Die Erfindung betrifft ein Durchflusszytometrie-Messverfahren, bei dem ein Analy semedium bereitgestellt wird, welches ein Fluid und darin enthaltene, zu klassifi zierende biologische Zellen aufweist, wobei mindestens ein Markierungsmolekül bereitgestellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spezifisch an mindestens eine an der Oberfläche der Zel len befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Zielstruktur aufweist, wobei ein Fluidstrom des Analysemediums erzeugt wird, in dem die Zellen einzeln in einen Messbereich eines Energiestrahls und/oder eines elektrischen Felds ge langen, wobei für die einzelnen, in dem Messbereich befindlichen Zellen jeweils zumindest für einen ersten physikalischen Parameter ein erster und für einen zweiten physikalischen Parameter ein zweiter Durchflusszytometrie-Messwert er fasst werden, wobei zumindest der erste Parameter eine Fluoreszenzstrahlung ist, welche das mindestens eine Markierungsmolekül bei Anregung mit dem Energie strahl oder dem elektrischen Feld abgibt, und wobei die Zellen anhand der Durch- flusszytometrie-Messwerte klassifiziert werden. Außerdem betrifft die Erfindung ei nen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Der Begriff Durchflusszytometrie (Zytometrie: Zell-Vermessung) beschreibt ein Messverfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Es erlaubt die Analyse von biologischen Zellen, die mit hoher Geschwindigkeit einzeln ein elektrisches Feld oder einen Lichtstrahl passieren. Je nach Form, Struktur und/oder Färbung der Zellen werden unterschiedliche Durchflusszytometrie-Mess- werte erfasst, aus denen die Eigenschaften der einzelnen Zellen abgeleitet und die Zellen somit klassifiziert werden können.

Bei einer Form der Durchflusszytometrie werden Fluoreszenz-markierte Zellen je nach Färbung in unterschiedliche Reagenzgefäße sortiert. Entsprechende Geräte werden als Fluss-Sortierer (flow sorter) oder als FACS (fluorescence-activated cell sorting) bezeichnet. Manchmal wird der Begriff FACS (=fluorescence-activated cell scanning) mit dieser Bedeutung für Geräte verwendet, die keine Sortierung der Zellen, sondern nur eine Analyse oder Klassifizierung ihrer Eigenschaften durch führen.

Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahl passiert. Durch einen Hüllstrom fo kussiert, tritt die Probe in den Mikrokanal einer hochpräzisen Küvette aus Glas o- der Quarz ein, derart, dass jede Zelle einzeln nacheinander durch den Messbe reich eines Laserstrahls geführt wird. Das dabei entstehende Streulicht oder Fluo reszenzsignal wird von einem Detektor erfasst. Das Ergebnis sind quantitative In formationen über jede einzelne Zelle. Durch die Analyse einer großen Anzahl von Zellen innerhalb eines sehr kurzen Zeitintervalls (>1000 Zellen/Sekunde) erhält man schnell repräsentative Informationen über Zell-Populationen, die in dem Ana lysemedium enthalten sind.

Zugleich mit dem gestreuten Licht kann man im Durchflusszytometer Fluoreszenz farben messen. Nur wenige Zellen emittieren per se fluoreszierendes Licht. Daher verwendet man Markierungsmoleküle, wie z.B. Farbstoffe, die an bestimmte Ziel strukturen der Zellen binden. Setzt man z.B. die Farbstoffe DAPI (4',6-Diamidine- 2'-phenylindole dihydrochloride) und Propidiumiodid ein, welche an die Desoxyri bonukleinsäure (DNA) einer Zelle binden (DAPI) bzw. in diese interkalieren (Propi diumiodid) - d. h. sich zwischen die Basen einlagern -, kann man anhand der Hel ligkeit der Fluoreszenzstrahlung, die das mindestens eine, an die Zelle immobili sierte Markierungsmolekül beim Passieren des Laserstrahls aussendet, untersu chen, wie viel DNA die Zelle enthält.

Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können als Markie rungsmoleküle verwendet werden. Die Antikörper sind meist gegen bestimmte Oberflächenproteine gerichtet, z.B. Proteine der CD-Klassifizierung (CD: Cluster of differentiation). Nach Markierung kann bei Bedarf dann auch die Sortierung der Zellen nach diesen Merkmalen erfolgen. Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und vor allem Filtern kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und da mit die Informationsdichte erhöht werden. Dabei sind Antikörper die am häufigsten verwendeten Moleküle, um Oberflächenproteine auf Zellen zu markieren. Unter Markierungsmolekülen werden Antikörper, die mit mindestens einem optischen Markern markiert sind, und/oder andere Moleküle verstanden, die geeignet sind, spezifisch an eine an der Oberfläche einer in dem Analysemedium enthaltenen Zelle, wie zum Beispiel einer Krebszelle, befindliche Zielstruktur zu binden und die Zelle optisch zu markieren.

Obwohl das Durchflusszytometer bei fluoreszenzmarkierten Zellen sowohl die Messung der Anzahl der markierten Zellen als auch die Erfassung eines Mess werts für das von den einzelnen Zellen abgegebene Fluoreszenzsignal ermöglicht, ist eine quantitative Auswertung des Fluoreszenzsignals schwierig, da die für die Messungen verwendeten Durchflusszytometer unterschiedlich sind und daher bei Messungen, die mit verschiedenen Durchflusszytometern vorgenommen wurden, eine Vergleichbarkeit der Durchflusszytometrie-Messwerte nicht gewährleistet ist. Insbesondere werden die Durchflusszytometrie-Messwerte durch die Intensität der zur Beleuchtung des Messbereichs verwendeten Laserstrahlung, durch Toleran zen von optischen Filtern, dem Aufbau der Durchflussmesszelle (Fluidik), den ver wendete Reagenzien, Detektoren und der Variabilität der die Markierungsmoleküle enthaltenden Proben beeinflusst.

Zwar ist eine Quantifizierung der Fluoreszenzmesswerte der Zellen durch Ver gleich des ersten Durchflusszytometrie-Messwerts mit einem Schwellwert möglich, jedoch wird dieser meistens willkürlich gesetzt. Eine genau Quantifizierung der Bindungsereignisse pro Zelle und damit eine universelle plattformunabhängige Vergleichbarkeit der Fluoreszenzmesswerte ist bisher nicht möglich.

Es ist auch bereits bekannt, Durchflusszytometrie-Messgeräte mit Hilfe von fluo reszierenden Mikropartikeln, die in einem Fluid angeordnet sind, das durch den Messbereich des Energiestrahls bzw. des elektrischen Felds geleitet wird, zu ka librieren. Es zeigte sich jedoch, dass diese Kalibrierung nicht ausreicht, um einen genauen Vergleich der mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessenen Flu oreszenzmesswerte zu ermöglichen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Durchflusszytometrie-Messverfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, die Zielstruktur an der Oberfläche der Zellen mit großer Präzision quantitativ nachzuweisen. Außer dem sollen die durch Fluoreszenzmessung erhaltenen quantitativen Messwerte, wenn sie mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessen wurden, präzise mit einander vergleichbar sein (Referenzieren / Normalisieren). Aufgabe der Erfindung ist außerdem, einen ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird bezüglich des Durchflusszytometrie-Messverfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Erfindungsgemäß ist dabei ein Durchflusszy- tometrie-Messverfahren vorgesehen, bei dem ein Analysemedium bereitgestellt wird, welches ein Fluid und darin enthaltene, zu klassifizierende biologische Zellen aufweist, wobei mindestens ein Markierungsmolekül bereitgestellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spe zifisch an mindestens eine an der Oberfläche der Zellen befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Zielstruktur aufweist, wobei ein Fluidstrom des Analysemediums erzeugt wird, in dem die Zellen einzeln in einen Messbereich ei nes Energiestrahls und/oder ein elektrisches Feld gelangen, wobei für die einzel nen, in dem Messbereich befindlichen Zellen jeweils zumindest für einen ersten physikalischen Parameter ein erster und für einen zweiten physikalischen Parame ter ein zweiter Durchflusszytometrie-Messwert erfasst werden, wobei zumindest der erste Parameter eine Fluoreszenzstrahlung ist, welche das mindestens eine Markierungsmolekül bei Anregung mit dem Energiestrahl oder dem elektrischen Feld abgibt, wobei die Zellen anhand dieser Durchflusszytometrie-Messwerte klas sifiziert werden, wobei mindestens ein erster und mindestens ein zweiter Kalibra tor bereitgestellt werden, die jeweils einen Festkörperpartikel aus einem nicht was serlöslichen, anorganischen und/oder polymeren Material aufweisen, wobei die Festkörperpartikel des mindestens einen ersten und des mindestens einen zwei- ten Kalibrators bezüglich ihrer Form, ihrer Größe und ihres Materials übereinstim men, wobei der mindestens eine erste Kalibrator an seiner Oberfläche mindestens eine Zielstruktur aufweist, die mit der mindestens einen Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalibrators immobilisiert ist, wobei der mindestens eine zweite Kalibrator diese Zielstruktur nicht aufweist, wobei der mindestens eine erste und der mindestens eine zweite Kalibrator mit dem Analysemedium vermischt werden, bevor die Durchflusszytometrie-Mess- werte erfasst werden, derart, dass mindestens ein in dem Analysemedium befindli ches Markierungsmolekül an die mindestens eine Zielstruktur des ersten Kalibra tors bindet, wobei die Kalibratoren in dem Fluidstrom einzeln nacheinander in den Messbereich eingebracht werden, wobei für den mindestens einen ersten und den mindestens einen zweiten Kalibrator entsprechende erste und zweite Durch- flusszytometrie-Messwerte erfasst werden wie für die Zellen, wobei der dem zwei ten Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen und dem zweiten Durchflusszyto- metrie-Messwert der Kalibratoren zugeordnete Parameter derart gewählt wird, dass sich die Kalibratoren anhand der zweiten Messwerte von den Zellen unter scheiden lassen, und wobei aus dem mindestens einen ersten Durchflusszytomet rie-Messwert des mindestens einen ersten Kalibrators, dem mindestens einen ers ten Durchflusszytometrie-Messwert des mindestens einen zweiten Kalibrators und dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert mindestens einer Zelle ein normali sierter erster Durchflusszytometrie-Messwert für die mindestens eine Zelle gebil det wird.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die Toleranzen der für den Nachweis der Bindung der Markierungsmoleküle an die Zielstruktur der Zellen ver wendeten Reagenzien, die Variabilität der Markierungsmoleküle und die Zusam mensetzung des Analysemediums einen wesentlichen Einfluss auf die Durch- flusszytometrie-Messwerte der zu klassifizierenden Zellen hat. Diese Toleranzen werden insbesondere durch das Alter der Markierungsmoleküle, die Art und Weise, wie und unter welchen Bedingungen die Markierungsmoleküle vor der Durchführung des Durchflusszytometrie-Messverfahrens gelagert wurden, und durch zusätzlich zu den Zellen in dem Analysemedium enthaltene Substanzen, wie z.B. Inhibitoren, welche die Bindung der Markierungsmoleküle an die Zielstruk tur erschweren oder anstelle der Markierungsmoleküle an die Zielstruktur binden, beeinflusst. Außerdem können auch Umgebungsbedingungen, wie z.B. die Tem peratur, die Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen beeinflussen.

