Campo da aplicação

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia, mais especificamente no campo da mutação ou engenharia genética, mais especificamente manipulação genética de células eucarióticas.

Histórico da invenção e análise do estado da técnica

[0002] A coagulação sanguínea é uma via essencial para a hemostasia em seres humanos. Esta via é formada por uma cascata enzimática complexa que culmina na formação de uma rede de fibrina que, juntamente com adesão e agregação de plaquetas, formam um coágulo que visa estancar a hemorragia no tecido lesionado (Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 2010;32(5):416-421 ).

[0003] Três proteínas são críticas nas etapas finais da via de coagulação (Blood. 2013 Mar 7;121 (10):1712-9): fibrinogênio (fator I), pró-trombina (fator II), e fator XIII. Pró-trombina é uma serina protease que, quando ativada pelo complexo pró-trombinase (fator Xa+Va), torna-se enzimanticamente ativa (trombina) e cliva proteoliticamente fibrinogênio e fator XIII para formar moléculas de fibrina e fator Xllla, respectivamente. As moléculas de fibrina polimerizam-se espontaneamente formando protofilamentos que, após ligação cruzada catalisada por fator Xllla, constituem uma rede tridimensional estável. Assim sendo, a ativação de trombina é uma etapa chave na formação de um coágulo.

[0004] As moléculas de fibrina são as unidades básicas para formação de filamentos que formam um coágulo, sendo, portanto, a proteína preponderante nessa estrutura. O fibrinogênio é ranqueado como a terceira proteína mais abundante no plasma humano, com concentração circulante de 2-4g/L. [0005] Várias técnicas têm sido usadas para isolar e concentrar fibrinogênio e trombina a partir de um pool de plasma humano, incluindo precipitação (Blood separation and plasma fractionation, Wiley-Liss Pub, New York. pg. 349-383), crioprecipitação (Methods Mol Biol, 201 1 , 728, 259-265) e purificação cromatográfica (US patent 7,550,567. February 25, 2005; US patent 7,816,495. January 22, 2004).

[0006] O conhecimento da cascata de coagulação e das proteínas críticas para formação do coágulo de fibrina, juntamente com métodos para isolamento dessas proteínas a partir de plasma humano, direcionou o desenvolvimento de hemoderivados voltados ao tratamento de hemorragias (Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use, John Wiley & Sons, 2013). Produtos conhecidos como selantes de fibrina ou cola de fibrina baseiam-se na aplicação local de moléculas de fibrinogênio e trombina (podendo conter fator XIII) para formação de um selante biológico. Esse tipo de selante biológico, ou cola de fibrina, é amplamente usada em cirurgias como agente acessório para alcançar hemostasia e também como selantes cirúrgicos para cicatrização de feridas (Drugs. 201 1 Oct 1 ;71 (14):1893-915). No sítio de aplicação, uma solução contendo fibrinogênio é misturada com outra solução contendo trombina que catalisa a conversão de fibrinogênio para monômeros de fibrina resultando na formação de um hidrogel que adere ao tecido, ou coágulo de fibrina.

[0007] Embora selantes de fibrina comerciais já estejam disponíveis há mais de 30 anos, o mercado continua em expansão. Esforços recentes têm sido feitos para desenvolver selantes de fibrina humanos totalmente recombinantes em sistemas de cultivo de células, com a grande vantagem de serem livres de qualquer patógeno transmissível pelo sangue. As proteínas necessárias para o preparo de um selante de fibrina recombinante (fibrinogênio, trombina e fator XIII) são extensivamente modificadas pós-traducionalmente (Blood. 2013 Mar 7;121 (10):1712-9). Logo, a produção destas só é viável em células eucarióticas, descartando-se os sistemas de produção bacterianos.

[0008] A trombina humana recombinante produzida em célula CHO já está disponível como um produto licenciado pelo FDA (Recothrom, ZymoGenetics) e, recentemente, também foi expressa em células CHO DHFR de maneira a alcançar altos níveis de produção da proteína (J Biosci Bioeng. 2015 Oct;120(4):432-7). O fator XIII recombinante, produzido por fermentação em leveduras, foi recentemente aprovado para tratamento de deficiência congénita de fator Xlll-A (Tretten, Novo Nordisk).

