蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程� ��運転条件を決定するにあたって、重要な項� ��は、蛋白製剤中間製品の平均蛋白濾過速度� ��、ウイルス除去率である。濾過速度は一般� ��蛋白質濃度と負の相関があり、蛋白質濃度� ��高くなると濾過速度が低下するため、濾過� ��間が長くかかってしまい好ましくない。蛋� ��質濃度を下げるために希釈工程を付加する� ��とは、設備面でもコストがかかることにな� ��好ましくない。蛋白質濃度が高濃度のまま� ��、濾過速度を低下させずに濾過するには、� ��イルス除去フィルター自体の耐圧が600kPa以� ��あることが前提であるが、入口と出口を夫� ��少なくとも一つ有する容器とウイルスを除� ��するためのウイルス除去膜とを有し、容器� ��空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中� ��製品の入口側空間と出口側空間に仕切られ� ��おり、入口の構造が600kPa以上の耐圧性を持� ��嵌合構造を持つノズルであるウイルス除去� ��ィルターを用いて濾過すればよい。

 ここで言う600kPa以上の耐圧性を持つ嵌合� ��造を持つノズルには、例えばルアーロック� ��ノズルや、ワンタッチ接続ノズル(例えばSMC 社製のインチサイズワンタッチミニ、インチ サイズワンタッチ管継手、ワンタッチミニ(� �上登録商標)など)、カプラー式ノズル、フェ ルール接続式ノズルなどがあり、これらを使 用できる。これら以外でも、液漏れなく濾液 を送り込むことができる、600kPa以上の耐圧性 を持つ嵌合構造を持つノズルであれば、本発 明に適用できることは言うまでもない。

 また、ウイルス除去膜の有効膜面積は、0.00 01m ² 以上0.03m ² 以下である必要がある。0.03m ² より大きいと、濾過に必要な蛋白製剤中間製 品の量が大量になってしまうため、評価コス トがかかる問題点が生じる。一方、有効膜面 積が0.0001m ² 未満と小さいと濾過量が少なくなり、ウイル ス除去性能を評価するための蛋白製剤中間製 品の体積が少なすぎてウイルスの定量が困難 になる問題点が生じる。従って、0.0001m ² 以上0.03m ² 以下が適当である。好ましくは0.0003m ² 以上0.02m ² 以下、より好ましくは0.0005m ² 以上0.01m ² 以下であり、最も好ましくは0.0007m ² 以上0.002m ² 以下である。

 なお、ウイルス除去膜の有効膜面積とは� ��ウイルス除去膜の表面積のうち、蛋白製剤� ��間製品が通過しうる部分の面積をいう。ウ� ��ルス除去膜が中空糸の場合で、中空糸の内� ��から外側に濾過する場合は、中空糸内側の� ��面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しう� ��部分の面積をいい、中空糸の外側から内側� ��濾過する場合は、中空糸外側の表面積のう� ��、蛋白製剤が通過しうる部分の面積をいう� ��また、ウイルス除去膜が平膜の場合は、蛋� ��製剤中間製品を流しこむ側の面の表面積の� ��ち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の� ��積をいう。

 ウイルス除去膜の有効膜面積の調整は、� ��空糸型フィルターでは、中空糸の本数を増� ��させることによって容易にスケールアップ� ��スケールダウン可能であり、スケールアッ� ��・スケールダウン時の大きな外乱因子もな� ��ため、スケーラビリティを得ることが容易� ��あるという特徴がある。すなわち、中空糸� ��フィルターの場合、膜面積が変わると濾過� ��積が変わるのみで、濾過性能は維持される� ��考えてよい。膜面積が変わることによる影� ��は、濾液が増減することによる影響である� ��少なすぎると、ウイルスの定量に弊害が生� ��、多すぎると操作の利便性やコストに影響� ��でることは前述の通りである。平膜の場合� ��、著しいスケールアップは膜の形状を変え� ��(円盤型から筒型へ、など)ことになるが、� �様の影響しかないと考えられる。蛋白製剤� �造工程におけるウイルス除去工程の工程設� �が、実生産スケールではなく、小スケール� �実施できるのは、このようなスケーラビリ� �ィの信頼性によるものである。

 ウイルス除去フィルターとしては、前述� ��構造をもつものが利用できる。膜の形状は� ��平膜構造や中空糸構造のものが利用できる� ��、好ましくは中空糸構造のものがよい。膜� ��材質としては、600kPa以上の耐圧性を有する� ��のが利用できる。例えば、ポリフッ化ビニ� ��デン(PVDF)やポリエーテルスルホン(PES)、ポ� �スルホン(PS)のような合成高分子を素材とし� ��親水性を持たせた膜が好ましい。肝要な点� ��600kPa以上の耐圧性を有するという点である� ��

