Chitine-glucane d'extrait fongique de qranulométrie fine

L'invention concerne un copolymère chitine-glucane sous forme de poudre de granulométrie fine et contrôlée, en particulier de très fine granulométrie, utilisable notamment dans le domaine de la cosmétique, et particulièrement l'utilisation d'un copolymère entre la chitine et des beta-glucanes pour prévenir ou réduire les signes du vieillissement cutané.

L'invention concerne également un tel polymère sous forme de matériaux poreux, notamment pour son utilisation en ingénierie tissulaire.

Etat de l'art

II est connu que certains polysaccharides exercent une action hydratante pour les couches supérieures de l'épiderme, ou même permettent de prévenir ou d'atténuer certains des signes du vieillissement cutané. En particulier, les ingrédients à base de beta-glucanes, le schizophyllane, le xyloglucane, l'acide hyaluronique, les galactomannanes, la chitine sont fréquemment employés dans les produits de soin cosmétiques. Ces polysaccharides se distinguent des ingrédients de type alpha- hydroxyacide, qui agissent en desquamant l'épiderme, ce qui favorise un renouvellement cellulaire rapide mais peut altérer les couches inférieures de l'épiderme. La plupart des ingrédients anti-âge agissent sur le renouvellement des cellules de la peau ou du collagène. Or un mécanisme de renouvellement du collagène pose le problème de la compatibilité avec la législation en matière de produits cosmétiques, dont on ne peut pas revendiquer une pénétration transcutanée. Traiter les signes du vieillissement cutané va au-delà de la notion de rides et du renouvellement cellulaire, et rares sont les actifs disponibles aujourd'hui qui adressent le problème de manière globale et réellement efficace.

Parmi les polysaccharides à effet « anti-âge », les beta-glucanes, issus de levures, de champignons, de céréales, ou de plantes, sont une famille de polysaccharides purs constitués d'unités D-glucose, liées entre elles par des liaisons de type bêta, les carbones étant liés variant selon l'espèce dont ils sont extraits, avec une structure plus ou moins branchée : bêta(l,3)(l,6) pour les beta-glucanes issus de la levure Saccharomyces cerβvisiae ; bêta(l,3) pour la chaîne principale (branchée en position bêta(l,6) par des chaînes courtes) du schizophyllane, issu du champignon Schizophyllum commune ; bêta(l,4) pour les beta-glucanes issus de céréales comme l'avoine, l'orge, le blé ; bêta(l,4) pour la chaîne principale (branchée en position bêta(l,6) par des chaînes courtes) pour le xyloglucane issu de plantes. La solubilité en milieu aqueux des beta-glucanes dépend de leur structure, de la longueur des chaînes macromoléculaires et de l'organisation tri-dimensionnelle des chaînes.

Les beta-glucanes sont appréciés en cosmétique pour leurs effets (qui diffèrent selon la molécule considérée) revitalisant, anti-inflammatoire, protecteur contre les radiations UV, apaisant, immunostimulant, anti-âge, anti-ride, antiacné, etc, qui conduisent à une amélioration des symptômes du vieillissement cutané ou de l'acné. Les beta-glucanes recherchés en cosmétique sont généralement hydrosolubles pour pouvoir être incorporés dans la phase aqueuse des émulsions, ce qui limite le choix en terme de molécules utilisables en cosmétique. En effet, les beta-glucanes non solubles ont des propriétés cosmétiques et dermatologiques très intéressantes, mais ne peuvent pas être incorporés aux formules cosmétiques en raison de leur forme en particules dures, irritantes, etc. Les quelques beta-glucanes hydrosolubles utilisables en cosmétique sont présentés sous la forme d'extraits ou de solutions riches en beta-glucanes.

D'autre part, des usages cosmétiques des dérivés hydrosolubles de la chitine (carboxyméthylchitine et chitosane principalement) sont connus, par exemple dans des crèmes de soin, comme agent filmogène, hydratant, améliorant l'aspect des peaux sujettes à la cellulite par exemple, ou également pour la préparation de microsphères. Cependant, la chitine à usage cosmétique

et ses dérivés sont industriellement obtenus à partir de carapaces de crustacés - crevette, crabe -, les crustacés étant un des principaux responsables d'allergies. Des cas d'allergies à des crèmes contenant des dérivés de chitine ont d'ailleurs été publiés (Cleenewerck MB, Martin P, Laurent D. Allergie contact dermatitis due to a moisturizing body cream with chitin. Contact Dermatitis 31, 196, 1994 ; Pereira F, Pereira C, Lacerda MH. Contact dermatitis due to a cream containing chitin and a carbitol. Contact Dermatitis 38, 290, 1998).

A la connaissance des inventeurs, la chitine (le polymère constitué des unités N-acétyl-D-glucosamine) obtenue au départ des carapaces de crustacés ou au départ d'algues microscopiques n'est pas connue comme pouvant prévenir ou réduire les effets du vieillissement cutané. Le chitosane, qui est le polymère dérivé de la chitine, portant des charges cationiques, constitué des unités D- glucosamine/N-acétyl-D-glucosamine, ses dérivés (succinamide) et ses sels (par exemple lactate, ascorbate, glycolate, succinate) sont utilisés en cosmétique pour leurs propriétés substantîve, filmogène, hydratantes, antimîcrobienne, anti-âge, hydratant, améliorant l'aspect de la cellulite, améliorant du toucher des formules.

Les inventeurs ont déjà montré que l'on peut isoler et purifier un copolymère composé de deux types de chaînes, chitine [poly(N-acétyl-D- glucosamine)] et bêta-glucane [poly(D-glucose)] à partir de champignons. Les parois des cellules du mycélium de certains champignons, comme Aspergillus niger{ûe type Ascomycète), sont constituées des deux polysaccharides liés entre eux de manière covalente dans un réseau tridimensionnel dénommé « chitine- glucane ». Or ce copolymère chitine-glucane peut être avantageusement produit de manière hautement pure et économiquement rentable par un procédé en étapes successives, comme décrit dans le brevet EP1483299B1 (US 2005/130273 Al ou WO 03068824 Al). On obtient une poudre fine, blanche, non odorante, dont la teneur en copolymère chitine-glucane est supérieure à 90%. Cette poudre n'est soluble dans aucun solvant, ni aqueux, ni organique, ce qui a priori compromet

son usage en cosmétique. Différentes applications sont décrites dans les demandes de brevets FR 05 07066 et FR 06 51415.

Des usages médicaux de compositions à base d'extraits fongiques contenant la chitine et les beta-glucanes ont été décrits auparavant, en particulier comme actifs cicatrisants de plaies. Cependant ces différentes utilisations, par exemple sous forme de pansements, ne sont a priori pas adaptées pour une formulation cosmétique.

Buts de l'invention L'invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un copolymère chitine-glucane présentant une forme adaptée à une utilisation cosmétique, et en particulier en dermocosmétique ou en dermatologie, et/ou adaptée à une utilisation médicale ou pharmaceutique, et/ou adaptée à une utilisation comme complément alimentaire pour l'homme ou l'animal.

L'invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un copolymère chitine-glucane sous forme de suspension ou d'émulsion ou de dispersion, notamment utilisable dans le domaine de la cosmétique, et en particulier de la dermocosmétique ou de la dermatologie.

La présente invention a notamment pour but de fournir une composition dermocosmétique pour réaliser un soin du corps et/ou du visage, comme un soin hydratant, raffermissant, protecteur, ou anti-rides (décrit notamment par une évaluation du relief de la peau par profïlométrie) ou anti-âge. La présente invention a également pour but de résoudre les problèmes techniques mentionnés ci-dessus en fournissant une substance d'origine naturelle qui présente innocuité, tolérance cutanée et oculaire, une très bonne hypoallergénicité, tout en étant aisément disponible en grand volume, et à un coût compatible avec l'usage comme ingrédient cosmétique. La présente invention a également pour but d'optimiser une composition de complément alimentaire permettant une administration orale aisée et

favorisant la biodisponibilité et les effets sur la santé du copolymère chitine- glucane.

La présente invention a également pour but de fournir une poudre de chitine-glucane permettant d'ajuster et d'optimiser ses propriétés physico- chimiques et biologiques selon l'application envisagée, comme composition dermocosmétique et dermatologique, composition de complément alimentaire, composition d'aliment fonctionnel, auxiliaire de technologie pour le traitement des boissons, composition pour des dispositifs médicaux comme par exemple des produits cicatrisants. L'invention a également pour but de fournir une substance naturelle d'origine non animale, d'excellente pureté, bien caractérisée, obtenue par un procédé de production qui garantit reproductibilité et traçabiiité.

La présente invention a également pour but de fournir une substance naturelle, de type polysaccharïde, stable en poudre et en suspension, facile à formuler, compatible avec l'ensemble des ingrédients les plus couramment employés, et qui permette la préparation de formulations cosmétique stables dont les caractéristiques sont en adéquation parfaite avec leur usage, par exemple avec une texture parfaitement homogène et dont les qualités sensorielles (viscosité, texture, toucher) sont excellentes. L'invention a pour but de proposer un actif cosmétique permettant de prévenir ou de réduire les effets du vieillissement cutané, d'hydrater la peau de manière durable, de la tonifier, et/ou de la raffermir, de lui rendre un aspect homogène et lisse, de diminuer l'état squameux, de la protéger contre les agressions extérieures comme la sécheresse et/ou pollution par les métaux lourds, de lui permettre de restaurer sa fonction barrière. L'invention a pour but de proposer également un ingrédient cosmétique ayant un pouvoir de rétention d'eau et un pouvoir viscosifiant important.

L'invention a également pour but de fournir un matériau poreux utilisable par exemple en l'ingénierie tissulaire et culture cellulaire ou utilisable comme matériau en cosmétique ou en pharmaceutique.

Résumé de l'invention

Afin de résoudre les problèmes techniques mentionnés ci-dessus, les inventeurs sont partis de l'action des substances de type bêta-glucane en cosmétique qu'ils connaissaient. Cependant aucune composition à base d'un copolymère chitine-glucane n'aurait pu être a priori utilisable dans la mesure où la poudre obtenue, comme par exemple selon le procédé décrit dans la demande de brevet PCT WO 03068824, n'est pas soluble en phase aqueuse ou organique.

Les inventeurs ont cependant découvert de manière surprenante que l'on pouvait résoudre les problèmes techniques mentionnés ci-dessus en utilisant une poudre de granulométrie très fine et contrôlée d'un copolymère chitine-glucane.

Cette solution est tout à fait surprenante dans la mesure où l'homme du métier s'attendait à ce que les particules finement broyée de ce copolymère soient également insolubles et qu'elle se présenteraient de la même manière que les beta-glucanes non solubles, c'est-à-dire sous forme de particules dures et irritantes pour la peau.

Les inventeurs ont pu de manière surprenante d'une part préparer des dispersions stables de chitine-glucane, et des suspensions stables de chitine- glucane, en particulier dans l'eau sans additif, et d'autre part, préparer des émulsions stables contenant notamment des concentrations élevées en chitine- glucane.

Par «chitine-glucane», les inventeurs entendent un copolymère de chitine- glucane selon la présente invention.

En particulier l'invention concerne un polysaccharide d'origine fongique comprenant majoritairement un copolymère chitine-glucane, ledit polysaccharide ayant une granulométrie fine.

L'invention concerne également une poudre finement broyée d'un extrait fongique comprenant au moins un copolymère chitine-glucane finement broyé.

Avantageusement, les particules de granulométrie fine ont au moins 70% en poids des particules une taille inférieure à 500 microns (μm), et de préférence inférieure à 355 microns (μm).

Encore de préférence au moins 50%, de préférence 60%, en poids des particules ont une taille inférieure à 250 microns (μm), et de préférence inférieure à 150 microns (μm).

On entend par « taille de particules inférieure à X microns » des particules ayant une dimension leur permettant le passage au travers d'un tamis dont la taille des mailles est de X microns.

Un mode de réalisation permet d'obtenir au moins 50% en poids des particules d'une taille inférieure à 65 mesh (environ 149 μm), et de préférence inférieure à 100 mesh (environ 230 μm). La granulométrie est avantageusement contrôlée en choisissant, notamment après tamisage ou classification, une fraction de taille particulière en fonction des besoins. Les fractions auxquelles il est fait référence dans les exemples sont inclues ici par référence dans leur généralité, notamment vis-à-vis du type de co-polymère qui peut être l'un quelconque de ceux décrits dans la présente invention.

Avantageusement, le copolymère de chitine-glucane comprend un rapport entre les unités N-acétyl-D-glucosamine de la chitine et les unités D-glucose des beta-glucanes compris entre 95:5 et 15:85 (m/m).

Avantageusement, le polysaccharide d'origine fongique comprend plus de 70 % de copolymère chitine-glucane en masse par rapport à la masse totale de l'extrait d'origine fongique, de préférence supérieure à 85 %.

Avantageusement, les enchaînements entre les unités D-glucose sont majoritairement de type bêta(l,3).

De préférence l'extrait fongique est issu du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier de Aspergillus niger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus.

Avantageusement, au moins 85 % de la partie chitine du copolymère chitine-glucane sont des unités N-acétyl-D-glucosamine, et qu'au plus 15 % sont des unités D-glucosamine.

On préfère que l'extrait fongique de taille de particules micrométrique soit un hydrolysat du copolymère chitine-glucane.

Avantageusement, le rapport entre la chitine et le bêta-glucane est compris entre 90:10 et 30:70 (m/m). L'invention concerne également une composition comprenant un polysaccharide ou un extrait fongique de granulométrie fine tel que défini précédemment, notamment sous forme de suspension ou d'émulsion ou dispersion.

Avantageusement, la composition est une composition cosmétique, en particulier dermocosmétique ou dermatologique.

De préférence le polysaccharide de l'extrait fongique de granulométrie fine est utilisé à une concentration comprise entre 0,01 et 10%, et de préférence entre 0,05 et 5%, en poids de la composition totale.

L'invention concerne également l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus pour exercer un soin cosmétique, de préférence dermocosmétique ou dermatologique, caractérisée en ce que le soin est choisi parmi le groupe consistant en un soin du corps ou du visage, pour améliorer, notamment de manière durable et significative l'hydratation de la peau, augmenter le pouvoir de rétention de l'eau de la peau notamment à long terme, améliorer la fonction barrière de la peau, exercer un effet anti-âge , améliorer l'aspect de la peau, améliorer l'homogénéité de la peau, notamment en la rendant plus lisse, plus homogène, plus douce, plus saine, améliorer la fermeté et la tonicité de la peau, et favoriser l'accrochage de l'épiderme au derme.

On entend par produit présentant un effet anti-âge un produit ou une composition qui permet de ralentir le vieillissement cutané, notamment par le fait d'améliorer la protection de la peau et/ou les activités de défense de la peau, de réduire les effets d'agressions extérieures, telles que les rayonnements, la sécheresse de l'air, le froid, la pollution notamment pas les métaux lourds, les agressions libérant des radicaux libres, et notamment les agressions par radiation UV, ainsi que par le fait de réduire les rides cutanée.

L'invention concerne également une composition telle que définie ci- dessus pour diminuer la profondeur des rides ou ralentir ou prévenir l'apparition des rides.