[0009] O fibrinogênio, proteína mais abundante num coágulo e, portanto, crítica na produção de uma cola de fibrina recombinante, foi primariamente expressa em células CHO (Blood, 1997, 89, 4407-4414). Entretanto, a produção de altos níveis de fibrinogênio com intuito de comercialização de um biofármaco só foi alcançado recentemente. O grupo de pesquisa do Dr. Willian H. Velabnder da Universidade de Nebraska, EUA, expressou fibrinogênio no leite de vacas transgênicas (Biomacromolecules. 2013 Jan 14;14(1 ):169-78.) e recentemente publicou a primeira geração de uma cola de fibrina totalmente recombinante (J Surg Res. 2014 Mar;187(1 ):334-42) contendo fibrinogênio obtido do leite de vacas, fator XI MA produzido em leveduras e trombina recombinante comercial (Recothrom, ZymoGenetics).

[0010] Outro instituto também lidera o desenvolvimento de uma cola de fibrina totalmente recombinante: Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, KAKETSUKEN do Japão. Esse grupo produz fibrinogênio em células CHO DG44 alcançando mais de 1 g/L dessa molécula (J Biochem. 2016 Feb;159(2):261 -70). Essa foi a primeira demonstração de produção recombinante de fibrinogênio capaz de atender alta demanda industrial. Entretanto, a solução encontrada por Hirashima e colaboradores foi a amplificação do número de cópias dos genes de fibrinogênio através da amplificação por metatrexato em células CHO deficientes para ação da enzima dihidrofolato redutase (DHFR). O mesmo grupo recentemente também utilizou o mesmo método de expressão em células CHO DHFR deficientes para alcançar altos níveis de produção da proteína trombina (J Biosci Bioeng. 2015 Oct;120(4):432-7).

[0011] Embora o mecanismo de amplificação gênica em células DHFR- deficientes já tenha sido usado com sucesso para produção de diversas proteínas recombinantes comercialmente importantes (incluindo eritropoetina, Epogen, Procrit, hormônio do crescimento, Genentech e diversos anticorpos monoclonais), o sistema de amplificação mediado por metatrexato possuiu o problema de alta instabilidade genômica que pode culminar com a inibição da expressão do gene de interesse (Biotechnol Lett. 2013 Jul;35(7):987-93; Biotechnol Bioeng. 201 1 Oct;108(10):2434-46). Além disso, após a amplificação gênica com metatrexato, as culturas devem ser continuamente expostas à droga para evitar o silenciamento gênico (Biotechnol Bioeng. 2009 Mar 1 ;102(4):1 182- 96), encarecendo a produção.

[0012] Todos os selantes de fibrina descritos acima, atualmente disponíveis como biofármacos e produzidos a partir de plasma humano, não adiantam a presente invenção, já que aqui se utiliza um sistema recombinante para produção da cola de fibrina.

[0013] A cola de fibrina produzida pelo grupo da Universidade de Nebraska nos EUA (J Surg Res. 2014 Mar;187(1 ):334-42) revela um método interessante de expressão e purificação de fibrinogênio a partir do leite de vacas transgênicas. Não adianta a presente invenção por usar sistemas de expressão distintos dos aqui empregados.

[0014] O grupo japonês Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (KAKETSUKEN), em conjunto com a companhia farmacêutica Teijin Pharma, produziu fibrinogênio e trombina em células CHO em alta escala, pela primeira vez, entregando o produto numa tela bioabsorvível (KTF-374). Não adianta o objeto de análise pois (i) não inclui o fator XIIIA em sua composição, (ii) por usar um sistema de expressão recombinante diferente para alcançar maiores níveis de expressão, incluindo seleção com antibióticos e amplificação gênica mediada por metatrexato, o que implica em instabilidade genética. A presente invenção, por sua vez, faz uso de FACS {fluorescence activated cell sorting) para seleção de células positivas altamente estáveis. Além disso, a presente invenção (iii) utiliza a co-expressão da chaperona ERp57 para obter altos níveis de expressão de fibrinogênio.

