ACTIVIDAD UREASA

En general, la presente invención se refiere a una composición fertilizante que incluye un inhibidor de la actividad ureasa.

Más concretamente, la invención proporciona una composición fertilizante de disponibilidad controlada que incluye como inhibidor de la actividad ureasa un pigmento de origen natural, la pulcherrimina, un quelato de hierro derivado del ácido pulcherrimínico, preferentemente sintetizada de forma natural por la levadura de la especie Metschnikowia pulcherrima.

Pulcherrimina

El nitrógeno es el nutriente más necesario y utilizado en los cultivos. El nitrógeno, una vez aplicado en el suelo, sufre una serie de transformaciones, produciéndose la absorción por los cultivos o la pérdida del nutriente por diferentes causas, tales como pérdida por emisiones a la atmósfera de óxidos de nitrógeno y amoniaco, pérdida por procesos de lixiviación o pérdida debida a la erosión de los terrenos.

Por ello se han llevado a cabo investigaciones orientadas al desarrollo de fertilizantes más eficientes, como podrían ser los desarrollados en las patentes ES 2 204 307 A1 ; ES 2 264 386 B1 ; WO 2001072665 A1 ; WO 2007/132032; WO 2006 125836 A1 .

La urea constituye uno de los fertilizantes nitrogenados más utilizados del mundo debido principalmente a su elevado contenido en nitrógeno (46%), su bajo coste, su solubilidad en agua y su fácil manejo. Sin embargo, presenta un bajo rendimiento y una pérdida de eficacia del fertilizante debida a la lixiviación del nitrógeno en forma nítrica y a las pérdidas por volatilización del nitrógeno amoniacal debido a la rápida hidrólisis que sufre la urea al ser aplicada en los suelos.

(NH ₂ ) ₂ CO + H ₂ 0→ C0 ₂ + 2NH ₃

Reacción de hidrólisis de la urea El amoniaco producido entra en equilibrio con la humedad del suelo originado iones amonio: NH ₃ + H ₂ 0→ NH ⁺ + OH ^" .

Esta hidrólisis es catalizada por la enzima ureasa, una metaloenzima cuyo sitio activo está compuesto por un dímero de Ni (II).

La acción de este enzima es muy rápida, y provoca un alto grado de pérdida de eficacia del fertilizante aportado. El am on iaco l i berado puede tener u na concentración demasiado elevada en las proximidades de las raíces de las plantas jóvenes, produciendo su intoxicación, además de su liberación al medioambiente, con los problemas que esto puede acarrear.

La contaminación de aguas y manantiales por la presencia de nitratos constituye uno de los problemas medio-ambientales más importantes de los países desarrollados. Este hecho, normalmente asociado a un uso excesivo de fertilizantes nitrogenados, ha provocado la promulgación de leyes específicas con el fin de regular la cantidad máxima de unidades nitrogenadas que el agricultor puede aplicar dependiendo del grado de contaminación de su región específica. En este contexto, toda investigación orientada al desarrollo de fertilizantes más eficaces y con menos riesgos de contaminación medio-ambiental es de gran interés.

Entre los productos que han demostrado mayor eficacia en este sentido cabe destacar los inhibidores de los procesos de nitrificación y de la hidrólisis de la urea (Hauck R D 1985, Slow-release and bioinhibitor-amended nitrogen fertilizers", en "Fertilizer technology and use", Ed. O P Engelstad, pp 293-322, Soil Science Society of America, Madison). En relación con los inhibidores de la hidrólisis de la urea, se han desarrollado gran cantidad de moléculas tanto de origen natural (por ejemplo, Baughman y Wozniak., US5549728; Seiyaku, JP8019595) como sintético (por ejemplo, Cheng y col., US5770771 ; Peacock y col., US5352265; Radel, US4932992). Igualmente, existe en el mercado un producto comercial que contiene el inhibidor de la ureasa conocido como NBTP, triamida del ácido N-(n-butil)t¡ofosfór¡co, altamente eficaz para inhibir la hidrólisis de la urea en suelos.

Sin embargo el NBPT presenta dos problemas importantes: 1 . Es un producto altamente eficaz para inhibir la actividad de las ureasas tanto de origen de microorganismos (asociada con la actividad en suelos) como de origen de plantas. Este hecho hace que su uso en fertirrigación sea potencialmente peligroso, ya que puede afectar significativamente al correcto metabolismo de la urea en el interior de la planta.

