Technisches Gebiet Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen.

Stand der Technik In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar-und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt.

Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie, sogenannten DNA-oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.

Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische) Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem Radiolabel (z. B. 32p) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Fluorescein, Cy3 oder Cy5w) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von Fluorophoren im Subattomol-Bereich.

Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.

Sowohl für die Protein-als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA- Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen und nach der Hybridisierung keine komplizierten Waschschritte notwendig sind.

Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z. B.

Fluorescein, TexasRed@) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher (z. B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt eine Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann.

Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (Nature Biotech. Vol. 19,2001, Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Bei Verwendung von Gold-Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchern. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht

mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist.

Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test- Sites pro cm2 z. B. für sogenannte POC (Point of Care) -Systeme bzw. für high throughput screening-HTS-Systeme) hoch.

Darstellung der Erfindung Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Ligat- Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 23 gelöst.

Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt : Genetik DNA Desoxyribonukleinsäure RNA Ribonukleinsäure PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die-NH- (CH2) 2- N (COCH2-Base)-CH2C0- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.) A Adenin G Guanin C Cytosin T Thymin U Uracil Base A, G, T, C oder U Bp Basenpaar Nukleinsäure wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat"der kovalent verbundenen Pyrimidin-oder Purin- Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat-oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit zur sequenzspezifischen Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA. nt Nukleotid Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer : Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin-oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind). ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer. Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-, PNA-oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge. Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick-Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als"Mismatch"bezeichnet. ss single strand (Einzelstrang) ds double strand (Doppelstrang) Substrat, Cofaktor, Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms). Coenzym Antikörper Komplexbindungspartner eines Antigens. Antigen Komplexbindungspartner eines Antikörpers. Rezeptor Komplexbindungspartner eines Hormons. KA Assoziationskonstante für die Assoziation von Ligat und Ligand.

Substanzen Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions-und Emissionsmaxima sind in der Regel um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift). FP Fluorophor Cy3TM 5, 5'-disulfo-1, 1'di (-carbopentenyl)-3, 3, 3', 3'-tetramethyl- indodicarbocyanin (Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.) Cy5 T""5, 5', 7, 7'-tetrasulfo-1, 1' di (-carbopentenyl)-3, 3, 3', 3'-tetramethyl- benzindodicarbocyanin (Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.) Fluorescein Resorcinphtalein (Fluoreszenzfarbstoff) Rhodamin 6G Basic Red 1 (Fluoreszenzfarbstoff) Texas RedO Fluoreszenzfarbstoff der Firma Molecular Probes, Inc. DABCYL 4-((4-(Dimethylamino) phenyl) azo) benzoesäure Fluoreszenzlöschung strahlungsloser Energietransfer Fluoreszenz-Quenchen Fluoreszenziöschung Quench-Oberfläche leitende (Metall)-Oberfläche, die durch einen Energietransfer Fluoreszenz löschen kann (insbesondere Gold-, Silber-, Kupfer- Oberflächen usw. ) EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz) Ligand Bezeichnung für Moleküle, die von Ligaten spezifisch gebunden werden ; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure-Oligomers) Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs-und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template). Linker molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl-oder Hetero-Alkinyfkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-60, insbesondere der Kettenlänge 5-40, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, einem Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt. Spacer Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-60, insbesondere der Kettenlänge 5-40, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.

Modifizierte Oberflächen/Elektroden Au-S- (CH2) 2-ss-oligo- Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus FP derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3'Ende mit (HO- (CH2) 2-S) 2 zum P-O-(CH2) 2-S-S-(CH2) 2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden- Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor (FP) wie z. B. Cy3w, Cy5w, Texas Red@, Rhodamin 6G, Fluorescein etc. Au-S- 2-ds-oligo-Au-S-(CH2) 2-ss-oligo-FP hybridisiert mit dem zu ss-oligo FP komplementären Otigonukteotid.