Les compositions cosmétiques comprennent avantageusement de 0.1 à 2% du copolymère chitine-glucane de granulométrie fine.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus comme composition de complément alimentaire de préférence pour obtenir un effet choisi parmi le groupe consistant en un effet antioxydant, hypocholestérolémiant, hypolipidémiant, de stimulation du système immunitaire, hypoglycémique, notamment dans le cas de diabète, et un effet de prévention et/ou de traitement, et/ou de lutte contre une pathologie choisie parmi le groupe consistant en la dyslipidémie, l'athérosclérose, l'obésité, d'une maladie liée à l'obésité, une maladie cardiovasculaire, le syndrome métabolique, le diabète, et l'hyperuricémie. De préférence dans cette composition de complément alimentaire, le copolymère de l'extrait fongique de granulométrie fine est utilisé comme principe actif.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif au moins un copolymère ou un extrait d'origine fongique, tel que défini précédemment.

L'invention concerne notamment l'utilisation en l'ingénierie tissulaire d'un matériau poreux obtenu à partir du polysaccharide ou extrait d'origine fongique selon la présente invention, et concerne donc également matériau poreux obtenu à partir du polysaccharide ou extrait d'origine fongique selon la présente invention. Ce matériau poreux peut être obtenu notamment par lyophilisation.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un polysaccharide ou un extrait d'origine fongique, tel que défini précédemment comme excipient d'une composition, notamment d'une composition cosmétique, de préférence dermatologique ou dermocosmétique.

L'invention concerne encore un procédé de préparation d'un extrait fongique de granulométrie fine comprenant : a) l'extraction et la purification d'un copolymère chitine-glucane à partir d'une biomasse fongique, ledit copolymère de cet extrait fongique étant insoluble dans l'eau ou un solvant organique, b) des étapes, simultanées, ou séparées indépendamment de leur ordre, de filtration, de séchage, de broyage, et de classification des particules, au départ du chitine-glucane sec ou solvaté, permettant d'obtenir des particules micrométriques dont au moins 70% en poids, de préférence 75%, et encore de préférence 80%, des particules ont une taille inférieure à 500 microns (μm), et de préférence inférieure à 355 microns (μm).

De préférence l'étape b) du procédé de préparation de l'extrait fongique de granulométrie permet d'obtenir au moins 50%, de préférence 60%, et encore de préférence 70%, en poids des particules totales obtenues, ayant une taille inférieure à 250 microns, de préférence inférieure à 125 μm.

On peut ainsi à l'étape b) mettre en œuvre une étape simultanée de filtration, de séchage, et de broyage, puis une étape séparée de classification.

L'invention concerne également le dispositif que nous appareillage pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention.

Description détaillée de l'invention

Les compositions selon l'invention permettent d'obtenir des formulations avec un toucher agréable et doux, ce qui est très avantageux dans le domaine de la cosmétique notamment.

En particulier, la stabilité, la texture, la couleur, le toucher, la viscosité et la rhéologie des émulsions ou suspensions obtenues sont parfaitement adaptées à la production de crèmes de soin du visage ou du corps, y compris pour les bébés. Enfin, l'excellente tolérance cutanée {in vitro et in vivo chez l'homme) et oculaire {in vitro), ainsi que l'hypoaliergénicité {in vivo chez l'homme, selon la procédure de Maibach-Marzulli) d'un copolymère chitine-glucane ont été établies.

La solution proposée par les inventeurs est d'autant plus avantageuse dans la mesure où un copolymère chitine-glucane purifié issu de sources fongiques, notamment mais pas exclusivement, de type Ascomycète est disponible en grande quantité en tant que sous-produit industriel. II est notamment préféré d'utiliser comme source fongique le mycélium à'Aspergillus niger.

Selon l'invention, Ie copolymère chitine-glucane extrait du mycélium de champignons de type Ascomycète peut être formulé aisément, bien que non hydrosoluble, notamment sous forme d'une composition cosmétique. Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que quand le composé chitine-glucane issu des sources de champignons se présente sous la forme d'une poudre de granulométrie fine, il est tout à fait adapté à la préparation d'une composition permettant de résoudre les problèmes techniques mentionnés ci-dessus. La poudre de chitine-glucane avantageusement obtenue selon le procédé décrit dans la demande de brevet PCT WO03/068824, ou dans la demande de brevet français FR 0507066 est préparée de manière à obtenir une granulométrie fine et contrôlée notamment par des procédés de filtration, de broyage, de séchage et/ou de classification des particules. Lorsqu'une granulométrie fine est recherchée, on sélectionne un procédé pour obtenir des particules dont au moins 70% en poids, de préférence 75%, et encore de préférence 80%, des particules ont une taille inférieure à 500 microns (μm), et de préférence inférieure à 355 microns (μm).

Avantageusement, les particules ont au moins 50% en poids, de préférence 60%, et encore de préférence 70%, des particules ont une taille inférieure à 250 microns (μm), et de préférence inférieure à 150 microns (μm).

De préférence, on met en œuvre un procédé de préparation de la poudre de chitine-glucane de manière à obtenir majoritairement des particules ayant une taille inférieure à 250 microns. Avantageusement, les particules selon la présente invention sont constituées essentiellement de particules ayant une taille inférieure à 125 μm,

voire inférieure à 90 μm, et notamment sont obtenues après classification pour obtenir une distribution étroite.

Il est possible de mettre en oeuvre le procédé de préparation de la poudre par l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier. Il est avantageux de sélectionner une technique permettant de contrôler au mieux la granulométrie et de manière bien définie.

Par granulométrie on entend la forme, plus ou moins sphérique, la taille et la distribution de taille des particules de la poudre de chitine-glucane. Ce paramètre qui caractérise l'ingrédient en poudre influence d'une part la manière dont on peut le formuler, c'est-à-dire l'incorporer dans une composition solide ou liquide comme une matrice alimentaire, une crème cosmétique, un liquide alimentaire ou cosmétique, un dispositif médical ou pharmaceutique. Selon la granulométrie obtenue, et notamment selon l'aspect ou la forme finale désirée, la composition obtenue sera plus ou moins homogène. La granulométrie et la distribution de taille des particules sont caractérisées par les techniques classiques telles que la diffraction de lumière (par exemple un système de diffraction laser Mastersizer 2000 de Malvern Instruments), la microscopie électronique à balayage suivi d'une analyse d'image, ou le tamisage sur tamis successifs suivi d'une mesure gravimétrique. Avantageusement, il a été établi de manière surprenante qu'en ajustant la distribution de taille des particules de manière à obtenir une taille de particules inférieure à 125 μm, on peut obtenir une crème homogène contenant le copolymère chitine-glucane. Cela permet notamment d'incorporer ce copolymère après formation d'une émulsion, même à une concentration élevée (par exemple 2%), et atteindre une texture parfaitement homogène et dont les qualités sensorielles (viscosité, texture, toucher) sont excellentes. On utilise donc avantageusement les la fraction des particules ayant la taille la plus faible.

Lorsque la taille des particules est plus importante, l'ingrédient n'apporte plus ces qualités sensorielles, le produit forme des grains palpables à l'étalement de la crème, et/ou la formulation n'est pas stable dans le temps, ce qui n'est pas

désiré dans le cas d'une composition topique, et notamment dans une crème de soin.

Avantageusement, une poudre de granulométrie fine et contrôlée peut être utilisée pour Ia préparation d'aliments dits fonctionnels, comme des biscuits, pâtes, confiseries, barres diététiques, pains, boissons, beurres, margarines, etc..

Avantageusement, la poudre de granulométrie fine peut être mise en œuvre sous la forme d'une dispersion aqueuse, et entrer dans la composition de dispositifs médicaux comme des systèmes cicatrisant et/ou hémostatiques. De manière surprenante, le chitine-glucane de granulométrie fine peut être mise en œuvre sous la forme d'un matériau poreux cohésif, présentant une bonne stabilité mécanique, et de porosité supérieure à 80%, de préférence supérieure à 90%, par des techniques porogènes bien connues de l'homme du métier. Le matériau poreux peut être préparé soit en partant d'une dispersion aqueuse concentrée sous la forme d'une pâte de chitine-glucane seul, soit en partant d'une dispersion d'un mélange de chitine-glucane et d'autres composés insolubles et dispersables, soit en partant d'une dispersion de chitine-glucane dans une phase aqueuse dans laquelle un polymère ou une autres substance est solubilisé. La porosimétrie et les propriétés mécaniques des matériaux obtenus est fonction des paramètres de formulation, notamment de la granulométrie du chitine-glucane, de la composition du mélange, de la concentration de la dispersion de départ, ainsi que des paramètres de mise en œuvre de la dispersion.

Pour la préparation de produits dermocosmétiques et dermatologiques, le chitine-glucane de granulométrie fine, avec des particules de taille étant de préférence inférieure à 125 μm, possède avantageusement une bonne affinité à la fois avec des composantes présents en phase aqueuse et en phase huileuse, ce qui favorise le procédé d'incorporation.

La poudre de chitine-glucane de granulométrie fine peut être produite industriellement selon divers procédés, en fonction de la granulométrie visée, soit au départ du chitine-glucane en poudre sèche, soit au départ du chitine-glucane solvaté en milieu aqueux ou organique, ou encore au départ du chitine-glucane

incorporé dans un milieu plus complexe comme une émulsion huile dans eau ou eau dans huile. Les inventeurs entendent par procédés de préparation de poudre de granulométrie fine tous les procédés solide-liquide et solide-solide de filtration, de séchage, de broyage, d'homogénéisation, de réduction de taille des particules, et de classification des particules, appliqués aux solides, aux solides solvatés, et aux milieux complexes solvatés tels que les émulsions, les suspensions colloïdales, etc.

Les différents procédés de séparation industriels peuvent être utilisés au départ de chitine-glucane solvaté, comme par exemple avec un sécheur conique, un filtre Nϋtsche, un filtre à plaque, un filtre à bande, un sécheur à lit fluidisé, un équipement d'atomisation, pour parvenir à un séchage complet ou partiel du chitine-glucane. Les procédés peuvent être appliqués sur le chitine-glucane solvaté tel quel ou après broyage du chîtine-glucane solvaté. Les différents procédés industriels de fragmentation pour obtenir des poudres de granulométrie fine et contrôlée peuvent être appliqués sur le produit totalement ou partiellement séché, ou sur le produit solvaté, comme par exemple les procédés de broyage à fléaux, à marteaux, à galets, à couteaux, à lames, à disque, à contre-jet d'air, et les procédés de désintégration, par exemple aux ultrasons et de micronisation. Les différents procédés industriels de séparation des poudres peuvent être employés pour diminuer la largeur de la distribution de taille ou sélectionner une taille spécifique, comme par exemple avec des équipements de tamisage et de classification dynamique et statique.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour obtenir une poudre de chitine-glucane d'origine fongique insoluble dans l'eau ou un solvant organique, ayant une granulométrie fine, pour préparer les particules du copolymère chitine-glucane stables dans une solution aqueuse ou organique notamment pour préparer une suspension ou émulsion.

L'étape permettant d'obtenir la poudre de granulométrie fine est réalisée avant ou après la préparation de l'émulsion ou de la suspension ou de la dispersion.

Cette suspension ou dispersion ou émulsion contient des substances généralement utilisées dans le domaine la cosmétique et permettent avantageusement la formulation d'une composition cosmétique.

Des compositions cosmétiques contiennent généralement de 0,01 à 10% en poids des compositions selon la présente invention, notamment de 0,01 à 10% en poids sous forme de suspension ou d'émulsion, par rapport au poids de la composition totale.

Les inventeurs entendent par dérivés du copolymère chitine-glucane tous les composés étant obtenus au départ de chitine-glucane, par modification physique ou chimique, selon des procédés physiques, chimiques et enzymatiques.

La présente invention concerne en particulier un polysaccharide d'origine fongique comprenant un polymère comprenant des chaînes bêta-glucane, lesdites chaînes de bêta-glucane consistant essentiellement d'enchaînements d'unités D-glucose via des liaisons en position (1,3), et de préférence comprenant au moins 80% en masse de chaînes bêta-glucane dont l'enchaînement de D-glucose est en position (1,3) par rapport au pourcentage de la masse total de bêta-glucane, notamment pour la fabrication d'une formulation cosmétique. Un copolymère chitine-glucane peut être avantageusement obtenu selon le procédé décrit dans la demande de brevet PCT WO03/068824, et la demande de brevet français FR 0507066 déposée par KitoZyme S.A. le 4 juillet 2005. Ce procédé est décrit en particulier dans la demande FR 0507066 pages 18, ligne 14 et suivantes. On utilise de préférence Aspergillus niger comme source fongique dans ce procédé.

L'enchaînement des unités D-glucose et la proportion entre les chaînes alpha(l,6)-chitine et beta-glucanes dépendent du champignon et de la souche. Par exemple, il a été montré par les inventeurs qu'un mycélium û' Aspergillus niger contient le copolymère chitine-glucane avec un rapport massique entre chitine et bêta-glucane entre 30:70 et 60:40, avec un enchaînement des unités D-glucose principalement du type bêta(l,3).

Le copolymère se présente généralement sous la forme d'une poudre blanche. Il est essentiellement insoluble dans les solvants aqueux et organiques quelle que soit la température et Ie pH. Il est hygroscopique, pouvant généralement absorber environ 10 fois sa masse en eau. Cette poudre de chitine-glucane peut par exemple être produite par des procédés industriels de manière à obtenir un produit de granulométrie fine selon la présente invention.

La présente invention concerne un extrait, avantageusement purifié, de source fongique, et préférentiellement du mycélium de champignons de type Ascomycète comme û'Aspergillus niger. Les hydrolysats des extraits purifiés, c'est-à-dire les copolymères de chitine et bêta-glucane de masse moléculaire inférieure, font également partie de l'invention. La présente invention couvre également sous le terme « copolymère de chitine-glucane » ou « chitine- glucane » tous les composés obtenus au départ de chitine-glucane, par modification physique ou chimique du copolymère, selon un procédé physique, chimique ou enzymatique, dans la mesure où les propriétés du copolymère chitine-glucane restent équivalentes pour les applications envisagées, et où les copolymères sont insoluble dans l'eau et un solvant organique dans la plage de granulométrie de la présente invention, mais formulable sous forme de dispersion, d'émulsion, ou de suspension. La disponibilité et la qualité en particulier û'Aspergillus niger, qui est un co-produit de la production industrielle d'acide citrique à destination de l'industrie alimentaire et pharmaceutique, en font une matière première de choix pour les usages en cosmétique. D'autres sources fongiques contenant les polysaccharides chitine et bêta-glucane peuvent également être exploitées, comme par exemple les Basidiomycètes, notamment les champignons Lentinula edodes (shiitake) et Aga n ^' eus bisporus.

Les inventeurs entendent par « polysaccharides d'origine fongique » les extraits purifiés de parois cellulaires de champignons composés majoritairement de polysaccharides de chitine et de bêta-glucane, sous forme de copolymères, et leurs dérivés. Les extraits purifiés comprennent une teneur de préférence en chitine-glucane supérieure à 70% en masse par rapport à la masse totale de

l'extrait, de préférence supérieur à 80%, de préférence supérieure à 85% et encore de préférence supérieure à 90%.