Diese Einflüsse werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch kompen siert, dass standardisierte erste und zweite Kalibratoren bereitgestellt werden, dass für diese Kalibratoren entsprechende Durchflusszytometrie-Messwerte er fasst werden wie für die Zellen, und dass die an den Zellen gemessenen Durch flusszytometrie-Messwerte mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Messwerte der Ka libratoren normalisiert werden. Hierdurch wird eine genaue Quantifizierung der zwischen den einzelnen Zellen und den Markierungsmolekülen bzw. deren Anti körpern auftretenden Bindungsereignisse pro Zelle ermöglicht. Die normalisierten Durchflusszytometrie-Messwerte können auch bei Durchflusszytometrie-Messun- gen, die mit unterschiedlichen Durchfluss-Zytometern durchgeführt wurden und/o der bei denen Reagenzien bzw. Markierungsmolekülen verwendet wurden, die be züglich ihrer Eigenschaften voneinander abweichen, exakten miteinander vergli chen werden. Hierdurch ist es insbesondere möglich, durch Clusteranalyse zu sammengehörige Zell-Subpolulationen zu identifizieren. Da die Kalibratoren keine lebenden Zellen sind sondern Festkörperpartikel als Träger für die mindestens eine Zielstruktur aufweisen, sind die Kalibratoren langzeitstabil, d.h. sie lassen sich über einen längeren Zeitraum lagern, ohne dass sich ihre für den Nachweis der Zielstruktur relevanten Eigenschaften wesentlich verändern.

Der Parameterraum jeder Analyse ist von der Anzahl der maximalen Bindungser eignisse pro Zelle und den Messparametern abhängig. D.h. bei der Bestimmung von z.B. drei Parametern ergeben diese einen dreidimensionalen Raum, dessen Achsen aber nicht zwingend rechtwinkelig zueinander stehen. Die Markierungsart und Markierungsdichte (Anzahl der Fluorophore pro Antikörper) und die Binde stärke und Spezifität der verwendeten Antikörper (bzw. Markierungsmoleküle) spielen dabei ebenfalls eine Rolle. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden normalisierte Durchflusszytomet- rie-Messwerte für die Zellen bereitgestellt, die unabhängig von den physikalischen Eigenschaften des für die Durchführung des Verfahrens verwendeten Durch- flusszytometers, unabhängig von Toleranzen von den verwendeten Reagenzien und Markierungsmoleküle und unabhängig von Substanzen und Wirkstoffen ist, die in dem Analysemedium zusätzlich zu den Zellen enthalten sein können.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird zur Bildung des norma lisierten ersten Durchflusszytometrie-Messwerts die Differenz zwischen dem ers ten Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators und dem ersten Durch- flusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators zur Differenz zwischen dem ers ten Durchflusszytometrie-Messwert der Zelle und dem ersten Durchflusszytomet rie-Messwert des zweiten Kalibrators ins Verhältnis gesetzt. Dabei beträgt der nor malisierte Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen vorzugsweise 100%, wenn der erste Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen mit dem ersten Durchflusszy tometrie-Messwert des ersten Kalibrators übereinstimmt. Wenn der erste Durch flusszytometrie-Messwert der Zellen mit dem ersten Durchflusszytometrie-Mess wert des zweiten Kalibrators übereinstimmt, hat der normalisierte Durchflusszyto metrie-Messwert der Zellen den Wert null. Die ersten Kalibratoren sind bevorzugt derart ausgestaltet, dass der erste Durchflusszytometrie-Messwert mindestens ei nes ersten Kalibrators mit dem zu erwartenden Maximalwert des ersten Durch flusszytometrie-Messwerts der Zellen übereinstimmt oder etwas darüberliegt, ins besondere maximal 3%, maximal 5%, maximal 10% oder maximal 25% über dem erwarteten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators. Der ent sprechende Erwartungswert kann experimentell ermittelt werden.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden mehrere identische erste Kalibratoren und mehrere identische zweite Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt, bevor die Durchflusszytometrie-Messwerte für die einzelnen erfasst werden, wobei aus den ersten Durchflusszytometrie-Mess- werten der ersten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszytometrie-Mess- wert für die ersten Kalibratoren und aus den ersten Durchflusszytometrie-Mess- werten der zweiten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszytometrie-Mess- wert für die zweiten Kalibratoren gebildet wird, und

wobei zur Bildung eines normalisierten ersten Messwerts einer Zelle die Dif ferenz zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Messwert der ersten Kalibratoren und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Mess wert der zweiten Kalibratoren zur Differenz zwischen dem ersten Durch flusszytometrie-Messwert der Zelle und dem gemittelten ersten Durch flusszytometrie-Messwert der zweiten Kalibratoren ins Verhältnis gesetzt wird,

oder

wobei zur Bildung eines normalisierten ersten Messwerts für eine mehrere Zellen umfassende Zellpopulation jeweils für die einzelnen Zellen erste Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst werden, wobei aus diesen Durch- flusszytometrie-Messwerten ein gemittelter erster Durchflusszytometrie- Messwert für die Zellpopulation gebildet wird, und wobei zur Bildung des normalisierten ersten Messwerts für eine Mehrzahl von Zellen

a) die Differenz zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der ersten Kalibratoren und dem gemittelten ersten Durch flusszytometrie-Messwert der zweiten Kalibratoren zur Differenz zwi schen dem ersten gemittelten Durchflusszytometrie-Messwert der Zellpopulation und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der zweiten Kalibratoren ins Verhältnis gesetzt wird, oder b) der Quotient zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Mess wert eines Kalibrators für ein Signal mit vorbestimmter Signalstärke, insbesondere für ein 100%-Signal gebildet wird.

Dabei kann der Mittelwert mit an sich bekannten statistischen Verfahren bestimmt werden und insbesondere der arithmetische Mittelwert sein. Bei Bedarf kann der normalisierte erste Messwert zusätzlich skaliert werden, wobei der Skalierungsfak tor beispielsweise dem Quotient aus dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der ersten Kalibratoren und der Zahl 100 entsprechen kann.