2. Diferentes estudios han puesto de manifiesto que el producto, una vez incluido en el fertilizante conteniendo urea, tiene una vida media en relación con la actividad que se sitúa entre 3 semanas y 3 meses, lo que hace muy difícil su uso en la fabricación de fertilizantes cuyo plazo de almacenamiento sea superior al plazo de caducidad de dicha molécula.

En este sentido la búsqueda de nuevas moléculas con la capacidad de inhibir selectivamente las ureasas asociadas a microorganismos, siendo menos activas en las ureasas presentes en las plantas, y que sean lo suficientemente estables como para mantener su actividad en largos periodos de tiempo es de gran interés. Sorprendentemente, la solicitante ha encontrado ahora que el pigmento de origen natural pulcherrimina, un quelato de hierro derivado del ácido pulcherrimínico, sintetizada de forma natural por la levadura de la especie Metschnikowia pulcherrima, tiene la propiedad de inhibir a la enzima ureasa, y por ello la nitrificación, que genera pérdidas en la disponibilidad de nitrógeno por parte de las plantas.

Así, la presente invención tiene por objeto una composición fertilizante de disponibilidad controlada que incluye como inh ibidor de la actividad ureasa pulcherrimina, un quelato de hierro derivado del ácido pulcherrimínico sintetizado de forma natural por la levadura de la especie Metschnikowia pulcherrima (Candida pulcherrimina). La pulcherrimina es un pigmento sintetizado por ciertas especies de Candida pulcherrimina que crecen sobre medios que contienen sales férricas (MacDonald, Biosynthesis of pulcherriminic acid, The Biochemical journal 96, 533-538, 1965). Cook y Slater (1954) citados por (MacDonald, 1965) demostraron que este pigmento era la sal férrica de un ácido dibásico al cual denominaron ácido pulcherrimínico, un derivado de ácido hidroxámico formado por aromatización oxidativa de ciclo(L-leucil- L-leucil) (Kluyver AJ, van der Walt JP, van Triet AJ (1953), Pulcherrimin, The Pigment of Candida Pulcherrima, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 39, 583-593). En la búsqueda de inhibidores de ureasas, la selección de este principio activo se debe a que algunas investigaciones apuntaban a que la enzima ureasa podía ser inhibida por moléculas derivadas de ácidos hidroxámicos ( Luzia V. Modolo, Aliñe X. de Souza, Lívia P. Horta, Dóbora P. Araujo, Angelo de Fátima, An overview on the potential of natural producís as ureases inhibitors: A review, Journal of Advanced Research (2015) 6, 35-44); Z. Amtul, Atta-ur-Rahman, R A. Siddiqui y M . l : Choudhary, Chemistry and Mechanism of Urease Inhibition, Current Medicinal Chemistry, 2002, 9, 1323-1348). El uso de este principio activo inhibidor de la ureasa permite obtener una composición fertilizante de origen natural y totalmente biodegradable. La invención proporciona una composición fertilizante de disponibilidad controlada que incluye como inhibidor de la actividad ureasa el pigmento de origen natural pulcherrimina.

En la presente invención, el término "composición fertilizante" se refiere a cualquier composición orgánica o inorgánica, natural o sintética, que aporte a las plantas uno o varios de los elementos nutritivos indispensables para su desarrollo vegetativo normal, habitulamente macroelementos primarios (N , P, K), macroelementos secundarios (Ca, Mg, S) así como microelementos (B, Cl, Co, CU, Fe, Mn, Mo y Zn). Así el término "composición fertilizante" abarca en particular fertilizantes minerales simples (contenido en uno solo de los macroelementos siguientes: nitrógeno, fósforo o potasio) conteniendo nitrógeno y complejos (contenido en más de uno de los macroelementos siguientes: nitrógeno, fósforo o potasio) conteniendo nitrógeno, fertilizantes orgánicos, órgano-minerales, etc. tales como, fertilizantes N, fertilizantes NP, fertilizantes NK o fertilizantes NPK, pudiendo el nitrógeno del fertilizante ser de origen ureico o de otros tipos de nitrógeno (orgánico, inorgánico).

Preferentemente, la composición fertilizante de la presente invención está en forma granulada. Preferentemente, los granulados están revestidos m ed iante un med io de revestimiento basado en extractos húmicos.