Les inventeurs entendent par « chitine-glucane » un copolymère pur extrait des parois cellulaires de champignons qui est constitué de chaînons des unités N-acétyl-D-glucosamine et éventuellement d'une proportion minoritaire des unités D-glucosamine liées entre elles par des enchaînements de type (1,6) de conformation alpha (chaînon chitine), et de chaînons des unités D-glucose liées entre elles par des enchaînements de type bêta(l,3), ou bêta(l,3)(l,6), ou bêta(l,3)(l,4), et préférentiellement bêta(l,3) (chaînons bêta-glucane) »). II est généralement admis que les polysaccharides des parois cellulaires des champignons sont séparés en deux groupes selon leur solubilité en milieu alcalin, et que le squelette des parois cellulaires est insoluble. Il est également connu que la fraction insoluble est constituée de polymères de chitine et de bêta- glucane, en proportions variables selon les espèces, que les unités bêta-glucane sont liées par des enchaînement de structure variable, et que la liaison entre les chaînons chitine et bêta-glucane est stable comme montré par exemple par Siestma & Wessels pour Saccharomyces cerevisiae (Zygomycete), Neurospora crassa (Ascomycete), Aspergillus nidulans (Ascomycete) et Coprinus cinereus (Basidiomycete) [Siestma JH & Wessels JG. (1981) Solubility of (l,3)-beta-D- (l,6)-beta-D-glucane in fungal walls : importance of presumed linkage between glucan and chitin. (1981) J. Gen. Microbiol. 125 :209]. Il est connu que les chaînons chitine et bêta-glucane de la fraction insoluble û' Aspergillus niger sont liés entre eux de manière covalente, comme cité par exemple par Stagg CM et Feather MS [Biochim. Biophys. (1973) Acta 320:64]. Des méthodes de détermination de la nature du lien covalent entre les chaînons chitine et bêta- glucane ont été décrites par exemple par Fontaine et al. pour Aspergillus fumigatus [Fontaine T, Simenel C, Dubreucq G, Adam O, Delepierre M, Lemoine J, Vorgias CE, Diaquin M & Latgé JP. (2000) Molecular organization of the alkali- insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall, J. Bio. Chem. 275:27594], et par Kollar et al. pour la levure Saccharomyces cerevisiae [Kollar R, Petrakovas E,

Ashwell G, Robbins P & Cabib E. (1995) Architecture of the yeast cell wall, the linkage between chitin and beta(l,3)glucan, J. Biol. Chem. 270:1170].

L'extrait fongique selon la présente invention peut être obtenu à partir de paroi cellulaire de mycélium fongique de différents groupes, incluant les groupes des Zygomycetes, Basidiomycetes, Ascomycetes (dont Aspergillus niger fait partie) et Deuteromycetes et/ou un mélange de ceux-ci. Ladite source de champignons doit être choisie de manière à permettre l'extraction d'un polysaccharide tel que défini ci-dessus et ci-après. Il existe des sources de champignons qui comprennent des bêta-glucanes, mais ces unités sont solubles dans l'eau notamment, ou ne comprennent pas ou peu de chaînes de structure chitine, et ne permettent donc pas d'obtenir le polysaccharide de la présente invention. La présente invention couvre l'ensemble des champignons qui permettent d'obtenir le polymère chitine-glucane défini dans la présente demande. Le rapport entre la chitine et le bêta-glucane est compris entre 95:5 et

5:95, de préférence entre 70:30 et 10:90 (m/m). La partie chitine du copolymère chitine-glucane est composée de préférence d'au moins 85% d'unités N-acétyl-D- glucosamine et d'au plus 15% d'unités D-glucosamine, préférentiellement d'au moins 90% d'unités N-acétyl-D-glucosamine et d'au plus 10% d'unités D- glucosamine.

L'invention concerne en particulier une suspension ou une dispersion comprenant un solvant et au moins un copolymère de granulométrie fine selon la présente invention. Cette suspension ou cette dispersion est réalisée selon les méthodes classiques.

L'invention concerne également une émulsion comprenant le copolymère de granulométrie fine selon la présente invention. Cette émulsion est réalisée selon les méthodes classiques, avec soit l'eau soit l'huile comme phase continue.

Avantageusement Pémulsion est d'abord préparée, puis le copolymère chitine-glucane est ajouté. Ceci permet notamment de préparer l'émulsion dans

les conditions de température habituellement appliquées industriellement pour sa préparation, sans prendre le risque de dégrader le copolymère.

Les composés selon la présente invention sont préparés notamment sous forme de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, de préférence sous forme topique. De ce fait, pour ces compositions, l'excipient contient par exemple au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en les conservateurs, les antioxydants, les stabilisants, les conditionneurs, les hydratants, les émollients, les émulsifiants, les tensioactifs, les épaississants, les agents matifiant, les agents de texture, les agents de brillance, les agents filmogènes, les solubilisants, les pigments, les colorants, les parfums, et les filtres solaires. Ces excipients sont de préférence choisis parmi le groupe consistant en les acides aminés et leurs dérivés, les polyglycérols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de lanoline, les phospholipides, les stabilisants à base de sucrose, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les silicones et ses dérivés, les hydrolysats de protéines, les esters lipo/hydrosolubles, les betaines, les aminoxides, les glycines, et les parabens.

Comme huiles utilisables dans la composition de l'invention, on peut citer par exemple: les huiles hydrocarbonées d'origine animale, telles que le perhydrosqualène; les huiles hydrocarbonées d'origine végétale, telles que les triglycérides liquides d'acides gras comportant de 4 à 10 atomes de carbone comme les triglycérides des acides heptanoïque ou octanoïque ou encore, par exemple les huiles de tournesol, de maïs, de soja, de courge, de pépins de raisin, de sésame, de noisette, d'abricot, de macadamia, d'arara, de ricin, d'avocat, les triglycérides des acides caprylique/caprique, l'huile de jojoba, l'huile de beurre de karité; les esters et les éthers de synthèse, notamment d'acides gras, les esters hydroxylés les esters de polyol ; et les esters du pentaérythritol ; les hydrocarbures linéaires ou ramifiés, d'origine minérale ou synthétique, tels que les huiles de paraffine, volatiles ou non, et leurs dérivés, la vaseline; les alcools gras; les huiles fluorées partiellement hydrocarbonées et/ou siliconées; les huiles

de silicone comme les polyméthylsiloxanes (PDMS) volatiles ou non à chaîne siliconée linéaire ou cyclique, liquides ou pâteux à température ambiante, notamment les cyclopolydiméthylsiloxanes (cyclométhicones); les silicones phénylées; et leurs mélanges. Différents excipients sont illustrés dans les exemples de formulations.

Les autres corps gras pouvant être présents dans la phase huileuse sont par exemple les acides gras comportant de 8 à 30 atomes de carbone, comme l'acide stéarique, l'acide laurique, l'acide palmitique et l'acide oléîque; les cires comme la lanoline, la cire d'abeille, les cires de paraffine, ou les cires micro- cristallines, les cires synthétiques ; les résines de silicone; et les élastomères de silicone.

Avantageusement, les compositions précitées sont formulées sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-dans- huile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un savon liquide ; un pain dermatologique ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre.

L'invention concerne également une composition administrée par voie orale à un être humain ou un animal, de préférence un mammifère, pour obtenir un effet choisi parmi le groupe consistant en un effet antioxydant, hypocholestérolémiant, hypolipidémiant, de stimulation du système immunitaire, hypoglycémique, notamment dans le cas de diabète, et un effet de prévention et/ou de traitement, et/ou de lutte contre une pathologie choisie parmi le groupe consistant en la dyslipidémie, l'athérosclérose, l'obésité, une maladie liée à l'obésité, une maladie cardio-vasculaire, le syndrome métabolique, le diabète, et rhyperuricémie. Le contrôle de la granulométrie de la poudre de chitine-glucane,

notamment l'obtention d'une poudre de granulométrie fine, permet avantageusement une meilleure biodisponibilité du produit.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique ou de complément alimentaire comprenant à titre de principe actif au moins un polysaccharide ou un extrait d'origine fongique, tel que défini précédemment.

La présente invention concerne également une méthode de traitement, de prévention, ou de lutte contre une pathologie, notamment celle mentionnée ci- dessus, comprenant l'administration par voie orale d'une quantité efficace un sujet en ayant besoin d'une composition comprenant au moins un polysaccharide tel que défini dans la description ci-dessus et ci-après.

La présente invention concerne également une méthode pour diminuer la masse ou prévenir ou lutter contre Ia prise de masse d'un être humain ou un animal, et de préférence un mammifère. Cette méthode concerne notamment un soin esthétique. La présente invention concerne également une méthode de soin cosmétique, notamment du corps ou du visage ces soins son avantageusement choisi parmi les soins cités plus haut.

Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un produit de la présente invention pour la fabrication d'une composition destinée notamment à être utilisée dans l'une des méthodes décrites ci-dessus ou pour exercer l'un des effets décrits ci-dessus et ci-après.

L'homme du métier détermine aisément par les méthodes classiques les quantités efficaces des produits de l'invention à utiliser. On utilise avantageusement en cosmétique ou en pharmaceutique une quantité efficace comprise entre 0,01 et 10% du polysaccharide d'origine fongique selon la présente invention en poids de la composition totale. De préférence on utilise

0,05 à 5%, et encore de préférence de 0,1 à 2% en poids de la composition totale. Par application topique, une à deux applications par jour est avantageuse.

On utilise une quantité efficace généralement comprise entre 0,001 et 100% en poids du produit selon la présente invention par rapport au poids total de la composition à administrer sous forme de complément alimentaire. Si les

produits sont administrés sous forme de gélules, granules, ou comprimés, ils peuvent être utilisés purs ou à toute autre concentration, accompagnés d'autres composants actifs ou d'excipients. S'ils sont incorporés dans des aliments, la concentration en produit est inférieure à 15%, et de préférence inférieure à 10%. Il est avantageux d'administrer entre 1 et 30 g du par jour par personne produit selon l'invention en fonction du poids de la personne.

L'invention couvre aussi a) des matériaux solides poreux cohésifs obtenus par la mise en œuvre d'extraits fongiques sous forme de particules de granulométrie fine et contrôlée et b) des matériaux solides composites poreux cohésîfs comprenant une matrice polymérique synthétique ou d'origine naturelle (animale ou végétale) au sein de laquelle sont répartis des particules d'extraits fongiques sous forme de particules de granulométrie fine et contrôlée.

Plus généralement, les matériaux poreux cohésifs de la présente invention sont obtenus par la mise en oeuvre de polymères de chitine ou de chitine- glucane sous forme de particules de granulométrie fine et contrôlée.

Plus particulièrement aussi, la présente invention couvre des matériaux composites poreux cohésifs dont la matrice est le chitosane et au sein de laquelle sont réparties des particules de chitine ou/et de chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée.

Un matériau « composite » au sens de la présente invention est un assemblage d'au moins deux matériaux.

Un matériau « cohésif » au sens de la présente invention est un matériau caractérisé par son aptitude à rester stable et sous la forme d'un monolithe même sous l'action de forces et de contraintes externes (compression, étirement, élongation...), par opposition au matériau friable. Par conséquent, le matériau cohésif est susceptible d'être façonné pour lui conférer une forme et une taille adaptées à son application (comme par exemple un implant de forme anatomique spécifique).

Un matériau « poreux » au sens de la présente invention est un matériau caractérisé par la présence de pores dont la taille, le nombre, la morphologie, l'interconnectivité, le degré d'isotropie/anisotropie... sont ajustés et contrôlés.

L'état de l'art révèle de nombreux documents relatifs à la préparation de matériaux poreux de polymères naturels, tels que le chitosane ou des polymères synthétiques tels que le polyuréthane, le PLA(acide polylactique), PGA (acide polyglycolique), le PLGA (copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique)... L'état de l'art révèle également quelques documents relatifs à la préparation de compositions riches en extraits fongiques contenant de la chitine, du chitosane- glucane. Aucun cependant ne fait état de Ia préparation de matériaux solides poreux cohésifs à partir de ces extraits fongiques. Par exemple le brevet RU2086247 révèle une composition obtenue au départ du mycélium de champignons inférieurs {Aspergillus nigeή et contenant un complexe chitosane- glucane en vue de préparer un système anti-brûlure. La méthode de préparation inclut une étape de lavage et de traitement alcalin directement à partir de la biomasse, suivis d'une étape de lyophilisation. Cependant le document ne fait pas état d'un produit obtenu sous la forme d'un matériau poreux. La Sacchachitin est une composition riche en chitine extraite du fruit du champignon Ganoderma tsugae, dont l'action sur la cicatrisation a été décrite par SH Su et al. (Development of fungal mycelia as skin subsitutes : effects on wound healing and fibroblasts, Biomaterials 20, 61-68, 1999 ; Fungal mycelia as the source of chitin and polysaccharides and their applications as skin subsitutes, Biomaterials 18, 1169-1174, 1997) et par Hung et al. (Cytotoxicity and immunogenicity of Sacchachitin and mechanism of action on skin wound healing, J Biomed Mater Res 56, 93-100, 2001).

JP2006273912 divulgue un matériau moulé composé de beta-glucane et de chitosane. Il ne révèle pas que ces matériaux sont poreux. De plus ils n'incluent pas dans leur composition des copolymères chitine-glucane.

L'état de l'art ne révèle donc aucun document relatif à des matériaux poreux cohésifs obtenus à partir d'extraits fongiques comme par exemple la chitine ou un copolymère de chitin-glucane sous la forme de particules de granulométrie fine et contrôlée. Des matériaux poreux comprenant du chitosane et un second composé ont été largement décrits. Parmi de nombreux exemples de second composé on peut citer un polymère synthétique comme le PGA (Bïomaterials, 24 (2003), 1047-1057), ou l'acide polyacrylique (Macromolecular Bioscience, 3(10), 2003, 540-545), des polymères naturels comme la gélatine (Polymer International, 49(12), 2000, 1596-1599, CN 1097980), le collagène (WO0016817, KR2002017552, CN1406632, CN1387922, RU2254145), la cellulose ou la soie (JP2000027027), la cellulose oxydée (US2006172000) , des composés inorganiques comme l'hydroxyapathite (Journal of Biomaterial Science, Polymer édition, 13(9), 2002, 1021-1032)... US2003190346 couvre une méthode de préparation d'une éponge composite constituée de chitosane et d'hydrogel de chitine, la forme particulière de la présente invention n'étant pas envisagée. CN 1485097 couvre une méthode de préparation d'une éponge au départ de chitosane/chîtine. Ce document ne spécifie pas s'il s'agit d'un matériau composite ou des matériaux constitués soit de chitosane, soit de chitine. L'abrégé de ce document révèle que la première étape pour préparer l'éponge consiste à solubiliser le matériel de départ ce qui indique qu'il s'agit de préparer une éponge essentiellement de chitosane puisqu'il est bien connu que la chitine est insoluble, sauf dans des conditions très particulières (système diméthylacétamide-LîCI). Aucun document ne révèle un matériau composite composé de chitosane et de copolymère de chitine-glucane. En effet, il est bien connu de l'homme de l'art que les copolymères de chitine-glucane sont insolubles quel que soit le solvant. Il est également bien connu que les méthodes de préparation d'un matériau composite et en particulier un matériau composite biodégradable incluent au départ, une solubilisation et un mélange homogène des composés solubilisés et ce, avant de procéder à la phase d'élimination du solvant en vue de

préparer le matériau solide. Le problème technique rencontré pour préparer un matériau solide (en particulier poreux) de chitine ou de chitine-glucane ou pour préparer un matériau composite solide (en particulier poreux) composé d'une matrice polymérique, par exemple biodégradable, comme premier composé et de chitine ou de chitin-glucane comme second composé est donc de solubiliser, en une première étape, la chitine ou le chitine-glucane en vue de son mélange avec la solution contenant le chitosane.

La présente invention apporte une solution technique à ce problème en proposant l'utilisation de chitine ou/et de copolymère de chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée sous la forme d'une suspension, dispersion ou émulsion susceptible d'être mélangée avec une solution du polymère biodégradable servant de matrice.

De même la présente invention apporte une solution technique à la préparation d'un solide poreux de chitine ou de chitine-glucane par l'utilisation d'une supsension, dispersion ou émulsion contenant la chitine ou le copolymère de chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée.

