DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un método para la determinación por fluorescencia de aminas terciarias a través de reactivos que utilizan pigmentos basados en xantenos halogenados. Además, la invención comprende un kit que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención. ESTADO DE LA TÉCNICA

El consumo abusivo de drogas es un serio problema de salud siendo la causa de millones de enfermedades graves o lesiones, y muchos de los principales problemas sociales, tales como la conducción bajo sus efectos, violencia, estrés y abuso infantil. Además, la adicción derivada de este consumo es una enfermedad crónica, caracterizada por la búsqueda compulsiva de drogas y su uso a pesar de las consecuencias negativas asociadas al mismo.

Entre las drogas más adictivas se encuentra la heroína, un opioide derivado de la morfina, y que administrada vía intravenosa es entre dos y cuatro veces más potente que la ésta. Tanto esta droga, como el resto de compuestos pertenecientes a la familia de los opiáceos, como de forma más general, las aminas terciarias, tienen muy variadas aplicaciones tales como fármacos, pesticidas y surfactantes, y por lo tanto el desarrollo de métodos analíticos sensibles para su determinación, especialmente en disolución acuosa, es un aspecto deseable.

Las trialquilaminas, y los compuestos relacionados, son problemáticos para su detección ya que no presentan buena absorción en la región UV/VIS del espectro, mostrando bajas absortividades molares, y son muy difíciles de derivatizar. Desde los primeros trabajos de Noffsinger y Danileson (Noffsinger, J. B.; Danielson, N. D. Journal oí Chromatography 1987, 387, 520), la detección y determinación analítica de aminas terciarias depende de la electroluminiscencia de [Ru(bipy) ₃ ] ³⁺ , como se ha revisado y tratado en detalle (Yuan, Y.; Han, S.; Hu, L.; Parveen, S.; Xu, G. Electrochimica Acta 2012, 82, 484). La reacción de detección se basa en la oxidación de [Ru(bipy) ₃ ] ²⁺ a [Ru(bipy) ₃ ] ³⁺ en el electrodo, y la posterior transferencia electrónica entre [Ru(bipy) ₃ ] ³⁺ y el dador de electrones (amina terciaria). Tal transferencia electrónica abitualmente ocurre con emisión de luz (electroquimioluminiscencia, ECL). Sin embargo, uno de los inconvenientes del método es la baja selectividad debido al alto número de especies que pueden actuar como dadores de electrones hacia [Ru(bipy) ₃ ] ³⁺ . Así, las aminas primarias, secundarias y terciarias dan ECL aunque su intensidad de luminiscencia decrece en el orden terciaria>secundaria>primaria.

En particular, hay muchos métodos de determinación descritos para la cuantificación de heroína. Entre todos, la cromatografía de gases acoplada con detección de ionización de llama (GC-FID) continúa siendo la elección ideal dado que es rápida y versátil. Alternativamente, la cuantificación de la heroína también es posible con cromatografía de gases con detección de masas (GC-MS) y en menor medida, a través de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), reflectancia difusa por espectroscopia de infrarrojo cercano (DR-NIR) y cromatografía capilar micelar electrocinética (MECC). Asimismo, el inmunoensayo enzimático para opiáceos en orina se ha descrito para la determinación cuantitativa de derivados de morfina en fluidos biológicos (Schneide.Rs; Lindquis.P; Tonginwo.E; Rubenste.Ke; Ullman, E. F. Clinical Chemistry 1973, 19, 821 ). Sin embargo, la mayor parte de las pruebas comerciales para la detección de opiáceos dan apreciable reacción cruzada con los metabolitos principales de la heroína (6-monoacetilmofina, morfina, morfina-3-glucurónido y morfina-6-glucurónido), así como con otros productos de su biotransformación. Es por eso, que se requieren nuevos métodos para la determinación rápida y precisa de aminas terciarias, incluyendo opiáceos y heroína, que permita la discriminación de tales drogas y opere en un amplio rango de concentraciones, no sea susceptible de interferir con otras drogas de aminas no terciarias y evite técnicas de extracción incómodas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describe un método y reactivos para la determinación de aminas terciarias basado en la fluorescencia emitida por una muestra desaireada que contiene el analito y los reactivos basados en pigmentos tipo-xanteno halogenados, al ser iluminada con una lámpara halógena. Esta iluminación de la muestra provoca una reacción entre las aminas terciarias y el estado excitado del pigmento tipo-xanteno halogenado, que resulta en la producción de fluoresceína. Esta reacción de deshalogenación requiere una transferencia electrónica entre el estado excitado del pigmento (el aceptor) y la amina (el dador de electrones).

