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Patent Searching and Data


Title:
FLUORESCENCE MEASUREMENT METHOD
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2013/029580
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a fluorescence measurement method having the following steps: irradiating excitation radiation (24) with an excitation wavelength (λ1) onto an object (14) to be measured, said object (14) to be measured containing fluorescent material (12); measuring a fluorescent radiation intensity (I34) of fluorescent radiation (34) in a spatially resolved manner, said fluorescent radiation having been caused by the excitation radiation (24) in the object (14) and having at least one fluorescence wavelength (λ3); irradiating an auxiliary radiation (30) with at least one auxiliary radiation wavelength (λ2) onto the object (14) to be measured, said auxiliary radiation wavelength (λ2) being greater than the excitation wavelength (λ1); ascertaining an auxiliary radiation intensity (I30) of scattered auxiliary radiation (30) in a spatially resolved manner; and ascertaining a spatially resolved parameter (P), which is a measurement of the concentration (c) of fluorescent material (12), from the fluorescent radiation intensity (I34) and the auxiliary radiation intensity (I30). The steps of ascertaining the auxiliary radiation intensity (I30) in a spatially resolved manner and measuring the fluorescent radiation intensity (I34) in a spatially resolved manner include a suppression of scattered excitation radiation (24).

Inventors:
HAGEN, Axel (Greifswalder Strasse 194, Berlin, 10405, DE)
Application Number:
DE2012/000658
Publication Date:
March 07, 2013
Filing Date:
July 02, 2012
Export Citation:
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Assignee:
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND, VERTRETEN DURCH DAS BUNDESMINISTERIUM FÜR WIRTSCHAFT UND TECHNOLOGIE, DIESES VERTRETEN DURCH DEN PRÄSIDENTEN DER PHYSIKALISCH-TECHNISCHEN BUNDESANSTALT (Bundesallee 100, Braunschweig, 38116, DE)
HAGEN, Axel (Greifswalder Strasse 194, Berlin, 10405, DE)
International Classes:
G01N21/64; A61B5/00
Domestic Patent References:
WO2011074448A1
Foreign References:
US4773097A
EP0478026A1
US6175759B1
DE102008057115A1
EP0237363A2
EP1775565A1
DE102007008850A1
DE4026465C2
DE69535254T2
Other References:
A. POELLINGER ET AL: "Breast Cancer: Early- and Late-Fluorescence Near-Infrared Imaging with Indocyanine Green--A Preliminary Study", RADIOLOGY, Bd. 258, Nr. 2, 1. Februar 2011 (2011-02-01), Seiten 409-416, XP55042425, ISSN: 0033-8419, DOI: 10.1148/radiol.10100258
Attorney, Agent or Firm:
PLÖGER, Jan (Gramm, Lins & Partner GbRPatent- und Rechtsanwaltssozietä, Theodor-Heuss-Straße 1 Braunschweig, 38122, DE)
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Claims:
Verfahren zur Fluoreszenzmessung, mit den Schritten:

(a) Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) einer Anregungswellenlänge { Äy ) auf ein zu vermessendes Objekt (14), wobei das zu vermessende Objekt (14) fluoreszierendes Material (12) enthält,

(b) ortsaufgelöstes Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) von Fluoreszenzstrahlung (34), die

von der Anregungsstrahlung (24) im Objekt (14) hervorgerufen wurde und

zumindest eine Fluoreszenzwellenlänge ( ^ ) hat,

(c) Einstrahlen einer Hilfsstrahlung (30) mit zumindest einer Hilfs- strahlungswellenlänge ( L, ) auf das zu vermessende Objekt (14), wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge ( X, ) größer ist als die Anregungswellenlänge { Äy ) ,

(d) ortsaufgelöstes Ermitteln einer Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) gestreuter Hilfsstrahlung (30) und

(e) Ermitteln eines ortsaufgelösten Parameters (P), der ein Maß für die Konzentration (c) an fluoreszierendem Material (12) ist, aus der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o),

(f) wobei das ortsaufgelöste Ermitteln der Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) und das ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenzstrahlungs Intensität (l34) ein Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung (24) umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die H

strahlungswellenlänge ( X, ) der Fluoreszenzwellenlänge ( A, ) entspricht. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass

das Einstrahlen der Anregungsstrahlung (24) und

das Einstrahlen der Hilfsstrahlung (30) alternierend erfolgen.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass

das ortsaufgelöste Messen der Hilfsstrahlungs-Intensität (ho) und das ortsaufgelöste Messen der Fluoreszenzstrählungs- Intensität (l34) mit ein und demselben Detektor (36) durchgeführt werden und

das Messgerät mit einer Strahlungsquelle, die die Anregungsstrahlung (24) und die Hilfsstrahlung (30) abgibt, synchronisiert wird.