Les matériaux poreux cohésifs de la présente invention couvrent a) des matériaux poreux cohésifs préparés à partir d'extraits fongiques, préférentiellement des polymères de chitine et /ou des copolymères de chitine-glucane sous forme de particules de granulométrie fine et contrôlée et plus préférentiellement des copolymères de chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée. b) des matériaux composites poreux cohésifs comprenant comme matrice, encore dénommée agent dispersant, un polymère et comme second composé, encore dénommé agent dispersé, des extraits fongiques, préférentiellement des polymères de chitine ou des copolymères de chitine-glucane sous forme de particules de granulométrie fine et contrôlée.

En particulier l'invention concerne encore :

Un matériau poreux comprenant au moins un extrait fongique, préférentiel lement au moins un polymère de chitine et /ou un copolymère de chitine-glucane, sous forme de particules de granulométrie inférieure à 500 microns (μm).

Avantageusement, le matériau poreux comprend un extrait fongique tel que défini précédemment.

L'invention concerne encore un procédé de préparation d'un matériau poreux caractérisé en ce qu'il comprend une étape de dispersion, ou de mise en émulsion, ou de suspension d'au moins un extrait fongique sous forme de particules de granulométrie inférieure à 500 microns dans un solvant, puis l'élimination de ce solvant et l'obtention d'un matériau poreux comprenant l'extrait fongique.

Les particules de polymères de chitine ou de copolymères de chitine- glucane utilisés pour le matériaux poreux 'a'ont une granulométrie inférieure à

250 μm, plus préférentiel lement inférieure à 90 μm et encore plus préférentiellement inférieure à 63 μm. Préférentiellement on utilise des particules de copolymères chitine-glucane ayant cette granulométrie fine et contrôlée.

L'invention concerne aussi un matériau composite poreux comprenant une matrice et un agent dispersé, ladite matrice, encore dénommée agent dispersant, étant au moins un type de polymère, et l'agent dispersé étant au moins un extrait fongique, et préférentiellement un polymère de chitine ou un copolymère de chitine-glucane, sous forme de particules de granulométrie inférieure à 500 microns (μm). Avantageusement, le matériau poreux comprend un extrait fongique tel que défini à précédemment.

Le matériau composite poreux ^'comprend des particules de chitine ou de chitine-glucane de l'invention de granulométrie inférieure à 250 μm, plus préférentiellement inférieure à 90 μm et encore plus préférentiellement inférieure à 63 μm. Préférentiellement on utilise des particules de copolymères chitine- glucane ayant cette granulométrie fine et contrôlée.

L'invention couvre un procédé de préparation d'un matériau composite poreux comprenant une matrice et un agent dispersé dans la matrice, caractérisé en ce qu'il comprend (i) une étape de solubilisation d'un polymère apte à former la matrice du matériau composite poreux, (ii) une étape de dispersion, ou de mise en émulsion, ou de suspension d'au moins un extrait fongique sous forme de particules de granulométrie inférieure à 500 microns dans la solution de polymère, (iii) une étape d'élimination du solvant de la solution de polymère comprenant l'extrait fongique, (iv) l'obtention d'un matériau composite comprenant le polymère poreux formant la matrice et l'extrait fongique formant l'agent dispersé.

Le matériau poreux ou composite poreux peut former une couche ou plusieurs d'un matériau composite.

La matrice polymérique du matériau composite poreux ^* b' peut être d'origine naturelle, animale ou végétale (un polymère de la Matrice Extracellulaire

(MEC). En particulier les polymères d'origine naturelle (encore dénommés biopolymères) peuvent être choisis dans le groupe constitué des giycosaminoglycanes (GAG), en particulier l'acide hyaiuronique ou l'hyaluronate, le sulfate de chondroitine ou l'héparine, des collagènes, des alginates, des dextranes, des chitosanes et de leurs mélanges

On pourra aussi choisir des polymères de synthèse choisis dans la groupe constitué des polyuréthanes, des polyacrylates... ou des polymères de synthèse biodégradables, en particulier choisis dans le groupe constitué des polyesters biodégradables de synthèse tels que les homopolymères et copolymères basés sur l'acide lactique, l'acide glycolique, l'epsilon-caprolactone et la p-dioxanone ou encore tout autre polyester naturel comme ceux de la famille des polyhydroxyalcanoates comme les homo- et copolymères basés sur l'hydroxybutyrate, l'hydroxyvalérate, les polyorthoesters... ou une matrice polymérique issue de leur combinaison ou de la combinaison de polymères

naturels et de polymères de synthèse . Préférentiellement la matrice est un polymère biodégradable.

Préférentiellement la matrice polymérique biodégradable est le chitosane de n'importe quelle masse moléculaire et de n'importe quel degré d'acétylation. Le rapport en masse entre le polymère de chitine ou de chitine-glucane et de chitosane (ou polymère biodégradable) est compris entre 5 :95 et 95 :5, préférentiellement entre 20 :80 et 80 :20. La composition préférée a un rapport en masse compris entre 40 :60 et 60 :40, de préférence entre 45 :55 et 55 :45, et encore de préférence d'environ 50 :50. Les matériaux poreux cohésifs de l'invention sont de n'importe quelle forme, n'importe quelle géométrie et n'importe quelle taille, préférentiellement sous la forme de membranes poreuses, supports poreux tridimensionnels tels que supports plans, mousses poreuses, de microporteurs ou billes poreuses, de fibres poreuses, de tubes poreux... Les matériaux poreux cohésifs ont une masse volumique d'au moins de

0.005 g/cm ³ .

Les matériaux composites poreux cohésifs présentent un module de Young (qui exprime la résistance à la compression) d'au moins de 0.05 MPa. Les propriétés mécaniques des matériaux poreux sont modulables notamment en fonction de la taille des particules de l'agent dispersé, du rapport en masse entre la matrice et l'agent dispersé et la méthode de préparation en particulier de la concentration de la solution de chitosane au départ. De façon surprenante, on a constaté que le rapport en masse d'environ 50 :50 entre chitosane et le copolymère chitine-glucane présente la meilleure résistance à la compression. Les matériaux de l'invention couvrent différentes tailles des pores et porosités totales, différentes morphologies (circulaires, allongées, fibrillaires...), différents degrés d'interconnectivité, degrés d'isotropie ou d'anisotropie des pores, différentes rugosités de la parois des pores... en fonction de la concentration de la suspension de particules de chitine ou chitine-glucane, de leur taille choisie parmi la granulométrie fine et contrôlée, du rapport en poids

entre ces particules et la matrice polymère et de la méthode de préparation de ces matériaux.

Les matériaux poreux cohésifs de l'invention présentent les avantages de proposer des matériaux de chitine et chîtine-glucane facilement manipulables et adaptables, capables d'être appliqués temporairement ou de façon permanente (sous la forme de pansements, tampons, implants, patches etc...) _/ dans des applications cosmétiques ou pharmaceutiques pour lesquelles l'effet bénéfique de ces composés est recherché, ou en combinaison (par exemple imprégnation, adsorption, absorption, inclusion dans les pores, ...) avec d'autres agents actifs. De même les matériaux composites poreux de l'invention présentent l'intérêt de combiner les effets bénéfiques de la matrice polymère biodégradable et de la chitine et/ou du copolymère chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée. De plus, les fines particules de chitine ou de chitine-glucane peuvent être ancrées dans la structure poreuse de la matrice polymère lui conférant une structure rugueuse et caractérisée par une surface spécifique plus élevée. Ces caractéristiques peuvent constituer un avantage pour l'utilisation de ce matériau dans des domaines d'application tels que la culture cellulaire ou la reconstruction tissulaire pour lesquels l'adhésion cellulaire est un enjeu important.

La méthode de préparation des matériaux poreux cohésifs 'a' et des matériaux composites poreux cohésifs ^λ b' comporte une première étape de mise en suspension, en émulsion, ou de dispersion, de particules de chitine ou de chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée soit dans l'eau en vue de préparer le matériau V, soit dans une solution d'une matrice polymère en vue de préparer le matériau ^y b'. Dans une seconde étape, le mélange est soumis à un séchage ou élimination de solvant selon des techniques porogènes connues de l'homme de l'art. Parmi les techniques porogènes, la lyophilisation, le moussage en fluide supercritique (CO ₂ supercritique), l'extraction de sels porogènes, l'immersion-précipitation, l'électrospinntng, le modelage d'émulsion (solid free- forming) conviennent pour la réalisation de cette étape. Préférentiel lement, l'étape de séchage est une lyophilisation.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention pour préparer le matériau poreux cohésif 'a', la méthode comprend une première étape (i) consistant à suspendre le polymère de chitine ou préférentiellement le copolymère de chitine-glucane de l'invention de granulométrie fine et contrôlée dans l'eau selon un rapport en masse compris entre 05 :95 et 30 :70, préférentiellement 05 :95 et 20 :80, suivie d'une homogénéisation pendant au moins 30 minutes en vue de préparer une pâte. En une seconde étape (ii), la pâte est congelée par n'importe quelle méthode de congélation, notamment en plaçant la pâte dans un congélateur à -18°C. Dans une troisième étape (iii), le mélange congelé est soumis à une lyophilisation pour conduire à un matériau poreux cohésif.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention pour préparer un matériau composite poreux cohésif ^λ b', la méthode comprend une première étape (i) de mise en solution de la matrice polymère biodégradable dans un solvant et selon des conditions expérimentales permettant sa solubilisation complète. Préférentiellement, le chitosane est solubilisé à raison de 1 à 10% dans une solution d'acide dilué à une concentration comprise entre 0.5 et 5 %, préférentiellement entre 0.5 et 2%, Parmi les acides utilisables pour cette étape, les acides minéraux comme par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide phosphonique... ou les acides organiques comme par exemple l'acide acétique, l'acide formique, l'acide lactique, l'acide glycolique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide succinique, l'acide glutamique... conviennent. En une seconde étape (ii), les particules de granulométrie fine et contrôlée de chitine ou de chitine-glucane sont dispersées dans la solution contenant la matrice polymère, homogénéisée pendant au moins 1 minute puis versée dans un moule choisi en fonction de la taille, la géométrie et les propriétés du matériau composite poreux à préparer. Les rapports en masse entre le polymère de la matrice et l'agent dispersé est compris entre 10 :90 et 90 :10. En une troisième étape (iii) le mélange est soumis à une congélation par n'importe quelle technique de congélation. En une dernière étape (iv), le mélange congelé est soumis une lyophilisation. Le matériau composite obtenu est

poreux. La masse volumique, la taille et la morphologie des pores, les propriétés mécaniques, notamment de résistance à la compression du matériau, sont ajustables, selon ce mode de réalisation de l'invention, en fonction de concentration de la matrice polymère, des rapports en masse entre la matrice polymère et l'agent dispersé, la nature du solvant de la matrice, le type de moule, le volume de remplissage de ce moule, et les conditions de congélation.

Sur les figures :

La figure 1 représente les conditions d'enregistrement du spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone 13 (13C-RMN) en phase solide d'un copolymère de chitine-glucane.

La figure 2 représente le spectre de 13C-RMN en phase solide d'un copolymère de chitine-glucane.

La figure 3 représente quatre photographies par microscopie électronique à balayage des particules de chitine-glucane (lot L26) selon la présente invention, et notamment des fractions de taille 100-200 μm (fraction 100-200), de taille

<100 μm (fraction <100), de taille 500-1000 μm (fraction 500-1000), et de taille

250-500 μm (fraction 250-500).

La figure 4 représente une photographie par microscopie électronique à balayage des particules selon la présente invention (lot L32), après séchage par un procédé d'atomisation (grossissement x 750).

La figure 5 représente un graphique de profilométrie optique, portant la hauteur des sillons (Rz) en fonction de la distance sur la peau, obtenus après 16 semaines sur 1 sujet (avant-bras gauche : crème Tl, 5 à base de chîtine- glucane ; avant-bras droit : crème TO placebo). Les graphiques montrent que les microreliefs sont significativement atténués (valeur moyenne Rz 7.0 μm avec chitine-glucane versus 9.6 μm avec le placebo) et que la peau est plus tendue.

La figure 6 représente deux photographies par microscopie électronique à balayage d'un matériau poreux de chitine-glucane.

La figure 7 représente une photographie par microscopie électronique à balayage d'un matériau poreux mixte de chitïne-glucane et de chitosane (chitine- glucan/chitosane 10:90, m/m) en coupe longitudinale.

Les figures 8A-C représentent des photographies par microscopie électronique à balayage d'un matériau poreux composite de chitine-glucane et de chitosane obtenus pour trois échantillons (Figure 8A : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 25/75, Figure 8B : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 50/50 et Figure 8C : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 75/25). Pour chacun des échantillons la taille des particules de chitine-glucane est inférieure à 63 μm. Les photographies de gauche représentent une section longitudinale et celles de droite un section transversale.

Les figures 9A et 9B représentent des photographies par microscopie électronique à balayage d'un matériau poreux composite de chitine-glucane et de chitosane obtenus pour quatre échantillons obtenus avec des particules de chitine-glucane ayant une granulométrie supérieure à 250 μm

Figure 9A photo de gauche ; proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 25/75 et taille des grains comprise entre 250 et 500 μm

Figure 9A photo de droite : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 25/75 et taille des grains comprise entre 500 et lOOOμm

Figure 9B photo de gauche : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 50/50 et taille des grains comprise entre 250 et 500 μm

Figure 9B photo de droite : proportion chitosane/chitine-glucane (m/m) de 50/50 et taille des grains comprise entre 500 et lOOOμm D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.

Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble,

incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.

Ainsi, chaque exemple a une portée générale.

D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

EXEMPLES

Le procédé d'obtention des copolymères chitine-glucane obtenus ci- dessous est décrit dans les demandes de brevets WO 03/068824 et FR 05.07066.

SERIE EXEMPLES VT REiAnFS A LA PREPARATION D'UN COPOLYMERE DE CHITINE-GLUCANE ET DE PARTICULES DE CELUI-CI DE GRANULOMETRIE VARIABLE ET CONTROLEE

EXEMPLE Al - Préparation d'un copolvmère chitine-glucane à partir du mycélium d'Aspergillus niger

Une masse de 50 kg (poids sec) de mycélium ά'Aspergillus niger humide est mise en suspension dans une solution d'acide chlorhydrique 0.5 N, puis filtrée. La matière solide est ensuite mise en suspension dans une solution d'hydroxyde de sodium 1 N, puis filtrée. La matière solide est lavée 4 fois à l'eau, puis filtré à l'aide d'un filtre-presse et séchée à l'aide dans un sécheur conique (conical dryer). Elle est ensuite mise en suspension dans l'éthanol, puis filtrée et séchée. On obtient environ 15 kg de chitine-glucane (lot L25).

Les caractéristiques moléculaires et la composition de huit lots de chitine- glucane obtenus selon ce procédé sont données dans le tableau 1.

Le rapport massique chitine/glucane est calculé à partir du spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) du carbone 13 en phase solide enregistré dans les conditions indiquées à la figure 1 selon la méthode décrite brièvement ci-dessous. Le spectre du composé chitine-glucane (lot L28) est présenté à la figure 2. La proportion en bêta-glucane est déterminée à partir de l'aire des quatre bandes de résonance suivantes : 104 ppm (carbone 1 de la chitine et du bêta-glucane), 23 ppm (carbone CH ₃ de la chitine), 55 ppm (carbone 2 de la chitine) et 61 ppm (carbone 6 de la chitine et du bêta-glucane), en prenant comme référence la chitine pure. Par exemple, on peut effectuer le calcul selon la Formule 1, où I' est l'aire des signaux des carbones, et où [ ]œ indique la valeur du rapport pour le chitine-glucane analysé et [ ]c pour la chitine de référence. Cl est le carbone 1 de la chitine et du bêta-glucane et C2 est le carbone 2 de la chitine.