La deshalogenación fotoquímica de la eosina y otros pigmentos tipo-xanteno halogenados ya ha sido descrita con anterioridad (Oster et al. Journal of Physical Chemistry, 1962, 66, 2514; Eisenberg, R. Journal of the American Chemical Society 2009, 131, 9192; McCormick et al. Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 15480; Han, Z. J. ET AL. Angewandte Chemie-lnternational Edition 2012, 51, 1667). En todos los casos mencionados, el dador de electrones está en gran exceso con respecto al pigmento. En este sentido, los investigadores han desarrollado un método de detección y cuantificación de aminas terciarias hasta un intervalo de concentración de 0.1 a 5.0 ppm en el que la iluminación de los pigmentos tipo xantenos halogenados en presencia de estas aminas provoca una fluorescencia intensa en el rango de 510- 535nm (A _exc = 495nm), detectable por medios fluorimétricos, tales como un espectrofluorímetro, cuya intensidad de emisión se correlaciona con la concentración de las aminas terciarias.

Adicionalmente, el método se lleva cabo en medio acuoso y utiliza reactivos estables por lo que es válido para la determinación in situ de sustancias como heroína y opiáceos, en muestras de orina y saliva.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la detección y/o cuantificación fluorimétrica de aminas terciarias, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) preparación de una disolución reactiva que comprende poner en contacto la muestra a analizar con al menos un pigmento tipo xanteno halogenado de fórmula general I

donde X se selecciona de entre hidrógeno, flúor, cloro, bromo y iodo, e Y se selecciona de entre H y Cl, o cualquiera de sus sales;

b) ajustar el pH de la disolución de la etapa (a) entre 8 y 13;

c) desairar la disolución de la etapa (b) e iluminar con luz visible;

d) detectar y/o cuantificar la señal fluorescente producida.

Opcionalmente, puede llevarse a cabo la cuantificación de las aminas terciarias mediante la curva de calibrado de acuerdo con la ecuación

I _f = A(l - 10 ^~BC )

donde / _/ es la variación de intensidad antes y después de iluminar la muestra a una longitud de onda determinada, y C es la concentración de amina terciaria que hay en la muestra.

Con el método proporcionado por la presente invención es posible detectar terciarias independientemente de la procedencia de las muestras.

En una realización preferida, la muestra a analizar o muestra diana procede de un fluido fisiológico o tejido derivado de un organismo (humano o animal), como por ejemplo: orina, sangre, suero, plasma sanguíneo, sudor, fluido oral (saliva) o cabello. En una realización aún más preferida, la detección y cuantificación de las aminas terciarias se realiza en muestras de orina o saliva.

En otra realización preferida, la disolución reactiva de la etapa a) puede prepararse a diferentes concentraciones, ya que se ha se ha encontrado que ciertas concentraciones son las más adecuadas para según qué aplicaciones. Preferiblemente la concentración de pigmento tipo-xanteno halogenado se encuentra en el intervalo de 10 ^~7 M a 10 ^~2 M. Más preferiblemente, una concentración de 10 ^~6 M de reactivo es la elección adecuada para cuantificar aminas con una concentración de entre 10 ^~7 M y 10 ^~5 M. En otra realización preferida la disolución se lleva a cabo en un disolvente polar que comprende agua y opcionalmente un disolvente orgánico polar. Preferiblemente, la proporción máxima del disolvente orgánico polar es del 50% y se selecciona de entre el grupo que comprende: alcoholes monohídricos como metanol, etanol, 1 - propanol, 2-propanol, 1 -butanol, 1 -hexanol, 1 -octanol, y trifluoroetanol, alcoholes polihídricos como el propilenglicol, PEG 400, y 1 ,3-propanediol, y cetonas como la acetona, cetona etil metílica, y cetona isobutílica metílica. En una realización más preferida, el disolvente orgánico es metanol, etanol o acetona. En una realización más preferida, el disolvente es agua.

En otra realización preferida, el pigmento tipo xanteno halogenado de fórmula general I son compuestos comercialmente, disponibles en disolución acuosa o en estado sólido. En una realización más preferida estos pigmentos se seleccionan de entre eosina Y, floxina, eritrosina, y rosa bengal, o cualquiera de sus sales, y más preferiblemente el pigmento es eosina Y, o cualquiera de sus sales. Se entiende por cualquiera de sus sales las comercialmente disponibles, como por ejemplo la sal sódica de la eosina Y. En otra realización preferida, el pH de la etapa b) se ajusta a un rango de entre 10 y 12, y más preferiblemente de entre 1 1 y 12.