Elektrochemie E Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt. gEss geometrisches Änderungspotential der oberflächengebundenen einsträngigen Sonde : Potential, bei dessen Durchlauf in positiver

Richtung die einsträngige Sonde eine Änderung von einer mehr gestreckten, in die Lösung hineinragenden Konformation in eine mehr komprimierte, an die Oberfläche gedrückte Form erfährt. (Konformationsänderung von"stehend"zu"liegend") gEds geometrisches Änderungspotential der oberflächengebundenen doppelsträngigen Sonde/Target : Potential, bei dessen Durchlauf in positiver Richtung die doppelsträngige Sonde/Target eine Änderung von einer mehr gestreckten, in die Lösung hineinragenden Konformation in eine mehr komprimierte, an die Oberfläche gedrückte Form erfährt. (Konformationsänderung von"stehend"zu"liegend") Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden.

Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten und vor dem Inkontaktbringen der Targets (Probe) mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors durchgeführt. Die so erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet.

Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich eine Normierungsmessung durchgeführt. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Ligaten modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Unter"im wesentlichen abgetrennten Bereichen"werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Ligat modifiziert sind.

Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Ligat- Arten kommen. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site Too) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T, 00-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich Tioo erhaltenen Wert. Der für den Bereich T100 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von Ligaten modifiziert wurde.

Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von Ligat in einem bestimmten Bereich (Site To) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also der entsprechende Assoziationspartner bzw. Ligand nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit

der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site Tioo) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T100-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich Tioo erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich To erhaltenen Wert. Der für den Bereich To erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der oben geschilderten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieser Ligand in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand weist eine Assoziationskonstante >0 zu einer Art von Ligaten auf, die in einem bestimmten Bereich (Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der Ligaten des Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich To erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werten. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat-Ligand-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligaten der entsprechend Art.

Die Menge an Ligand, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n% ige Assoziation am Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z. B. nach Detektion der Werte für To und Tioo eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen der Ligat und der Ligand ausgestattet sind. Das Verhältnis der Intensitäten von Ligand-Label-Signal zu Ligat-Label-Signal entspricht n%.

Wird eine genügende Anzahl an Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Normierungskurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die

Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Normierungskurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich.

Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Liganden, der nicht in der Probe enthalten ist, insbesondere im Fall der Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren als Liganden und Ligaten keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten.

Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Normierungssites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.

Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht und wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Referenzwerte von dem Kit bereits umfasst, sodass die Fluoreszenz des Fluorophors vom Endverbraucher nur einmal detektiert werden muss. Die bei dieser Detektion erhaltenen Werte brauchen dann nur mit den bereits vorhandenen Referenzwerten verglichen zu werden.

\ Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Kit eine modifizierte Oberfläche, die wenigstens einen Bereich To und wenigstens einen Bereich Tioo aufweist. Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen, wonach die modifizierte Oberfläche zusätzlich wenigstens einen Bereich Tn umfasst.

Die Quench-Oberfläche Mit dem Begriff"Oberfläche"wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Ligaten zu

tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis 50 A Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant (>10% der erwarteten Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird.

Insbesondere sind Gold und Silber als Quench-Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder-Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z. B. Glas, Metall oder Plastik gebunden vorliegen.

Bindung des Ligaten an die Oberfläche Verfahren zur Immobilisierung von Ligat-Molekülen, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäure-Oligomeren oder Antigenen bzw. Antikörpern an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z. B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino-oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Der Ligat kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder-molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann der Ligat durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z. B. durch Verwendung von biotinylierten Ligaten zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Bei Verwendung von Nukleinsäure- Oligomeren als Ligaten kann die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure- Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden.

Dabei wird auch das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder-molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z. B. Hartwich, G. : ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON SEQUENZSPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217).

Bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberflächen ist auf einen besonders wichtigen Punkt zu achten. Grundsätzlich herrschen zur Detektion der

Differenz der Fluoreszenzintensität von hybridisierten Nukleinsäure-Oligomeren und einsträngigen Nukleinsäure-Oligomeren dann besonders günstige Bedingungen, wenn der Fluorophor sich in nur einem der Zustände"hybridisiert"oder"nicht hybridisiert" möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Das Ausmaß des Quench- Vorgangs verändert sich ja bekanntermaßen mit einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstandes zwischen Quench-Oberfläche und Fluorophor. Solche besonders günstigen Bedingungen können nur mit speziellen Anbindungstechniken erreicht werden.