Bei einer Weiterbildung der Erfindung wird für den mindestens einen ersten Kalib rator ein erster Kalibrierfaktor bereitgestellt, der bezüglich des Messignals für den ersten Parameter dem Verhältnis zwischen der Messsignalstärke des ersten Kalib rators und der Messsignalstärke eines die Zielstruktur aufweisenden ersten Refe renz-Kalibrators entspricht, wobei für den ersten physikalischen Parameter des ersten Kalibrators ein erstes Messsignal erfasst wird und der erste Durchflusszyto- metrie-Messwert des ersten Kalibrators aus dem ersten Messsignal und dem ers ten Kalibrierfaktor gebildet wird, wobei für den zweiten Kalibrator ein zweiter Kalib rierfaktor bereitgestellt wird, der bezüglich des Messignals für den ersten Parame ter dem Verhältnis zwischen der Messsignalstärke des zweiten Kalibrators und der Messsignalstärke eines die Zielstruktur nicht aufweisenden zweiten Referenz-Ka librators entspricht, und wobei für den ersten physikalischen Parameter des zwei ten Kalibrators ein zweites Messsignal erfasst wird und der erste Durchflusszyto- metrie-Messwert des zweiten Kalibrators aus dem zweiten Messsignal und dem zweiten Kalibrierfaktor gebildet wird.

Durch die Kalibrierfaktoren ist es möglich, Durchflusszytometrie-Messwerte, die mit unterschiedlichen, voneinander abweichenden Chargen des ersten Kalibrators und/oder des zweiten Kalibrators durchgeführt wurden, noch präziser miteinander zu vergleichen. Die Kalibrierfaktoren werden bevorzugt experimentell unter exakt definierten Bedingungen gemessen.

Hierbei wird zunächst für die ersten und zweiten Referenz-Kalibratoren, die in ei ner ersten Charge hergestellt werden, jeweils ein Erwartungswert für den ersten Durchflusszytometrie-Messwert bestimmt. Dabei wird anstelle des Analysemedi ums ein Puffer mit definierten, konstanten Eigenschaften verwendet, in dem die ersten bzw. zweiten Referenz-Kalibartoren angeordnet sind. Biologische Zellen sind in dem Puffer nicht enthalten. In diesem Puffer werden für eine Vielzahl von gleichen oder im Wesentlichen gleichen ersten bzw. zweiten Referenz-Kai ibrato- ren jeweils die entsprechenden ersten Durchflusszytometrie-Messwerte gemes sen. Aus den so erhaltenen Referenz-Durchflusszytometrie-Messwerten wird mit an sich bekannten Methoden der Statistik für die ersten und zweiten Referenz-Ka librator jeweils ein Erwartungswert bestimmt.

In einem weiteren Schritt werden für erste und zweite Kalibratoren einer zweiten Charge in entsprechender Weise Erwartungswerte bestimmt.

Danach wird der erste Kalibrierfaktor ermittelt, indem der Quotient aus dem Erwar tungswert der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalibratoren der zweiten Charge und dem Erwartungswert der ersten Durchflusszytometrie-Mess werte der ersten Referenz-Kalibratoren gebildet wird. In entsprechender Weise wird der zweite Kalibrierfaktor ermittelt, indem der Quotient aus dem Erwartungs wert der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der zweiten Kalibratoren der zweiten Charge und dem Erwartungswert der ersten Durchflusszytometrie-Mess werte der zweiten Referenz-Kalibratoren gebildet wird.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt, wobei sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbe sondere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ihrer mindestens einen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels derart voneinander unterscheiden, dass die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ei ner ersten Kalibratorart eine Signalstärke aufweisen, die größer ist als die Signal stärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der zweiten Kalibratoren und kleiner ist als die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte einer zweiten Kalibratorart. Flierdurch kann der Einfluss eines nichtlinearen Signalver laufs bei der Erfassung der Durchflusszytometrie-Messwerte kompensiert werden.

Vorteilhaft ist, wenn in dem Fluid mindestens zwei unterschiedliche Populationen von Zellen enthalten sind, die sich derart voneinander unterscheiden, dass die ers ten Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen einer ersten Population in einem ersten Signalstärkebereich und die die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen einer zweiten Population in einem außerhalb des ersten Signalstärkebe reichs befindlichen zweiten Signalstärkebereich liegen, und wenn die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalibratorart derart gewählt wird, dass sie zwischen dem ersten und zweiten Signalstärkebereich liegt. Der Ka librator der ersten Kalibratorart erzeugt dabei eine Signalstärke, die es erlaubt, die Referenzbereiche von zwei Subpopulationen voneinander abzugrenzen. D.h. Zel len mit einem ersten Durchflusszytometrie-Messwert, der kleiner ist als der erste Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators der ersten Kalibratorart, ge hören zu einer ersten Population und Zellen mit einem höheren Durchflusszyto metrie-Messwert zu einer zweiten Population.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die größte Abmessung der Festkörperpartikel kleiner als 20 miti, insbesondere kleiner als 15 pm und bevor zugt kleiner als 10 pm ist und/oder die kleinste Abmessung der Festkörperpartikel ist größer als 4 pm, insbesondere größer als 5 pm und bevorzugt größer als 6 pm. Geeignet Festkörperpartikel sind beispielsweise Mikrosphären mit einem Durch messer von 6-10 pm. Die Festkörperpartikel haben bevorzugt eine ähnliche Größe wie die in dem Analysemedium befindlichen Zellen.

Die Festkörperpartikel sind bevorzugt synthetische Mikropartikel. Die Festkörper partikel können ein Polystyren, Melamin, Latex und/oder Silikat aufweisen oder aus einem dieser Materialien bestehen.

Die Markierungsmoleküle können Moleküle sein, die an Zielantigene auf der Ober fläche von Zellen oder Kalibratoren binden und anschließend zum Nachweis die ser Zielantigene verwendet werden können. Solche Moleküle sind z.B. Antikörper und deren Fragmente, Lektine, andere bindende Proteine (z.B. Protein A).

Die Zielantigene auf den ersten Kalibratoren sind bevorzugt kovalent immobilisiert. Verfahren zum Herstellen einer solchen kovalenten Bindung sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. Bindung an Amine (über Crosslinker), Thi- ole, Epoxide, Aldehyde, Maleinimide und andere Gruppen. Geeignete Verfahren und deren chemische Umsetzung sind in der Fachliteratur beschrieben (Bioconju- gate Techniques, Third Edition 3rd edition by Hermanson, Greg T. (2013)). Es können aber auch nicht kovalente Verfahren angewandt werden, wie z.B. His-Tag, Biotin-Streptavidin, Protein G, Protein A, vorimmobilisierte Antikörper.

Zielantigene bzw. Zielstrukturen auf den ersten Kalibratoren können beispiels weise Proteine, Peptide, Rezeptoren, Allergene, glykosylierte Proteine, Liposac- charide, Oligo- und Polysacharide, Nukleinsäuren sowie die Fragmente und Deri vate der vorgenannten Substanzen sein.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der mindestens eine zweite Durchflusszytometrie-Messwert einen Vorwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Messbereich auftretende Vorwärtsstreuung des Energiestrahls und/oder einen Seitwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Messbereich auftre tende Seitwärtsstreuung des Energiestrahls. Diese Messwerte lassen sich auf ein fache Weise mittels geeigneter Sensoren erfassen. Der Vorwärtsstreuungs-Mess wert ist ein Maß für die Größe und der Seitwärtsstreuungs-Messwert ein Maß für die Granularität der Zellen bzw. der Kalibratoren. Anhand dieser Messgrößen las sen sich die Zellen von den Kalibratoren unterscheiden. Somit lassen sich die ge messenen Durchflusszytometrie-Messwerte anhand der Vorwärts- und Seitwärts- streuungs-Messwerte eindeutig den Zellen und den Kalibratoren zuordnen.

Es ist aber auch möglich, dass der mindestens eine zweite Durchflusszytometrie- Messwert ein Fluoreszenzmesswert für eine von den Markierungsmolekülen aus gesandte Fluoreszenzstrahlung ist, welche sich von der Fluoreszenzstrahlung des ersten Durchflusszytometrie-Messwerts unterscheidet. Dabei sind bevorzugt die Wellenlängen der Fluoreszenzstrahlung der ersten und zweiten Durchflusszyto metrie-Messwerte unterschiedlich. Vorteilhaft ist, wenn sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Ka libratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durchflusszyto- metrie-Messwerte erfasst wird, wenn wenigstens zwei und insbesondere zumin dest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedli chen Markierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, und wenn der mindestens eine erste Kalibrator zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von Zielstrukturen aufweist, die je weils spezifisch an eines der unterschiedlichen Markierungsmoleküle binden, wenn sie mit dem betreffenden Markierungsmolekül in Kontakt gelangen.