Problemas no estado da técnica

[0015] Diversos selantes de fibrina estão disponíveis no mercado para o suporte da hemostasia em cirurgias, todos produzidos a partir de plasma humano. Hemoderivados possuem um risco intrínseco de contaminação com vírus e príons. Além disso, é praticamente inevitável a co-purificação a partir do plasma de fatores fibrinolíticos que dificultam a estabilização e funcionalidade das moléculas de fibrinogênio. De forma a inibir a fibrinólise, alguns fabricantes adicionam inibidores de plasminogênio na formulação de selantes de fibrina hemoderivados. O ácido tranexâmico é usado com essa finalidade, mas por ser potencialmente neurotóxico, esse tipo de selante não pode ser usado em neurocirurgias. O plasminogênio indesejável pode ser retirado por técnicas cromatográficas, dispensando-se o uso de inibidores de plasminogênio, o que encarece o processo. O desafio central na produção de fibrinogênio a partir de plasma humano é a obtenção de uma solução estéril concentrada, após inativação virai, contendo 50-120mg/ml de fibrinogênio que mantenha sua solubilidade e atividade. Esse processo é laborioso e envolve diversas etapas de manipulação do plasma.

[0016] Considerando os problemas de hemoderivados citados acima, a principal lacuna a ser preenchida no estado da técnica de produção de selantes baseados em fibrina é o preparo de componentes totalmente produzidos em sistemas recombinantes de alta eficiência em células de mamíferos. As principais dificuldades tecnológicas encontradas neste campo de produção de proteínas recombinantes estão diretamente associadas à baixa estabilidade genética das células utilizadas (Curr. Opin. Struct. Biol. 2015 Jun;32:81 -90), com implicações negativas na produtividade.

[0017] Tradicionalmente, a expressão de proteínas recombinantes se dá por meio de clonagem de genes heterólogos em plasmídeos contendo elementos genéticos necessários à expressão em células hospedeiras, tais como promotores compatíveis, sinais de terminação de transcrição e elementos selecionáveis como genes de resistência a antibióticos etc, que permitem a seleção das células contendo o gene heterologo de outras células negativas na população.

[0018] No entanto, é necessário que o conjunto genético contendo o gene heterologo e o gene de seleção seja transmissível através das gerações celulares e, para isto, é necessária a integração de tal conjunto no genoma da célula hospedeira. Como a integração no genoma é normalmente um evento raro e de caráter randômico, se torna necessária a geração de clones, uma vez que integrações distintas apresentam variabilidades de alta escala na capacidade de produzir proteínas heterólogas em razão da resistência do genoma em absorver novas integrações, fato geralmente associado a infecções virais ou câncer. Esta resistência causa inativação progressiva do conjunto genético heterólogo por processos de metilação do DNA, a exceção sendo integrações adjacentes a genes essenciais. Na prática, o que se observa é que inexistem métodos que permitam prever o comportamento destas células durante os processos de seleção e elaboração dos bancos celulares (Porter AJ, Racher AJ, Preziosi R, Dickson AJ. Biotechnology Progress 26(5):1455-64 (2010)).

[0019] O único método documentado para produção de fibrinogênio (J Biochem. 2016 Feb;159(2):261 -70) e trombina (J Biosci Bioeng. 2015 Oct;120(4):432-7) em células CHO em escala comercial utiliza amplificação gênica mediada por metatrexato em células CHO DHFR-deficientes. Como já exposto anteriormente, essas linhagens são geneticamente instáveis, não solucionando de maneira ideal o problema de geração de uma população celular estável para manutenção de um banco máster de células produtoras.

Solução da presente invenção

[0020] A presente invenção soluciona os problemas citados acima para produção de uma cola de fibrina recombinante por meio da produção das proteínas necessárias (Fibrinogênio, Trombina e Fator XIII) em um sistema de expressão proprietário para produção de linhagens celulares recombinantes de alta estabilidade, denominado "Plataforma genética para superexpressão heteróloga associada à seleção de células altamente produtoras de proteínas" (pedido de patente BR 10 2017 001876 8).