Fluoreszenzverteilungs-Messgerät zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material (12) in einem Objekt (14), mit

(i) einer Anregungsstrahlungsquelle (16) zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) einer Anregungswellenlänge ( , ) auf das zu vermessende Objekt (14),

(ii) einer Hilfsstrahlungsquelle (26) zum Einstrahlen einer Hilfsstrahlung (30) mit einer Hilfsstrahlungswellenlänge (^ ) auf das zu vermessende Objekt (14), wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge ( ^ ) größer ist als die Anregungswellenlänge ( , ) und

(iii) zumindest einer Messvorrichtung (32), die ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) von Fluoreszenzstrahlung (34), die

aus dem Objekt (14) stammt,

von der Anregungsstrahlung (24) hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenzwellenlänge ( , ) hat, dadurch gekennzeichnet, dass

(iv) das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät einen Filter (40) zum Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung und zum Passierenlassen von Fluoreszenzstrahlung (34) und Hilfsstrahlung (30) aufweist,

(v) die Messvorrichtung (32) ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o) von Hilfsstrahlung (30), die im Objekt (14) gestreut wurde, und

(vi) dass das Fluoreszenzverteilurigsmessgerät ausgebildet ist zum automatischen Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Auswerteeinheit (37), die eingerichtet ist zum Berechnen eines ortsaufgelösten Parameters (P), der ein Maß für die Konzentration (c) an fluoreszierendem Material (12) ist, aus der Fluores- zenzstrahlungs-lntensität (l34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o).

7. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass

die Anregungsstrahlungsquelle (16) und die Hilfsstrahlungsquel- le (26) ausgebildet sind zum periodisch alternierenden Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) und Hilfsstrahlung (30) auf das zu vermessende Objekt (14),

das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät (10) eine Synchronisiervorrichtung zum Synchronisieren der Messvorrichtung (32) einerseits mit der Anregungsstrahlungsquelle (16) und der Hilfs- strahlungsquelle (26) andererseits aufweist und dass die Messvorrichtung (32) eingerichtet ist zum periodisch alternierenden Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (I34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o) synchron zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) und Hilfsstrahlung (30).

8. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach einem der vorstehenden Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass

es ein Handgerät (42) umfasst, mittels dem die Anregungsstrahlung (24) und die Hilfsstrahlung (30) auf das Objekt (14) abgebbar ist und die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität ( I34) und die Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) in Rückstrahlungslage messbar sind.

Description:
Verfahren zur Fluoreszenzmessung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung. Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Fluoreszenzverteilungs- Messgerät zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material in einem Objekt, mit (i) einer Anregungsstrahlungsquelle zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung einer Anregungswellenlänge auf das zu vermessende Objekt, (ii) einer Hilfsstrahlungsquelle zum Einstrahlen einer Hilfsstrahlung mit einer Hilfsstrahlungswellenlänge auf das zu vermessende Objekt, wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge größer ist als die Anregungswellenlänge, (iii) zumindest einer Messvorrichtung, die ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität von Fluoreszenzstrahlung, die aus dem Objekt stammt, von der Anregungsstrahlung hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenzwellenlänge hat.

Die Messung der Verteilung von fluoreszierendem Material in einem Objekt ist insbesondere in der Medizin von Interesse. So ist bekannt, dass Substanzen existieren, die mit Anregungsstrahlung zu Fluoreszenz ange- regt werden können, wobei sich diese Substanzen in Tumorgewebe oder an den Rändern von Tumoren im Vergleich zum umgebenden Gewebe anreichern und weitgehend ungiftig sind. Es ist daher möglich, nach Gabe dieses Farbstoffs die Fluoreszenz zu messen und aus der Fluoreszenz auf

|Bestätigungskopie| etwaig vorhandene Tumore zu schließen. Darüber hinaus kann solch ein Farbstoff auch zur Markierung und Lokalisierung von Tumornahen Lymphknoten im Rahmen einer Krebstherapie verwendet werden, sowie für Ge- webeperfusions-Untersuchungen.