 合成高分子を素材とする膜に親水性を持た� ��る方法には、ビニル基を1個有する親水性ビ ニルモノマーを微多孔膜の細孔表面に、3%以� ��、50%以下のグラフト率でグラフト重合する� ��法(国際公開第2004/035180号パンフレット)や、 架橋剤を介して多官能価アクリレートまたは メタクリレートから形成する高分子を結合さ せる方法(特開2000-1548号公報)、さらに重合開� ��剤と親水性モノマーを含む溶液を膜に含浸� ��せ、細孔中で重合させる方法(国際公開第91/ 16968号パンフレット)など多くの方法が知られ る。親水性を持たせる目的は、疎水性の合成 高分子を素材とする膜の蛋白製剤中間製品の 濾過性を向上させることにある。したがって 、親水性を持たせる方法はここに例示した限 りではない。
 なお、ここでいうグラフト率とは、下記式� ��定義される。
 グラフト率(%)=100×{(グラフト後の膜質量-グ� ��フト前の膜質量)/グラフト前の膜質量}

 膜の構造は、蛋白製剤中間製品を流す方向� ��従って、上流側に孔径が大きく、空孔率が� ��い粗大構造層が存在し、下流側に孔径が小� ��くウイルスを除去するのに適した緻密構造� ��が存在し、粗大構造層と緻密構造層のつな� ��りは連続的に孔径が変化しているグラジエ� ��ト構造であることが好ましい。
 また更に好ましい膜の構造は、開孔率が大� ��い粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造� ��を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜で� ��って、該粗大構造層が少なくとも一方の膜� ��面に存在し、その厚みが5.0μm以上であり、� ��緻密構造層の厚みが膜厚全体の50%以上であ� ��て、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一� ��化している多層微多孔膜であるものが好ま� ��い。
 さらに、前記粗大構造層は、膜表面から緻� ��構造層に向かって部分開孔率が連続的に減� ��する傾斜構造で、一方の膜表面のみに存在� ��るものが好ましい。この膜は、例えば特開� ��11-319522号公報や、特開平9-169867号公報、国� �公開第2004/035180号パンフレットに開示される 方法で製造することができる。

 評価に使用するウイルスとしては、蛋白� ��剤に混入する恐れのある関連ウイルスや特� ��的モデルウイルス、非特異的モデルウイル� ��の中から任意に選択することができる。こ� ��で言う関連ウイルス、特異的モデルウイル� ��、非特異的モデルウイルスの定義は日米EU� �薬品規制調和国際会議(ICH)ガイドラインに記 されているものと同義である。すなわち、関 連ウイルスとは、蛋白製剤の製造工程で使用 される細胞基材、その他の試薬類や各種物質 に混在することが知られているか、あるいは 存在の可能性があるウイルス類と同一または 同種のウイルスと定義される。特異的モデル ウイルスとは、存在が知られている、あるい は疑われているウイルスに密接に関連してい るウイルス。すなわち同一の属または科のも ので、検出されたウイルスまたは存在が疑わ れるウイルスと類似した物理的・化学的性質 を有するものと定義される。非特異的モデル ウイルスは、製造工程がウイルスの除去や不 活化に関して一般にどの程度の能力を有する かを解析する目的、すなわち工程が確実にウ イルスクリアランス能力を発揮するという面 での特性(robustness)を解析する目的で行なうウ イルスクリアランス工程特性解析試験に使用 されるウイルスと定義される。

 例えば、製剤がモノクローナル抗体など� ��ウス由来基材から製造される場合、関連ウ� ��ルスや特異的モデルウイルスとして、マウ� ��白血病ウイルスなどのレトロウイルス、マ� ��ス最小ウイルスなどのパルボウイルス、牛� ��痢症ウイルスなどのフラビウイルスを用い� ��ことができる。非特異的モデルウイルスと� ��て、ブタパルボウイルスなどのパルボウイ� ��スを最小サイズのウイルスモデルとして使� ��することもできる。