Es muss bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere darauf geachtet werden, dass diese entweder völlig ohne weiteres Co-Adsorbat an die Oberfläche gebunden werden oder, falls ein Co-Adsorbat notwendig erscheint, dass dieses eine möglichst dünne Schicht über der Oberfläche ausbildet. Es muss also entweder eine direkte Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an die Oberfläche erfolgen oder eine Belegung zusammen mit möglichst kurzkettigen Co-Adsorbaten wie z. B. kurzkettigen Thiolen. Bevorzugt werden Co-Adsorbate der Kettenlänge 1 bis 30, besonders bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 20, insbesondere der Kettenlänge 1 bis 10.

Insbesondere nachteilig ist in diesem Zusammenhang eine Anbindung der Nukleinsäure- Oligomere in Form einer Verbindung Oberfläche-Biotin-Avidin-Biotin-Oligomer. Bei einer solchen Anbindung ist der Fluorophor immer durch eine sehr dicke Schicht aus Biotin- Avidin-Biotin von der Oberfläche abgeschirmt, was mit entsprechenden Nachteilen in der Detektion der Fluoreszenz einhergeht.

Liganden (Targets) Als Liganden werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit dem an einer Oberfläche immobilisierten Ligaten (Sonde) unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken.

Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers).

Fluorophore Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Texas Red@, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z. B. Cl3, Cy5TM, Fluorescein etc (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet.

Fluoreszenzlöschung Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenziöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zu einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstands).

Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 A messbar. Im Bereich größer als ca. 200 A führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen Fig. 1 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen ; Fig. 2 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch E-Feld unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen ; Fig. 3 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch"Immobilisierte-lon"-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen.

Bezugszeichenliste 102 : Fluorophor 201 : einsträngige Oligomer-Sonde 202 : Sonde hybridisiert mit Target 203 : Oberfläche (z. B. Gold) 204 : Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierung 205 : Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierung 301 : Vorrichtung zum Anlegen eines elektrischen Feldes 401 : an der Oberfläche immobilisierte ionische Gruppen (Anionen) 402 : an der Oberfläche immobilisierte ionische Gruppen (Kationen) Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench- Oberflächen. Gemäß Figur 1A liegt vor der Hybridisierung das einsträngige Sonden- Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 1A). Gemäß Figur 1B liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 vor der Hybridisierung in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 1 B).

Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch E-Feld unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen. Durch ein an die modifizierte Oberfläche angelegtes elektrisches Potential wird am Ort des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers 201 ein elektrisches Feld erzeugt. In Figur 2A ist der Fall dargestellt, dass das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 aufgrund des elektrischen Feldes in einer gestreckten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 2A). Figur 2B zeigt den Fall, dass aufgrund des elektrischen Feldes das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer komprimierten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer- Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 2B).

Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch"Immobilisierte-lon"-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen. Gemäß Figur 3A liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 aufgrund der abstoßenden Wechselwirkung zwischen der negativ geladenen Sonde und den immobilisierten Anionen 401 in einer gestreckten Form vor. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 3A). Figur 3B zeigt den Fall, dass aufgrund der anziehenden Wirkung zwischen der negativ geladenen Sonde und den immobilisierten Kationen 402 das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer komprimierten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer- Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 3B).

Wege zur Ausführung der Erfindung Im folgenden werden zwei besonders bevorzugte Alternativen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen am Beispiel der Nukleinsäure-Hybridisierung (Ligat : Sonden-Oligonukleotid ; Ligand : zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres DNA-Teilstück) beschrieben. Diese Verfahrensalternativen sind für den Fachmann ohne weiteres auf die Detektion anderer <BR> Ligat/Liganden-Assoziate, wie sie im Abschnitt"Liganden (Targets) "erwähnt wurden, zu übertragen.

Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybriden durch Modulation des Fluoreszenz-Quenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z. B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder-moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure- Oligomere (z. B. DNA-, RNA-oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 5 bis 60, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 50, insbesondere bevorzugt der Länge 12 bis 40 verwendet.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Target-Oligonukleotide auch eine größere Anzahl an Basen umfassen können, also länger sein können, als die Sonden-Oligonukleotide. In diesem Fall wird unter dem Ausdruck"zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres Nukleinsäure-Oligomer"ein Nukleinsäure-Oligomer verstanden, das eine Basensequenz aufweist, die in einem Teilbereich zu dem Sonden-Oligonukleotid komplementär ist.

Der/die restlichen Abschnitte des Nukleinsäure-Oligomers ragen dann an dem/den Enden des Sonden-Oligonukleotids über dessen Basenkette hinaus.

An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z. B. mit einem Fluoreszenz- Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bestimmt.

Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target- Oligonukleotid (en) zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben.

Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target- Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.

Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird in einer zweiten Fluoreszenzmessung die Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt.

Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten bereichen komplementären) Target- Oligonukleotide.

In einer Alternative kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z. B. durch vorausgegangene Messungen etc. ) hinlänglich genau bekannt ist.

Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z. B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden.

Durch eine gezielte Beeinflussung der Stärke des elektrischen Feldes, in dessen Bereich sich die Fluorophor-modifizierten Sonden-Oligonukleotide befinden, lassen sich für das

einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer zwei verschiedene räumliche Anordnungen realisieren : a) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (hohe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Verringerung des Abstands zu einer Vermehrung des Quenchen kommt und eine geringere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 1A). b) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität).

Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Vergrößerung des Abstands 205 zu einer Verringerung des Quenchens kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 1 B).

Die beiden oben dargestellten geometrischen Anordnungen können durch die Wahl geeigneter Bedingungen erreicht werden, nämlich durch Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes oder durch an der modifizierten Oberfläche immobilisierte lonen : Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes Durch das Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes lassen sich verschiedene geometrische Anordnungen realisieren. Dabei können prinzipiell drei Potential-Bereiche unterschieden werden, deren genaue Lage von den gewählten Messbedingungen (z. B.

Ionenstärke, Kettenlänge) abhängt. Bei negativen bis hin zu leicht positiven Potentialen (E < 0,2 V gegen Silberdraht) liegen sowohl einzel-als auch doppelsträngige Oligomere aufgrund der Abstoßung des negativ geladenen DNA-Rückgrats in einer eher gestreckten

Konformation vor (siehe Figur 2A). Durch die Hybridisierung wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.

In einem Zwischenbereich bei leicht positiven Potentialen (0,2 V < E < 0,4 V gegen Silberdraht) liegen einsträngige Oligomere wegen der größeren Beweglichkeit in einer eher komprimierten Form vor. Doppelsträngige Oligomere sind in diesem Bereich aufgrund der starren helikalen Struktur eher senkrecht zur Oberfläche ausgerichtet (siehe Figur 2B). Durch die Hybridisierung wird eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.

Bei stärker positiven Potentialen (E > 0,4 V gegen Silberdraht) werden auch die doppelsträngige Oligomere näher an die Oberfläche gezogen. Daher ergibt sich durch die Hybridisierung nur eine geringe Änderung der Fluoreszenzintensität. Das Potential, bei dem der Einzelstrang eine Änderung von"stehend"nach"liegend"erfährt (ca. 0,2 V) wird als geometrisches Änderungspotential des Einzelstrangs 9Ess definiert. Das Potential bei dem der Doppelstrang eine Änderung von"stehend"nach"liegend"erfährt (ca. 0,4 V) wird als geometrisches Änderungspotential des Doppelstrangs 9Eds definiert.

Das Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes wird in der Regel durch das Anlegen eines Potentials an die modifizierte Oberfläche erfolgen. Von der vorliegenden Erfindung sind aber auch Ausführungsformen umfasst, gemäß denen z. B. durch Einbringen der modifizierten Oberfläche in einen Kondensator am Ort der modifizierten Ligaten ein elektrisches Feld erzeugt wird.

