Stand der Technik Fluoreszierende Proteine sind hervorragende Marker für die Genexpression und die Proteinlokalisation in verschiedenen biologischen Systemen (Kendall et al.

(1998), Trends Biotechnol. 16,216-224). Seit der Veröffentlichung des grün- fluoreszierenden Proteins (GFP = green fluorescent protein) aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria (Prasher et al. (1992) Gene 111,229- 233) wurden zahlreiche Versuche unternommen, dieses Protein vorteilhaft zu verändern. So konnte beispielsweise die Löslichkeit des Proteins und seine Darstellbarkeit bei der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS = fluorescence activated cell sorting) verbessert werden (Cormack et al. (1996), Gene 173,33- 38). Es wurden ferner verschiedene Farbmutanten des GFP erzeugt oder isoliert, die beispielsweise gelb, blau oder rot fluoreszieren (z. B. Sawano et al. (2000) NAR 28 (16), E 78 ; Yang et al. (1998), J. Biol. Chem. 273 (14), 8212 ; Heim et al. (1996), Curr. Biol. 6 (2), 178-182 ; Lewis et al. (1999) Anal. Chem. 71 (19), 4321 ; Patterson et al. (2001), J. Cell. Sci. 114,837-838 ; Matz et al. (1999), Nature Biotechnol. 17,969-973). Darüber hinaus wurden zahlreiche Versuche unternommen, bei dem GFP aus Aequorea durch Mutation eine hellere Fluoreszenz zu erzeugen (Sacchetti (2001) FEBS 492 (1-2), 151 ; Battistutta (2000), Proteins 41 (4), 429 ; Ito (1999) Biochem. Biophys. Res. Com. 264 (2), 556 ; Kim et al. (1998) Brain Res. Bull. 47 (1), 35 ; US 5,491, 084 bzw. Nature Biotechnol.

(1996) 14,315-319). Diese zahlreichen Anstrengungen zur Veränderung und Verbesserung der bekannten fluoreszierenden Proteine zeigen, dass ein großer Bedarf an, solchen autofluoreszenten Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften besteht. Einen Überblick über die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten fluoreszierender Proteine gibt der Artikel von van Roessel et al. (Nature Cell Biology (2002) Vol. 4, E 15-E 20).

Darüber hinaus wurden verstärkt neue fluoreszierende Proteine aus natürlichen Quellen, wie beispielsweise Anthozoen (Korallen), isoliert und charakterisiert (z. B.

Matz et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17,969-973 ; Fradkov et al. (2000), FEBS Letters 479,127-130). Eine solche Isolierung von neuen Proteinen aus natürlichen Quellen und deren anschließende Klonierung ist aber sehr aufwendig und kostenintensiv.

Die WO 99/49019 A2 offenbart beispielsweise grün-fluoreszierende Proteine aus Anthozoen der Gattungen Renilla und Ptilosarcus, sowie die isolierten Nukleinsäuren, die für diese Proteine kodieren.

Die WO 00/46233 A1 offenbart ferner ein fluoreszierendes Protein aus Krallen, sowie die hierfür kodierenden Gene und mögliche Anwendungen für die Proteine.

Die WO 01/32688 A1 offenbart die Aminosäuresequenzen von grün- fluoreszierenden Proteinen aus Renilla renformis (Anthozoa, Coelenterata), sowie die hieraus abgeleiteten Nukleotid-Sequenzen der Nukleinsäuren und eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten.

Die WO 01/34824 A2 zeigt einen Sequenzvergleich ("alignment") verschiedener fluoreszierender Proteine aus Aequorea victoria, Ptilosarcus gumeyi und Renilla mulleri. Dieser Sequenzvergleich dient der Feststellung von Homologien der Proteine, d. h. der Ermittlung der relativen Ähnlichkeiten zwischen diesen Proteinen, und führt nicht zur Herstellung neuer fluoreszierender Proteine.

Die Bestrebungen ständig neue autofluoreszente Proteine aus immer neuen Quellen zu isolieren zeigen, dass ein sehr großer Bedarf an neuen fluoreszierenden Proteinen mit vorteilhaften Eigenschaften besteht.

Zusammenfassung der Erfindung Es ist daher Aufgabe der Erfindung, neue fluoreszierende Proteine bereitzustellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein fluoreszierendes Protein gelöst, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1,15, 17,19 und 21 zumindest 80 % Homologie aufweist. Es werden also neue autofluoreszente Proteine bereitgestellt, die aufgrund ihrer Fluoreszenz in Zellen nachweisbar sind und daher als Marker für die Genexpression und die Proteinlokalisation beispielsweise in der Zell-, Entwicklungs-und Molekularbiologie verwendet werden können. Dabei weisen die erfindungsgemäßen Proteine auch teilweise neue Eigenschaften auf, wie beispielsweise die Regenerierbarkeit der Fluoreszenz nach deren Ausbleichen mittels Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlänge.