Aus der US 6,175,759 B1 ist bekannt, Licht zweier Wellenlängen durch das zu untersuchende Objekt zu schicken und das Verhältnis der Absorption beider Strahlungen zur Detektion von Tumoren einzusetzen. Allerdings ist dort nicht erwähnt, wie die Wellenlängen zu wählen sind, um die Messgenauigkeit zu optimieren. Ferner lässt US 6, 175,759 B1 offen, wie bei einer Fluoreszenzmessung vorzugehen ist.

Aus der DE 10 2008 057 1 15 A1 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe bekannt. Dabei wird neben der eigentlichen Fluoreszenzmessung, bei der Licht einer Anregungswellenlänge auf die zu untersuchende Substanz gestrahlt wird, parallel ein Referenzlicht einer Referenzlichtwellenlänge auf ein optisches Element gesendet, das als Remissionsstandard verwendet wird. Somit ist eine quantitative Bestimmung der Anzahl der Fluorophoren in der zu untersuchenden Substanz möglich.

Die EP 0 237 363 A2 offenbart ein Fluoreszenzmessungsverfahren. Dabei sind die Anregungs- und die Fluoreszenzwellenlänge nur leicht unterschiedlich bzw. verfügt die Anregungsstrahlung über einen Strahlungsan- teil, der sich im Frequenzbereich der Fluoreszenzstrahlung befindet. Daher ist es kaum möglich, die Fluoreszenzstrahlung von reflektierter Anregungsstrahlung zu unterscheiden. Dabei wird eine zweite Messung mit einer Strahlung durchgeführt, die keine Fluoreszenz hervorruft, im Bereich der Fluoreszenzwellenlängen jedoch der Anregungsstrahlung ähnelt. Die beiden Ergebnisse werden anschließend voneinander abgezogen. Dies geschieht jedoch lediglich in einem einzigen Test bei der zu untersuchenden Probe. Die EP 1 775 565 A1 offenbart ein Verfahren zur Farbmessung von gedruckten Proben mit Aufhellern. Dabei sind Aufheller Substanzen, die unter Beleuchtung mit ultraviolettem Licht eine Fluoreszenzstrahlung abge- ben, die im sichtbaren Bereich liegt. Je nach dem, wie groß der Anteil von ultraviolettem Licht bei der Messstrahlung ist, ändert sich der gemessene Helligkeitswert. Daher wird die zu untersuchende Probe einmal mit einem UV-freien Licht und einmal mit einem reinen UV-Licht bestrahlt. Beide Messungen werden separat gespeichert und spektral gewichtet addiert. Damit ist es möglich, für unterschiedliche Lichtarten, bei denen der jeweilige Anteil von sichtbarem und UV-Licht bekannt ist, den tatsächlichen Helligkeitswert zu berechnen.

Auch die DE 10 2007 008 850 A1 befasst sich mit der Messung von farb- metrischen Werten, insbesondere eines Weißgrades, bei Materialoberflächen, die optische Aufheller beinhalten. Diese Druckschrift schlägt vor, die Probe mit einer Mischung aus sichtbarem und UV-Licht zu bestrahlen und das daraufhin gemessene Spektrum in einen Fluoreszenzanteil und einen Reflexionsanteil zu zerlegen. Der Fluoreszenzanteil wird anschließend über empirisch bestimmte Fluoreszenzfaktoren auf die Lichtart umgerechnet, für die die Farbkombination ermittelt werden soll.