 また、製剤が血漿分画製剤など、ヒト血� ��由来基材から製造される場合は、関連ウイ� ��スとして、ヒトパルボウイルスB19(パルボウ イルス科)やHIVウイルス(レトロウイルス科)な どを、B19の特異的モデルウイルスとしてブタ パルボウイルス(パルボウイルス科)や、C型肝 炎ウイルスの特異的モデルウイルスとしての 牛下痢症ウイルス(フラビウイルス科)などを� ��いることができる。同様に、単純ヘルペス� ��イルス、仮性狂犬病ウイルスなどヘルペス� ��イルス科や、パラインフルエンザウイルス� ��どパラミクソウイルス科、レオウイルス3型 などレオウイルス科、ポリオウイルスなどピ コルナウイルス科、SV40ウイルスなどパポー� �ウイルス科などから選択して使用すればよ� �。使用するウイルスの選択については、ICH� �どの公知要求事項をもとに決めるべきもの� �ある。

 これらの、評価に使用するウイルスは、� ��白製剤中間製品にある一定量添加され、ウ� ��ルス除去フィルターによる濾過前後のウイ� ��ス量を測定して、ウイルス除去性能評価を� ��定する。このとき添加するウイルス量は、� ��要となるウイルス除去率から逆算して求め� ��ことができる。しかし、ウイルス溶液に混� ��している夾雑物(不純物)が原因でフィルタ� �に目詰まりを起こすことがあり、濾過試験� �弊害が生じる可能性があるため、添加ウイ� �ス量は、そのウイルス溶液の純度によって� �整することが望ましい。ウイルス溶液が精� �されている場合は、蛋白製剤中間製品の体� �に対して10%体積以下、好ましくは5%体積以下 まで、より好ましくは1%体積以下のウイルス� ��液を添加してもよいが、精製されておらず� ��雑物を多く含む場合は、1%体積以下、好ま� �くは0.5%体積以下、より好ましくは0.1%体積以 下の少ない量を添加するのが望ましい。ただ し、LRV≧3が検出可能な必要最低限の量以上� �体積のウイルス溶液を添加することが望ま� �い。

 なお、ここで言うウイルス除去率LRVは、ウ� ��ルス除去フィルターで濾過する前の溶液の� ��イルス量に対する、濾過したあとの溶液の� ��イルス量の低下率を対数値で示したもので� ��る。例えば、下記式で計算することができ� ��。
 LRV=log ₁₀ A-log ₁₀ B
 ただし A = ウイルス除去フィルターで濾� �する前の溶液のウイルス濃度
     B = ウイルス除去フィルターで濾過� �た後の溶液のウイルス濃度

 また、ウイルスの調製法によっては、大� ��の夾雑物を含有し、濾過速度に大きなダメ� ��ジを与える場合がある。その場合は、ウイ� ��スを精製して夾雑物を分離してから使用す� ��ばよい。ウイルスの精製法は超遠心分離を� ��いた方法などがすでに公知である。

 ウイルス除去フィルターのウイルスの除� ��率LRVは3以上であることを満たす条件を設定 する。ウイルス除去フィルターの孔径よりも 大きなサイズのウイルスの除去率は、通常LRV ≧3となり、一方ウイルス除去フィルターの� �径よりも小さなウイルスの除去率は通常LRV&l t;3となる( 泉 浩業ら、血漿分画製剤の安全� ��に関する検討II.モノクローナル抗体精製乾� ��濃縮人血液凝固第VIII因子製剤(クロスエイ� �M(登録商標))及び筋注用人免疫グロブリン製� ��(抗HBs人免疫グロブリン「日赤」(登録商標), 人免疫グロブリン「日赤(登録商標)」)の製造 工程におけるウイルス除去膜の効果について 、Japanese Journal of Transfusion Medicine 、(1999)  、 Vol.45. No.3, Pages 357-361.)。このとき、決� �て除去率は必ずLRV=0となるわけではなく、3� �下のある程度の除去率が得られることがあ� �が、それはウイルス除去フィルターのサイ� �分離による本来あるべき除去率ではなく、� �イルス分子の部分的凝集や吸着によるもの� �考えられる。従って、フィルターの孔径以� �のサイズのウイルスを意図して除去しよう� �する際には、LRV≧3以上の除去率を満たすべ� ��である。

 本発明の濾過方法に使用される蛋白製剤� ��間製品としては、抗体医薬中間製品、組換� ��蛋白医薬中間製品、血漿製剤中間製品、血� ��分画製剤中間製品などが適用できるが、特� ��免疫グロブリン製剤中間製品が好ましい。� ��らに好ましくは、免疫グロブリンG製剤中間 製品であり、最も好ましくは、免疫グロブリ ンGのモノクローナル抗体製剤中間製品であ� �。

