Diverse Fixativa ist beispielsweise aus der DE 10 2012 101 896 A1 bekannt. Eines der offenbarten Fixativa umfasst als Lösungsmittel Alkohol, in dem als

Denatunerungsmittel ein Polyamin gelöst ist. Die DE 10 2012 101 896 A1 offenbart allerdings auch, dass bestimmte Alkohole, wie Ethanol als Lösungsmittel nachteilig sind, weil es das zu konservierende Gewebe dehydriert. Ein anderes der offenbarten Fixativa umfasst als Lösungsmittel Wasser, in dem als

Denatunerungsmittel ein Polyamin gelöst ist. Insbesondere bei der Fixierung von Gewebe mit in Wasser gelösten Polyaminen als Denatunerungsmittel ist jedoch nachteilig, dass die zur Konservierung notwendige strukturelle Veränderung des zu konservierenden organischen Gewebes zu langsam abläuft und sich damit beispielsweise ungewünschte Artefakte bilden, oder der Fixiervorgang nicht alle Strukturen der Zellen und des Gewebes voll erfasst. Aufgabe der Erfindung ist es daher, die Wirkung des Denaturierungsmittels zu beschleunigen, ohne das zu konservierende Gewebe zu zerstören und so die Fixierung zu verbessern.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung, umfasst ein Fixativum zur Konservierung von organischem Gewebe und Zellverbänden ein hydrophiles Denatunerungsmittel zum strukturellen Verändern der Moleküle des organischen Gewebes, ein lipophobes Lösungsmittel, in dem das Denatunerungsmittel gelöst ist und ein in dem

Lösungsmittel gelöstes amphiphiles Infiltrationsmittel zum Lösen von Fetten an der Oberfläche des biologischen Gewebes, um ein Eindringen des

Denatunerungsmittels in das biologische Gewebe zu beschleunigen.

Dem angegebenen Fixativum liegt die Überlegung zugrunde, dass ein

Denatunerungsmittel zur Anwendung in einem Lösungsmittel gelöst verwendet wird und hydrophil wirkt. Das Denatunerungsmittel muss sich in dem Lösungsmittel lösen können, das Lösungsmittel ist daher nicht beliebig wählbar. Das

Lösungsmittel darf das zu konservierende organische Gewebe dabei nicht verändern und sollte daher lipophob gewählt werden. Auf der anderen Seite verlangsamt Fett an den Zellwänden des zu konservierenden organischen

Gewebes die Wirkung des Denatunerungsmittels, was die Wahrscheinlichkeit für osmotische Schäden am zu konservierenden organischen Gewebe erhöht, welche wiederum zu den zu vermeidenden Artefakten führen (Beispiele: Hämolytische Wirkung, strukturelle, biochemische und morphologische Zerstörung von

Erythrozyten und anderen Zellen, Zellstrukturen, beispielsweise auch von

Protozoen, Verschlechterung der immunologischen Eigenschaften).

Für ein schnelles Einwirken des Denatunerungsmittels in das zu konservierende Gewebe wäre es daher wünschenswert, wenn das Fett an den Zellwänden möglichst schnell gelöst wird. Daher wird mit dem angegebenen Fixativum vorgeschlagen, in dem Lösungsmittel zusätzlich ein amphiphiles, also ein gleichzeitig lipophiles und hydrophiles, Infiltrationsmittel zu lösen, welches sich aufgrund seiner Hydrophilität im Lösungsmittel lösen lässt, und welches aufgrund seiner Lipophilität das Fett den Zellwänden des zu konservierenden biologischen Gewebes löst. Die Penetration des Denatunerungsmittels in das zu konservierende biologische Gewebe wird auf diese Weise beschleunigt und die Wirkung des Fixativums verbessert, um alle inter- und extrazellulären Bereiche beziehungsweise Bestandteile des zu konservierenden Gewebes zu erfassen . Mit dem angegebenen Fixativum können selbst mit Polyamin, insbesondere auch mit Urotropin als Denatunerungsmittel zufriedenstellende

Konservierungsergebnisse erreicht werden.