Es ist aber auch denkbar, dass sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Kalibratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durch- flusszytometrie-Messwerte erfasst wird, dass zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen Markierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass mindes tens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren bereitgestellt werden, dass min destens ein erster Kalibrator einer ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche min destens eine erste Zielstruktur aufweist, die mit mindestens einer ersten Zielstruk tur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel dieses Kalibrators im mobilisiert ist, dass mindestens ein erster Kalibrator einer zweiten Kalibratorart an seiner Oberfläche mindestens eine zweite Zielstruktur aufweist, die mit mindes tens einer zweiten Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörper partikel dieses Kalibrators immobilisiert ist, und dass der mindestens eine erste Kalibrator der ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche die zweite Zielstruktur und der mindestens eine erste Kalibrator der zweiten Kalibratorart an seiner Oberflä che die erste Zielstruktur nicht aufweist. Dabei kann sogar zumindest eine der An zahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen ersten Kalibra toren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt werden, und diese ers ten Kalibratoren können unterschiedliche Zielstrukturen aufweisen, die jeweils für eines der unterschiedlichen Markierungsmoleküle bindungsspezifisch sind. Die Verwendung mehrerer Messparameter und deren Kalibratoren ist dabei nur durch die Anzahl der Messkanäle des Messgerätes und die verfügbaren Fluoro phore beschränkt. Routinemäßig können sechs bis acht Parameter erfasst wer den. Für die Analyse von AML-Zellen werden heute schon 30 relevante Parameter erfasst, die aber in mehreren Messdurchgängen erfasst werden müssen. Mit mo dernen Geräten, die auch die Messung im nahen Infrarotbereich erlauben, lassen sich deutlich mehr als acht Parameter erfassen. Sollen in einem solchen Parame terraum Subklassen von Zellen erfasst werden, so ist die Auflösung der Messung wichtig. Die Anzahl der Messungen, die pro Messkanal erfasst werden kann, kann durch die Verwendung von Kalibratoren einer weiteren Partikelklasse, deren Fest körperpartikel sich hinsichtlich ihrer Größe von den Festkörperpartikeln von Kalib ratoren einer ersten Partikelklasse unterscheiden, erhöht werden.

Dadurch, dass die ersten Kalibratoren (relative Signalstärke 100%) es erlauben, das zu erwartende Maximalsignal gerätespezifisch zu erfassen, kann die Auflö sung erhöht werden (z.B. durch Anpassung der Laserleistung bzw. der Verstärker leistung des Detektors, so dass messtechnisch das Maximale an Auflösung aus der Messung geholt werden kann). Mit einem derart erfassten und aufgearbeiteten Signal lassen sich nun Zellpopulationen mit Hilfe mathematischer Verfahren erfas sen (z.B. Clusternalyse - ein Standardverfahren der Mathematik, das unter https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalyse beschrieben ist). Somit können sehr variable Erkrankungen wie z.B. Leukämien besser typisiert werden und damit auch besser therapiert werden, da entsprechende Marker für das Ansprechen von Therapien erfasst und bewertet werden können. Im besonderen Falle von Lym phomen und Leukämien sind eine Reihe von Markern bekannt, welche einen star ken Einfluss auf die Prognostik der Erkrankung haben. So belegen aktuelle Stu dien, dass neben bekannten Markern wie CD38, die Expression von CD49d eine sehr schwerwiegende Auswirkungen auf den Verlauf der chronisch lymphatischen Leukemie (CLL) hat (DOI: 10.1 1 1 1/j.1365-2141 .201 1 08725.x).

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist die Zielstruktur auf den ersten Kalibratoren mindestens ein Antigen auf, das vorzugsweise ein mindestens ein Protein und/oder mindestens ein Peptid und/oder mindestens einen Rezeptor und/oder mindestens ein Allergen und/oder mindestens ein glykosyliertes Protein und/oder mindestens ein Liposaccharid und/oder mindestens ein Oligosacharide und/oder mindestens ein Polysaccharid und/oder mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Fragment und/oder Derivat der vorgenannten Substan zen umfasst.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Zielstruktur des min destens einen ersten Kalibrators über mindestens eine aktivierte Carboxy-Grup- pen und/oder mindestens eine aktivierte NFte-Gruppe am Festköperpartikel des ersten Kalibrators immobilisiert. Dies ermöglicht eine stabile Kopplung und Immo bilisierung der Zielstruktur, wie z.B. eines Antigens, an den Festköperpartikel. Ent sprechende Mikropartikel sind kommerziell erhältlich.

Vorteilhaft ist, wenn mindestens eine auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalib rators immobilisierte Zielstruktur mit einer der Zielstruktur übereinstimmt, die für Zellen mindestens einer Blutkrebsart typisch ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dann zur Klassifizierung von Leukemie-Zellen verwendet werden. Insbeson dere können dabei die schnellwachsenden Typ M Zellen von den weniger aggres siven Typ D Zellen unterschieden werden.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stimmt die mindestens eine auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalibrators immobilisierte Zielstruktur mit ei ner der Zielstruktur übereinstimmt, die innerhalb des B Zell Rezeptors (BCR) auf der Oberfläche von chronisch lympatischen Leukemie-Zellen (CLL-Zellen) vor kommt. Diese Leukemie-Zellen sind besonders aggressiv. Durch ihre hohe Affini tät und Spezifität ist diese Zielstruktur gut für eine durchflusszytometrische Diag nostik (FACS) geeignet.

Die Kalibratoren werden bei der Messung dem Analysemedium, z.B. Blut, zugege ben. Geeignete Konzentrationen der Kalibratoren sind bevorzugt 1 x10 ⁵ pro 1 x10 ⁶ Zellen. Bei der Messung werden die Kalibratoren über die Parameter Forward- Scatter (Größe) und Sideward-Scatter (Granularität) identifiziert und somit von den Zielzellen getrennt.

Bezüglich des Kits wird die vorstehend genannte Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst. Erfindungsgemäß umfasst der Kit

mindestens einen ersten Kalibrator, der einen ersten Festkörperpartikel aus einem nicht wasserlöslichen, anorganischen und/oder polymeren Material aufweist, wobei der erste Kalibrator an seiner Oberfläche mindestens eine auf dem ersten Festkörperpartikel immobilisierte Zielstruktur hat, mindestens einen zweiten Kalibrator, der einen mit dem ersten Festkörper partikel bezüglich Form, Größe und Material übereinstimmenden zweiten Festkörperpartikel aufweist, wobei der zweite Kalibrator an seiner Oberflä che die Zielstruktur nicht aufweist, und

mindestens ein für die Zielstruktur bindungsspezifisches Markierungsmole kül.

Mit einem solchen Kit können bei Durchflusszytometrie-Messverfahren Zielstruktu ren, die an der Oberfläche von in einem Fluid enthalten, zu klassifizierenden biolo gischen Zellen angeordnet sind, mit großer Präzision quantitativ erfasst werden. Die entsprechenden Messwerte lassen sich - auch wenn sie mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessen wurden - präzise miteinander vergleichen. Die mindestens eine Zielstruktur ist vorzugsweise ein Antigen. Bei Bedarf kann der Kit zusätzlich einen Puffer enthalten.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Kits sind an der Oberfläche des min destens einen ersten Kalibrators mehrere unterschiedliche Zielstrukturen angeord net, die auf dem ersten Festkörperpartikel immobilisiert sind. Dabei hat der Kit für jede dieser Zielstrukturen jeweils mindestens ein für die betreffende Zielstruktur bindungsspezifisches Markierungsmolekül. Mit einem solchen Kit können Parallel messungen durchgeführt werden. Der parallelen Beladung der Kalibratoren mit Zielstrukturen sind nur durch die Belegungsdichte der Festkörperpartikel und da mit durch das erreichbare Maximalsignal Grenzen gesetzt. Es ist aber auch denkbar, dass der Kit zum Durchführen von Parallelmessungen mehrere unterschiedliche erste Kalibratoren aufweist, die an ihrer Oberfläche un terschiedliche Zielstrukturen haben. Dabei kann jeder erste Kalibrator jeweils nur eine einzige Zielstruktur haben. Es ist auch möglich, dass mindestens ein erster Kalibrator mehrere Bereiche mit Zielstrukturen aufweisen, die für dieselben Mar kierungsmoleküle bindungsspezifisch sind.

Die Markierungsmoleküle sind bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen. Solche Farbstoffe sind im Normalfall kovalent an die Markierungsmoleküle gebun den. Kommerziell sind eine Vielzahl von solchen Farbstoffen verfügbar wie z.B. Cy3, Cy5, Cy 7, FITC, Rhodamin, Phycoerythrin, Lyssamin; eine Auflistung ver schiedener Farbstoffe findet sich unter: https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Kit mindestens ei nen Datenträger, auf dem für den mindestens einen ersten Kalibrator ein erster Kalibrierfaktor und/oder für den mindestens einen zweiten Kalibrator ein zweiter Kalibrierfaktor gespeichert sind. Mit einem solchen Kit können Toleranzen von Ka libratoren kompensiert werden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Mess ergebnisse von Durchflusszytometrie-Messverfahren miteinander verglichen wer den sollen, die mit unterschiedlichen Chargen von ersten bzw. zweiten Kalibrato ren durchgeführt wurden. Der Datenträger kann ein maschinenlesbarer Datenträ ger sein, der zum Beispiel einen Träger aufweisen kann, der mit einem Barcode oder einem QR-Code versehen ist. Es ist aber auch möglich, dass die Kalibrierfak toren in Form von Zahlen auf ein zu dem Kit gehörendes Dokument, wie z.B. ein Beipackzettel oder einer zu dem Kit gehörenden Verpackung, aufgedruckt sind.