Glucane (mol%) = (formule 1) Le rapport massique chitine/glucane des 8 lots de chitine-glucane du tableau 1 est en moyenne de 39:61 ± 2 (m/m).

La proportion d'unités D-glucosamine (NGIc), exprimée en % molaire de la partie chitine, peut être estimée à partir du spectre RMN, comme décrit par Heux et al. [Heux L, Brugnerotto J, Desbrières J, Versali MF & Rinaudo M. (2000) Solid state NMR for détermination of the degree of acetylation of chitin and chitosan. Biomacromolecules 1:746]. La proportion d'unités D-glucosamine est déterminée par titrage potentiométrique par l'hydroxyde de sodium, en suspension dans un excès d'acide chlorhydrique.

La qualité microbiologique du chitine-glucane (lot L26) et les résultats de recherche d'agents pathogènes sont donnés dans le tableau 2.

La distribution de taille de la poudre de chitine-glucane (lot L25) est donnée dans le tableau 3.

Tableau Al.1- Caractéristiques moléculaires et composition de différents lots de copolymère chitine-glucane

* écart-type sur le résultat de 4 calculs du rapport chitine-glucane ; **LQ : limite de sensibilité de la méthode d'analyse par Ion Cou pied Plasma (5.3 ppm)

Tableau Al.2 - Qualité microbiologique d'un lot de chitine-glucane (L26)

On comprend ainsi des tableaux précédents que le copolymère selon la présente invention à un degré de pureté élevé.

Tableau A1.3- Distribution de taille d'un lot de chitîne-glucane (L25)

On comprend de ce tableau que la distribution de taille des particules obtenues selon le procédé de l'exemple 1 est très large.

EXEMPLE A2 - Préparation de poudre de chitine-αlucane de αranulométrie variable par broyage

Pour réduire la granulométrie de manière contrôlée et variable, 15 kg de chitine-glucane obtenus selon l'exemple 1 (lot L25) sont broyés dans un broyeur à marteaux (Fitzmill model D, Fitzpatrick) équipé de filtres de différentes géométrie et taille de tamis de 20 à 100 mesh (références A, B, C, D au tableau 1). On obtient ainsi quatre lots de poudre de chitine-glucane dont la distribution de taille, déterminée par tamisage sur tamis calibrés et gravimétrie, est celle indiquée au tableau 1.

Tableau A2.1- Distribution de taille d'un lot de chitine-glucane obtenu par broyage à l'aide de différents types de tamis

On comprend de ce tableau que l'on obtient aisément des particules de faible taille, en dessous de 200 μm par exemple, en broyant la poudre de chitine- glucane avec un tamis fin, par exemple de 100 ou 65 mesh.

Les lots de chitine-glucane broyés avec les différents tamis sont rassemblés par fraction par tamisage sur tamis calibrés, et les poudres sont observées par microscopie électronique à balayage après métallisation au platine (figure 4). La longueur et la largeur des particules est calculée après analyse d'une centaine de particules par échantillon (tableau A2.2).

Tableau A2.2- Dimensions des fractions de chitine-glucane broyé (lot L25) observées par SEM

On comprend de ce tableau que la technique de broyage à marteau produit des particules non sphériques, ovoïdes, comme le révèle l'observation par microscopie électronique à balayage de la figure 4.

La fraction 100-200 μm du lot L25 est le produit est utilisé pour préparer la crème test (référence Tl,5) de l'exemple Cl .

EXEMPLE A3 - Préparation de poudres de chitine-Qlucane de granulométrie fine et contrôlée obtenue par atomisation de chitine-αlucane solvatée

Pour obtenir une poudre de chitine-glucane de granulométrie fine avec des particules de géométrie sphérique, une pâte contenant 0,15 kg de chitine- glucane (lot L25) dans 3,75 litres d'eau est préparée à l'aide d'un mixeur. La pâte est séchée par atomisation à une température de 200 ⁰ C, On obtient 0,15 kg d'une poudre dont la distribution de taille cumulée est celle donnée au tableau A3.1. La photographie de la figure 5 représente les particules observées par microscopie électronique à balayage.

Tableau A3.1 - Distribution de taille d'un lot de chitine-glucane (L25) après séchage par atomisation

On comprend de ce résultat que la technique d'atomisation du chitine- glucane solvaté permet d'obtenir majoritairement une taille de particules fine et homogène, 73% des particules ayant un diamètre inférieur à 125 μm.

EXEMPLE A4 - Préparation de poudres de chitine-αlucane de pranulométrie fine et contrôlée obtenue par séchage de chitine-glucane solvaté dans un filtre Nϋtsche

Pour obtenir une poudre de chitine-glucane fine, une pâte contenant

50 kg de chitine-glucane solvaté dans l'éthanol est séchée dans un filtre Nϋtsche à une température de 60 ⁰ C pendant 12 heures. On obtient 50 kg d'une poudre de chitine-glucane (lot L16) dont la distribution de taille cumulée est celle donnée au tableau A4.1. La masse volumique tapée (ou tassée) de la poudre de chitine- glucane ainsi obtenue, déterminée selon la méthode de la Pharmacopée Européenne 2.9.15, est de 0.71 g/cm ³ .

Tableau A4.1- Distribution de taille d'un lot de chitine-glucane après séchage (lot L16)

On comprend de ce résultat que la technique de séchage du chitine- glucane par filtre Nϋtsche à partir du chitine-glucane solvaté dans l'éthanol

permet d'obtenir majoritairement une taille de particules fine et homogène, avec 60% des particules ayant un diamètre inférieur à 125 μm.

On fractionne par tamisage la poudre obtenue pour en sélectionner les particules de taille inférieure à 90 μm. Cette fraction est utilisée pour la préparation des formulations des exemples 14 à 20. Cette fraction inférieure à 90 μm observée par microscopie électronique à balayage révèle une taille moyenne déterminée par analyse d'image de 43 ± 18 μm. La masse volumique tapée de la fraction de taille inférieure à 90 μm, déterminée selon la méthode de la Pharmacopée Européenne 2.9.15, est de 0.61 g/cm ³ .

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EXEMPLE A5 : Préparation de poudre de chitine-olucane de pranulométrie inférieure à 125 υm par broyage et tamisage

Pour obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 125 μm, un lot de

15 chitine-glucane [L07073CG] séché est broyé dans un broyeur à disques, puis tamisé sur un tamis calibré d'ouverture de maille égale à 125 μm (ou 120 mesh) introduit dans une tamiseuse industrielle. La dispersion granulométrique obtenue après chaque cycle de broyage est donnée dans le tableau A5.1.

20 Tableau A5.1— Dispersion granulométrique de la poudre de chitine- glucane avant broyage

On comprend grâce à ces tableaux l'importance et l'efficacité de l'étape de broyage et tamisage pour augmenter le rendement d'obtention des particules. Une proportion nettement plus élevée de poudre de granulométrie inférieure à 125 μm est obtenue après le premier broyage. Cette proportion est encore augmentée après un second broyage. Cet exemple montre une proportion élevée (plus de 50% m/m) de particules ayant une granulométrie inférieure à 90 μm, et même une proportion importante de particules ayant une granulométrie inférieure à 50 μm (plus de 25% m/m).

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SERIE D'EXEMPLES B : Exemples de préparation de CREMES SIMPLES A BASE DE CHUINE-GLUCANE destinées aux études de tolérance et résultats des études de tolérance au chitine-qlucane

15

Ces exemples ont notamment pour but de montrer l'innocuité d'un copolymère de chitine-glucane sous la forme de particules (et ce, quelles que soient leurs tailles). Ces compositions simples se limitent à être un support d'étalement du copolymère de chitine-glucane sur la peau en vue de l'étude de

20 tolérance.

EXEMPLE Bl- Préparation d'une crème simple à base de chitin-glucane destinées aux études de tolérance

Une crème de type émulsion a été préparée à base de chitine-glucane (lot L31),

25 ce dernier étant incorporé dans la phase aqueuse, le pâte obtenue étant homogénéisée pendant environ Ih à l'aide d'un broyeur à couteaux (Ultraturax,

10 000 tr/min.) : une émulsion simple contenant le chitine-glucane en

concentration variable de 0 à 2,5% (tableau Bl-I). Une formule placebo (référence CO) a été préparée dans les mêmes conditions sans chitine-glucane.

Tableau Bl.1- Composition des crèmes cosmétiques simples à base de chitine- glucane à une concentration de X% (références CX)

On prépare ainsi CO, C0,5, Cl ,0, Cl,5, C2,0 et C2,5.

EXEMPLE B2 (Etude de la tolérance cutanée et du pouvoir hydratant d'une crème simple à base de chitine-qlucane en concentration variable

Protocole- Une série de 4 crèmes de type émulsion huile dans eau, contenant une concentration en chitine-glucane de 0.5 à 2%, dont la composition est donnée à l'exemple Bl, a été testée par application sur l'avant-bras de 13

volontaires, âgés de 46 ans en moyenne (de 32 à 61 ans), dont la peau est sensible au niveau de ce site. Les crèmes sont comparées à une crème placebo sans chitine-glucane (référence CO). Les produits ont été appliqués 2 fois par jour sur des zones délimitées sur chaque avant-bras (3 zones de 6,25 cm ² ). Trois types de mesures biométrologiques ont été effectué toutes les 2 semaines pendant 6 semaines afin de rechercher la tolérance et l'efficacité des produits. L'examen clinique initial n'a rien révélé d'anormal chez aucun des sujets. Les évaluations ont été réalisées le matin, en respectant un intervalle d'au moins 10 heures après la dernière application des produits. Mesures biométrologiques- Un éventuel érythème, signe d'irritation, a été recherché par cornéométrie, par la mesure du paramètre a* donné par la colorimétrie en réflectance évaluée selon les normes CIE L*a*b* (Chroma Meter® CR200 Minolta). Une altération éventuelle de la fonction barrière a été recherchée par la mesure de la perte insensible en eau (PIE) en g/m ² /hr (Tewameter®, C+K Electronic). La PIE est de 5 à 7 g/m ² /hr pour une peau normale, et de 15 à 20 g/m ² /hr pour une peau sèche. La dynamique de l'imprégnation en eau de la couche cornée sous occlusion a été mesurée. Le « rate of water accumulation » (RWA) ou taux d'accumulation en eau a été évalué sur une période de 30 secondes (RWA 30) par le rapport entre la différence entre les valeurs à T30s et à TOs et la valeur à TOs. Plus la valeur est élevée, plus la couche cornée est sèche et perméable à l'eau, laissant fuir sans la capturer l'équivalent de la PIE.

Statistiques- A chaque temps d'évaluation, la comparaison inter-produit a été réalisée par le test non paramétrique de Friedman suivi du test de Dunn. Pour chaque produit, la comparaison au cours du temps a été réalisée selon les mêmes modalités. Pour chaque paramètre, des différences significatives entre les valeurs obtenues aux différents temps ont été recherchées par le test apparié non paramétrique de Friedman suivi du test de Dunn.

Résultats- Les valeurs de a*, PIE et RWA30, mesurées au moins 10 heures après application des 5 crèmes aux temps 0, 2, 4, et 6 semaines sont consignées dans le tableau B2.1 . Jusqu'à la concentration maximale de chitine-

glucan de 2.0% étudiée, aucun signe d'érythème, d'irritation ou d'altération de la barrière cutanée n'a été observé pendant toute la période de 6 semaines, comme démontré par les valeurs de a* et de PIE qui n'augmentent pas. Il a au contraire été mis en évidence que le taux d'accumulation en eau à la surface coméenne sous occlusion (RWA30) est significativement plus faible après application des crèmes à base de chitine-glucane, ce qui indique une meilleure capacité de la peau à retenir l'eau à la surface. Cet effet est observé dès la deuxième semaine d'application pour les concentrations de 1.5 et 2.0%, et dès la quatrième semaine pour les concentrations de 0.5 et 1.0%.

Tableau B2.1- Résultats de colorimétrie en réflectance (a*), perte insensible en eau (PIE) et dynamique de l'imprégnation en eau (RWA30, « rate of water accumulation » sur 30 secondes)

Temps Référence a* _pIE RWA30 (semaine) de Ia g/m ² /hr crème

Semaine 0 CO 5.36±0.60 5.52±0.72 1.05±0.48 (placebo)

C0,5 5.39±0.62 5.50±0.60 l.ll±0.49

Cl,0 5.39±0.60 5.49±0.70 1.15±0.46

Cl,5 5.42±0.55 5.41±0.66 1.14±0.50

C2,0 5.38±0.56 5.49±0.62 1.16±0.49

Semaine 2 CO 5.4±0.5 ⁱ 5.45±0.66 0.96±0.48 ¹ (placebo)

C0,5 5.4±0.5 ¹ 5.42±0.69 1.01±0.53 ^x

Cl ₇ O 5.4±0.4 * 5.42±0.63 0.88±0.46

Cl,5 5.3±0.5 ¹ 5.36±0.56 0.74±0.47 ²

C2,0 5.1±0.4 ² 5.25±0.60 0.65±0.42 ²

Semaine 4 CO 5.47±0.49 * 5.65±1.05 0.91±0.42 ¹ (placebo)

C0,5 5.49±0.41 * 5.58±0.86 0.83±0.46

Cl,0 5.42±0.38 ¹ 5.57±0.88 0.70±0.39 2

Cl,5 5.24±0.31 2 5.53±0.85 0.62±0.36 2

C2,0 5.20±0.31 2 5.42±0.96 0.57±0.38 2

Semaine 6 CO 5.42±0.67 1 5.48±0.76 1 0.83±0.36 1 (placebo)

C0,5 5.39±0.55 1 5.47±0.68 1 0.76±0.42 1

Cl,0 5.38±0.54 1 5.38±0.71 0.68±0.35 1

Cl,5 5.32±0.53 1 4.98±1.45 2 0.56±0.35 2

C2,0 5.18±0.49 2 5.21±0.49 2 0.46±0.34 2

¹⁽² les valeurs portant un chiffre différent en exposant sont significativement différentes (p<0.02) l'une de l'autre, au sein d'une série de mesure au même temps.

EXEMPLE B3 Etude de la tolérance par cornéoxénométrie sur couche cornée in vitro de crèmes simples à base de chitine-qlucane en concentration variable

Protocole- Des biopsies de surface au cyanoacrylate ont été prélevées au niveau des avant-bras de 15 volontaires sains pour prélever la couche cornée. Les crèmes contenant le chitine-glucane en concentration variable de 0 à 2% sont celles de l'exemple 5 (de 0,5 à 2,5%). Elles ont été diluée par de l'eau à 50:50 (v/v) afin de pouvoir garantir un contact intime entre les produits et la couche cornée. Les solutions ont été déposées pendant 2 heures sur les prélèvements de couche cornée. A l'issue de ce contact, les échantillons ont été abondamment rincés à l'eau. Après séchage, ils ont été colorés pendant 1 min par une solution alcoolique de fuschine basique et de bleu de toluidine. Après rinçage à l'eau et séchage, la couleur de chaque échantillon a été mesurée par colorimétrie en réflectance pour le mode L* et Chroma C*. La différence en L* et C* correspond à l'indice colorimétrique de douceur (ICD). Un ICD supérieur à 40 indique un produit très doux pour la peau.