Preferentemente, la pulcherrimina como activo inhibidor de la actividad ureasa está presente en el medio de revestimiento basado en extractos húmicos como medio de vehiculación. Los ácidos húmicos son complejas agrupaciones macromoleculares que forman parte d e l a m ateri a o rgán i ca de l s ue l o y q ue m ej oran la absorci ón de macronutrientes, estimulando así e l creci m iento vegeta l . La extracción , caracterización y propiedades de los ácidos húmicos de leonardita se describe por ejemplo en los documentos US3398186 A, US3544296 A o EP0284339 B1 . El uso de sustancias húmicas extraídas de leonardita para la vehiculación de la pulcherrimina le proporciona excelentes propiedades, como son:

• Elevada capacidad de complejación del hierro, lo que permite proteger a la pulcherrimina del hierro, impidiendo que se inactive.

• Capacidad para formar m icelas, que protegen de la degradación tanto al principio activo, como a la composición fertilizante que están recubriendo.

• Baja presión de vapor y elevada capacidad de absorción de humedad, motivo por el cual no es necesaria una etapa de secado posterior a su aplicación en superficies sólidas.

En la invención, la pulcherrimina se obtiene a partir de la levadura previamente mencionada, Metschnikowia pulcherrima.

Por tanto, en un segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso de obtención del extracto de pulcherrimina a partir de un cultivo de la levadura Metschnikowia pulcherrima, donde el extracto de pulcherrimina obtenido contiene entre un 0, 1 y un 2% en peso de pulcherrimina. El proceso de obtención del extracto de pulcherrimina a partir de un cultivo de la levadura Metschnikowia pulcherrima, incluye las siguientes etapas: a. Preparación de un medio de cultivo adecuado para el crecim iento de la levadura ajustado a pH 5,5 y a una temperatura de 28°C.

En una realización preferente, dicho medio de cultivo tiene la siguiente composición (los porcentajes expresados en peso):

Inoculación de la levadura Metschnikowia Pulcherrima (cepa V6, depositada en la colección española de cultivos tipo con la referencia CECT 13098) a una presión constante de 0,4 bar, complementando el m edio con g licerol suplementado con aminoácidos. c. Extracción del caldo del reactor, separación de los cuerpos de las levaduras del líquido, microfiltración clarificadora del sobrenadante obtenido y opcionalmente concentración mediante osmosis inversa. El caldo clarificado sin concentrar es el extracto de pulcherrimina a utilizar como inhibidor en la composición fertilizante de la invención, presentando un contenido en pulcherrimina entre un 0, 1 y un 2%.

En una realización preferente de la invención, la proporción entre el extracto de pulcherrimina y el medio de vehiculación se encuentra entre 1 -4: 1 -1 0. En una realización particularmente preferente, esta proporción es de 1 :1 , 1 :9, 3:7 o 4: 1 .

En otra forma de realización, la composición fertilizante contiene entre un 0, 1 y un 10% de extracto de pulcherrimina y entre un 0, 1 y un 10% en peso del medio de vehiculación, siendo el resto de los componentes hasta el 100% en peso urea u otras fuentes de nitrógeno.

Según un ejem plo de realización del proceso de obtención del extracto de pulcherrimina a partir de un cultivo de la levadura Metschnikowia pulcherrima, en primer lugar se prepara un medio de cultivo cuya com posición se detalla a continuación:

Glicerol 2-10%

Sulfato magnésico 0, 1 -5%

Acido fosfórico 1 -5%

Carbonato cálcico 0,01 -1 %

Antiespumante 0,01 -1 %

PMT1 0, 1 -10%

Una vez preparado el medio de cultivo, se ajusta el pH a 5,5 con agua amoniacal. Posteriormente, el medio de cultivo se esteriliza en autoclave a 121 °C y 1 bar de presión durante 15 minutos. Se atempera el medio de cultivo a 28°C y se mantiene a esa temperatura durante todo el proceso de producción. Se realiza la inoculación de la levadura Metschnikowia Pulcherrima (cepa V6) depositada en la colección española de cultivos tipo con la referencia CECT 1 3098. Se ajusta el pH a 5,5 mediante la adición controlada de agua amoniacal. La aireación se mantiene entre 0,5 y 2 vvm durante todo el proceso. La presión dentro del reactor es constante y a 0,4 bar. Una vez terminado el glicerol del medio de cultivo inicial (momento en que se dispara la concentración de oxígeno disuelto), se reduce la temperatura a 25°C y se realiza una sobrealimentación mediante la incorporación de un flujo continuo de 0,0045 volúmenes/hora de un medio rico formado por glicerol suplementado con un 2% de aminoácidos. Se extrae el caldo del reactor, se decanta por centrifugación para separar los cuerpos de las levaduras del líquido, se realiza una microfiltración clarificadora del sobrenadante obtenido del paso anterior, por último, se puede realizar una concentración mediante osmosis inversa. El caldo clarificado sin concentrar es el extracto de pulcherrimina a utilizar como inhibidor en la composición fertilizante de la invención (el contenido de pulcherrimina está entre un 0, 1 y un 2%). Como se ha mencionado anteriormente, el medio de vehiculación del extracto de pulcherrimina es un recubrimiento también de origen natural obtenido a partir de ácidos húmicos, preferentemente extraídos de leonardita.