 これら蛋白製剤中間製品を、まずはウイル� ��添加を行なわずに、ウイルス除去フィルタ� ��装置で濾過することにより、蛋白製剤中間� ��品の平均蛋白濾過速度を評価する。蛋白質� ��度が20mg/ml以上100mg/ml以下という高濃度で、� ��つ蛋白製剤中間製品の入口圧力が150kPa以上6 00kPa以下の高圧条件で、1時間以上5時間以下� �過することにより、平均蛋白濾過速度(kg/m ² /Hr)を評価する。平均蛋白濾過速度が1.0kg/m ² /Hr以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確 認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で 、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添 加して、ウイルス除去フィルターで濾過する ことにより、ウイルス除去工程のウイルス除 去性能を評価する。

 蛋白製剤の製造工程における1バッチの製造 量は、総重量拡大化の傾向にある。蛋白製剤 の1バッチの総量(総重量)は、例えば抗体医薬 製剤では、生産性向上の研究が進み、1バッ� �が50kg以上という高い生産能力が示されてい� ��例もある。このような高い生産能力の蛋白� ��剤においても、ウイルス除去工程という一� ��の工程は1日で完了することが、蛋白製剤中 間製品の安定性や、製造工程の効率の面から 望ましい。そのためには、ウイルス除去フィ ルターの平均蛋白濾過速度が1.0kg/m ² /Hr以上であるべきである。1.0kg/m ² /Hr以上であれば、50kgの蛋白製剤中間製品の� �過を4m ² フィルター1本で12.5時間以内に、2本で6.25時� �以内に濾過することが可能である。

 平均蛋白濾過速度が1.0kg/m ² /Hr以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確 認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で 、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添 加して、ウイルス除去フィルターで濾過する ことにより、ウイルス除去工程のウイルス除 去性能を評価する。すなわち、ウイルス除去 率LRV≧3を満たす蛋白製剤中間製品の蛋白質� �度条件、及び入口圧力条件を選択する。蛋� �質濃度が20mg/ml以上100mg/ml以下という高濃度� �、かつ蛋白製剤中間製品の入口圧力が150kPa� �上600kPa以下の高圧で濾過した場合に、同様� �1.0kg/m ² /Hr以上の平均蛋白濾過速度が得られ、かつLRV ≧3となるウイルス除去率を確認し、スケー� �アップした場合の設備、操作条件等を予想� �る。なお、ウイルス溶液を添加しないで実� �する平均蛋白濾過速度の測定は省略し、ウ� �ルスを添加した系で同時に測定することも� �きる。

 また、蛋白質濃度は高濃度で濾過するほ� ��が、濾過装置・容器・配管などのスケール� ��ップによるコストアップを防止することが� ��きるメリットがある。その反面、高濃度に� ��りすぎると、安定性の面から問題が生じる� ��したがって、蛋白質濃度は20mg/ml以上100mg/ml� ��下で実施するが、好ましくは25mg/ml以上100mg/ ml以下、より好ましくは30mg/ml以上100mg/ml以下� ��最も好ましくは30mg/ml以上50mg/ml以下である� �

 濾過の際の入口圧力は、高圧の方が短時間� ��迅速に濾過を行なえるメリットがあるが、� ��力が高すぎると、装置への圧力によるダメ� ��ジやリークのリスクが増えるため、入口圧� ��は、150kPa以上600kPa以下で実施する。好まし� ��は196kPa以上500kPa以下、より好ましくは245kPa� ��上400kPa以下、さらに好ましくは294kPa以上400k Pa以下、最も好ましくは294~300kPaである。蛋白 質濃度および入口圧力は、上記範囲内で、平 均蛋白濾過速度が1.0kg/m ² /Hr以上であり、かつLRVがLRV≧3を同時に満た� �るように数点振って評価することが好まし� �。

 また、蛋白製剤中間製品をウイルス除去� ��ィルターに流す濾過時間は、1時間以上、5� �間以下であるが、スケールアップしたとき� �蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程を� �ウイルス除去フィルターの膜面積は大きく� �っても短時間で完了したい場合は、短時間� �、多少長くかかってもウイルス除去膜の有� �膜面積を小さくしたい場合には、長時間に� �定することができる。また濾過開始後3時間� ��もLRV≧3であることを満たす条件を決定する ために、蛋白製剤中間製品をウイルス除去フ ィルターに3時間以上5時間以下流すことも好� ��である。