Als fluoreszierende Proteine im Sinne der Erfindung sind dabei auch Fusionsproteine und Multimere zu verstehen, die zumindest ein erfindungsgemäßes fluoreszierendes Protein enthalten. Dies gilt besonders für Fusionsproteine, da die erfindungsgemäßen Proteine unter anderem als Expressionsmarker verwendet werden können und sich somit eine Fusion mit weiteren Proteinen anbietet.

Im Sinne der Erfindung ist unter dem Begriff Homologie der Grad der Übereinstimmung von zwei Proteinsequenzen, d. h. die Anzahl der in den Proteinen übereinstimmenden Aminosäure-Positionen in Prozent, zu verstehen.

Dabei können in eine oder beide Proteinsequenzen eine oder mehrere Lücken eingefügt werden, damit die höchstmögliche Anzahl identischer Aminosäuren in Bezug auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind. Zur Bestimmung der Homologie kann aber beispielsweise auch ein herkömmliches Datenverarbeitungsprogramm verwendet werden.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung weist das erfindungsgemäße fluoreszierende Protein mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1,15, 17,19 und 21 zumindest 90 % Homologie auf.

Durch gezielte oder ungerichtete Mutation lassen sich die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Proteins vorteilhaft beeinflussen. Dabei hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, dass bezogen auf die Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 1 die Aminosäure an Position 2 Valin oder Glutaminsäure ist, die Aminosäure an Position 3 Alanin oder Leucin, die Aminosäure an Position 4 Lysin oder Cystein, die Aminosäure an Position 6 Lysin oder Valin oder Glutaminsäure, die Aminosäure an Position 7 Asparagin oder Alanin, die Aminosäure an Position 10 Lysin oder Threonin, die Aminosäure an Position 44 Threonin oder Alanin, die Aminosäure an Position 98 Isoleucin oder Phenylalanin, die Aminosäure an Position 108 Isoleucin oder Alanin, die Aminosäure an Position 125 Leucin oder Phenylalanin, die Aminosäure an Position 128 Valin oder Alanin, die Aminosäure an Position 150 Lysin oder Glutaminsäure, die Aminosäure an Position 174 Tyrosin oder Histidin, die Aminosäure an Position 183 Lysin oder Glutaminsäure, die Aminosäure an Position 213 Valin oder Alanin, die Aminosäure an Position 223 Glycin oder Lysin, die Aminosäure an Position 224 Valin oder Isoleucin oder Serin, die Aminosäure an Position 225 Alanin oder Arginin oder Tryptophan, die Aminosäure an Position 226 Leucin oder Glycin oder Serin, die Aminosäure an Position 227 Prolin oder Threonin und/oder die Aminosäure an Position 228 Lysin oder Serin ist. Das Vorliegen dieser Aminosäuren an den jeweiligen Positionen wirkt sich beispielsweise vorteilhaft auf die Expression, Stabilität, Löslichkeit und Fluoreszenzintensität der erfindungsgemäßen Proteine aus.

Einige der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine weisen die vorteilhafte und überraschende Eigenschaft auf, dass die Fluoreszenz bei der Bestrahlung mit Licht für die Fluoreszenz geeigneter Wellenlänge nach kurzer Zeit abklingt und durch eine folgende Bestrahlung mit Licht anderer Wellenlänge wieder regenerierbar ist. Dabei kann die Bestrahlung zur Anregung der Fluoreszenz mit Licht einer Wellenlänge zwischen 375 und 580 nm und die Bestrahlung zur Regeneration der Fluoreszenz mit Licht kürzerer Wellenlänge, insbesondere einer Wellenlänge zwischen 320 und 400 nm, erfolgen. Erfindungsgemäß kann dieses fluoreszierende Protein in vorteilhafter Weise beispielsweise zum Nachweis von zeitabhängigen zellulären Prozessen, wie Proteindiffusion oder-transport, oder zur optischen Informationsspeicherung verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die für ein fluoreszierendes Protein kodiert, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) einer isolierten oder künstlichen Nukleotidsequenz, welche für das erfindungsgemäße fluoreszierende Protein kodiert, b) einer Nukleotidsequenz gemäß Seq ID Nrn. 2,16, 18,20 oder 22, oder c) einer Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet, d. h bei der zumindest eine stille Mutation vorliegt.

Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor zur Expression eines fluoreszierenden Proteins in einer geeigneten Zelle, wobei dieser das zuvor beschriebene Nukleinsäuremolekül in exprimierbarer Form enthält.

Die Erfindung betrifft auch Zellen, welche das erfindungsgemäße Protein, das genannte Nukleinsäuremolekül und/oder den genannten Vektor enthalten, sowie einen Kit, der das erfindungsgemäße Protein, das beschriebene Nukleinsäuremolekül, den beschriebenen Vektor und/oder zumindest eine der genannten Zellen enthalten.

