; und ILV3 ohne die mitochondrielle Targetingsequenz

der entsprechenden Proteine oder mit einer zerstörten, inaktivierten mitochondriellen Targetingsequenz überexprimiert , sodass die produzierten Proteine bevorzugt im Cytosol der Hefezellen lokalisiert sind (Pang and Duggleby, 1999; Omura, 2008) . Dieses kann mit den natürlichen oder codon-optimierten Allelen geschehen.

Pyruvat kann in verschiedenen Reaktionswegen weiter umgesetzt werden. Der mengenmäßig stärkste dieser Reaktionswege ist seine Umsetzung zum Ethanol . Dabei wird Pyruvat durch die

Pyruvatdecarboxylasen (Pdcs) zu Acetaldehyd decarboxyliert und weiter zum Ethanol umgesetzt. Dabei geht Pyruvat für die Produktion von Isobutanol verloren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, aber nicht notwendigerweise, wird daher der Fluss des Pyruvat zum Ethanol durch Ausschalten bzw. Verringerung der Pyruvatdecarboxylase-Expression oder - Aktivitäten blockiert bzw. reduziert. Dies geschieht z.B. durch Deletion bzw. Reduktion der Expression der Gene PDCl, PDC5 und/oder PDC6. Da jedoch die Hefe das aus dem Acetaldehyd im Cytosol hergestellte Acetyl-CoA benötigt, muss dieses bei vollständiger Ausschaltung der Pyruvatdecarboxylasen zusätzlich zur Verfügung gestellt werden. Dieses geschieht entweder (i) durch eine nicht vollständige Ausschaltung der Expression oder Aktivität der Pyruvatdecarboxylasen, (ii) durch Expression einer heterologen Pyruvat-Formiat-Lyase mit ihrem aktivierenden Enzym einschließlich der überexpression einer Formiatdehydrogenase, (iii) durch heterologe Expression eines reversiblen mitochondrialen Carnitin-Carriers oder (iv) durch die Einführung von spontanen Suppressormutationen. Darüberhinaus bleibt die Reduktion oder Ausschaltung weiterer Stoffwechselreaktionen vorbehalten, um den Fluss der Intermediärmetabolite zum Isobutanol zu verstärken.

Weiterhin kann die Produktion von Isobutanol sowie die Resistenz gegenüber toxischen Konzentrationen von Isobutanol in den rekombinanten Hefezellen durch Zufallsmutagenese oder die Methoden des „Evolutionary Engineerings" oder der „Directed Evolution" (Sauer, 2001) noch gesteigert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren für die Produktion von Isobutanol mit Hefezellen, umfassend die Bereitstellung einer Hefezelle wie vorstehend definiert sowie das Inkontaktbringen der Hefezelle mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle .

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die fermentierbare Kohlenstoffquelle eine C3 - C6 Kohlenstoffquelle ist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden gehört.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Xylose oder Arabinose gehört.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle mit der Kohlenstoffquelle in Kulturmedium in Kontakt gebracht wird.

Methoden

1. Stämme und Medien

1.1 Bakterien

- E. coli SURE (Stratagene)

- E. coli DH5α (Stratagene)

Vollmedium LB 1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,5 (siehe Maniatis, 1982) .

Für die Selektion auf eine plasmidkodierte

Antibiotikaresistenz wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 40μg/ml Ampicillin zugesetzt. Feste Nährmedien enthielten zusätzlich 2% Agar. Die Anzucht erfolgte bei 37 °C.

1.2 Hefe

Stämme aus der Serie CEN. PK, Industriehefen

-synthetisches Komplettselektivmedium SC: 0,67% Yeast nitrogen base w/o amino acids, pH6,3, Aminosäure/Nukleobase-Lösung, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration

-synthetisches Minimalselektivmedium SM: 0,16% Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulphate, 0,5% Ammoniumsulfat ,2OmM Kalium- dihydrogenphosphat, pH6,3, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration

-synthetisches Fermentationsmedium (Mineralmedium) SFM: (Verduyn et al., 1992), pH 5,5

Salze: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 5g/l; KH ₂ PO ₄ , 3g/l; MgSO ₄ *7H ₂ O, 0,5g/l

Spurenelemente: EDTA, 15mg/l, ZnSO ₄ *4, 5mg/l; MnCl ₂ MH ₂ O, 0,lmg/l; CoCl ₂ *6H ₂ 0, 0,3 mg/1; CuSO ₄ , 0,192 mg/1; Na ₂ Mo0 ₄ *2H ₂ 0, 0,4 mg/l;CaCl ₂ *2H ₂ O, 4,5 mg/1; FeSO ₄ *7H ₂ O, 3 mg/1; H ₃ BO ₃ , 1 mg/1; KI, 0,1 mg/1