[0021] A plataforma genética desenhada para obtenção de alto grau de expressão de proteínas heterólogas em células eucarióticas, resumidamente, consiste em:

1 . Garantir alta taxa de integração do cassete de expressão no cromossomo da célula hospedeira, mediada por transposase. 2. Presença de isoladores genéticos flanqueando os cassetes de integração que garantem alto nível de transcrição independentemente do sítio de integração cromossômica.

3. Co-expressão de um repórter fluorescente que permite monitoramento da expressão em tempo real e seleção de clones ou populações homogéneas altamente produtoras independente de seleção por antibióticos.

4. Desenvolvimento de linhagens celulares proprietárias, a partir da introdução de genes otimizados na célula (fusão Atf66-Xbp1 ), favorecendo o aumento na quantidade de proteína viável e mantendo, ao mesmo tempo, sua integridade biológica.

5. Possibilidade de expressão regulada por doxiciclina em um sistema TetON modificado.

[0022] Tal plataforma genética foi usada para expressão recombinante em células CHO das proteínas (i) fibrinogênio, (ii) pró-trombina, (iii) fator XIIIA, (iv) ecarina e (v) ERp57. A proteína ecarina é uma protease derivada do veneno de cobra Echis carínatus que possui a capacidade de ativar pró-trombina para trombina através de clivagem proteolítica, (Thromb Res. 1975 Jan;6(1 ):57-63) dispensando-se a necessidade do complexo pró-trombinase (fator Xa+Va) para produção de trombina ativada. Já a proteína ERp57 é uma chaperona que possui homologia a proteínas dissulfido-isomerases e que está presente no retículo endoplasmático. Foi descrita como essencial para a montagem da proteína hexamérica fibrinogênio a partir de dois trímeros das subunidades α, β e γ (PLos ONE. 2013 Set;8(9):e74580).

[0023] A co-expressão dessa proteína com as subunidades α, β e γ do fibrinogênio em células CHO leva a um aumento da concentração de fibrinogênio secretado por essas células. As proteínas expressas e secretadas pelas células CHO são então purificadas por métodos cromatográficos. A ecarina é adicionada ao sobrenadante contendo trombina para sua ativação e depois é totalmente retirada da mistura. Trombina ativada, fibrinogênio e fator XIII produzidos pelo método sumarizado acima são então utilizadas para formulação de uma cola de fibrina recombinante. Descrição das figuras

[0024] A Figura 1 mostra as construções genéticas usadas para a expressão de cada gene em células CHO.

[0025] A Figura 2 mostra um esquema da plataforma genética usada para transfecção dos genes de interesse e seleção de populações positivas por FACS. É mostrado como exemplo o gene de pró-trombina.

[0026] A Figura 3 mostra um exemplo de seleção de populações homogéneas altamente secretoras da proteína de interesse para a proteína trombina.

[0027] A Figura 4 mostra a análise por coloração de Coomassie de SDS- PAGE e western blot do fibrinogênio total produzido em células CHO pela presente invenção. 1 = F-ABG, Pós centricon, coloração por comassie; 2= F- ABG, Pós centricon, Western blot; 3= F-ABG, Aliquota do Biorreator, IP:V5 Western Blot.

[0028] A Figura 5 mostra os ensaios de clotabilidade por turbimetria à 350nm. A polimerização e turvação do fibrinogênio recombinante são semelhantes às do fibrinogênio padrão derivado de plasma humano na presença de trombina humana ativada. 0.2 mg/ml de FBG, 1 U/ml de Trombina (50 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2).

[0029] A Figura 6 mostra um western blot contra trombina expressa e purificada pela presente invenção.

[0030] A Figura 7 mostra a atividade de trombina recombinante, ativada por ecarina recombinante, através de ensaio cromogênico. A1 : Trombina comercial ativada com fator Xa/Va; B1 , 2, 3: Ecarina (diferentes frações de purificação) + Pró-trombina comercial; C1 , 2, 3: Ecarina (diferentes frações de purificação) + Pró-trombina; D1 : Ecarina + Pró-trombina E1 : Ecarina + Pró- trombina comercial.