Una de las técnicas más útiles para la caracterización de revestimientos es la espectroscopia infrarroja, ya que permite monitorear los cambios que ocurren mostrando las bandas de absorción de los grupos funcionales de las moléculas poliméricas y permitiendo observar el grado de degradación de las mismas.

En este caso, se obtuvieron los espectros utilizando un espectrómetro de Infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). Esta técnica, también permite conocer el tipo de interacciones que existen entre el recubrimiento y su núcleo.

En la Figura 1 se muestra el espectro de FT-IR obtenido para el medio de vehiculación, donde se pueden ver las bandas de los grupos funcionales característicos de los ácidos húmicos, como son alcoholes, grupos ácidos, sistemas aromáticos, cetonas o fenoles.

El método de extracción para la obtención de este medio de vehiculación del extracto de pulcherrimina comporta una doble extracción. En primer lugar se lleva a cabo la primera extracción, que se realiza por adición de potasa a una disolución acuosa de una leonardita de características conocidas. En segundo lugar, se precipitan las sustancias húmicas en un medio ácido, que se consigue por adición de ácido sulfúrico hasta un pH entre 0 y 2. Por último, se redisuelven adicionando carbonato potásico y pirofosfato hasta un pH en torno a 10. Para una mejor exposición del contenido de la presente invención, se incluyen a continuación una serie de ejemplos que en ningún caso deben considerarse limitativos de la misma.

Se prepararon las siguientes composiciones fertilizantes granuladas incluyendo urea como fuente de nitrógeno y el extracto de pulcherrimina obtenido según se ha descrito anteriormente como inhibidor de la ureasa. En los ejemplos 1 a 6 el extracto de pulcherrimina se aporta a la composición fertilizante granulada mediante su inclusión en el medio de vehiculación basado en ácidos húm icos. Con fines comparativos, en los ejemplos 7 y 8 la composición fertilizante granulada incluye el extracto de pulcherrimina directamente sobre la fuente de nitrógeno. Ejemplo 1 : Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 99,0

Extracto de Pulcherrimina 0, 1

Medio de vehiculación 0,9

Ejemplo 2: Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 99,0

Extracto de Pulcherrimina 0,3

Medio de vehiculación 0,7

Ejemplo 3: Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 99,0

Extracto de Pulcherrimina 0,5

Medio de vehiculación 0,5

Ejemplo 4: Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 99,0

Extracto de Pulcherrimina 0,8

Medio de vehiculación 0,2

Ejemplo 5: Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 80,0

Extracto de Pulcherrimina 10,0

Medio de vehiculación 10,0 Ejemplo 6: Composición fertilizante según la invención

Componente % en peso

Urea 90,0

Extracto de Pulchemmina 5,0

Medio de vehiculación 5,0

Ejemplo 7: Composición fertilizante comparativa

Componente % en peso

Urea 99,0

Extracto de Pulchemmina 1 ,0

Ejemplo 8: Composición fertilizante comparativa

Componente % en peso

Urea 95,0

Extracto de Pulcherrimina 5,0

Ejemplo 9:

Se estudió la capacidad inhibidora de la actividad ureasa de las composiciones fertilizantes de la invención en varias muestras de tierra. Con este fin, se midió la actividad de la enzima ureasa y se observó su variación en función de la concentración de extracto de pulcherrimina. Los resultados se muestran en la figura 2. Como se puede observar en la figura 2, el extracto de pulcherrimina efectivamente disminuye la actividad de la ureasa.

Ejemplo 10: Con el fin de valorar la influencia del medio de vehiculación basado en ácidos húmicos sobre la actividad de la ureasa, se estudió la variación en el tiempo del nitrógeno ureico presente en un suelo tratado con urea respecto a un suelo tratado con urea con 0,5% extracto de pulcherrimina + 0,5% medio de vehiculación (ejemplo 3). Los resultados se muestran en la figura 3. Como se puede observar en la figura 3, la cantidad de urea presente en el suelo disminuye rápidamente en pocos días, mientras que esta dism inución es mucho más lenta en caso de la urea con el inhibidor pulcherrimina aportado en el medio de vehiculación.