Vorteilhaft ist, wenn der Kit mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibrato ren aufweist, und wenn sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbesondere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ih rer mindestens einen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels der art voneinander unterscheiden, dass sie bei einer Durchflusszytometrie-Messung Messsignale mit unterschiedlicher Signalstärke erzeugen, wenn ihre Zielstrukturen mit dem Markierungsmolekül markiert sind. Mit einem solchen Kit kann bei Durch- flusszytometriemessungen, bei denen das Fluoreszenzsignal einen nichtlinearen Verlauf hat, eine Regression durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Be zugnahme auf die Zeichnung. Es zeigt:

Fig. 1 eine graphische Darstellung von mit Hilfe eines Durchflusszytometers für eine Population von zweiten Kalibratoren (Nullkalibrator) erfassten

Messwerten, wobei auf der Abszisse die gemessene Intensität PE und auf der Abszisse die Anzahl n der Bindungsereignisse aufgetragen ist,

Fig. 2 eine Darstellung ähnlich Fig. 1 wobei jedoch die Messwerte für eine Po pulation von ersten Kalibratoren einer ersten Kalibratorart dargestellt sind,

Fig. 3 eine Darstellung ähnlich Fig. 1 wobei jedoch die Messwerte für eine Po pulation von ersten Kalibratoren einer zweiten Kalibratorart dargestellt sind,

Fig. 4 eine Standardkurve, bei der auf der Abszisse die Menge Protein CD23 pro 2,1 -10 ⁶ Festkörperpartikel und auf der Ordinate der MFI-Wert (mitt lerer Fluoreszenz-Messwert) aufgetragen ist,

Fig. 5 eine graphische Darstellung der für die Parameter Größe und Granula- rität gemessenen Messignale, wobei auf der Abszisse die dem Parame ter Größe zugeordnete Vorwärtsstreuung (FSC) und auf der Ordinate die dem Parameter Granularität zugeordnete Seitwärtsstreuung (SSC) einer Fluoreszenzstrahlung an Zellen und Kalibratorpartikeln aufgetra gen sind, Fig. 6 eine graphische Darstellung der für Zellen und Kalibratorpartikel ge messenen Intensitätswerte für IgM und CD19, wobei auf der Abszisse die die Intensität für IgM und auf der Ordinate die Intensität für CD19 aufgetragen sind,

Fig. 7 eine graphische Darstellung der Zellen und Kalibratorpartikel gemesse nen Intensitätswerte für IgD und CD19, wobei auf der Abszisse die die Intensität für IgD und auf der Ordinate die Intensität für CD19 aufgetra gen sind,

Fig. 8 eine graphische Darstellung der Zellen und Kalibratorpartikel gemesse nen Intensitätswerte für IgD und IgM, wobei auf der Abszisse die die In tensität für IgD und auf der Ordinate die Intensität für IgM aufgetragen sind,

Fig. 9 eine dreidimensionale Darstellung des Messraums gemäß den Fig. 6 bis 8, und

Fig. 10 eine graphisch e Darstellung einer Clusteranalyse für den in Fig. 6 bis 9 abgebildeten Messraum.

Bei einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden als Zielstrukturen krankheitsassoziierte Antigene bereitgestellt. Als eine erste Zielstruktur wird IgM (Immunglobolin M) und als eine zweite Zielstruktur IgD (Immunglobolin D) bereit- gestellt.

Außerdem werden eine Vielzahl von Festkörperpartikeln bereitgestellt, nämlich Mikrosphären aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 6 pm. Die Festkörper partikel stimmen bezüglich ihrer Form, ihrer Größe und ihres Materials überein.

Die Festkörperpartikel sind an ihrer Oberfläche mit daran bindenden Car- boxylgruppen (-COOFI) beschichtet. Anstelle der Carboxylgruppen oder zusätzlich zu diesen können an der Oberfläche der Festkörperpartikel NFh-Gruppen vorgese hen sein. Über die Carboxylgruppen und/oder die NFh-Gruppen können die ersten und zweiten Zielstrukturen an die Oberfläche der Festkörperpartikel gebunden werden.

Ferner werden erste und zweite Markierungsmoleküle bereitgestellt. Bei den ers ten Markierungsmolekülen handelt es sich um Antigene, die für die erste Zielstruk tur IgM bindungsspezifisch sind. Die zweiten Markierungsmoleküle sind Antigene, die für die zweite Zielstruktur IgD bindungsspezifisch sind. Die Markierungsmole küle haben jeweils mindestens einen optischen Marker, der bei Anregung mit einer geeigneten Anregungsstrahlung eine Fluoreszenzstrahlung aussendet.

1.1 Kopplung von krankheitsassoziierten Antigenen an die Oberfläche der Festkörperpartikel

Es werden dreizehn Festkörperpartikel-Populationen bereitgestellt, die jeweils die gleiche Anzahl von Festkörperpartikeln umfassen, die an ihren Oberflächen Kar- boxylgruppen tragen.

An die Oberfläche der Festkörper-Partikel von sechs Festkörperpartikel-Populatio nen werden die ersten Zielstrukturen und an die Oberfläche der Festkörper-Parti kel von sechs weiteren Festkörperpartikel-Populationen die zweiten Zielstrukturen gekoppelt. Flierzu werden zu den Festkörperpartikeln

- einer ersten Festkörperpartikel-Population 2,00 pg IgM,

- einer zweiten Festkörperpartikel-Population 1 ,00 pg IgM,

- einer dritten Festkörperpartikel-Population 0,40 pg IgM,

- einer vierten Festkörperpartikel-Population 0,20 pg IgM,

- einer fünften Festkörperpartikel-Population 0,08 pg IgM,

- einer sechsten Festkörperpartikel-Population 0,04 pg IgM,

- einer siebten Festkörperpartikel-Population 2,00 pg IgD,

- einer achten Festkörperpartikel-Population 1 ,00 pg IgD, - einer neunten Festkörperpartikel-Population 0,40 pg IgD,

- einer zehnten Festkörperpartikel-Population 0,20 pg IgD,

- einer elften Festkörperpartikel-Population 0,08 pg IgD und

- einer zwölften Festkörperpartikel-Population 0,04 pg IgD,

jeweils je pro 1 ,2-10 ⁶ Festkörperpartikel zu den Festkörperpartikeln der betreffen den Festkörperpartikel-Population dazugegeben und in einem Bindungspuffer (50mM MES, pH 5,2; 0,05% Proclin) für 60 Minuten unter ständiger Bewegung in kubiert. Die Kopplung erfolgt jeweils nach einem Standardprotokoll mittels Aktivie rung durch EDAC (Carbodiimid). Die Festkörperpartikel werden gewaschen und in EDAC-Lösung (20 mg/ml) aktiviert.

Nach Zentrifugation der einzelnen Festkörperpartikel-Populationen bei 800 g wird jeweils der Überstand abgenommen und für eine Kontrollmessung der verbliebe nen Antigenkonzentration zurückgestellt. Die Festkörperpartikel werden in einen Waschpuffer aufgenommen und resuspendiert. Nach nochmaliger Zentrifugation wird der Überstand verworfen und die Partikel zur Sättigung nicht besetzter reakti ver Gruppen in einen Wasch- und Storagepuffer (10mM Tris, pH 8.0; 0,05% BSA; 0,05% Proclin) aufgenommen.

An die Oberfläche der Festkörperpartikel einer dreizehnten Festkörperpartikel-Po pulation werden weder erste noch zweite Zielstrukturen gekoppelt. Stattdessen werden die reaktiven COOH-Gruppen derart mit einem Blockierungsprotein in Kontakt gebracht, dass das Blockierungsprotein unspezifisch an die COOH-Grup pen binden kann. Als Blockierungsprotein kann beispielsweise bovines Serumal bumin oder hydrolisiertes Casein verwendet werden.