Die DE 40 26 465 C2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbildes einer lonenkonzentration in einer leben- den Zelle. Dabei wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Um das so ermittelte Fluoreszenzintensitätsbild von Hintergrundfluoreszenz zu befreien, wird das Fluoreszenzintensitätsbild mit einem weiteren Bild der Zelle, das beispielsweise ein Hellfeldbild sein kann, abgeglichen, um festzustellen, wo sich die Ränder der Zelle befinden. Die Fluoreszenz außerhalb dieser Ränder wird als Hintergrundfluoreszenz angesehen. Der Wert, den diese Hintergrundfluoreszenz am Ort der Zellwände aufweist, wird als konstant angesehen und vom Fluoreszenzwert innerhalb der Zelle abgezogen. Die DE 695 35 254 T2 offenbart eine Hochgeschwindigkeitslichtquelle, die über zwei Einzellichtquellen verfügt, die Licht unterschiedlicher Wellenlänge aus senden. Beide Lichtquellen werden elektrisch betrieben, wobei die Intensität der jeweils ausgesandten Strahlung direkt von der Stromstärke abhängt, mit der die jeweilige Lichtquelle betrieben wird. Über ein rasches Umschalten der Stromstärken an den beiden Lichtquellen kann die Frequenz des ausgesandten Lichtes schnell zwischen den beiden Werten der Einzellichtquellen hin und her umgeschaltet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Messgenauigkeit bei der ortsaufgelösten Fluoreszenzmessung in streuenden Medien zu optimieren. Unter Messgenauigkeit wird hier die Korrelation von Fluoreszenz-Bildkontrast zur im streuenden Medium vorhandenen Farbstoffkonzentration verstanden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Messgenauigkeit bei der ortsaufgelösten Fluoreszenzmessung in streuenden Medien zu verbessern.

Die Erfindung löst das Problem durch ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung, mit den Schritten (a) Einstrahlen von Anregungsstrahlung einer Anregungswellenlänge auf ein zu vermessendes Objekt, wobei das zu vermessende Objekt fluoreszierendes Material enthält, (b) ortsaufgelöstes Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität von Fluoreszenzstrahlung, die von der Anregungsstrahlung im Objekt hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenz-Wellenlänge hat, (c) Einstrahlen einer Hilfsstrahlungswellen- länge auf das zu vermessende Objekt, wobei die Hilfsstrahlungswellenlän- ge größer ist als die Anregungswellenlänge, (d) ortsaufgelöstes Ermitteln einer Hilfsstrahlungs-Intensität gestreuter Hilfsstrahlung und (e) Ermitteln eines ortsaufgelösten Parameters, der ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material im Objekt ist, zumindest auch aus der Fluores- zenzstrahlungs-lntensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität , wobei (f) das ortsaufgelöste Ermitteln der Hilfsstrahlungs-Intensität und das ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität ein Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung umfasst

Gemäß einem zweiten Aspekt löst die Erfindung das Problem durch ein gattungsgemäßes Fluoreszenz-Messgerät, das einen Filter zum Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung und zum Passierenlassen von Fluoreszenzstrahlung und Hilfsstrahlung aufweist und bei dem die Mess- Vorrichtung ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Hilfsstrahlungs-Intensität von Hilfsstrahlung, die im Objekt gestreut wurde.

Vorteilhaft an der Erfindung ist die erhöhte Messgenauigkeit. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass auch das Fluoreszenzlicht im Objekt gestreut und absorbiert wird, bevor es den Detektor erreicht. Diese Streuung und Absorption ist von der lokalen Eigenschaft des Objekts und der Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung abhängig. Das bedeutet, dass das Messergebnis nicht nur von der ortsaufgelösten Konzentration an fluoreszierendem Material abhängig ist, sondern auch von den unbekannten Streu- und Absorptionseigenschaften des Objekts. Dadurch, dass eine

Hilfsstrahlung verwendet wird, die hinsichtlich ihrer Wellenlänge bzw. Frequenz der Fluoreszenzstrahlung entspricht, kann der Einfluss der unbekannten Streu- und Absorptionseigenschaften auf die Fluoreszenzstrahlung minimiert werden. Es wird so ein optimales Messergebnis erhalten, was insbesondere in der medizinischen Anwendung wichtig ist.

Ein weiterer Vorteil ist, dass wie in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen in Rückstrahlanordnung gemessen werden kann. Hierunter ist insbesondere zu verstehen, dass ein Winkel zwischen der optischen Ach- se des eingestrahlten Lichts und der optischen Achse des detektierten

Lichts höchstens 45° beträgt und insbesondere kleiner ist als 25°. So kann das erfindungsgemäße Fluoreszenzverteilungs-Messgerät als Handgerät ausgebildet werden, was für medizinische Anwendungen besonders günstig ist.