[0031] A Figura 8 mostra a ligação de moléculas de fibrina catalisada por fator Xlll+trombina, analisada por western blot contra fibrinogênio. [0032] A Figura 9 mostra a seleção e expressão de fibrinogênio em células CHO ERp57 -/+.

Metodologia detalhada

[0033] A plataforma genética para superexpressão heteróloga associada à seleção de células altamente produtoras de proteínas (pedido de patente BR 10 2017 001876 8) foi empregada para expressão das 4 proteínas necessárias para a produção da cola de fibrina recombinante. A Fig. 1 mostra as construções usadas para a expressão de cada gene. Os cassetes de expressão foram inseridos no genoma de células proprietárias produzidas pelo grupo que expressam de maneira condicional a fusão dos genes Atf6-Xbp1 sob o controle de tetraciclina (ou doxiciclina). Para maior detalhamento desse sistema, consultar patente da plataforma genética (BR 10 2017 001876 8).

[0034] As proteínas Atf6 e Xbp1 são as principais transdutoras de sinal na via de estresse do retículo endoplasmático (UPR - unfolded protein response) e, depois de ativadas, agem no núcleo celular induzindo a expressão de um conjunto de genes (chaperonas, enzimas envolvidas na glicosilação, formação de pontes dissulfeto e transporte de vesículas) capazes de estabilizar um fenótipo celular altamente secretor de proteínas (Celi. 2001 Dec 28;107(7):881 - 91 ; Mol Immunol. 2004 Jul;41 (9):919-27; EP2316955A1 ). Ao fusionar a forma ativa de ambas as proteínas em um único polipeptídio Atf6-Xbp1 , construímos um sistema simples e direto para ativação da via UPR que facilita a indução de aumento de expressão de proteínas recombinantes, visto que diferentes proteínas podem ter aumento de expressão na presença de Atf6 ou Xbp1 . Basicamente, após a cultura celular atingir a fase estacionária de crescimento (ponto de maior densidade celular, -107 células/mL) induz-se a expressão de Atf6-Xbp1 . Dessa forma, as células deixam de se dividir e passam para um metabolismo celular focado na síntese e tráfego proteico.

[0035] Para a produção de fibrinogênio, três plasmídeos recombinantes da plataforma genética, cada um contendo um gene para uma cadeia de fibrinogênio A, B ou G - e um gene repórter diferente (Fig. 1 ) foram sequencialmente integrados no genoma da célula hospedeira CHO-S via transposição pela transposase Sleeping Beauty. As células produtoras foram então selecionadas por cell sorting em citometria de fluxo, através da detecção do respectivo produto do gene repórter (Fig. 2). Para as demais proteínas (pró- trombina, fator XIII e ecarina), somente um vetor da plataforma genética foi necessário visto que são proteínas de cadeia única (Fig. 1 ).

[0036] Inicialmente, as células foram transformadas com os vetores descritos na Fig. 1 . Após seleção por FACS (Fig. 2) e crescimento significativo da cultura celular (5-7 dias pós-transfecção), a cultura transformada sofreu o primeiro ciclo de seleção, onde foram coletadas as células que estavam com fluorescência detectável em relação às células não transfectadas. Neste momento, cerca de 5% das células da cultura apresentavam este perfil de expressão. Todavia, após 14 dias da transformação (7 dias após primeiro ciclo de seleção por cell sorting) mais de 50% das células apresentam elevados níveis de produção das proteínas recombinantes exógenas, conforme aferição pelo gene repórter. A figura 3 mostra um exemplo de seleção de populações homogéneas altamente secretoras da proteína de interesse para a proteína Trombina.