Vitamine: Biotin, 0,05 mg/1; p-Aminobenzoesäure, 0,2 mg/1; Nicotinsäure, 1 mg/1; Calciumpantothenat , 1 mg/1; Pyridoxin- HCL, 1 mg/1; Thiamin-HCL, 1 mg/1; Minositol, 25 mg/1

Konzentration der Aminosäuren und Nukleobasen im synthetischen Komplettmedium (nach Zimmermann, 1975) : Adenin (0,08mM), Arginin (0,22mM), Histidin (0,25mM), Isoleucin (0,44mM), Leucin (0,44mM), Lysin (0,35mM), Methionin (0,26mM), Phenylalanin (0,29mM), Tryptophan (0,19mM), Threonin (0,48mM), Tyrosin (0,34mM), Uracil (0,44mM), Valin (0,49mM) . Als Kohlenstoffquelle wurden L-Arabinose und D-Glucose eingesetzt.

Feste Voll- und Selektivmedien enthielten zusätzlich 1,8 % Agar. Die Anzucht der Hefezellen erfolgte bei 30 ⁰ C. Das für die Fermentationen eingesetzte synthetische Mineralmedium enthielt Salze, Spurenmetalle und Vitamine in den oben aufgelisteten Konzentrationen und L-Arabinose als

Kohlenstoffquelle . Von den Spurenmetallen und den Vitaminen wurde eine Stammlösung angesetzt. Beide Lösungen wurden steril-filtriert . Beide wurden bei 4°C gelagert. Für die Herstellung der Spurenmetalllösung war der pH-Wert von entscheidender Rolle. Die verschiedenen Spurenelemente mussten in der obigen Reihenfolge nacheinander in Wasser vollständig gelöst werden. Nach jeder Zugabe musste der pH-Wert mit KOH auf 6,0 eingestellt werden bevor das nächste Spurenelement zugegeben werden konnte. Am Ende wurde der pH-Wert mit HCL auf

4.0 justiert. Um Schaumbildung zu vermeide, wurde dem Medium 200μl Antischaum (Antifoam2004 , Sigma) zugegeben. Da die Versuche unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wurden, musste dem Medium nach dem Autoklavieren noch 2,5 ml/1 einer TweenδO-Ergosterol-Lösung zugegeben werden. Diese besteht aus 16,8 g Tween80 und 0,4 g Ergosterol, welche mit Ethanol auf 50 ml aufgefüllt und darin gelöst wurden. Die Lösung wurde steril-filtriert . Die Salze und der Antischaum wurden gemeinsam mit dem kompletten Fermenter autoklaviert . Die Arabinose wurde getrennt vom restlichen Medium autoklaviert. Nach Abkühlen des Mediums wurden die Spurenelemente sowie die Vitamine hinzugegeben.

2. Transformation

2.1 Transformation von E. coli

Die Transformation der E. coli Zellen erfolgte durch die Elektroporationsmethode nach Dower et al. (1988) und Wirth (1993) mittels eines Easyject prima Geräts (EQUIBO) .

2.2 Transformation von S. cerevisiae

Die Transformation von S. cerevisiae Stämmen mit Plasmid-DNA bzw. DNA-Fragmenten erfolgte nach der Lithiumacetat-Methode von Gietz und Woods (1994) .

3. Präparation von DNA

3.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte nach der Methode der alkalischen Lyse von Birnboim und DoIy (1979),

modifiziert nach Maniatis et al. (1982) oder alternativ mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit" der Firma Qiagen. Hochreine Plasmid-DNA für Sequenzierungen wurde mit dem „Plasmid Mini Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers präpariert.

3.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae

Die Zellen einer stationären Hefekultur (5ml) wurden durch Zentrifugation geerntet, gewaschen und in 400μl Puffer Pl

(Plasmid Mini Kit, Firma Qiagen) resuspendiert. Nach Zugabe von 400μl Puffer P2 und V ₃ Volumen Glasperlen (0 0,45 mm) erfolgte der ZellaufSchluss durch 5-minütiges Schütteln auf einem Vibrax (Vibrax-VXR von Janke & Kunkel oder IKA) . Der überstand wurde mit H Volumen Puffer P3 versetzt, gemischt und für 10min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Zentrifugation bei 13000rpm wurde durch Zugabe von 0,75ml Isopropanol zum überstand die Plasmid-DNA bei Raumtemperatur gefällt. Die durch Zentrifugation für 30min bei 13000rpm pelletierte DNA wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20μl Wasser resuspendiert, lμl der DNA wurde für die Transformation in E. coli eingesetzt.

3.3 Bestimmung der DNA-Konzentration

Die DNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch in einem Wellenlängenbereich von 240-300nm gemessen. Liegt die Reinheit der DNA, bestimmt durch den Quotient E ₂₆ 0nm/E280nm, bei 1,8, so entspricht die Extinktion E _260nm ⁼ l _r 0 einer DNA-Konzentration von 50μg dsDNA/ml (Maniatis et al., 1982) .