1.2 Bestimmung der für die Kopplung einzusetzenden Konzentrationen von IgM und IgD.

Jede der dreizehn Festkörperpartikel-Populationen wird jeweils mit Hilfe eines Durchflusszytometers (FACS) vermessen. Hierzu werden die Festkörperpartikel der ersten bis sechsten Festkörperpartikel-Population und die ersten Markierungs- moleküle (ca. 0,5 pg pro Messung) in einem Fluid suspendiert und für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Proben werden zentrifugiert und der Überstand verwor fen. Es wird einmal mit 2 ml PBS-Puffer (Phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend noch einmal zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen wurde, werden die Festkörperpartikel in 100-200 pl PBS aufgenommen. Die so er haltene Suspension wird derart durch eine einen Messbereich begrenzende Dü senöffnung eines Durchflusszytometers hindurch geleitet, dass die in dem PBS enthaltenen Festkörperpartikel einzeln in einen Messbereich eines Laserstrahls gelangen. Durch den Laserstrahl werden die spezifisch an die erste Zielstruktur gebundenen ersten Markierungsmoleküle zur Aussendung einer Fluoreszenz strahlung angeregt. Von dieser werden mit Hilfe eines optischen Detektors Fluo reszenzmesswerte erfasst. Dabei werden für jede Festkörperpartikel-Population jeweils eine Vielzahl von Fluoreszenzmesswerten (Intensitätsmesswerten) gemes sen. Aus den für die einzelnen Festkörperpartikel erfassten Fluoreszenzmesswer ten jede Festkörperpartikel-Population wird jeweils ein Mittelwert gebildet (MFI- Wert bzw. Median-Fluoreszenz-Intensity).

In entsprechender Weise werden die Festkörperpartikel der siebten bis zwölften Festkörperpartikel-Population mit Hilfe des Durchflusszytometers vermessen. Da bei werden durch den Laserstrahl die spezifisch an die zweite Zielstruktur gebun denen zweiten Markierungsmoleküle zur Aussendung einer Fluoreszenzstrahlung angeregt.

Obwohl humanes IgM (Immunglobolin M) aus dem Serum leicht zugänglich ist, stellte sich heraus, dass für die Kopplung an die Festkörperpartikel und insbeson dere für die Stabilität nach der Kopplung, humanes rekombinant erstelltes mono meres IgM besser geeignet ist. Im Serum liegt IgM meist in einem Pentamer vor. Es zeigte sich, dass es bei der Bindung von IgM-Pentameren meist nicht zu einer vollständigen Bindung kommt. Ein Teil der IgM-Moleküle der Pentamere werden nicht kovalent an die Partikel gebunden. Die unkontrollierte Degradierung führt dann bei der späteren Verwendung zu einem Verlust der Auflösung im Durch- flusszytometer. Daher werden sowohl für IgM als auch IgD (IgD (Immunglobolin D) rekombinant hergestelltes monomeres IgM und IgD verwendet. In Fig. 1 bis 3 sind die Fluoreszenzmesswerte und der Mittelwert für die erste, zweite und siebte Festkörperpartikel-Population graphisch dargestellt. Auf der Abszisse ist jeweils die mit Hilfe des Durchflusszytometers für die Festkörperparti kel der betreffende Festkörperpartikel-Population gemessene Intensität PE der Fluoreszenzstrahlung und auf der Abszisse die Anzahl n der Bindungsereignisse aufgetragen.

Wie in Fig. 4 zu sehen ist, werden die Mittelwerte für die einzelnen Fluoreszenzen zu einer Kopplungskurve gegen die CD23-Proteinmenge PM pro 2,1 -10 ⁶ Festkör perpartikel jeweils für die erste aufgetragen. Eine entsprechende Kopplungskurve wird für die zweite Zielstruktur erstellt.

Anhand der betreffenden Kopplungskurve kann die für eine gewünschte Intensität bzw. Signalstärke der Fluoreszenz benötigte Menge der ersten bzw. zweiten Ziel struktur abgelesen werden. Anhand der Kopplungskurve wird maximale Mittelwert der Intensität Lax für die jeweilige Zielstruktur bestimmt und definiert. Anschlie ßend werden ein 75%-Wert (P75) und ein 25%-Wert (P25) wie folgt definiert:

P75 ⁼ Imax ' 0,75

P25 = p ₇₅ / 10 Für die Kopplung ergeben sich bei dem ersten Ausführungsbeispiel folgende Werte:

Imax ⁼ 21700

P75 = 21700 0,75 = 16275

P25 = 16275 / 10 = 1627

Diese Werte werden als Referenz festgelegt. Aus der Kopplungskurve kann nun die passende Proteinmenge ausgelesen werden. Für P75 beträgt diese 1 ,3 pg pro 2,1 -10 ⁶ Festkörperpartikel. 1.3 Zubereitung von Kalibratoren für zwei CLL-charakteristische Parameter: IgM und IgD

Ziel ist es für die ersten und zweiten Zielstrukturen (IgM und IgD) jeweils mehrere Kalibratorpopulationen zu erstellen.

Eine erste Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer ersten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils einen Festkörperpartikel, auf dessen Oberfläche als erste Zielstruktur IgM derart immobi lisiert ist, dass das Fluoreszenzsignal der einzelnen ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart in einer durchflusszytometrischen Analyse jeweils eine relative Inten sität von 25% erreicht.

Eine zweite Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer zweiten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wir die ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkörperpartikel der ersten Kalibratoren der zweiten Kalibra torart ist die gleiche Zielstruktur immobilisiert wie an der Oberfläche der ersten Ka libratoren der ersten Kalibratorart. Die Flächenbelegungsdichte und die Anordnung der Zielstruktur der ersten Kalibratoren der zweiten Kalibratorart ist jedoch derart gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Kalibratoren der zweiten Kalibra torart in der durchflusszytometrischen Analyse eine relative Intensität von 75% er reicht.

Eine dritte Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer dritten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie die ersten Kalibratoren der ersten und zweiten Ka libratorart. Auf der ersten Kalibratoren der dritten Kalibratorart ist eine für IgD bin dungsspezifische zweite Zielstruktur derart immobilisiert, dass das Fluoreszenz- Signal die ersten Kalibratoren der vierten Kalibratorart in der durchflusszytometri- schen Analyse eine relative Intensität von 25% erreicht.

Eine vierte Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer vierten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie die ersten Kalibratoren der ersten, zweiten und dritten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkörperpartikel der ersten Kalibra toren der vierten Kalibratorart ist die gleiche Zielstruktur immobilisiert wie an der Oberfläche der ersten Kalibratoren der dritten Kalibratorart. Die Flächenbele gungsdichte und die Anordnung der Zielstruktur der ersten Kalibratoren der vierten Kalibratorart ist jedoch derart gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Ka libratoren der vierten Kalibratorart in der durchflusszytometrischen Analyse eine relative Intensität von 75% erreicht.

Außerdem wird eine fünfte Kalibratorpopulation erstellt, eine Vielzahl von überein stimmenden ersten Kalibratoren einer fünften Kalibratorart enthält. Diese Kalibra toren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie ersten Kalibratoren der ersten, zweiten, dritten und vierten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkör perpartikel der ersten Kalibratoren der fünften Kalibratorart sind zwei unterschiedli che Zielstrukturen immobilisiert. Eine dieser Zielstrukturen ist mit der ersten Ziel struktur (bindungsspezifisch für IgM) und die andere Zielstruktur ist mit der zweiten Zielstruktur (für IgD bindungsspezifisches Antigen) identisch. Die Flächenbele gungsdichte und die Anordnung der Antigene IgM und IgD der ersten Kalibratoren der fünften Kalibratorart ist so gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Ka libratoren der fünften Kalibratorart in der durchflusszytometrischen Analyse sowohl für IgM als auch für IgD jeweils eine relative Intensität von 75% erreicht.

Zusätzlich wird eine Negativpopulation erstellt, die eine Vielzahl von übereinstim menden zweiten Kalibratoren aufweist. Diese bestehen jeweils aus einem Festkör perpartikel, auf dem weder die erste (IgM) noch die zweite Zielstruktur (IgD) immo bilisiert ist. Bei der Negativpopulation sind die an der Oberfläche der Festkörper partikel befindlichen Carboxylgruppen (-COOFI) bzw. NFh-Gruppen unspezifisch an ein Blockierungsprotein gebunden. Die Festkörperpartikel der zweiten Kalibra toren sind mit den Festkörperpartikel der ersten Kalibratoren identisch.

Für die Kopplung der Antigene an den Festkörperpartikeln wird die für jede zu er stellende Population benötigte Menge Festkörperpartikel in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Festkörperpartikel werden bei 800 g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Anschließend werden die Festkörperpartikel in ei nen Kopplungspuffer aufgenommen. Die Kopplung erfolgt nach dem zuvor be schriebenen Protokoll, wobei für die erste, zweite und fünfte Kalibratorpopulation eine adäquate Menge IgM und für die dritte, vierte und fünfte Kalibratorpopulation eine adäquate Menge IgD eingesetzt wird.