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden unter den genannten Wellenlängen immer Vakuumwellenlängen verstanden. Selbstverständlich hängt die Wellenlänge von Strahlung vom Brechungsindex ab, so dass die Wellenlänge im Objekt in der Regel kleiner ist, maßgeblich ist aber der Einfachheit halber die Vakuumwellenlänge. Unter dem Parameter, der ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material ist, wird jede Zahl oder Größe verstanden, die mit der Konzentration an fluoreszierendem Material oder einer Ableitung nach dem Ort so stark korreliert, dass eine verlässliche Aussage über die Konzentration möglich ist. Beispielsweise handelt es sich bei diesem ortsaufgelösten Pa- rameter um den Quotienten aus Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und Hilfsstrahlungs-Intensität oder eine daraus abgeleitete Größe oder Zahl.

Vorzugsweise entspricht die Hilfsstrahlungswellenlänge der Fluoreszenzwellenlänge. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die Hilfsstrah- lungswellenlänge innerhalb eines Intervalls von ±25 Nanometern um das globale Maximum der Intensität der Fluoreszenzstrahlung liegt Die Fluoreszenzstrahlung hat in der Regel ein Wellenlängenspektrum mit einem Maximum und ist nicht auf eine einzelne Wellenlänge beschrieben. Es ist also möglich, nicht aber notwendig, dass die Hilfsstrahlung lediglich eine Wellenlänge besitzt. Denkbar ist auch, dass die Hilfsstrahlung mehrere Wellenlängen aufweist oder Wellenlängen aus einem Wellenlängen- Intervall besitzt. In diesem Fall bezieht sich die Aussage auf den auf Intensitätsanteile gewichteten Mittelwert. Je mehr die Hilfsstrahlung der Fluoreszenzstrahlung entspricht, desto genauer gelingt die Auswertung, da die Streu- und Absorptionseigenschaften des Objekts bezüglich der Fluoreszenzstrahlung dann besonders ähnlich sind zu den Streu- und Absorptionseigenschaften bezüglich der Hilfsstrahlung. Optimal ist es daher, wenn das Spektrum der Hilfsstrahlung dem Spektrum der Fluoreszenzstrahlung entspricht. Da eine derartige Hilfsstrahlung meist aufwändig herzustellen ist, hat es sich als vorteilhaft er- wiesen, eine solche Hilfsstrahlung zu verwenden, die lediglich eine Wellenlänge hat, wobei diese Wellenlänge dicht beim Maximum des Spektrums der Fluoreszenzstrahlung liegen sollte.

Vorzugsweise erfolgen das Einstrahlen der Anregungsstrahlung und das Einstrahlen der Hilfsstrahlung alternierend. Das hat den Vorteil, dass die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und die Hilfsstrahlungs-Intensität mit ein und demselben Detektor gemessen werden können, der dazu lediglich mit dem Wechsel der Anregungsstrahlung zur Hilfsstrahlung synchronisiert werden muss. Es handelt sich dabei quasi um ein Zeitmultiplexen der bei- den Strahlungen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden das ortsaufgelöste Messen der Hilfsstrahlungs-Intensität und das ortsaufgelöste Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität mit ein und demselben Detektor durchge- führt, wobei das Messgerät mit einer Strahlungsquelle, die die Anregungsstrahlung und die Hilfsstrahlung abgibt, synchronisiert wird. Unter dem Merkmal, dass die Hilfsstrahlungs-Intensität und die Fluoreszenzstrah- lungs-lntensität in demselben Messgerät durchgeführt werden, wird insbesondere verstanden, dass die Umsetzung des optischen Signals in Form der Intensitäten in ein elektrisches Signal mit dem gleichen Sensorelement durchgeführt wird. Das ermöglicht einen einfachen Messaufbau und erspart ein ansonsten notwendiges Ausrichten von Sensorelementen für die unterschiedlichen Intensitäten relativ zueinander. In aller Regel umfasst das Messgerät einen Langpassfilter, der so gewählt ist, dass die Anre- gungsstrahlung herausgefiltert wird. In anderen Worten wird die Strahlung zunächst so gefiltert, dass die Anregungsstrahlung unterdrückt wird, danach werden die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und die Hilfsstrahlungs- Intensität zeitversetzt ortsaufgelöst gemessen, und zwar synchron zum Wechsel beim Einstrahlen zwischen Anregungsstrahlung und Hilfsstrahlung. Vorzugsweise ist das zu vermessende Objekt ein Teil eines menschlichen oder tierischen Körpers, dem ein Fluoreszenzfarbstoff zugeführt wurde. Als geeigneter Fluoreszenzfarbstoff hat sich Indocyaningrün herausgestellt. Ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät ist zum automatischen Durchführen eines beschriebenen Verfahrens ausgebildet und umfasst eine Auswerteeinheit, die eingerichtet ist zum Berechnen eines ortsaufgelösten Parameters aus der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität, wobei dieser Parameter ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material im Objekt ist. Insbesondere handelt es sich bei dem Parameter um das Verhältnis aus Fluores- zenzstrahlungs-lntensität und Hilfsstrahlungs-Intensität. Vorzugsweise ist das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät als Handgerät ausgebildet und die Messvorrichtung zum Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität ist bezüglich der Hilfsstrahlungsquelle und der Anregungsstrahlungsquelle in Rückstrahllage angeordnet.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigt

Figur 1 eine Schemazeichnung eines erfindungsgemäßen Fluores- zenzverteilungs-Messgeräts,

Figur 2 eine mit einem Verfahren nach Stand der Technik aufgenommene ortsaufgelösten Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und Anregungsstrahlungsrückstreu-Intensität, eine mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzverteilungs- Messgerät gemäß Figur 1 unter Laborbedingungen durchge führte Messung. Figur 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material 12 in einem Objekt 14. Das fluoreszierende Material 12 ist beispielsweise Indocya- ningrün, das an verschiedenen Orten in verschiedenen Konzentrationen vorliegt.

Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 besitzt eine Anregungsstrah- lungsquelle 16, die im vorliegenden Fall eine erste Lichtquelle 18, eine Alterniervorrichtung 20 und eine Lichtleitfaser 22 umfasst. Die Anregungs- strahlungsquelle 16 ist ausgebildet zum Einstrahlen von Anregungsstrah- lung 24 mit einer Anregungswellendlänge auf das zu vermessende Objekt 14. Beispielsweise kann die Anregungswellenlänge Λ, = 760 Nanome- ter betragen.

Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 umfasst zudem eine Hilfsstrah- lungsquelle 26, die eine zweite Lichtquelle 28 umfasst und mit der Anre- gungsstrahlungsquelle 16 die Alterniervorrichtung 20 und die Lichtleitfaser 22 teilt. Die Hilfsstrahlungsquelle 26 ist eingerichtet zum Abgeben von Hilfsstrahlung mit einer Wellenlänge . Beispielsweise beträgt die Wel- lenlänge der Hilfsstrahlung λ 2 = 820 Nanometer.

Die Anregungsstrahlungsquelle 1 6 und die Hilfsstrahlungsquelle 26 sind so angeordnet, dass Hilfsstrahlung 30 in die gleiche Abstrahlrichtung RA abgegeben wird wie die Anregungsstrahlung 24.

Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 1 0 besitzt zudem eine Messvorrichtung 32, beispielsweise in Form einer CCD-Kamera, die so angeordnet ist, dass vom Objekt 14 abgegebene Fluoreszenzstrahlung 34 mit einer Fluoreszenzwellenlänge A, und zurück gestreute Hilfsstrahlung ortsaufgelöst messbar sind. Die Messvorrichtung 32 ist so angeordnet, dass aus einer Einstrahlrichtung R E stammende Strahlung erfasst wird. Ein Winkel α zwischen Einstrahlrichtung R E und Abstrahlrichtung R A beträgt im vorliegenden Fall weniger als 1 0° .