An der modifizierten Oberfläche immobilisierte Ionen Durch Immobilisierung von lonen an der modifizierten Oberfläche lassen sich verschiedene geometrische Anordnungen realisieren. Dabei können prinzipiell zwei Zustände unterschieden werden. An der Oberfläche immobilisierte Anionen 401 (z. B. über entsprechende bifunktionale Moleküle mit Carbonsäure oder Sulfonsäure-Funktionen, die in einem bestimmten pH-Bereich als oberflächengebundene Anionen vorliegen) führen wegen der Abstoßung des negativ geladenen Phosphatrückgrats zu einer gestreckten Konformation des Einzelstrangs 201. Aufgrund der größeren Beweglichkeit wird die einsträngige Sonde stärker gestreckt als die doppelsträngige Sonde/Target (siehe Figur 3A). Durch die Hybridisierung wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.

An der Oberfläche immobilisierte Kationen 402 (z. B. über entsprechende bifunktionale Moleküle mit Amin-oder Ammonium-Funktionen, die in einem bestimmten pH-Bereich als oberflächengebundene Kationen vorliegen) führen wegen der Anziehung des negativ geladenen Phosphatrückgrats zu einer eher komprimierten Konformation des Einzelstrangs 201. Aufgrund der geringeren Beweglichkeit wird die doppelsträngige Sonde/Target weniger komprimiert als die einsträngige Sonde (siehe Figur 3B). Durch die Hybridisierung wird eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.

Ausführungsformen E-Feld-unterstützte Modulation der Fluoreszenziöschung durch Hybridisierung Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z. B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'-oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z. B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient.

Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z. B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z. B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z. B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl.

Beispiel 1). Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird (i) in Puffer (z. B. 10-500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die-gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche angebunden oder (ii) in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers in Puffer (z. B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1 mM EDTA, 0,1-1 M NaCI) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden- Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker an die-

gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend monofunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder (iii) in Puffer (z. B. 10-350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die-gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche angebunden. Anschließend wird die so modifizierte Oberfläche mit dem entsprechenden monofunktionalen Linker in Lösung (z. B.

Alkanthiole oder w-Hydroxy-Alkanthiole in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol-modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der monofunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die-gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt"Bindung des Ligaten an die Oberfläche").

Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z. B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner in Gegenwart eines angelegten elektrischen Feldes. Bei Potentialen E kleiner als das geometrische Änderungspotential des Einzelstrangs gEss (E < 9Ess) wird durch die Hybridisierung eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet. Bei Potentialen E im Bereich zwischen dem geometrischen Änderungspotential des Einzelstrangs gEs, und dem geometrischen Änderungspotential des Doppelstrangs 9Eds (9Ess < E < 9Eds) wird durch die Hybridisierung eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet. Die Lage der Potentiale 9Ess und gelds ist abhängig von den gewählten Bedingungen. Bei 100 mM Chlorid liegt das Potential gEss bei ca. 0,2 V (gegen Silberdraht als Referenzelektrode) und das Potential gelds bei ca. 0,4 V (gegen Silberdraht als Referenzelektrode).

Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors in Gegenwart des angelegten elektrischen Feldes wiederholt.

Der Unterschied im Messsignal (Ab-bzw. Zunahme, ja nach Messverfahren, vgl. Fig. 2) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden- Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target-Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung.

"Immobilisierte-lon"unterstützte Modulation der Fluoreszenziöschung durch Hybridisierung Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z. B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'-oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z. B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient.

Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z. B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäure- funktionen (z. B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z. B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1). Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird (i) in Gegenwart eines bifunktionalen Linkers zur Erzeugung von immobilisierten lonen (z. B. to-Carboxy-, Amin-oder Sulfonsäure-Alkanthiole) in Puffer (z. B.