Die auf diese Weise bereitgestellten Kalibratorpopulationen sind nachstehend auf gelistet:

Erste Kalibratoren:

a) IgM-Kalibratoren: PD25 - IgM Konzentration Int25

PD75 - IgM Konzentration Int s b) IgD-Kalibratoren: PD25 - IgD Konzentration Int25

PD75 - IgD Konzentration Int75 c) IgM- und IgD- Kalibratoren: Pmd - IgM und IgD Konzentration Int s

Zweite Kalibratoren: Po - weder IgM noch IgD

Die einzelnen Kalibratoren werden nach ihrer Fierstellung mittels FACS (flu- orescence-activated cell sorting) unter Verwendung kommerziell erhältlicher, mit einem Marker markierter Antikörper vermessen. Für eine Anwendung zum Zwecke der späteren Diagnostik werden die Kalibratoren zu einem Kit zusammengefasst. So wird bei der späteren FACS-Messung, zu diagnostischen Zwecken, der Mess raum durch die einzelnen Populationen definiert, standardisiert und normiert. 1.4 Verwendung der Kalibratoren zur Analyse von Blutproben mittels FACS

Es wird ein Kit bereitgestellt, der folgendes aufweist:

a) Eine erste Population von ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD25 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgM immobilisiert ist. b) Eine zweite Population von ersten Kalibratoren ersten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD75 um fasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgM immobilisiert ist.

c) Eine erste Population von ersten Kalibratoren der zweiten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD25 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgD immobilisiert ist. d) Eine zweite Population von ersten Kalibratoren zweiten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD75 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgD immobilisiert ist. e) Eine Population von zweiten Kalibratoren, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen zweiten Kalibratoren Po umfasst.

f) Eine Population von ersten Markierungsmolekülen, die jeweils ein erstes Antigen aufweisen, welches für die erste Zielstruktur IgM bindungsspezi fisch ist. Die ersten Markierungsmoleküle weisen jeweils einen ersten opti schen Marker auf, der an das erste Antigen gekoppelt ist und bei Anregung mit einer geeigneten ersten Anregungsstrahlung eine erste Fluoreszenz strahlung aussendet.

g) Eine Population von zweiten Markierungsmolekülen, die jeweils ein zweites Antigen aufweisen, welches für die zweite Zielstruktur IgD bindungsspezi fisch ist. Die zweiten Markierungsmoleküle weisen jeweils einen zweiten op- tischen Marker auf, der an das zweite Antigen gekoppelt ist und bei Anre gung mit einer geeigneten zweiten Anregungsstrahlung eine zweite Fluo reszenzstrahlung aussendet. h) eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS-Puffer).

Bei einer FACS-basierten Analyse von Blutzellen wird nach der Blutentnahme die Zellzahl der zu klassifizierenden Zellen (Lymphomzellen) im Analysemedium Blut bestimmt und die benötigte Zellzahl für jede FACS-Analyse in ein Reaktionsgefäß gegeben (z.B. 1x10 ⁶ Zellen pro Messung). Anschließend werden die Markierungs moleküle (ca. 0,5 pg pro Messung) und die Kalibratoren Po, PD25, PD75 hinzuge fügt und für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird das Volumen mit 2 ml Lyse-Fixierungspuffer aufgefüllt und noch einmal für 10 Minuten inkubiert. In diesem Schritt werden die Zellen nicht nur fixiert, sondern die Mehr heit der roten Blutkörperchen zum Platzen gebracht. Diese sind für die Messung nicht von Bedeutung und würden diese unter Umständen stören.

Die Proben werden zentrifugiert und der Überstand verworfen. Es wird einmal mit 2 ml PBS-Puffer (Phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend noch einmal zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen wurde, werden die Zellen in 100-200 pl PBS aufgenommen.

Das so erhaltene Analysemedium wird anschließend in einem FACS-Durch- flusszytometer analysiert. Im FACS-Durchflusszytometer wird das Analysemedium derart durch eine einen Messbereich begrenzende Düsenöffnung hindurch gelei tet, dass sowohl die mit dem Markierungsmolekül markierten Zellen als auch die unterschiedlichen Kalibratoren jeweils einzeln in den Messbereich von Laserstrah len gelangen.

Mit Hilfe des FACS-Durchflusszytometers werden für jeden in den Messbereich gelangenden Kalibrator und für jede in den Messbereich gelangende Zelle jeweils ein erster und zwei zweite Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst. Der erste Durchflusszytometrie-Messwert ist von der Fluoreszenzstrahlung abhängig, wel che mindestens ein an den betreffenden, im Messbereich befindlichen Kalibrator bzw. die betreffende, im Messbereich befindliche Zelle gebundenes Markierungs molekül aufgrund der Anregung durch den Laserstrahl abgibt. Die beiden zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte umfassen einen Vorwärtsstreuungsmesswert und einen Seitwärtsstreuungsmesswert für die beim Auftreffen des Laserstrahls auf den betreffenden, im Messbereich befindlichen Kalibrator bzw. die betreffende, im Messbereich befindliche Zelle erzeugte Streustrahlung.

Die zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte werden mit Referenzwerten vergli chen. In Abhängigkeit vom Ergebnis des Vergleichs lässt sich aufgrund der unter schiedlichen Streuungseigenschaften von Zellen und Kalibratoren feststellen, ob die zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte durch Streuung des Laserstrahls an einer Zelle oder an einem Kalibrator verursacht wurden. Die unterschiedlichen Ka libratoren lassen sich anhand der Signalpegel ihrer ersten Durchflusszytometrie- Messwerte unterscheiden. Demgemäß wird in Abhängigkeit vom Ergebnis des Vergleichs der erste Durchflusszytometrie-Messwerte entweder den Zellen oder einem Kalibrator zugeordnet.

Falls es sich um einen Kalibrator handelt wird der erste Durchflusszytometrie- Messwert mit Vergleichsintervallen verglichen, welche des unterschiedlichen Ka libratorpartikel-Populationen zugeordnet sind. Somit lässt sich erste Durchflusszy- tometrie-Messwert einem Kalibrator einer bestimmten Kalibratorpartikel-Population zuordnen. Die Zuordnung kann automatisiert erfolgen, beispielsweise mittels einer geeigneten Software.

Für jede einzelne Zielstruktur (IgM bzw. IgD) werden für die einzelnen Kalibratoren Po, PD25 und PD75 die jeweiligen Mittelwerte der ersten Durchflusszytometrie- Messwerte (Fluoreszenz-Intensitäten) bestimmt. Diese bilden die Grundlage für den zur Messung genutzten Referenz-Messraum. Der erste Durchflusszytometrie- Messwert für die Kalibratoren Po dient dazu, den Hintergrund in dem Kanal zu be stimmen. Außerdem ermöglicht das erste Durchflusszytometrie-Messwert für die Kalibratoren Po eine Aussage über die Qualität der Kopplung der Antigene der Markierungsmoleküle an die ihnen jeweils zugeordnete Zielstruktur (Negativ-Kon trolle). Außerdem werden für die Zellen für jede einzelne Zielstruktur Mittelwerte der ers ten Durchflusszytometrie-Messwerte bestimmt.

Bei dem Ausführungsbeispiel werden für IgM folgende Mittelwerte für die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ermittelt:

Erste Kalibratoren PD25 der ersten Kalibratorart: 1600

Erste Kalibratoren PD75 der ersten Kalibratorart:: 16000

Zweite Kalibratoren Po: 25

Zellen für die erste Zielstruktur: 5600

Zunächst wird das Hintergrundrauschen aus den Messwerten bereinigt. Das Hin tergrundrauschen entsteht durch unspezifische Bindungen der Antikörper der ver wendeten Markierungsmoleküle an die Festkörperpartikel der Kalibratoren bzw. an die Zellen. Dazu wird der erste Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalib ratoren Po der ersten Kalibratorart jeweils von den ersten Durchflusszytometrie- Messwerten der ersten Kalibratoren PD25 und PD75 der ersten Kalibratorart, der zweiten Kalibratoren Po und der Zellen subtrahiert. Es ergeben sich somit für IgM folgende bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwerte:

Erste Kalibratoren PD25 der ersten Kalibratorart: 1600 - 25 = 1575

Erste Kalibratoren PD75 der ersten Kalibratorart: 16000 - 25 = 15975

Zweite Kalibratoren Po: 25 - 25 = 0

Zellen für die erste Zielstruktur: 5600 - 25 = 5575.

Für die Kalibratoren PD25 und PD75 werden Referenzeinheiten definiert. Dem be reinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des Kalibrators PÜ75 der ersten Kalibratorart werden 100 Referenzeinheiten zugewiesen. Somit entspricht eine Referenzeinheit einem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert von 15975 / 100 = 159,75. Diese Zahl wird nachstehend auch als erster Skalierungs faktor bezeichnet. Der bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwert des Kalib- rators PD25 der ersten Kalibratorart entspricht 1575 / 159,75 = 9,86 Referenzein heiten. Aus dem bereinigte ersten Durchflusszytometrie-Messwert für die erste Zielstruktur der Zellen und dem ersten Skalierungsfaktor wird ein erster normierter Messwert gebildet: 5575 / 159,75 = 34,90 Referenzeinheiten.