En otra realización preferida, para la iluminación de la etapa c) se puede utilizar una fuente de luz visible como por ejemplo luz solar, o cualquier dispositivo que emita a longitudes de onda de entre 400 y 700 nm. En una realización preferida se emplea una bombilla halógena de 12 V y 50 W de potencia.

En otra realización preferida, las aminas terciarias son drogas como opiáceos y/o sus derivados. En una realización más preferida, el método de la invención se emplea para la detección y/o cuantificación de heroína.

En la presente invención se entiende por opiáceos tanto a los alcaloides naturales procedentes del opio, como la morfina, codeína y tebaína, entre otros; como a sus derivados semi-sintéticos como heroína y oxicodona, entre otros; y a los opioides completamente sintéticos, tales como petidina y metadona, entre otros. En un segundo aspecto, la invención también se refiere a un kit o dispositivo para la detección y/o cuantificacion de aminas terciarias que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método descrito anteriormente. Esto incluye, sin ningún tipo de limitación, la disolución reactiva que comprenda al menos un pigmento tipo xanteno halogenado de fórmula general I, tampones o soluciones reguladoras del pH en un rango de entre 8 y 13, una fuente de luz visible, entre otros. Por otro lado, este kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. En una realización preferida, el kit o dispositivo comprende un pigmento tipo xanteno halogenado de fórmula general I que se selecciona de entre eosina Y, floxina, eritrosina, y rosa bengal, o cualquiera de sus sales; y más preferiblemente eosina Y, o cualquiera de sus sales. En otra realización preferida, el kit o dispositivo se emplea para la detección y/o cuantificacion de drogas como opiáceos y/o sus derivados. En una realización más preferida, este kit o dispositivo se emplea para la detección y/o cuantificacion de heroína. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Ilustra como la fluorescencia inicial de un pigmento tipo-xanteno halogenado (eosina Y) cambia y crece y se desplaza hacia la izquierda durante 10 minutos de iluminación en presencia de una amina terciaria (trietanolamina) en concordancia con la presente invención.

FIG. 2. Ilustra como la intensidad de la fluorescencia (medida por el área de la curva) de una mezcla iluminada de eosina Y (10 ^"6 M) y una amina terciaria (trietanolamina) alcanza el máximo valor tras 50 segundos de iluminación. La curva superior corresponde a una relación amina/eosina Y de 5/1 . La curva inferior corresponde a una relación amina/eosina Y de 1 /1 .

FIG. 3. Compara la intensidad de la fluorescencia dependiendo del pigmento (10 ^~6 M) en presencia de una amina terciaria (trietanolamina 5- 10 ^"6 M).

FIG. 4. Compara la intensidad de la fluorescencia (eosina Y 10 ^"6 M) dependiendo de la amina (5- 10 ^~6 M). FIG. 5. Ilustra los efectos en la concentración de heroína sobre la fluorescencia de eosina Y (10 ^"6 M) a 518 nm tras 10 minutos de iluminación con una bombilla halógena comercial de 12 V y 50 W de potencia de acuerdo con la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

A menos que se indique lo contrario, los diferentes materiales, concentraciones, y similares especificados en este documento son solo ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 . Calibrado de las aminas terciarias El calibrado necesario antes de medir las muestras problema se lleva a cabo mediante la preparación de varias disoluciones con distintas concentraciones de amina cada una, a las cuales se les añade el colorante y el medio básico, y se miden según el procedimiento aquí expuesto, dando cada una su correspondiente señal. La gráfica resultante de estas medidas se ajusta a la siguiente ecuación:

l _j = A l - 1(T ^BC )

donde / _/ es la variación de intensidad antes y después de iluminar la muestra a una longitud de onda determinada, y C es la concentración de amina terciaria que hay en la muestra.

La Figura 4 muestra las curvas de calibrado para diferentes aminas terciarias. Ejemplo 2. Preparación de las muestras

Se prepararon alícuotas de 1 ,0 mi que contenían muestras de amina terciaria con un intervalo de concentraciones desde 0 a 10 ppm. Cada alícuota fue añadida a una cubeta y a continuación se añadió 1 ,0 mi de eosina Y 1 μΜ a un pH de 12. Para mezclar los reactivos, las cubetas fueron invertidas. En este punto se desairearon las muestras burbujeando nitrógeno o argón durante 10 minutos. A continuación, las muestras fueron iluminadas con una bombilla halógena comercial de 12 V y 50 W de potencia manteniendo una distancia de 10 cm entre la cubeta y la bombilla. La muestra fue entonces analizada mediante espectroscopia de fluorescencia.