Als Lösungsmittel sollte bevorzugt Wasser verwendet werden, weil dies einerseits das zu konservierende Gewebe nicht angreift und andererseits sehr kostengünstig ist. Das amphiphile Infiltrationsmittel sollte bevorzugt hygroskopische Eigenschaften aufweisen. Auf diese Weise wirkt das Infiltrationsmittel selbst fixierend und unterstützt das eigentliche Denaturierungsmittel bei der Konservierung, ohne dass ungünstige denaturierende und hygroskopische Eigenschaften zu Tage treten.

In dem amphiphilen Infiltatraionsmittel kann wenigstens ein kurzkettiges Alkanol mit maximal zehn Kohlenstoffeinheiten enthalten sein. Kurzkettige Alkohole haben sowohl eine polare OH-Gruppen als auch unpolare CH-Gruppen und wirken daher amphiphil. Das kurzkettige Alkanol kann aus Methanol, Ethanol, Isopropanol, Glyzerin und Butanol ausgewählt sein.

Das angegebene Fixativum kann 80 bis 99,8 Gew. % des Lösungsmittels,

0,1 bis 10 Gew. % des Denaturierungsmittels und 0,1 bis 10 Gew. % des

Infilitrationsmittels enthalten. Mit diesen Mischungsverhältnissen wird durch eine Lösung von lipophilen Membranstrukturen der Gewebszellen eine aktive Infiltration erzielt. Im eingangs genannten Fixativum wird durch Verwendung von amphiphilen Ethanol als Lösungsmittel lediglich eine passive Funktionshilfe erreicht, die bei vielen Gewebetypen nicht oder nur unvollkommen funktioniert.

Das Infiltrationsmittel kann 0,1 bis 10 Gew % Methanol und/oder 0,1 bis 10 Gew % Ethanol und/oder 0,1 bis 10 Gew % Isopropanol und/oder 0,1 bis 10 Gew %

Glyzerin und/oder 0,1 bis 10 Gew % Butanol enthalten. Insbesondere kann das Fixativum drei oder vier der genannten Alkohole enthalten und so ein ternäres oder quaternäres Gemisch sein.

Das Denaturierungsmittel kann ein Polyamin, insbesondere Urotropin (auch auch Hexamethylentetramin oder Methenamin genannt) enthalten. Das Fixativum kann ferner ein Säurungsmittel umfassen, das eingerichtet ist, Protonen abzuzgeben, die mit dem Denaturierungsmittel reagieren und so ein Aldehyd bilden, das dann wiederum die Konservierung des biologischen Gewebes beschleunigt. Mit dem Säurungsmittel kann der pH-Wert des Fixativums eingestellt werden. Wird beispielsweise Urotropin allein in Wasser als Lösungsmittel verwendet, dann ist der pH-Wert dieser Wasserlösung alkalisch und instabil. Für ein wirkungsvolles Fixativum sollte der pH-Wert auf einen stabilen Wert zwischen 2,5 und 10, vorzugsweise unterhalb von unter 8 eingestellt werden.

Das Säuerungsmittel zum Einstellen des pH-Wertes kann eine organische Säure, eine anorganische Säure, ein sauer reagierendes Salz oder eine Mischung davon sein.

Die organische Säure kann ausgewählt sein aus aliphatischen gesättigten und ungesättigten Monocarbonsäuren, Di- und Tricarbonsäuren, aromatischen

Carbonsäuren, beispielsweise Salizylsäuren, Benzoesäuren, heterozyklischen Carbonsäuren oder Mischungen davon. Beispiele für in Frage kommende organische Säuren sind Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Sorbinsäure, Ascorbinsäure und deren Mischungen.

Die anorganische Säure kann ausgewählt sein aus Salzsäure, Schwefelsäure, schweflige Säure, Phosphorsäure, Salpetersäure, salpetrige Säure und

Polythionsäuren und deren Salze, sowie deren Mischungen. Das sauer reagierende Salz kann ausgewählt sein aus quartären

Ammoniumverbindungen, Ammoniumchlorid und Mischungen davon.

Dem Fixativum können ferner bakterizid wirkende Substanzen (wie z.B.