[0037] Após o segundo ciclo de seleção celular e mesmo mantendo estas células por mais de 12 dias em crescimento (vida média deste tipo de células em biorreatores), os resultados mostraram que mais de 98 por cento das células ainda apresentavam alto índice de expressão, aferido pelo sistema repórter utilizado (Fig. 3)

Clonagem e expressão dos genes da cola de fibrina recombinante

[0038] O fibrinogênio é produzido no fígado a partir da expressão de três genes: FGA, FGB e FGG. Após processamento no retículo endoplasmático e Golgi, as três proteínas formam um hétero trímero na composição A2B2G2 que é secretado na circulação sanguínea. Portanto, o DNA complementar (cDNA) foi preparado a partir de RNA mensageiro (mRNA) de fígado humano e os três genes foram amplificados por PCR e sequenciados. As sequências completas de FGA, FGB e FGG (sem íntrons) foram então preparadas sinteticamente para uso na presente invenção: FGA (SEQ ID NO: 1 ), FGB (SEQ ID NO: 2) e FGG (SEQ ID NO: 3), presentes na listagem de sequências. As proteínas usadas para expressão de cada as seguites: CD20 para FGA, CD25 para FGG e GFP para FGB (Fig. 1 ).

[0039] As sequências de aminoácidos foram deduzidas a partir de sequências de nucleotídeos, e têm 100% de homologia com a sequência deduzida dos templates do NCBI (NM_021871 / NM_001 18471 / NM_021870.2)

[0040] O fator XIII é produzido no fígado a partir da expressão de dois genes distintos, F13A1 e F13B. Após processamento, a proteína é secretada na circulação como um hetero tetrâmero composto por duas cadeias A e duas cadeias B. O homo dímero F13A(2) possui atividade catalítica latente e o homo dímero F13B(2) serve como transportador plasmático, mas não é necessário para a atividade biológica do Fator XIII. Uma vez processado proteoliticamente por Trombina, F13A(2) e F13B(2) se separam e F13A(2) exerce sua atividade bioquímica como uma transglutaminase produzindo um crosslink covalente lateral sobre os polímeros de fibrina, conferindo robustez estrutural ao coágulo fibrinocítico.

[0041] O gene F13A1 foi amplificado a partir do cDNA de fígado humano e sequenciado, e a região CDS sintetizada para clonagem na plataforma genética. A sequência sintética usada (SEQ ID NO: 4) foi clonada no vetor de expressão da plataforma genética CD25 (Fig. 1 ). As sequências de aminoácidos foram deduzidas das sequências de nucleotídeos apresentadas abaixo e têm 100 % homologia com a sequência deduzida dos templates do NCBI NM_000129.3

[0042] A trombina é produzida no fígado a partir da expressão do gene

F2 e é secretada na circulação sanguínea como uma pró-enzima com atividade latente do tipo serina-protease. A pró-trombina é processada proteoliticamente por componentes da cascata de coagulação sanguínea convertendo-a em uma serina protease ativa (trombina) que age principalmente sobre fibrinogênio para produzir polímeros de fibrina, Fator XIII (revelando a atividade transglutaminase deste) e fator VIII, convertendo este em fator Villa, um amplificador essencial na cascata de coagulação. A pré-pró-trombina (F2) foi amplificada por PCR a partir do cDNA de fígado humano e sequenciado. A CDS completa foi sintetizada (SEQ ID NO: 5) e clonada no plasmídeo da plataforma genética CD25 (Fig. 1 ) e também no plasmídeo RFP. As sequências de aminoácidos foram deduzidas das sequências de nucleotídeos apresentadas abaixo e tem 100 % de homologia com a sequência deduzida dos templates do NCBI NM_000506.3

[0043] O gene das proteínas ecarina (SEQ ID NO: 6) e ERp57 (SEQ ID NO: 7) foi obtido de maneira similar, de forma sintética, e então subclonados nos vetores da plataforma genética contendo os repórteres GFP e RFP, respectivamente (Fig. 1 ).

[0044] Os grupos de células cuja expressão de proteínas permaneceu constante em relação à expressão pré-congelamento, foram mantidos como um banco máster. Células obtidas por este processo seletivo foram usadas para crescimento em biorreator de 1 .7 litros (Fig. 2) usando a estratégia batch em meio CHO Freestyle, 8 mM Glutamax, penicilina/streptomicina. O crescimento e a viabilidade celular são monitorados diariamente e a cultura é interrompida ao primeiro sinal de perda de viabilidade. As células são então separadas por centrifugação e o sobrenadante contendo fibrinogênio é concentrado for filtração tangencial e submetido a diafiltração em tampão apropriado a ser utilizado no processo subsequente de purificação. Os mesmos processos de transfecção, seleção, expansão, armazenamento e produção foram efetuados para os outros dois componentes, Fator XIII e pró-trombina, e ecarina usada para ativar pró- trombina.