Particularmente, la Figura 1 muestra las medidas de una disolución (2,5 mL) que contiene de eosina Y 10 ^"6 M, 10 ^"3 M de NaOH y 5- 10 ^"5 M de trietanolamina. Tras eliminar el aire, se lleva la muestra al fluorímetro para obtener su espectro de fluorescencia. Después se ilumina 10 segundos con la lámpara de 50W de luz visible y se repiten las medidas cada 10 segundos obteniendo las distintas curvas que muestran cómo la eosina Y se va deshalogenando hasta fluoresceína.

Por otro lado, las curvas de la Figura 2 recogen el máximo de intensidad a cada tiempo para una disolución de eosina Y 10 ^"6 M, 10 ^"3 M de NaOH y 5- 10 ^"5 M ó 10 ^"6 M de trietanolamina.

Estas mismas medidas se llevaron a cabo para los colorantes floxina, eritrosina, y rosa bengal a una concentración 10 ^"6 M, 10 ^"3 M de NaOH y 5- 10 ^"5 M, en total un volumen de 2,5 mL. Las curvas resultantes se recogen en la Figura 3, lo que permite compararlos entre sí.

Específicamente, las muestras se colocaron en un espectrofluorímetro Hitachi F7000 FL en el intervalo 300-700 nm, con celdas de cuarzo de 1 cm de camino óptico termostatadas a 25 ^e C y se realizaron las medidas de fluorescencia. La longitud de onda de excitación utilizada fue 495 nm y los espectros se registraron en el rango 450- 650 nm.

Ejemplo 3. Análisis de morfina-3-qlucurónido en orina Se probaron muestras que contenían morfina-3-glucurónido en orina. Para ello se añadieron 25 μΙ_ de una disolución de morfina-3-glucurónido 10 ^"4 M en 2,5 mL de orina. Se añadió una pequeña cantidad de carbón activado y se filtró esta mezcla con un filtro Millipore MillexGP 0,22 μηι. La disolución resultante fue extraída con un cartucho Strata X-C 25 μηι Polymeric Strong Catión de Phenomenex. El cartucho cargado fue eluído con 9 mL de metanol (1 % de amoniaco) y la disolución fue evaporada. Se añadieron 25 μΐ de eosina Y (10 ^~4 M), 25 μΐ de NaOH (10 ^~1 M) y 2,45 mL de agua al residuo resultante. La disolución obtenida fue desaireada, iluminada y la fluorescencia se midió siguiendo la metodología descrita en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4. Análisis de morfina-3-qlucurónido en saliva

Se probaron muestras de morfina-3-glucurónido contenidas en disoluciones de saliva. Para ello se añadieron a 2,45 mL de saliva, 125 μΐ de una disolución de morfina-3- glucurónido 10 ^~4 M y esta mezcla se filtró con un filtro Millipore MillexGP 0.22 μηι. Se añadieron 25 μΐ de eosina Y (10 ^~4 M), 25 μΐ de NaOH (10 ^~1 M) a la disolución resultante, se desaireó, se iluminó y se midió la fluorescencia siguiendo la metodología descrita en el Ejemplo 2. Ejemplo 5. Determinación de heroína.

Para llevar a cabo el calibrado inicial, se usaron disoluciones con las concentraciones que aparecen en la siguiente tabla y se siguió el procedimiento previamente descrito (1 μΜ de eosina Y, pH 1 1 , cantidad de amina correspondiente de cada muestra, 2,5 mi de agua. Las alícuotas se desairean burbujeando nitrógeno). Estas muestras se midieron en el fluorímetro antes y después de iluminar.

Tabla 1

[Heroína], M ΔΙ,

0,0000002 188,64

0,0000004 283,54

0,0000006 355,65

0,0000008 383,46 0,000001 425,29

0,000002 475,97

0,000004 494,23

Esta tabla muestra los valores de variación de la intensidad de fluorescencia (ΔΙ, ) en función de la concentración de heroína, tomados a 518 nm. Esta variación corresponde a la diferencia de intensidades a 518 nm entre el valor de intensidad después de iluminar y antes de iluminar las disoluciones. La representación de estos valores corresponde a la gráfica correspondiente a la Figura 5.

Ajustando la curva a la ecuación de calibrado indicada en el Ejemplo 1 se obtienen los siguiente valores de A y B (Tabla 2), necesarios para poder introducir las medidas de muestras problemas y determinar su concentración.

Tabla 2

A continuación se miden las muestras problema de heroína con el método de la invención.

Además, se ha llevado a cabo una medida simultánea de las muestras a través de un método de análisis estándar y oficial para este tipo de muestras (espectrometría de masas) para comparar los resultados (Tabla 3).

Tabla 3