Résultats- Les valeurs d'ICD calculées pour les 5 crèmes sont consignées dans le tableau B3.1 . Supérieures à 70 quelle que soit la concentration en chitine-glucane dans la formule appliquée, elles reflètent l'excellente tolérance des 6 produits.

Tableau B3.1- Indice colorimétrique de douceur (ICD = L*-C*) de la couche cornée après 2 heures de contact avec les solutions contenant les crèmes à base de chitine-glucane diluées par 2

EXEMPLE B4 - Evaluation clinique du potentiel irritant et sensibilisant du chitine-glucane

L'évaluation clinique du potentiel sensibilisant et de l'hypoallergénicité du chitine-glucane est effectuée selon le protocole de Maibach-Marzulli, sur 50 volontaires à peau normale (37 ± 2 ans), pendant 6 semaines. Une pâte de concentration 10% est préparée en dispersant le chitine-glucane (L25) dans l'eau. La pâte est appliquée sur la peau à l'aide d'un patch occlusif de type Finn Chamber®. Les signes éventuels d'érythème, d'cedème, de sécheresse et l'apparition de vésicules sont observés, pour caractériser le potentiel irritant (phase d'induction) et le potentiel sensibilisant du produit (phase de challenge). Au vu de l'ensemble des observations, le chitine-glucane est considéré comme non-irritant et non-sensibîlisant. Il peut donc porter la revendication « hypoallergénique ».

EXEMPLE B5 - Irritation primaire cutanée du chitine-qlucane, étude in vivo sur volontaires

L'évaluation de l'irritation primaire du chitine-glucane sur la peau est réalisée en appliquant le chitine-glucane (L25) sous la forme d'une pâte aqueuse à 10% (comme dans l'exemple B4), appliqué sur la peau dans un patch occlusif de type Finn Chamber®, pendant 24 heures. L'étude est réalisée sur 10 sujets. Les observations visant à détecter les signes d'érythème, d'cedème et les modifications de la structure de la peau sont effectuées 30 minutes et 24 heures après le détachement du patche, sous contrôle dermatologique. L'ensemble des

résultats de l'étude indique que le chitine-glucane (dispersé à 10% dans l'eau) peut être classé non irritant pour la peau.

EXEMPLE B6 - Irritation oculaire du chitine-qlucane (in vitro, méthode HET- CAM)

L'évaluation de l'irritation oculaire du chitine-glucane (L25) est effectuée par le test du HET-CAM sur la membrane chorioallantoïdienne d'ceufs de poule embryonnés (hen's egg test chorio-allantoic membrane), selon Luepke et al. [Fd Chem Toxic 23, 287, 1985], reconnu officiellement comme alternative à l'expérimentation animale (JO du 26/12/1996). Le chitine-glucane dispersé à 5% dans l'eau est déposé à la surface de la membrane et mis en contact pendant 20 secondes. Le test est répété sur quatre œufs. Le chitine-glucane à 5% obtient le score le plus faible, le classant comme pratiquement non irritant pour la membrane chorioallantoïdienne de l'œuf de poule.

SERIE D'EXEMPLES C : PREPARAηON DE SUSPENSIONS, DISPERSIONS, EMULSIONS à base de Chitine-Glucane de granulométrie fine et contrôlée

EXEMPLE Cl - Crème de jour à base de chitine-qlucane, destinées à l'étude des propriétés sur volontaires âgés

Tableau Cl.l- Composition des crèmes test placebo (référence TO) et à base de chitine-glucane (lot L25) à une concentration de 1,5% (référence Tl, 5)

Procédure de préparation de Ia crème test (référence Tl,5)

Les ingrédients de la phase A sont mélangés à 80 ⁰ C, puis les ingrédients de la phase B sont mélangés à 75°C. La phase B est ajoutée à la phase A, et le

mélange est homogénéisé avec un mixeur, puis laissé à refroidir. Les ingrédients C et S sont enfin ajoutés à 40 ⁰ C.

Tableau C1.2- Caractéristiques des crèmes TO et Tl,5

EXEMPLE C2 - Influence de la αranulométrie du chitine-αlucane sur la préparation et les caractéristiques sensorielles de crèmes cosmétiques à base de chitine-glucane contenant du chitine-glucane de granulométrie variable

Des crèmes de jour contenant différents lots de chitine-glucane de granulométrie variable, à la concentration 1.5%, ont été préparées selon le même protocole que celui de l'exemple Cl : un lot non broyé non tamisé (L25), et les 3 lots L25 broyés et fractionnés de l'exemple A2. La facilité de formulation et les caractéristiques des crèmes obtenues sont celles du tableau C2.1.

Tableau C2.1 - Caractéristiques des crèmes préparées avec les poudres de chitine-glucane (L25) de différentes granulométries ; Les aspects sensoriels (visuel et toucher) sont classés de 1 à 5, le score 5 correspondant aux meilleures impressions sensorielles. La facilité de formulation est classée de 0 à 5, le score 1 correspondant à la plus grande facilité de formulation.

On comprend aisément de ce tableau que plus la taille des particules est fine, plus il est facile d'incorporer le chitine-glucane dans une crème cosmétique et meilleures sont les impressions sensorielles. On voit également que l'incorporation du chitine-glucane finement broyé, en particulier à partir de la fraction 50-90 μm, permet de viscosifier de manière importante la crème, ce qui est très avantageux pour le formulateur.

EXEMPLE C3 - Influence de la αranulométrie de la poudre de chitine-αlucane sur la préparation et les caractéristiques d'un baume à lèyres

Une formule de baume à lèvres est préparée avec quatre granulométries différentes de la poudre de chitine-glucane et les ingrédients du tableau C3.1. Les poudres de granulométrie inférieure à 125, 90, 50 et 30 μm sont produites selon la méthode de l'exemple A5, à une concentration de 1,5%. La fraction de granulométrie de diamètre inférieur à 30 μm est obtenue après une étape de micronisation supplémentaire à l'aide d'un broyeur à jet d'air.

Tableau C3.1

Protocole- Les ingrédients de la phase A sont mélangés à 60 ⁰ C, puis le mélange est refroidi à 45°C. Les ingrédients de la phase B sont mélangés à la phase A et le mélange est agité 2-3 minutes. Le mélange est inséré dans le conditionnement final immédiatement, le point de solidification étant de 40 ⁰ C environ. Les caractéristiques sensorielles des baumes à lèvres obtenues sont celles du tableau C3.2.

Tableau C3.2- Caractéristiques sensorielles des baumes à lèvres en fonction de la granulométrie du chitine-glucane

*les aspects sensoriels (visuel et toucher) sont classés de 1 à 6, le score 6 correspondant aux meilleures impressions sensorielles.

On voit de cet exemple que pour pouvoir obtenir un baume à lèvres de qualité professionnelle, d'aspect homogène, avec un toucher sur les lèvres agréable, il faut utiliser une poudre de chitine-glucane dont le diamètre est inférieur à 30 μm. Avec les poudres de diamètre supérieur à 30 μm, le baume à lèvres paraît inhomogène, les particules de chitine-glucane sont visibles et perçues au toucher.

EXEMPLE C4 - Préparation d'une émulsion de protection solaire

Une émulsion de protection solaire de type émulsion « eau dans huile » est préparée avec le chitine-glucane (1,5%) et les ingrédients du tableau C4.1. Des poudres de chitine-glucane de trois granulométries différentes préparées selon l'exemple A5 ont été utilisées : <125 μm, <90 μm et <50 μm.

Tableau C4.1

Tableau C4.2- Caractéristiques des émulsions de protection solaire en fonction de la granulométrie du chitine-glucane

*les aspects sensoriels (visuel et toucher) sont classés de 1 à 5, le score 5 correspondant aux meilleures impressions sensorielles. La facilité de formulation est classée de 0 à 5, le score 5 correspondant à la plus grande facilité de formulation.

On voit de cet exemple que pour une formulation de type émulsion eau dans huile comme cette émulsion de protection solaire, il est préférable d'utiliser une poudre de chitine-glucane de diamètre inférieur à 90 μm, pour garantir un aspect visuel conforme aux exigences des fabricants. Selon d'autres essais, un copolymère possédant des particules ayant diamètre inférieur à 125 μm est approprié aux émulsions huile dans eau.

EXEMPLE C5 - Préparation d'une solution tonique

Une solution tonique aqueuse est préparée avec le chitine-glucane (1,5%) et les ingrédients du tableau C5.1. Des poudres de chitine-glucane de deux granulométries différentes ont été utilisées : <30 μm et <10 μm. Les poudres sont préparées comme à l'exemple C3.

Tableau C5.1

Protocole- Mélanger les ingrédients de la phase A dans l'ordre. Ajouter l'eau lentement. Ajuster le pH à 5-6 avec B, ajouter le chitine-glucane et mélanger pendant quelques minutes.

Tableau C5.2- Caractéristiques de la solution tonique en fonction de la granulométrie du chitine-glucane

*la facilité de formulation les aspects sensoriels (visuel et toucher) sont classés de 1 à 5, le score 5 correspondant aux meilleures impressions sensorielles. La facilité de formulation est classée de 0 à 5, le score 5 correspondant à la plus grande facilité de formulation.

On voit de cet exemple que pour préparer une solution tonique d'apparence acceptable et pour que les particules de chitine-glucane restent en suspension stable, il faut que le diamètre des particules soit inférieur à 10 μm.

EXEMPLE C6 - Préparation d'une crème de nuit contenant des ingrédients certi fiables par le BDIH

Une crème de nuit de type émulsion « eau dans huile » est préparé avec le chitine-glucane (1,5%) et les ingrédients du tableau C6.1. Ces ingrédients répondent tous aux critères de certification de l'association fédérale des entreprises commerciales et industrielles allemandes pour les médicaments, les produits diététiques, les compléments alimentaires et les soins corporels (BDIH). La crème peut obtenir la marque BDIH indiquant qu'elle a été contrôlée par cette association.

Des poudres de chitine-glucane de trois granulométries différentes préparées selon l'exemple C3 ont été utilisées : <125 μm, <90 μm et <50 μm.

Tableau C6.1

Tableau C6.2- Caractéristiques des crèmes de nuit en fonction de la granulométrie du chitine-giucane

*les aspects sensoriels (visuel et toucher) sont classés de 1 à 5, le score 5 correspondant aux meilleures impressions sensorielles. La facilité de formulation est classée de 0 à 5, le score 5 correspondant à la plus grande facilité de formulation.

On voit de cet exemple que pour formuler un soin de type émulsion eau dans huile comme cette crème de nuit, il est préférable d'utiliser une poudre de chitine-giucane de diamètre inférieur à 90 μm pour garantir un aspect visuel conforme aux exigences des fabricants.

EXEMPLE C7 - Préparation de formules de soin de type émulsion « eau dans silicone »

Deux formules de soin de type émulsion « eau dans silicone » sont préparées avec une concentration de chitine-giucane de 1,5% et les ingrédients des tableaux C7. la et C7. Ib.

Tableau C7.1a- Ingrédients de la formule 1

Protocole- Les ingrédients de la phase A sont mélangés à une température de 50-60 ⁰ C. Les ingrédients de la phase B sont ajoutés à la phase A et le mélange est homogénéisé. C est ajouté sous agitation, et le mélange est homogénéisé jusqu'à incorporation complète. D est ajouté et le mélange est homogénéisé jusqu'à incorporation complète.

EXEMPLE C8- Formulation d'un soin de jour

On peut par exemple préparer une formulation soin de jour contenant 1,5% de chitine-glucane selon la formulation décrite à Cl.

EXEMPLE C9- Formulation d'un lait de soin pour le corps

Deux formules de lait de soin pour le corps, sans chitine-glucane (a) et avec chitine-glucane (b), sont décrites ci-dessous.

Protocole- Les ingrédients de la phase A sont mélangés. Les ingrédients de la phase B sont mélangés. La phase B est ajoutée à la phase A, et le mélange est homogénéisé pendant 10 minutes à 400 tr/min. La poudre C est ajoutée au mélange B/A et le mélange est homogénéisé à 400 tr/min pendant 1 heure. Le pH est ajusté entre 4.8 et 5.4 avec la phase D.

EXEMPLE ClO- Formulation d'une crème raffermissante pour le buste

On peut par exemple préparer une crème raffermissante pour le buste contenant 1,5% de chitine-glucane selon la formulation décrite ci-dessous.

Procédure- Les ingrédients de la phase A sont mélangés à 80 ⁰ C, puis les ingrédients de la phase B sont mélangés à 85°C. La phase B est ajoutée à la phase A, et le mélange est homogénéisé pendant 5 minutes à 10000 tours/minute, puis laissé à refroidir à 40 ⁰ C. Les ingrédients des phases C et D sont ajoutés dans l'émulsion sous agitation.

EXEMPLE CIl - Formulation d'un lait de soin pour bébé

On peut par exemple préparer un lait de soin pour bébé contenant 1,5% de chitine-glucane selon la formulation décrite ci-dessous.

Procédure- Les ingrédients de la phase A sont mélangés à 75°C, puis les ingrédients de la phase B sont mélangés à 80 ⁰ C. La phase A est ajoutée à la phase B, et le mélange est homogénéisé pendant 3 minutes à 10000 rpm, puis laissé à refroidir à 4O ⁰ C. Les ingrédients des phases C et D sont ajoutés dans l'émulsion sous agitation, puis le mélange est homogénéisé pendant 1 minute à 10000 tours/minute. La poudre de chitine-glucane (E) est ajoutée et l'ensemble est agité pendant 60 minutes (pour une quantité finale de 200 g).

EXEMPLE C12- Formulation d'une crème pour les mains

On peut par exemple préparer une crème pour les mains contenant 1,5% de chitine-glucane selon la formulation décrite ci-dessous.

Protocole- Les ingrédients de la phase A sont mélangés à 65°C, puis les ingrédients de la phase B sont mélangés à 65°C. La phase A est ajoutée à la phase B, et le mélange est homogénéisé pendant 3 minutes à 10000 tours/minute, puis laissé à refroidir à 4O ⁰ C. Les ingrédients C sont ajoutés dans rémulsion, et le mélange est refroidit, puis mélanger au moins 30 minutes.

EXEMPLE C13- Formulation d'une lotion anti-acné

On peut par exemple préparer une lotion anti-acné contenant 1,5% de chitine-glucane selon la formulation décrite ci-dessous.

Procédure

Les ingrédients de la phase A sont mélangés. Les ingrédients de la phase B sont mélangés. La phase A est ajoutée à la phase B, et le mélange est homogénéisé pendant 3 minutes à 10000 tours/minute (pour une quantité finale de 200 g).

EXEMPLE C14 - Formulation d'un soin anti-psoriasis

On peut par exemple préparer un soin anti-psoriasis contenant 1,5% de chitine- glucane selon la formulation décrite ci-dessous.

Procédure- Les ingrédients de la phase A sont mélangés. Les ingrédients de la phase C sont mélangés, et la phase C est portée à 75°C. La phase C est ajoutée à la phase A sous agitation, et le mélange est homogénéisé pendant 3 minutes à 10000 tours/minute, puis refroidi à 40 ⁰ C. Les ingrédients de la phase B sont mélangés, puis la phase B est ajoutée à l'émulsion C/A. Le mélange est homogénéisé pendant 1 minute à 10000 tours/minute (pour une quantité finale de 400 g).