Purificação dos componentes

[0045] Após a concentração do sobrenadante de células CHO contendo fibrinogênio e diafiltração em tampão Tris, a solução obtida é carregada em coluna de troca iônica DEAE pré-equilibrada no mesmo tampão numa operação controlada por um sistema de FPLC. O fibrinogênio é eluído num sistema de gradiente contínuo de de NaCI em Tris e coletado automaticamente num coletor de frações. Após análise das frações por western blot e ELISA para determinação da presença, integridade e concentração de fibrinogênio, as frações escolhidas são misturadas, concentradas e dessalinizadas para tampão Citrato/NaCI por centrifugação em filtro seletivo e submetidas a gel filtração operada no FPLC. A fração contendo fibrinogênio é coletada e armazenada em freezer a -20°C. Uma pequena amostra da fração é reanalisada para integridade e concentração de fibrinogênio. [0046] Os sobrenadantes de células CHO contendo ecarina e pró- trombina sofrem o processo de concentração por filtração tangencial e então são misturados, na proporção 1 :10 (ecarina:trombina) e incubados a 37°C por 16 horas. A solução então é submetida a diafiltração para tampão Citrato de sódio e a amostra é carregada em coluna de troca iônica pré-equilibrada com o mesmo tampão. A proteína ligada a coluna é lavada com tampão de lavagem e eluída com gradiente linear de NaCI em Citrato.

[0047] Para FXIII, concentração e diafiltração são realizadas no mesmo sistema em tampão Tris. A amostra é então carregada em coluna de troca iônica e equilibrada no mesmo tampão. Proteína ligada é lavada com 5 volumes de tampão de lavagem e eluída por gradiente contínuo de NaCI em Tris. As amostras coletadas após a coluna de troca iônica (DEAE e QAE) são analisadas por western blot e ELISA para determinação da presença, integridade e concentração com anticorpos específicos anti-pró-Trombina e anti-FXIII. Frações contendo a proteína desejada são misturadas e dessalinizadas para tampão Citrato e NaCI (pró-Trombina) ou Tris e NaCI (FXIII) por centrifugação em filtro seletivo e submetidas a gel filtração operada no FPLC. As frações contendo pró- Trombina ou FXIII, são coletadas e armazenadas em freezer.

Resultados analíticos

[0048] A análise por coloração de Coomassie de SDS-PAGE e western blot do fibrinogênio total (Fig. 4) demonstrou fibrinogênio intacto composto das cadeias individuais A, B e G com as massas moleculares esperadas (Fig. 4). Porém a característica mais importante de qualquer fonte de fibrinogênio é a medida da proporção sensível à clotabilidade. Para a medição da clotabilidade, fibrinogênio é incubado com trombina que processa proteoliticamente as regiões terminais das cadeias A e B do fibrinogênio resultando na polimerização de monômeros de fibrina em cadeias monoméricas (fibrina) que são insolúveis no ambiente fisiológico. Esta insolubilidade causa a formação de um coágulo inicial de característica opticamente turva que absorve luz no comprimento de onda entre 340 e 350 nm.

[0049] Portanto, utiliza-se este ensaio de turbimetria a 350 nm para a aferição de clotabilidade de qualquer amostra de fibrinogênio, usando uma amostra padrão com clotabilidade conhecida para efeito de comparação. Os resultados da Fig. 5 mostram que a polimerização e turvação do fibrinogênio recombinante são semelhantes ao do fibrinogênio padrão derivado de plasma humano na presença de trombina humana ativada.