3.4 DNA-Amplifikation mittels PCR

Verwendung des Phusion™ High Fidelity Systems

Die Polymerasekettenreaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50μl mit dem „Phusion™ High Fidelity PCR System" der Firma Finnzymes nach Angaben des Herstellers. Jeder Ansatz bestand aus 1-lOng DNA oder 1-2 Hefekolonien als Synthesevorlage, 0,2mM dNTP-Mix, lxPuffer 2 (enthält l,5mM MgCl ₂ ), IU Polymerase und je lOOpmol der entsprechenden Oligonukleotidprimer . Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler der Firma Techne durchgeführt und die PCR-Bedingungen nach Bedarf wie folgt gewählt :

1 Ix 30sec, 98°C Denaturierung der DNA

2 3Ox lOsec, 98 ⁰ C Denaturierung der DNA

30sec, 56- Annealing/Bindung der

62°C Oligonukleotide an die DNA

0, 5-lmin, DNA-Synthese/Elongation

72°C

3 Ix 7min, 72°C DNA-Synthese/Elongation

Nach dem ersten Denaturierungsschritt wurde die Polymerase zugegeben („hot Start PCR") . Die Anzahl der Syntheseschritte, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit wurden an die spezifischen Schmelztemperaturen der verwendeten

Oligonukleotide bzw. an die Größe des zu erwarteten Produkts angepasst. Die PCR-Produkte wurden durch eine Agarosegelelektrophorese überprüft und anschließend aufgereinigt .

3.5 DNA-Aufreinigung von PCR-Produkten

Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem „QIAquick PCR Purification Kit" der Firma Qiagen nach Herstellerangaben,

3.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 0,15- 20kb erfolgte in 0,5-l%igen Agarosegelen mit 0,5μg/ml

Ethidiumbromid. Als Gel- und Laufpuffer wurde lxTAE-Puffer (4OmM Tris, 4OmM Essigsäure, 2mM EDTA) verwendet (Maniatis et al., 1982) . Als Größenstandard diente eine mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hindlll geschnittene Lambda-Phagen-DNA. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit Vio Volumen Blaumarker ( lxTAE-Puffer, 10% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und nach der Auftrennung durch Bestrahlung mit UV-Licht (254nm) sichtbar gemacht.

3.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Das gewünschte DNA-Fragment wurde aus dem TAE-Agarosegel unter langwelligem UV-Licht (366nm) ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers isoliert.

4. Enzymatische Modifikation von DNA

4.1 DNA-Restriktion

Sequenzspezifische Spaltung der DNA mit

Restriktionsendonukleasen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Inkubationsbedingungen für 1 Stunde mit 2-5U Enzym pro μg DNA durchgeführt.

Weitere mögliche Expressionsvektoren sind aus der Serie pRS303X, p3RS305X und p3RS306X. Hierbei handelt es sich um integrative Vectoren, die einen dominanten Antibiotika-Marker

besitzen. Nähere Angaben zu diesen Vektoren finden sich bei Taxis und Knop (2006) .

5. Klonierung von DNA-Fragmenten durch in vivo-Rekombination

Für eine in vivo-Klonierung von DNA-Fragmenten in S. cerevisiae wurde zunächst das entsprechende Gen bzw. die DNA- Sequenz durch eine PCR-Reaktion synthetisiert. Die dabei eingesetzten Oligonukleotide enthalten jeweils im 5 "-Bereich 36-39 Nukleotide umfassende spezifische Anhänge, die homolog zu den 5 ^' - bzw. 3 " -flankierenden Sequenzen des Integrationsbereiches im Zielvektor sind. Im 3 ^s -Bereich enthalten die Oligonukleotide 20-22 Basen mit Homologie zu den 3 ^X - bzw. 5 ^N -Enden des zu amplifizierenden Gens. Das entstandene PCR-Produkt wurde zusammen mit dem durch Restriktion im Integrationsbereich linearisierten und aufgereinigten Vektor in Hefe transformiert. Die Zellen wurden auf synthetischem Selektivmedium ausplattiert, dem für die Selektion auf den Auxotrophiemarker des Vektors die entsprechende Aminosäure bzw. Nukleotidbase fehlte. Auf diese Weise wurden nur solche Transformanten erhalten, die aufgrund homologer Rekombination des DNA-Fragmentes in den liearisierten Vektor wieder ein stabiles, zirkuläres Plasmid gebildet hatten. Die Plasmide wurden isoliert, in E. coli amplifiziert und durch anschließende Restriktionsanalyse, oder durch Sequenzierung überprüft.

6. Austausch von und Integration in genomische DNA

Dieses wurde wie in Becker und Boles (2003) und Wieczorke et al. (1999) beschrieben, durchgeführt.

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