Die Messvorrichtung 32 umfasst einen Detektor 36, im vorliegenden Fall in Form eines CCD-Chips, ein Linsensystem 38 sowie einen Langpassfilter 40. Der Langpassfilter 40 besitzt eine Absorptionskante zwischen der Anregungswellenlänge A, und der Fluoreszenzwellenlänge A, . Im vorliegen- den Fall liegt die Absorptionskante des Langpassfilters 40 beispielsweise bei Ä K = 800 Nanometer. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinheit 37 verbunden, die aus den Messdaten des Detektors 36 den unten beschriebenen Konzentrations-Parameter P berechnet. Die Messvorrichtung 32 ist Teil eines Handgeräts 42, das einen Handgriff 44 aufweisen kann. Am Handgerät 42 ist zudem eine Strahlabgabevorrichtung angeordnet. Die Strahlabgabevorrichtung 46 ist so zur Messvorrichtung 32 ausgerichtet, dass mit der Messvorrichtung 32 Fluoreszenzstrahlung 34 und gestreute Hilfsstrahlung 30 detektiert werden können, die durch Bestrahlung mit der Anregungsstrahlung 24 bzw. Hilfsstrahlung 30 hervorgerufen worden sind. Die Messvorrichtung 32 ist ausgebildet zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l 34 sowie einer Hilfsstrahlungs-Intensität l 30 . Damit beide Intensitäten, l 34, l 30) mit dem gleichen Detektor 36 gemes- sen werden können, ist die Messvorrichtung 32 über eine Verbindung 48, im vorliegenden Fall mittels eines elektrischen Kabels, mit der Alterniervorrichtung 20 verbunden, die auch als Chopper bezeichnet werden kann, die im vorliegenden Fall durch einen Chopper realisiert wurde. Im Betrieb gibt die Anregungsstrahlungsquelle 16 kontinuierlich oder diskontinuierlich Anregungsstrahlung 24 mit der Anregungswellenlänge ab. Zudem gibt die Hilfsstrahlungsquelle 26 kontinuierlich oder diskontinuierlich Hilfsstrahlung 30 mit der Hilfsstrahlungswellenlänge X, ab. Beide Strahlungen erreichen die Alterniervorrichtung 20, die die Strahlungsquel- len 16, 26 alternierend auf die Lichtleitfaser 22 schaltet, so dass Anregungsstrahlung 24 und Hilfsstrahlung 30 einander abwechseln. Das Objekt 14 wird so abwechselnd mit Anregungsstrahlung 24 und Hilfsstrahlung 30 bestrahlt. Über die Verbindung 48 wird ein Synchronisierungssignal an die Messvorrichtung 32 gesendet, so dass die im Detektor 36 gemessene Intensität eindeutig als Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l 34 oder als Hilfsstrahlungsintensität l 30 identifiziert werden kann. Die Verbindung 48 und eine in Figur 1 nicht eingezeichnete Steuervorrichtung der Alterniervorrichtung 20, die das Triggersignal generiert, sind Teil einer Synchronisiervorrichtung.

Figur 1 zeigt, dass das Handgerät 42 mit dem Handgriff 44 ergriffen und im Raum bewegt werden kann. Die möglicherweise schweren Strahlungsquellen 16 und 26 können ortsfest bleiben und über die Lichtleitfaser 22 und die Verbindung 48 mit dem Handgerät 42 Verbunden sein. Es ist dann einfach, das Handgerät 42 beispielsweise auf Teile des menschlichen Körpers zu richten. Figur 2 zeigt oben links die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität I34 bei Messung an einer weiblichen Brustdrüse 14. Das Teilbild oben rechts zeigt eine Anregungsstrahlungsrückstreu-Intensität I24, also die Intensitätsvertei- lung derjenigen Anregungsstrahlung 24 (vgl. Figur 1 ), die vom Objekt, im vorliegenden Fall der weiblichen Brustdrüse gestreut wurde. Diese Anre- gungsstrahlungsrückstreu-lntensität I24 wurde von einem separaten Detektor gemessen, wie er im Stand der Technik bekannt ist.

Das in der Mitte angeordnete Teilbild 2.3 zeigt das Verhältnis— , das mit

^24

aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ermittelt wurde. Es ist zu erkennen, dass dieses Verhältnis am Rand besonders klein ist und im Inneren der Brustdrüse größer. Es ist zudem ein heller Fleck erkennbar, der einen Tumor 54 darstellt.

Im Teilbild 2.4 ist der Konzentrations-Parameter P = ^ gezeigt, der mit

'30

einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde. Es ist zu erkennen, dass jenseits des hellen Punktes mit dem Tumor 54 der Konzentrations- Parameter P im Wesentlichen gleich 1 ist. Der Konzentrations-Parameter P eignet sich damit deutlich besser als das in Figur 2.3 gezeigte Verhältnis

-^- zum Bestimmen der einen ortsaufgelösten Konzentration c des fluo-

'34,R

reszierenden Materials.