[0050] Análise por western blot da pró-trombina produzida em nosso sistema mostra uma banda predominante com a massa molecular esperada de 75 kDa (Fig. 6). Fisiologicamente, pró-Trombina é convertida em trombina ativa pela ação da protease fator Xa em combinação com o co-fator Va (complexo pró- trombinase). A ativação gera um heterodímero associado covalentemente por pontes dissulfeto composto por cadeia beta (37 kDa) e cadeia alfa (variável, 3-6 kDa). A atividade de trombina pode ser avaliada por ensaio de absorbância usando um substrato cromogênico (beta-Ala-Gly-Arg para-nitroanilide) que, quando clivado por trombina libera o grupo p-nitroanilide que pode ser detectado por absorbância a 405nm. A Fig. 7 mostra os resultados da análise de atividade de trombina recombinante (medida pela liberação de p-nitroanilide) na presença ou não de ecarina recombinante. Os resultados mostram que ecarina recombinante é capaz de ativar pró-trombina recombinante para trombina, gerando sinais de absorbância similar a trombina de plasma humano ativada por fator Xa/Va. Os resultados da Fig. 7 indicam que ambas proteínas produzidas na presente invenção, ecarina e pró-trombina, são enzimaticamente ativas.

[0051] O coágulo inicial formado pela insolubilidade dos monômeros de fibrina não tem estrutura rígida, devido à ausência de ligação química entre os monômeros. A trombina ativa age sobre o Fator XIII nativo clivando a região N- terminal a partir do resíduo Arg 37, causando a ativação do modo transglutaminase do FX III. O FXIII ativo (FXIIIa) catalisa uma reação covalente entre resíduos Lisina e Glutamina em moléculas paralelas de fibrina. Isto resulta na estabilidade estrutural e bioquímica do coágulo de fibrina. Esta atividade transglutaminase pode ser visualizada em géis SDS-PAGE dado ao aparecimento de oligômeros de cadeias alfa (alfa-n) e dímeros de cadeias gamma (gamma-gamma) resistentes a SDS e agentes redutores (Fig. 8). Os resultados do western blot (usando anticorpo anti-fibrinogênio) da Fig. 8 mostram a formação de α -oligômeros e γ -dímeros somente quando na presença de FXIII e Trombina ativada, evidenciado em gel desnaturante. Já em gel não- desnaturante (Fig. 8), é possível observar a formação de complexos de alto peso molecular devido à ligação cruzada entre moléculas de fibrina catalisada por fator Xllla.

[0052] A proteína ERp57 foi descrita como essencial para a montagem da proteína hexamérica fibrinogênio a partir de dois trímeros das subunidades α, β e γ (PLos ONE. 2013 Set;8(9):e74580). Comparação dos níveis de expressão de fibrinogênio em células ERp57- vs ERp57+ mostrou que a co-expressão e ERp57 aumenta a produção de fibrinogênio recombinante em mais de 5 vezes (Fig. 9).

Formulação dos componentes da cola de fibrina para aplicações individuais ou em conjunto

[0053] O produto conta com duas soluções distintas em recipientes separados. No primeiro tubo, temos como substâncias ativas o fibrinogênio e o Fator XIII. No segundo recipiente, temos a trombina. Ao misturarmos o conteúdo dos dois recipientes, permitimos assim a ativação dos componentes obtendo um selante de fibrina biológico para aplicação local.

[0054] Ademais, cada proteína pode ser preparada em tubos individuais para entrega independente de cada fator de coagulação, que podem ser usados com diversos intuitos.

[0055] Tubo A (Fibrinogênio + Fator XIII):

- Fibrinogênio: 50 - 120 mg/ml.

- Fator XIII de coagulação: 10 - 90 U/ml (1 unidade (U) é equivalente à atividade de fator XIII de 1 mL de plasma fresco citratado (conjunto de plasma) de doadores saudáveis).

- Excipientes: cloridrato de arginina, cloreto de sódio (1 1 mg/ml), citrato de sódio (4,8 - 9,7 mg/ml), glicina, cloreto de cálcio (10-50 pmol/ml), e água para injeção.

[0056] Tubo B (trombina):

- Trombina: 400 - 1200 Ul/ml.

- Excipientes: cloreto de cálcio (5 - 7 mg/ml), albumina humana (10 - 20 mg), manitol, acetato de sódio, e água para injeção.