Bei dem Ausführungsbeispiel werden für IgD folgende Mittelwerte für die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ermittelt:

Erste Kalibratoren PD25 der zweiten Kalibratorart: 3103

Erste Kalibratoren PD75 der zweiten Kalibratorart:: 31030

Zweite Kalibratoren Po: 144

Zellen für die zweite Zielstruktur: 4450

Es ergeben sich somit für IgD folgende bereinigte erste Durchflusszytometrie- Messwerte:

Erste Kalibratoren PD25 der zweiten Kalibratorart: 3103 - 144 = 2959 Erste Kalibratoren PD75 der zweiten Kalibratorart: 31030 - 144 = 30886 Zweite Kalibratoren Po: 144 - 144 = 0

Zellen für die zweite Zielstruktur: 4450 - 144 = 4306.

Für die Kalibratoren PD25 und PD75 werden wiederum Referenzeinheiten definiert. Dem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des Kalibrators PD75 der zweiten Kalibratorart werden 100 Referenzeinheiten zugewiesen. Somit entspricht eine Referenzeinheit einem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert von 30886 / 100 = 308,86. Diese Zahl wird nachstehend auch als zweiter Skalierungs faktor bezeichnet. Der bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwert des Kalib rators PD25 der zweiten Kalibratorart entspricht 2959 / 308,86 = 9,58 Referenzein heiten. Aus dem bereinigte ersten Durchflusszytometrie-Messwert für die zweite Zielstruktur der Zellen und dem zweiten Skalierungsfaktor wird ein zweiter nor mierter Messwert gebildet: 4306 / 308,86 = 13,94 Referenzeinheiten. Durch die Zuweisung der Referenzeinheiten werden die bereinigten ersten Durch- flusszytometrie-Messwerte der Zellen von den Eigenschaften und Einstellungen des verwendeten Durchflusszytometers unabhängig und können mit entsprechen den bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwerte, die mit einem Durch- flusszytometer, das anders eingestellt ist als das zuerst genannte Durchflusszyto- meter oder das andere Eigenschaften aufweist als dieses verglichen werden.

In einem späteren Schritt können bei Bedarf die auf die Referenzeinheiten bezo genen normierten Messwerte der Zellen, mit denen der Kopplungskurve (Fig. 4) in Bezug gesetzt werden. Die Kopplungskurve entspricht einer logistischen Funktion (Gauß-Lorentz Verteilung). Mit Hilfe einer„Best-Fitting“-Kurve können so aus den in Referenzeinheiten angegebenen Werten Absolutwerte bestimmt werden, die der Menge der betreffenden, auf den Zellen befindlichen Zielstruktur entsprechen.

2.1 Zubereitung von Kalibratoren mit drei CLL-charakteristischen Parametern IgM, IgD und CD19

Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel werden für die Verwendung weiterer Para meter die Anzahl und die Kombination der einzelnen Populationen gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel erweitert. Wie für IgM und IgD beschrieben, wurde auch für das humane und rekombinant erstellte B-Lymphocyt Antigen CD19 zunächst eine Standardkurve für die effektive Intensität erstellt. Im Bezug darauf wurden die entsprechenden Mengen für die Kopplung verwendet.

Erste Kalibratoren:

a) IgM-Kalibratoren : PD25 - IgM Konzentration Int25

PD75 - IgM Konzentration Int s

b) IgD-Kalibratoren: PD25 - IgD Konzentration Int25

PD75 - IgD Konzentration Int75

c) CD19-Kalibratoren: PD25 - CD19 Konzentration Int25

PD75 - CD19 Konzentration Int75 d) IgM- und IgD- Kalibratoren: Pmd - IgM und IgD Konzentration Int s e) CD19- und IgM-Kalibratoren: PcDi 9/m - CD19 und IgM Konzentration

I nt75

f) CD19- und IgD-Kalibratoren: PcDi9/d - CD19 und IgD Konzentration

I nt75

Zweite Kalibratoren: Po - weder IgM noch IgD noch CD19

Dieses Verfahren lässt sich auf eine beliebige Anzahl von Parametern erweitern und variieren.

2.2 Schematische Darstellung des Immunoprofilings mittels Kalibratorpar- tikeln

Die zu klassifizierenden Zellen und die Kalibratorpartikel werden simultan im Durchflusszytometer vermessen und analysiert. Wie in Fig. 5 zu sehen ist, erfolgt in einem ersten Schritt die Auftrennung der Messsignale der Zellen und der Mess signale der Kalibratorpartikel nach den Parametern Größe und Granularität. Dabei wird die Größe durch Vorwärtsstreuungs-Messwerte (FSC) des des Energiestrahls und die Granularität durch Seitwärtsstreuungs-Messwerte (SSC) des Energie strahls repräsentiert. In dieser Phase erfolgt die Auswahl (gating) der zu analysie renden Zellen und der Kalibratorpartikel. Die Messwerte der ausgewählten Zellen (Zell-Populationen) sind in Fig. 5 durch ein erstes Oval 1 und die Messwerte der ausgewählten Kalibratoren (Kalibrator-Populationen) durch ein zweites Oval 2 um grenzt.

Diese Populationen können jetzt zusammen für die verschiedenen Parameter (Farbkanäle) analysiert werden. Dabei bilden die Kalibratorpartikel für jeden Kanal ein Referenz Raster. In den Fig. 6 bis 9 ist die exemplarische Analyse von drei Pa rametern (IgM, IgD und CD19) graphisch dargestellt, wobei

- l(lgM) die für IgM gemessene mittlere Intensität, - l(lgD) die für IgD gemessene mittlere Intensität und

- I(CD19) die für das Antigen CD19 gemessene mittlere Intensität der Fluoreszenzstrahlung bedeuten. Die Messwerte der ersten Population von ers ten Kalibratoren PD25 - IgM der ersten Kalibratorart sind mit der Bezugsziffer 3, die Messwerte der zweiten Population von ersten Kalibratoren PD75 - IgM der ers ten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 4, die Messwerte der ersten Population von ersten Kalibratoren PD25 - IgD der zweiten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 5, die Messwerte der zweiten Population von ersten Kalibratoren PD75 - IgD der zweiten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 6 und die Messwerte der Population von zweiten Kalibratoren Po sind mit der Bezugsziffer 7 bezeichnet. Die Messwerte der Kalibra toren PD25 - CD19 sind mit der Bezugsziffer 8, die Messwerte der Kalibratoren PD75 - CD19 mit der Bezugsziffer 9, die Messwerte der Kalibratoren Pmd - IgM und IgD mit der Bezugsziffer 10, die Messwerte der Kalibratoren PcDi9/m - CD19 und IgM mit der Bezugsziffer 1 1 und die Messwerte der Kalibratoren PcDi9/d - CD19 und IgD mit der Bezugsziffer 12 bezeichnet.

Die Kalibratorpartikel erfüllen mehrere Zwecke:

1 . Positiv- und Negativkontrollen für die Färbeeigenschaften der einge setzten Detektionsantikörper unter identischen Bedingungen im Ver gleich zu den Zellen.

2. Definition und Standardisierung des Messraumes, womit

i) eine Unabhängigkeit von bestimmten Geräten und oder Fier stellern erreicht wird,

ii) ein Profil der zu analysierenden Zellen bezüglich der zu Ana lysierenden Parameter (im Beispiel, IgM, IgD, CD19) erstellt werden kann, und

iii) die Grundlage für eine automatisierte Analyse gelegt wird. In Bezug auf den so definierten und standardisierten multiparametrischen Mess- raum (Fig. 9) werden die Werte der Zellen normiert und können an Hand ihrer ent stehenden Profile zu Gruppen oder Clustern zusammengefasst werden. Dieses Clustering ist die Basis die Erstellung eines Antigenprofils der zu analysierenden Zellen.

In Fig. 10 ist das Ergebnis der Clusteranalyse graphisch dargestellt. Jeder Kreis repräsentiert eine geclusterte Subpopulation, wobei der Durchmesser des Kreises ein Maß für die Anzahl der zu der betreffenden Subpopulation gehörenden Mess- werte ist im Verhältnis zur Gesamtzahl der Messwerte ist. Die Angaben beziehen sich auf die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) einer Ausgangspopulation, die durch den Kreis mit dem größten Durchmesser markiert ist. Diese Ausgangspopu lation hat für CD19, IgM und IgD MFI-Werte X, Y und Z. Die anderen Subpopulati onen haben einen entsprechenden veränderten MFI-Wert. Wenn also der Wert der Ausgangspopulation X= 1000 wäre, dann hätte ein Cluster mit X+200 einen MFI von 1200 für den betreffenden Parameter.