Natriumazid und quartäre Ammoniumverbindungen) beigemischt werden. Der Zusatz von Tensiden (anionischen und kationischen, nichtionischen und

amphoteren Tensiden - hier auch quartäre Ammoniumverbindungen mit

Tensidwirkung) verbessert die Fähigkeit der Infiltration und Penetration des in der Erfindung genannten Fixativums im physiologischen und nicht physiologischen Milieu. Als Konzentration kann 0,001 - 10,0% gewählt werden.

Die Lösungen mit den oben erwähnten Inhalten können ferner mit Duftstoffen und Farbstoff versehen.

Gegenüber den herkömmlichen Gewebe- und Zellfärbungen mit Formalin und anderen, bislang verwendeten konventionellen Fixiermittel mit vielen Nachteilen sind mit dem angegebenen Fixativum wenig, oder keine Artefakte zu verzeichnen. Viele Strukturen im Gewebe, in den Zellen und im subzellulären Bereich werden durch die verschiedenen nachfolgenden Färbeverfahren besser angefärbt. Durch die Verwendung des neu entwickelten Fixierkonzeptes werden auch die

serologisch-immunologischen und molekularbiologischen Untersuchungen begünstigt im Sinne der verbesserten Möglichkeit der fachlichen und

diagnostischen Beurteilung und Weiterverarbeitung.

Durch die Anfärbung des Fixiermittels erreicht man eine optische Differenzierung gegenüber anderen wässerigen Diagnostika und chemischen Lösungen. Dadurch kann die Sicherheit im Laboratorium erhöht werden. Die charakteristische Färbung, die mit geschützt werden soll: Pink-Farbe. Die Duftstoffe dienen ebenso der Sicherheit im Labor.

Durch das angegebene Fixativum findet keine nenneswerte Vernetzung von DNS und RNS und der Proteine statt, wie das bei den meisten bekannten Fixativa nach dem Stand der jetzt bekannten Technik gegeben ist. Das hat enorme Vorteile für die DNS/RNS-Untersuchungen, die molekular-biologische Gentechnologie, aber auch für alle anderen biotechnologischen Arbeiten und Untersuchungen, die mit

Proteinstrukturen zu tun haben. Fixiermittel, die primäre, sekundäre, tertiäre oder quartäre Proteinstrukturen verändern und dies häufig sogar irreversibel, erfüllen nicht die modernen analytischen und präparativen Arbeitsbedingungen und deren Qualitätsmanagement. Durch die starke, zum Teil irreversible Proteindenaturierung wird nicht nur eine künstliche Barierre, Behinderung und Verzögerung des

Fixationsvorganges erreicht. Es werden auch Artefakte produziert, die

beispielsweise in der Diagnostik falsch positive oder auch falsch negative

Ergebnisse begünstigen. Formalinhaltige Fixiermittel und deren Verwandte geben ein gutes Beispiel für diese Nachteile ab. Es muss aber hier auch auf die Nachteile der rein alkoholhaltigen Fixationsmittel verwiesen werden. Das angegebene

Fixativum verbindet die Vorteile aller bisherigen Fixationsmittel nach dem Stand der Technik ohne deren Nachteile aufzuweisen.

Die oben beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung sowie Art und Weise, wie diese erreicht werden, werden klarer und deutlicher verständlich im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung der

Ausführungsbeispiele, die im Zusammenhang mit der Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Darstellung eines zu konservierenden Gewebekörpers in einem Fixativum. In den Figuren werden gleiche technische Elemente mit gleichen Bezugszeichen versehen und nur einmal beschrieben. Die Figuren sind rein schematisch und geben vor allem nicht die tatsächlichen geometrischen Verhältnisse wieder.

Es wird auf Fig. 1 Bezug genommen. Schematisch gezeigt ist ein Becherglas 2, in dem eine Fixierlösung 4 sowie ein mit der Fixierlösung 4 zu fixierendes Gewebe 6 aufgenommen ist. Das zu fixierende Gewebe 6 kann ein sehr fettreiches Organ eines Menschen sein, wie beispielsweise das Zentralnervensystem, die Leber, die Muskulatur, das Herz oder die Blutgefäße. Der reiche Fettgehalt des zu fixierenden Gewebes 6 ist in Fig. 1 durch eine gestrichelte Linie 8 um das zu fixierende

Gewebe 6 angedeutet.