SERIE D'EXEMPLES 'D'. EFFETS DE LA' PPLICAηON REGULIERE DE CREMES COSMETIQUES A BASE DE CHUINE-GLUCAAiE SUR LES CARACTERISηQUES DE LA PEAU

EXEMPLE Dl- Etude des effets de l'application quotidienne d'une crème de jour à base de chitine-αlucane de concentration 1,5% pendant 4 mois sur les paramètres biométriques de la peau de sujets âgés

Cet exemple illustre les effets de la crème décrite à l'exemple Cl, qui contient 1,5% de chitine-glucane (référence Tl,5) sur différentes caractéristiques de la peau, en particulier dans le cadre du vieillissement cutané, la crème et son placebo étant appliqués sur l'avant-bras de sujets âgés pendant une période de 4 mois. La crème placebo étant une formulation elle-même déjà très hydratante, l'étude met bien les effets du chitine-glucane broyé en évidence. Protocole- L'étude a porté sur 20 volontaires masculins, âgés de 58 ± 4 ans, qui ont appliqué en aveugle la crème à base de chïtine-glucane (Tl, 5) et la crème placebo, chacune sur un avant-bras, à raison de 2 fois par jour pendant 4 mois. Cinq types d'examens cliniques et biométrologiques ont été effectués mensuellement. A chaque temps d'évaluation, la comparaison inter-produit a été réalisée par le test non paramétrique de Friedman, suivi du test de Dunn. Pour

chaque produit, la comparaison au cours du temps a été réalisée selon les mêmes modalités. Pour chaque paramètre, les différences significatives entre les valeurs obtenues aux différents temps ont été recherchées par le test apparié non paramétrique de Friedman suivi du test de Dunn (valeur p). Résultats-

1-Evaluation de la structure de la surface de la peau rêche par squamométrie X- La squamométrie X consiste à prélever la surface de la couche cornée par un disque transparent auto-adhésif appliqué pendant une dizaine de secondes sous une pression de 110 g/cm ² assurée par un dynamomètre. Le prélèvement de couche cornée est coloré par une solution de bleu de toluidine et de fuschine basique. La couleur définie par le Chroma C* mesuré en colorimétrie par réflectance (Chroma Meter Minolta) évalue l'état de xérose. Une peau « normale », lisse et bien hydratée, a un indice squamométrique C* d'environ 5 à 7. Plus la valeur est élevée, plus la couche cornée est épaisse, et la peau rugueuse et sèche.

A l'initiation de l'étude (MO), les deux sites devant recevoir les formulations à tester avaient des valeurs d'indice de squamométrie équivalentes. Les valeurs du Chroma C* obtenues ensuite sont celles du tableau Dl.1. Pour la formulation TO, une diminution significative a été observée après un mois (Ml) de traitement (p < 0,05), ainsi que les mois suivants (p < 0,001). Pour la formulation Tl,5, l'amélioration était très significative et était présente dès le deuxième mois (M2) de traitement (p < 0,001). Elle l'était également entre le premier et le troisième mois (M3) (p < 0,01), et le premier et le quatrième mois (M4) (p < 0,001). La comparaison entre l'efficacité des deux formulations a révélé une nette supériorité de Tl,5 dès la fin du premier mois de traitement et pendant les mois suivants (p < 0,001).

Tableau Dl.l- Indice squamométrique (Chroma C*) indiquant l'état squameux de la peau

NS : valeurs non signiflcativement différentes ; MO signifiant 0 mois, etc.

2. Evaluation de l'hétérogénéité de la couleur de la peau par ultraviolet light enhanced visualisation (ULEV)- La méthode ULEV (Visioscan) est une méthode non invasive qui met en évidence l'état squameux de la peau, en particulier les fines squames en voie de détachement, et caractérise la cohésion des coméocytes de la couche cornée. La mesure est exprimée en pourcentage de la surface cutanée affectée par le processus. Lorsque la peau est lisse et la couche cornée cohésive, le pourcentage ULEV est faible, de l'ordre de 5-6%.

Lors de l'inclusion dans l'étude (MO), et après un mois de traitement (Ml), le pourcentage de la surface cutanée affectée par le processus de desquamation était similaires sur les deux sites traités, environ 8-9%. Les valeurs obtenues ensuite sont celles du tableau Dl.2. La formulation placebo TO a apporté une amélioration significative (p < 0,001) dès le premier mois, et celle-ci a persisté pendant le reste de l'étude pour atteindre une valeur de 7,4% à 4 mois. La formulation Tl,5 a également apporté une amélioration significative qui s'est manifestée dès le premier mois (p < 0,01) et qui s'est renforcée les mois suivants (p < 0,001). Cela s'est manifesté par des améliorations entre le premier et le quatrième mois (p < 0,01) et entre le deuxième et le quatrième mois (p < 0,05). La comparaison entre les deux site traités démontre la supériorité de la formulation Tl, 5 au deuxième mois (p < 0,01) ainsi qu'aux troisième et quatrième mois (p < 0,001) par rapport à la crème placebo.

Tableau D1.2 Pourcentage de la surface cutanée affectée par le processus de desquamation (mesuré par ULEV « ultraviolet light enhanced visualisation », Visioscan)

NS : valeurs non significativement différentes ; MO signifiant 0 mois, etc.

3. Evaluation du relief de la peau par profilométrie optique- Le relief de la peau a été observé par profilométrie optique de manière non invasive (caméra Hitachi), et les graphes de profilométrie sont analysés pour calculer la profondeur moyenne de la rugosité de la peau Rz (μm).

A l'entrée dans l'étude (MO), aucune différence dans la valeur Rz n'était présente entre les deux sites. Les valeurs de profondeur moyenne obtenues ensuite sont celles du tableau Dl.3. La formulation TO a réduit significativement (p<0,01) la valeur Rz à l'issue du quatrième mois de traitement. La formulation

Tl, 5 a réduit la valeur Rz de manière hautement significative (p<0,001) dès le deuxième mois de traitement, jusqu'à la fin de l'étude. L'amélioration s'est également marquée entre le premier et le troisième mois de traitement (p<0,05) ainsi qu'entre le premier et le quatrième mois (p<0,001) et le deuxième et le quatrième mois (p<0,05). Par rapport à la crème placebo, la formulation Tl,5 s'est avérée être la plus efficace dès le premier mois (p< 0,01), ainsi que les mois suivants (p< 0,001).

La figure 5 présente les graphiques de profilométrie obtenue sur les deux avant-bras d'un sujet après 16 semaines d'application de la crème Tl,5 et de la crème TO.

Tableau D1.3 - Profondeur moyenne de la rugosité de la peau Rz (μm), par profilométrie optique

Comparaison inter-temps (p)

NS : valeurs non significativement différentes ; MO signifiant O mois, etc.

4. Evaluation de la tonicité/élasticité de la peau par la mesure de la vitesse de propagation intracutanée d'un train d'ondes ultrasonores- Le temps de propagation d'une onde ultrasonore dans la peau (RRTM, résonance running time measurement, valeur arbitraire) est mesuré entre deux lamelles apposées sur la peau, par un Reviscometer. Le RRTM est un bon indicateur de la tension intrinsèque et de la tonicité de la peau, car plus la peau est tonique et tendue, moins la peau forme des plis en relief, et plus vite l'onde ultrasonore se propage. Ainsi, plus le RRTM est court, plus les parties constitutives de la peau sont tendues. Le RRTM est également influencée par l'état de la couche cornée, sa cohésion, il est d'autant plus court que la couche cornée est normalisée.

Les valeurs RRTM sont similaires entre les deux sites au départ de l'étude et après un mois de l'essai. Les valeurs obtenues ensuite sont celles du tableau Dl.4. La formulation TO n'a entraîné aucune modification de la valeur RRTM au cours du traitement. La formulation Tl,5 a induit une réduction significative de RRTM après trois mois (p < 0,01) et quatre mois (p < 0,001), ainsi qu'entre le premier et, respectivement le deuxième mois (p < 0,01) et les troisième et quatrième mois (p < 0,001). Par rapport à la formule placebo, la crème Tl, 5 s'est avérée significativement plus performante après deux et trois mois (p < 0,01), ainsi qu'après quatre mois (p < 0,001).

Tableau D1.4- Vitesse de propagation d'une onde ultrasonore dans la peau (unité arbitraire RRTM, Reviscometer)

NS : valeurs non significativement différentes ; MO signifiant 0 mois, etc.

5. Evaluation de l'hydratation de la couche cornée par la mesure de capacitance- L'hydratation de la couche cornée est évaluée par la mesure de capacitance électrique à l'aide d'un Comeometer (valeur arbitraire). La capacitance de la peau est proportionnelle à la teneur en eau de la peau et à l'état d'hydratation des cornéocytes de la couche cornée. Une peau bien hydratée présente une capacitance de 65, une peau très sèche de 30 à 40.

Les valeurs de capacitance sont similaires sur les deux sites à l'initiation de l'étude. Les valeurs obtenues ensuite sont celles du tableau Dl.5. La

formulation placebo TO a permis d'accroître la capacitance de manière significative après un mois (p < 0,05) et après quatre mois (p < 0,001). Dans les temps intermédiaires de deux et trois mois, aucun effet de l'application des crèmes n'est observé sur la mesure de capacitance. La formulation Tl,5 permet un accroissement significatif de la capacitance après un mois (p < 0,05), ainsi qu'après 2 et 4 mois (p < 0,001). Une augmentation significative (p < 0,05) de la capacitance est aussi observée entre le premier et le quatrième mois. La crème Tl,5 est significativement plus performante que la crème placebo après un mois (p < 0,05), et encore plus significativement performante à 2 et 4 (p < 0,001).

Tableau D1.5- Hydratation de la couche cornée par détermination de la

capacitance électrique de la peau (Corneometer)

NS : valeurs non significativement différentes ; MO signifiant O mois, etc.

Conclusions- Les cinq paramètres biométrologiques indiquent tous la supériorité de la crème à base de chitine-glucane (T0,5) par rapport à Ia crème placebo (TO) contenant les mêmes ingrédients excepté le chitine-glucane. La peau âgée devient plus lisse, moins squameuse, plus hydratée, plus ferme et moins xérotique. Les résultats indiquent que la crème à base de chitine-glucane exerce un ensemble d'actions qui permet à la peau de retrouver son élasticité, et par là de paraître plus lisse, avec moins de relief, plus radieuse, permettant de le qualifier d'ingrédient anti-âge. Les résultats sont en partie expliqués par un effet hydratant important et prolongé, comme indiqué par les tests de cornéométrie et de capacitante, mais d'autres mécanismes d'action plus profond et durable entrent également en jeu, permettant à la peau de restaurer sa fonction barrière et de voir ses activités métaboliques et défensives stimulées.

EXEMPLE D2 - Etude des effets de l'application quotidienne d'une crème de jour à base de chitine-qlucane de concentration 1,5% pendant 4 mois sur les rides et la topoloqie de surface de la peau dans la région de l'œil de sujets âgés

Cet exemple illustre les effets d'une crème à base de 1,5% de chitine-glucane sur différentes caractéristiques de la peau, en particulier dans le cadre du vieillissement cutané, la crème test et son placebo étant appliqués sur la zone du coin de l'œil de sujets âgés quotidiennement pendant une période de 4 mois. La crème de jour est une émulsion de type huile dans eau préparée avec les ingrédients du Tableau D2.1, avec du chitine-glucane de granulométrie inférieure à 125 μm produit selon l'exemple A5, et sans chitine-glucane pour la crème placebo.

Tableau D2.1- Crème de jour avec chitine-glucane de granulométrie <125 μm (test) et sans chitine-glucane (placebo)

Protocole- L'étude en simple aveugle et en intra-individuel a porté sur 21 volontaires féminins, âgés de 59 ± 1 ans (entre 52 et 65 ans) ayant des rides profondes au niveau des pattes d'oies, qui ont appliqué la crème à base de chitine-glucane (crème test) et la crème sans chitine-glucane (placebo) sur la peau dans la région du coin de l'œil (patte d'oie), à raison de 2 fois par jour pendant 4 mois. Au début de l'étude puis après 1, 2, 3 et 4 mois d'utilisation, les paramètres de relief de la peau ont été caractérisés à partir de photographies des empreinte de la peau dans un gel SilFIo ^® analysées à l'aide du Skin Image Analyser ^® . Les photographies sont prises à un angle de 35° pour permettre la visualisation des zones d'ombres. Le logiciel d'analyse d'image Quantirides ^® fournit la surface totale ridée, toutes les rides ayant une surface minimum de

0.03 mm ² étant détectées. Il fournit aussi le nombre et la profondeur moyenne des rides, en particulier des rides du microrelief de la peau. On calcule ensuite la variation des paramètres en comparant ;

• La moyenne du paramètre pour tous les volontaires au temps t avec la moyenne du paramètre au temps zéro (δl)

• La moyenne du paramètre pour tous les volontaires à un temps t pour la zone traitée par la crème test avec chitine-glucane avec la moyenne du paramètre pour la zone traitée par la crème placebo (δ2) Selon les formules suivantes :

δl(°/o) = ^{Xt ~ Xt0} 100

δ2 = (X _τt — X _τt0 ) — (X _Pt — X _pt0 ) et

Où : X _t et X _t o sont les valeurs moyennes du paramètre X obtenues avec la crème test ou le placebo aux temps t et tO

X _τt et Xr _t o sont les valeurs moyennes du paramètre X obtenues avec la crème test (avec chitine-glucane) aux temps t et tO

Xp _t et Xp _t o sont les valeurs moyennes du paramètre X obtenues avec la crème placebo (sans chitine-glucane) aux temps t et tO

Statistiques- Les différences significatives entre deux paramètres (temps t versus temps zéro, ou crème test versus placebo) ont été recherchées par le test apparié non paramétrique de Friedman suivi du test de Dunn.

Résultats-

Tableau D2.2- Variation de la moyenne des paramètres du relief de la peau au temps t par rapport au temps zéro pour la crème avec chitine-glucane (test) et sans chitine-glucane (placebo)

NS : différence non significative

Tableau D2.3- Variation de la moyenne des paramètres du relief de la peau pour tous les volontaires à un temps t pour la zone traitée par la crème test avec chitine-glucane par rapport à la variation de la moyenne du paramètre pour la zone traitée par Ia crème placebo

On déduit de cet exemple qu'une crème de type émulsion huile dans eau contenant 1,5% de chitine-glucane de granulométrie inférieure à 125 μm permet de lisser la surface de la peau dans la région de la patte d'oie et de réduire visiblement le nombre et la profondeur des rides, en particulier des plis du micro- relief. Le relief de la peau est caractérisée par :

• une surface totale ridée significativement plus faible dès 3 mois d'utilisation de la crème à base de chitine-glucane, à la fois par rapport au temps zéro (δl) et par rapport à l'utilisation de la crème placebo (δ2)

• une profondeur et un nombre de plis du micro-relief significativement plus faibles après 4 mois d'utilisation de la crème à base de chitine-glucane, à la fois par rapport au temps zéro (δl) et par rapport à l'utilisation de la crème placebo (δ2)

EXEMPLE 'D3' . Effet anti-âge d'une composition contenant du chitine-αlucane de αranulométrie fine et contrôlée. Etude de la production de pro-collagène I dans un modèle de co-culture d'épiderme humain reconstruit et de fibroblastes humain en présence de chitine-glucane

Le modèle biologique utilisé comprend un épiderme reconstruit humain (0.5 cm ² , 5 jours) et des fibroblastes en provenance d'épiderme humain normal (PF2, huitième passage) disposés dans une plaque à 24 puits (un épiderme reconstruit et 120000 fibroblastes par puit), cultivés dans un milieu de co-culture DMEM/HAM F12 supplémenté.