Figur 3 zeigt eine mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzverteilungs- Messgerät gemäß Figur 1 unter Laborbedingungen durchgeführt Messung, wobei auf einem Probenträger 50 rasterartig angeordnete Flüssigkeitstropfen aufgebracht sind. Die Konzentration c an Indocyaningrün steigt spaltenweise von links oben nach rechts unten. Das linke Teilbild zeigt die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l 34 , das mittlere Bild die Hilfsstrahlungs- Intensität l 3 o. Das rechte Bild zeigt das Verhältnis aus beiden. Es ist zu erkennen, dass der Fluoreszenz-Bildkontrast im Verhältnisbild mit dem Verlauf der eingesetzten Indocyaningrün-Konzentration c korreliert. Ein vorteilhaftes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät umfasst die folgenden Komponenten:

eine EMCCD-Kamera mit Triggereingang (Detektor),

eine Lichtquelle für die Anregung der ICG-Fluoreszenz (760 nm), eine Lichtquelle für die Absorptionskorrektur (820 nm),

- eine Abbildungsoptik mit Filtern zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung,

einen Lichtwellenleiter mit Optik zur Ausleuchtung des Untersuchungsgebietes,

einen Chopper mit Triggerelektronik zum multiplexen der beiden Wel- lenlängen und

einen PC zur Steuerung des Systems, zur Datenerfassung und - anzeige

Als Detektor dient wahlweise eine EMCCD-Kamera mit frontseitig belichte- tem Sensor („Luca" von Andor Technologies; 20 % Quanteneffizienz bei 800 nm) oder alternativ mit rückwärtig belichtetem Sensor („iXon" von Andor Technologies; 60 % Quanteneffizienz bei 800 nm). Beide Kameras verfügen zur Minimierung des Dunkelstroms über eine Kühlung des Sensors.

Zur Anregung der ICG-Fluoreszenz wird derzeit ein durchstimmbarer Titan-Saphir-Oszillator (Mai Tai von Spectra-Physics, jetzt Newport) bei 760 nm und zur Absorptionskorrektur ein Diodenlaser (LDH Series, PicoQuant) bei 820 nm verwendet. Beide Wellenlängen werden mit Hilfe eines Chop- pers (hms elektronik) gemultiplext und in eine 0,48 NA Multimodefaser (Thorlabs) eingekoppelt, die zur Beleuchtung der Gewebephantome dient und deren Ende dicht neben dem für kleine Arbeitsabstände (bis 10 cm) ausgelegten Kameraobjektiv (HF9HA-1 B, Fujinon) angebracht ist. Zur Verbesserung der Homogenität der Ausleuchtung wird zusätzlich noch ein optischer Diffuser (ED1 -C50-MD, Thorlabs) am Faserende eingesetzt. Die Lichtleistung nach Diffuser liegt im Bereich von 100 - 300 mW für die An- regungsstrahlung (760 nm) und bei 1 - 3 mW für die Hilfsstrahlung (820 nm). Zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung ist ein 800 nm Langpass- Filter (3rd Millennium, Laser Components) sowie ein 780 nm Rotglas-Filter (RG 780, Schott) vor dem Objektiv angebracht. Über eine selbst entwickelte Triggerelektronik wird das Auslesen der Kamera mit der Chopperbewegung synchronisiert, so dass abwechselnd nacheinander jeweils ein Fluoreszenzbild und ein Absorptionsbild aufgenommen werden. Diese Bilder werden dann im PC verrechnet (Untergrundabzug, Division, ggf. Filterung) und als absorptionskorrigierte Fluo- reszenzbilder in Echtzeit am Monitor dargestellt. Die verwendete Software wurde mit LabVIEW (Version 8.6, National Instruments) sowie dem Nl Vision Development Modul (National Instruments) erstellt.

Bezugszeichenliste

10 Fluoreszenzverteilungs-

Messgerät A, Anregungswellenlänge

12 fluoreszierendes Material , Hilfsstrahlungswellenlänge

14 Objekt

A3 Fluoreszenzwellenlänge

16 Anregungsstrahlungsquelle

Ä K Absorptionskante

18 erste Lichtquelle c Konzentration

20 Alterniervorrichtung

l 30 Hilfsstrahlungs-Intensität

22 Lichtleitfaser

I34 Fluoreszenzstrahlungs¬

24 Anregungsstrahlung

intensität

26 Hilfsstrahlungsquelle

P Konzentrations-Parameter

28 zweite Lichtquelle

R A Abstrahlrichtung

R E Einstrahlrichtung

30 Hilfsstrahlung

32 Messvorrichtung

34 Fluoreszenzstrahlung

36 Detektor

37 Auswerteeinheit

38 Linsensystem

40 Langpassfilter

42 Handgerät

44 Handgriff

46 Strahlabgabevorrichtung

48 Verbindung

50 Probenträger

54 Tumor