Die Fixierlösung 4 enthält im vorliegenden Ausführungsbeispiel 98% eines

Lösungsmittels in Form von Wasser, 1 % eines Denaturierungsmittels in Form von Urotropin und 1 % eines noch zu beschreibenden Infiltrationsmittels.

Beispielsweise aus der DE 10 2012 101 896 A1 ist die konservierende Wirkung von Urotropin bekannt. Allerdings läuft der Konservierungsvorgang nur sehr langsam ab und insbesondere ein hoher Fettanteil 8 in dem zu konservierenden organischem Gewebe 6 verlängert den Konservierungsvorgang deutlich.

Aus diesem Grund ist in dem Lösungsmittel der Fixierlösung 4 zusätzlich das Infiltrationsmittel gelöst. Seine Aufgabe ist es, den Fettanteil 8 des zu fixierenden Gewebes zu lösen und so die Infiltration des Dentaturierungsmittels zu

beschleunigen. Damit das Infiltrationsmittel in der Fixierlösung 4 gelöst werden kann, muss es zusätzlich hydrophil gewählt sein, weshalb für das Infiltrationsmittel ausschließlich amphiphile Stoffe in Frage kommen.

In der vorliegenden Ausführung wurde für das Infiltrationsmittel ein quaternäres Gemisch aus Methanol, Ethanol, Isopropanol und Glyzerin zu je gleichen Anteilen gewählt. Durch Hinzugeben dieses Infiltrationsmittels zu der Fixierlösung 4 konnte die Zeitdauer des gesamten Fixier- und Konservierungsvorgang deutlich reduziert werden.

Zwar ist die Verwendung eines amphiphilen Mittels in Form von Alkohol in der Fixierlösung bereits aus der DE 10 2012 101 896 A1 bekannt, allerdings wird der Alkohol dort als Lösungsmittel selbst verwendet. Der dort angegebene Alkohol begünstigt, vermischt mit Urotropin als ein Mittel mit stark polarer und hydrophiler Eigenschaft, das passive Eindringen ins biologische Gewebe. Die Eigenschaft der zuvor als Infiltrationsmittel angegebenen Alkohole aufgelöst in Wasser erweitert einerseits das Eindringen des Fixiermittels Urotropin in einer deutlich verbesserten Weise, nämlich durch Erweichung/Auflösung - und Öffnung - der lipophilen Membranstrukturen, andererseits wirken diese Alkohole selbst in den vorgeschlagenen Konzentrationen und Mischungen auch als ideale Fixiermittel - ohne die ungünstigen denaturierenden und hygroskopischen Eigenschaften der reinen Alkoholfixierungen zu besitzen, wenn der Alkohol als Lösungsmittel selbst verwendet wird.

Zudem sind die Fixiereigenschaften der zusammen mit Urotropin in Wasser gelösten Alkohole in den angegebenen Konzentrationen nicht nur einzeln, sondern auch zusammen kumulativ gegeben, wodurch eine deutliche Steigerung der fixativen Qualität und Potenz bei allen Gewebetypen unabhängig vom Fettgehalt gegeben ist. Zusammenfassend lässt sich die angegebene Fixierlösung wie folgt beurteilen:

Amphiphile Stoffe, wie die beispielhaft angegebenen Alkohole werden nicht als das Denaturierungsmittel tragendes Lösungsmittel sondern als Hilfsmittel verwendet. Die für das angegebene Fixativum angegebenen Stoffgruppen wirken in den angegebenen Konzentrationen und im vorgeschlagenen Mischungverhältnis in idealer Weise fixierend im physiologischen Milieu wie auch bei verfettetem oder fettreichem Gewebe.

Das angegebene Fixtativim eliminiert die bisherigen Nachteile der einzelnen fixativ wirkenden amphiphilen Stoffe, weil diese Nachteile durch das lösen in einem hydrophoben Lösungsmittel nicht mehr zum Tragen kommen. Die Infiltration des Denatunerungsmittels wird aktiv durch Lösung von lipophilen Membranstrukturen der Gewebszellen erzielt. Bei der Verwendung amphiphiler Stoffe als Lösungsmittel konnte lediglich eine passive Funktionshilfe erzielt werden, die bei vielen Gewebetypen nicht oder nur unvollkommen funktioniert.