100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA, 0,1-1 M NaCI) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden- Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem bifunktionalen Linker an die- gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend bifunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder (ii) in Puffer (z. B. 10-350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die-gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche angebunden und anschließend wird die so

modifizierte Oberfläche zur Erzeugung von immobilisierten lonen mit dem entsprechenden bifunktionalem Linker in Lösung (z. B. w-Carboxy-, Amin-oder Sulfonsäure-Alkanthiole in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol- modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der monofunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die-gegebenenfalls entsprechend derivatisierte-Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt"Bindung des Ligaten an die Oberfläche").

Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z. B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner. Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors wiederholt.

Der Unterschied im Messsignal (Ab-bzw. Zunahme, ja nach Messverfahren, vgl. Fig. 3) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden- Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target-Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung.

Die oben beschriebenen Ausführungsformen können für eine Targetart (z. B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder- bei Verwendung jeweils verschiedener Sonden-Arten für jedes Test-Site-für mehrere Target-Arten (gleiche Ligandengruppen wie z. B. mehrere verschiedene Target- Oligonukleotid-Arten oder verschiedene Antikörper-Arten, Antigen-Arten etc., aber auch Mischungen davon) angewendet werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Darstellung der aminomodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat-bzw. Sondenoligonukleotide Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909 ; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1. 0 umol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT- Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.

Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel : 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechend aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.

Beispiel 2 Darstellung der fluorophormodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat-bzw. Sondenoligonukleotide Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909 ; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 Eumol Synthese. Bei den Synthesen mit dem

1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim letzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Glen Research 10-1037) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen- Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.

Beispiel 3 Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S (CH2) 2-ss-oligo-FP Die Quench-Oberfläche (hier : Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3'Endes ist mit (HO-(CH2) 2-S) 2 zum P-O-(CH2) 2- S-S- (CH2) 2-OH verestert ; Modifikation 2 : an das 5'Ende ist der Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10-5 bis 10-1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) 0,5-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-0- (CH2) 2-S-S- (CH2) 2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.

Beispiel 4 Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S (CH2) 2-ss-oligo-FP Die alternative Herstellung von Au-S (CH2) 2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).

Die Quench-Oberfläche (hier : Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3'Endes ist mit (HO-(CH2) 2-S) 2 zum P-0- (CH2) 2- S-S- (CH2) 2-OH verestert ; Modifikation 2 : an das 5'Ende ist der Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-0- (CH2) 2-S-S- (CH2) 2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.

Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10~1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5) komplett benetzt und 0,5-24 h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ zu Propanthiol kann auch ein anderes Thiol oder Disulfid geeigneter Kettenlänge verwendet werden.

Beispiel 5 Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S (CH2) 2-ss-oligo-FP Die alternative Herstellung von Au-S (CH2) 2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid

(Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).

Die Quench-Oberfläche (hier : Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3'Endes ist mit (HO- (CH2) 2-S) 2 zum P-O-(CH2) 2- S-S- (CH2) 2-OH verestert ; Modifikation 2 : an das 5'Ende ist Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2) 2-S-S-(CH2) 2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.

Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10-1 molaren Lösung von z. B. Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure oder Cysteamin (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5 oder in Ethanol) komplett benetzt und 0,5-24h inkubiert.

Das freie Thiol (Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure, Cysteamin) belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ können auch andere funktionale Thiole oder Disulfide geeigneter Kettenlänge mit den gleichen oder anderen funktionellen Gruppen verwendet werden.

Beispiel 6 Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von flüssigen Medien Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Bsp. 4 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 umol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HPO4/KH2P04 500 mM, pH 7, Nachbelegung mit Propanthiol 1mM in Wasser) und in der Form Au-S (CH2) 2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der

Fluoreszenz wird ein Potential von 0,3 V gegen Silberdraht angelegt. In Gegenwart von flüssigen Medien (100 mmol Chlorid) werden 150 ul des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.

Beispiel 7 Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von oberflächenimmobilisierten Anionen und flüssigen Medien Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Bsp. 5 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50, umol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HPO4/KH2P04 500 mM, pH 7 und anschließender Nachbelegung mit einer ca. 10-5 bis 10-'molaren Lösung von z. B. Mercaptopropionsäure, die die verbleibende freie Gold- Oberfläche belegt) und in der Form Au-S (CH2) 2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 ul des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.