Une formulation simple de type émulsion huile dans eau préparée avec les ingrédients du tableau D3.1, avec un chitine-glucane (Lot L25) de granulométrie inférieure à 125 μm, est appliquée en topique sur l'épiderme (5 mg/cm ² ). Deux études sont réalisées : une étude de cytotoxicité (viabilité cellulaire de l'épiderme et des fibroblastes), et une étude de la production de pro-collagène I dans le milieu de culture.

Tableau D3.1

Cytotoxicité- Après application topique de la crème test, l'épiderme en co- culture avec les fibroblastes sont incubés à 37 ⁰ C avec 5% CO ₂ pendant 48 heures. La viabilité cellulaire des fibroblastes et de l'épiderme est estimée par marquage colorimétrique des cellules vivantes au MTT (bromure de dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium), ainsi que par une évaluation visuelle de la morphologie des cellules des fibroblastes. La viabilité cellulaire des cultures traitées avec la crème test est comparée avec celle des cultures non traitée (contrôle). 3 cultures par type de traitement sont réalisées. Les résultats sont ceux du Tableau D3.2.

Tableau D3.2- Effet de l'application topique d'une crème contenant 1.5% de chitine-glucane sur la viabilité d'un épiderme reconstruit dans une co-culture de fibroblastes et des fibroblastes, après un temps de contact de 48 heures

Production de pro-collagène I- Les co-cultures épiderme/fibroblastes sont placées dans 3 conditions différentes :

-application topique de la crème test avec chitine-glucane 1,5% -aucun traitement (contrôle)

-ajout d'une solution de TGF-β et d'acide ascorbique pour supplémenter le milieu de culture et maximiser la production de collagène par les fibroblastes (référence)

3 co-cultures par condition sont incubées à 37 ⁰ C avec 5% CO ₂ pendant 48 heures. La concentration en pro-collagène I en solution dans le milieu est déterminée par un test ELISA (pro-collagen type I C-peptide EIA kit, BioWhittaker MKlOl). La comparaison entre les résultats des différents groupe est calculée par

i'analyse des variance (ANOVA) avec le test de comparaison multiple de Dunnett (Tableau D3.3).

Tableau D3.3- Effet de l'application topique d'une crème à base de chitine- glucane sur la production de pro-collagène type I dans les milieux de co-culture épiderme/fibroblaste (n=3) ; paramètre p pour la comparaison avec le groupe contrôle

On apprend de cet exemple que l'application topique d'une crème à base de chitine-glucane de granulométrie inférieure à 125 μm à la concentration de 1,5% sur un épiderme reconstruit en co-culture avec des fibroblastes est non toxique pour l'épiderme et les fibroblastes, et qu'elle favorise de manière très significative la production de pro-collagène de type I dans le milieu de culture (sécrété par les cellules de l'épiderme et/ou les fibroblastes) par rapport au groupe contrôle sans traitement. La crème à base de chitine-glucane de granulométrie inférieure à 125 μm à la concentration de 1,5% exerce donc une action anti-âge sur la peau, le pro-collagène de type I étant le précurseur du collagène, le principal composant de la matrice extracellulaire du derme.

EXEMPLE ^% D4' Effet anti-âge d'une composition contenant du chitine-glucane de granulométrie fine et contrôlée. Evaluation des effets protecteurs du chitine-

glucane sur les cellules de Langerhans dans des biopsies de peau humaine exposées aux radiations UVB

Protocole- Les cellules de Langerhans sont des cellules dendritiques localisées majoritairement dans les couches les plus profondes de l'épiderme. Ne contenant pas de mélanine, elles sont très sensibles aux aggressions extérieures comme l'exposition aux radiations UV. En cas de stress externe, elles ont tendance à migrer de l'épiderme vers le derme, puis à déclencher l'activation des lymphocytes. On utilise donc le nombre de cellules de Langerhans saines présentes dans l'épiderme comme un indicateur des dommages de la peau liés au stress et au vieillissement. Le modèle utilisé est un explant de peau provenant d'une biopsie (4 cm ² ), cultivé sur une plaque à 6 puits dans un milieu de culture

(DMEM, L-glutamine 2 mM, pénicilline-streptomycine 50 UI/ml-50 μg/ml), sérum de veau fétal 10% à 37°C (95% air et 5% CO2). On compare les effets des 3 traitements suivants :

-contrôle sans traitement topique

-application topique de 5 mg/cm ² d'une crème contenant 1,5% de chitine- glucane de granulométrie inférieure à 125 μm, préparée selon l'exemple 29

-application topique de 5 mg/cm ² d'une crème de protection solaire d'indice de protection 20 (référence)

Deux études sont réalisées : une étude de la cytotoxicité, et une étude de l'effet de la crème à base de chitine-glucane sur le nombre de cellules de Langerhans dans les explants ayant été ou non irradiés aux UVB.

Cytotoxicité- Elle est caractérisée par la viabilité cellulaire des cellules de l'expiant (visualisation par le test MTT comme à l'exemple 29), 24 heures après traitement. Les résultats sont ceux du tableau D4.1.

Tableau D4.1- Effet de l'application topique d'une crème contenant 1.5% de chitine-glucane sur la viabilité d'un explant de peau après un temps de contact de 48 heures sur l'épiderme

Effets de l'irradiation par les UVB sur le nombre de cellules de Langerhans saines présentes dans l'expiant. Une première application topique est effectuée, l'expiant est incubé pendant 24 heures, puis une heure après une deuxième application topique les explants sont irradiés aux UVB (0.75 J/cm ² ) dans le groupe UVB+, et non irradié dans le groupe UVB-. Les explants sont ensuite incubés pendant 16 heures. Deux explants par groupe sont utilisés.

Immunohistochimie- Les explants sont congelés, et trois sections par explant sont fixées dans un mélange acétone/méthanol puis incubées avec un anticorps anti-CDla-FUC (AbCys LO-CDIa-FOS) et le marqueur de noyaux Hoechst pendant 1 heure. Les sections sont observées par microscopie de fluorescence. Seules les cellules de Langerhans ayant une fluorescence marquée et une morphologies « normale » mise en évidence par la présence de dendrites sont comptées.

On calcule un taux de protection par rapport au contrôle non irradié aux UVB selon la formule suivante : p ₍ o/ _o ) ₌ LCtraité^ - LCcontrôle^ _χ±∞ LCcontroIe _uv _ -LCcontroleuv ₊

Où : -LCtraité _uv+ est le nombre de cellules de Langerhans dans l'expiant traité et exposé aux UVB

-LCcontrôleuv ₊ est le nombre de cellules de Langerhans dans l'expiant non traité et exposé aux UVB -LCcontrôle _uv - est le nombre de cellules de Langerhans dans l'expiant non traité et non exposé aux UVB

Les résultats sont ceux du tableau D4.2.

Tableau D4.2- Nombre de cellules de Langerhans (LC) marquées par un anticorps anti-CDla dans l'épiderme d'un explant de peau traité par une crème à base de chitine-glucane et exposé (UVB+) ou non (UVB-) aux radiations UVB, par comparaison avec un contrôle non traité et une référence traitée par une crème de protection solaire d'indice 20 ; taux de protection

On conclut de cet exemple que l'application topique d'une crème à base de chitine-glucane de granulométrie inférieure à 125 μm à la concentration de 1,5% permet de préserver une grande partie des cellules de Langerhans dans l'épiderme d'un explant de peau ayant subi une exposition aux UVB. Un taux de protection de 51% aux dommages liés à l'exposition des UVB est calculé, une crème de protection d'indice 20 ayant un taux de protection de 100%. Cet effet protecteur aux radiations UVB participe à l'effet anti-âge du composé chitine- glucane.

EXEMPLE ε'- Effets de l'administration orale d'une poudre de chitine-αlucane de αranulomέtrie inférieure à 500 μm sur les paramètres caractérisant les risques cardio vasculaires chez l'homme

Cet exemple vise à mettre en évidence l'effet anti-athérosclérose, antioxydant, hypocholestérolémiant, hypolipidémiant de l'administration orale de chitine- qlucane de granulométrie inférieure à 500 μm chez l'homme

Le modèle utilisé est l'homme présentant un poids normal ou un léger surpoids et une cholestérolémie comprise entre 1,3 et 2,5g/l sous régime alimentaire standard. Le chitine-glucane de granulométrie inférieure à 500 μm (obtenu selon la méthode de l'exemple A5) est administré à raison de 4,5 g/jour, en 3 prises, 30 minutes avant les repas principaux. Les effets sur une période de 4 semaines sont étudiés. Le groupe témoin reçoit l'équivalent de 4,5 g/jour de placebo. Celui-ci est du Kaolin lourd à usage interne de grade pharmaceutique. 30 sujets masculins âgées de 20 à 50 ans, présentant un indice de masse corporel compris entre 18 et 28 kg/m ² et une cholestérolémie comprise entre 1,3 et 2,5 g/1 sont répartis en deux groupes de façon aléatoire en simple aveugle (10 contrôles/ 20 traités). Une visite médicale, un bilan des paramètres sanguins considérés pour l'étude et un questionnaire alimentaire seront réalisés lors de la sélection des sujets. La consommation alimentaire, les paramètres biochimiques et antioxydants et les paramètres anthropométriques sont mesurés 3 fois au cours de l'étude (au début, à 2 semaines et à la fin de l'étude). Les prélèvements sanguins permettent l'analyse des paramètres biochimiques et antioxydants repris dans le tableau El. Les mesures anthropométrique portent sur le suivi du poids, Sa mesure de la taille, du tour de taille, le tour de bras, le tour de cuisse et la tension artérielle.

Une consommation régulière de polysaccharides végétaux sous forme de poudre de granulométrie contrôlée, tel que le chitine-glucane, exerce un effet préventif sur des maladies métaboliques telles que l'hypercholestérolémie, les maladies cardiovasculaires ou par extension le syndrome métabolique et l'obésité.

Tableau El- Paramètres biochimiques et antioxydants suivis au cours de l'expérimentation chez l'homme

Tableau E2- Influence de la prise de chitine-glucane sur paramètres biochimiques et antioxydants

On constate que la prise orale de chitine-glucane de granulométrie inférieure à 500 μm améliore de manière significative les profils lipidique, antioxydant et les paramètres associés chez le sujet humain. Ceci permet de conclure que la consommation régulière de chitine-glucane est bénéfique dans la prévention de l'athérosclérose et par extension aux pathologies associées.

SERIE d'EXEMPLES ψ' - Matériaux cohésifs poreux comprenant au moins du chitine-αlucane de granulométrie fine et contrôlée

EXEMPLE Fl- Mise en œuyre du chitine-αlucane sous forme d'un matériau poreux

On prépare une pâte de chitine-glucane en homogénéisant 100 g d'une poudre de chitine-glucane de granulométrie fine (L25, fraction<90μm) avec 900 g d'eau, pendant au moins 1 heure. La pâte est congelée à -18°C, puis lyophilisée. On obtient un matériau poreux, cohésif, avec une bonne tenue

mécanique. L'observation par microscopie électronique à balayage (figure 6) révèle une structure très aérée isotrope et fibrillaire.

EXEMPLE F2- Mise en œuyre du chitine-alucane et du chitosane sous forme d'un matériau composite poreux cohésif

On prépare une solution de chitosane à 2% dans l'acide acétique à 1%. On y disperse une poudre de chitine-glucane de granulométrie fine (L16, fraction<90 μm), et on homogénéise pendant 2 minutes. La dispersion est congelée à -18°C, puis lyophilisée. On obtient un matériau poreux, cohésif, avec une bonne tenue mécanique. L'observation par microscopie électronique à balayage (figure 7, coupe longitudinale) révèle une structure poreuse non fibrillaire, interconnectée, les pores présentant une certaine orientation.

EXEMPLE F3 - Préparation d'un matériau composite poreux composite avant la chitosane comme matrice polymère et des particules de copolymère chitin- glucane comme agent dispersé : influence de la αranuométrie sur les propriétés mécaniques et morphologiques

Différentes granulométries de chitine-glucane sont préparées selon la méthode de l'exemple A5. La fraction ayant un diamètre de particules inférieur à 63 μm, et les fractions ayant un diamètre compris entre 125 et 250 μm, 250 et 500 μm, 500 et 1000 μm sont séparées par tamisage.

Le chitosane de masse moléculaire 42K (masse moléculaire déterminée par viscosimétrie capillaire) et degré d'acétylation de 11% est dissout dans l'acide acétique (1%) pour former une solution de concentration égale à 2% (m/m). Un poids donné de particules de chitine-glucane de granulométrie contrôlée est ajouté à un volume donné de cette solution. Un volume de 4 ml de suspension est homogénéisée par agitation magnétique pendant 2-3 min avant d'être coulée dans un moule (de forme losange) et congelée. L'échantillon est ensuite placé

sur le plateau d'un lyophilisateur pour éliminer le solvant par sublimation sous vide pendant 48h.

Des matériaux composites poreux cohésifs de différentes compositions ont été préparées en faisant varier la proportion pondérale de chitosane et de chitine- glucane ainsi que la granulométrie de la poudre de chitine-glucane.

Des matériaux composites sous forme de mousses de différents formats ont été produits en faisant varier la taille du moule- exemples : nacelles de pesée hexagonale en polystyrène, petit format : 4ml de solution ; grand format : 15ml de solution. Les paramètres de formulation des mousses préparées sont repris au Tableau F3.1 ci-dessous.

Tableau F3.1- Mélanges chitosane / chitine-glucane et propriétés des matériaux composites poreux cohésifs

Les matériaux composites sous forme de mousses obtenues par lyophilisation ont été caractérisées en terme de microstructure par microscopie électronique à balayage (MEB). La résistance à la compression des mousses exprimée par le

module de Young est déterminée à l'aide d'essais de compression axiale sur un banc de traction-compression Instron 5566, équipé d'une cellule de faible force. Les échantillons ont été soumis à une précharge de 0.03 N, et déformés avec une vitesse de 0.2 mm/min. Le module de Young est déterminé à partir de la région linéaire initiale de la courbe stress/strain. La masse volumique a été déterminée par gravimétrie (volume/masse de la mousse). Les résultats sont reportés dans le tableau F3.1. Les microphotographies MEB sont celles de la figure 8.

On comprend ainsi du tableau F3.1 que la masse volumique des mousses augmente à mesure que la proportion du chitïne-glucane, augmente. De façon surprenante, on constate que c'est pour une proportion équivalente chitosane/chitine-glucane (50/50), que le module de Young est le plus élevé, alors qu'il est significativement plus faible pour les proportions 75/25 et 25/75. Une proportion d'environ 50% de particules de chitine-glucane constitue donc la proportion optimale pour améliorer les propriétés mécaniques des mousses et, en l'occurrence, la résistance à la compression axiale.

On constate également sur la figure 8 que les particules de chitine-glucane sont réparties de façon homogène sur l'épaisseur de la mousse, leur densité augmentant logiquement avec leur proportion initiale. Les particules se retrouvent ça et là au sein des pores et souvent ancrées dans les parois même des pores.

Des enregistrements d'images obtenues par MEB (figure 9) réalisées pour les échantillons A5 et B5 (taille des particules de chitine-glucane comprise entre 500 et 1000 μm) ainsi que pour des échantillons A4 et B4 (taille des particules comprises entre 250 et 500 μm) révèlent que l'homogénéité de structure n'existe plus. Les particules ont une taille trop élevée sédimentent et se concentrent dans la partie inférieure de l'échantillon après lyophilisation. Cet exemple démontre qu'en vue de la mise en oeuvre du copolymère de chitine-glucane dans un

matériau composite poreux, ce copolymère doit présenter une granulométrie fine et contrôlée.