Es ist ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, welche das erfindungsgemäße Protein, das genannte Nukleinsäuremolekül und/oder den genannten Vektor, sowie vorzugsweise übliche Hilfs-und/oder Trägerstoffe, enthält.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteins. Bei diesem Verfahren werden die Aminosäuresequenzen von zumindest drei bekannten autofluoreszenten Proteinen dadurch verglichen, dass diese zunächst auf eine Weise nebeneinander angeordnet werden, dass sich gegebenenfalls unter Einführung von Lücken eine Übereinstimmung der Positionen von invarianten Aminosäuren oder ähnlichen Bereichen für alle Proteine ergibt. Dabei können die Aminosäuresequenzen beispielsweise derart zueinander ausgerichtet werden, dass die höchstmögliche Anzahl identischer Aminosäuren in Bezug auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind, wobei dies vorzugsweise unter Beibehaltung der jeweiligen Reihenfolge der Aminosäuren erfolgt. Ähnliche Bereiche sind hierbei alle Sequenzabschnitte, vorzugsweise ein Abschnitt von zumindest drei aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die eine im wesentlichen identische Primärstruktur aufweisen oder im gefalteten Protein eine Domäne bilden, deren Funktion bereits bekannt ist. Die ähnlichen Bereiche können bei unterschiedlichen Proteinen auch an unterschiedlichen Positionen liegen. In diesem Fall kann der Abgleich der ähnlichen Bereiche beispielsweise durch Einfügen von Lücken oder das Verschieben dieser Bereiche in der Sequenz erfolgen.

Mit Hilfe dieses Abgleichs der jeweiligen Positionen der ausgewählten Aminosäuresequenzen wird eine Durchschnitts-Sequenz über zumindest einen wesentlichen Teil der gesamten Länge der Aminosäuresequenz ermittelt. Dabei wird für jede gegebene Position diejenige Aminosäure ausgewählt, die in den zugrundeliegenden Aminosäuresequenzen an dieser Position am häufigsten auftritt, wobei eine Lücke wie eine Aminosäure behandelt wird. Hieraus ergibt sich eine Folge von Aminosäuren und Lücken mit dazwischen liegenden Positionen, an denen keine Aminosäure am häufigsten auftritt bzw. an denen zwei oder mehr Aminosäuren mit der gleichen Häufigkeit auftreten. An diesen Stellen muss nun eine Aminosäure nach zuvor festgelegten, sinnvollen, reproduzierbaren und allgemein gültigen Kriterien ausgewählt werden. Hierzu stellt das erfindungsgemäße Verfahren mehrere Möglichkeiten zur Verfügung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Aminosäure an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass zunächst vor dem Vergleich der Aminosäuresequenzen eine Rangfolge der zugrundeliegenden Proteine festgelegt wird, d. h. den einzelnen Proteinen werden Rangnummern von 1 bis n zugeordnet.

Ist an einer Position die häufigste Aminosäure nicht eindeutig feststellbar, so wird diejenige Aminosäure eingesetzt, die unter den häufigsten Aminosäuren zu der Proteinsequenz gehört, die die niedrigste Rangnummer besitzt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Aminosäure an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass die Aminosäuren aufgrund funktioneller und/oder struktureller Kriterien in Gruppen eingeteilt werden und bei mehreren Aminosäuren mit gleicher Häufigkeit eine Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt wird, die an der jeweiligen Position am häufigsten auftritt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Aminosäure an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass bei mehreren Aminosäuren mit gleicher Häufigkeit die Aminosäure aufgrund funktioneller und/oder struktureller Kriterien unter Berücksichtigung der Eigenschaften der bekannten Proteine ausgewählt wird.

Dabei kann beim Erstellen der Durchschnitts-Sequenz die Auswahl einer Aminosäure bei mehreren Aminosäuren mit gleicher Häufigkeit innerhalb einer Aminosäuresequenz auch aufgrund unterschiedlicher Kriterien erfolgen, d. h. die zuvor genannten Ausführungsformen können in vorteilhafter Weise miteinander kombiniert werden. Ferner können funktionelle und strukturelle Kriterien oder sonstige Kenntnisse über die bekannten Proteine auch die genannte Festlegung der Rangfolge der Aminosäure-Sequenzen vor deren Vergleich bedingen oder zumindest beeinflussen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht überraschender Weise die Herstellung neuer fluoreszierender Proteine, die sich in einem geigneten System exprimieren lassen. Die zuvor beschriebenen Verfahrensschritte führen zu einer vollständigen, künstlichen Aminosäuresequenz, die ein Protein repräsentiert, welches Autofluoreszenz zeigt und in einem geeigneten System exprimierbar ist.

Zur Expression des Proteins und zum Nachweis der Fluoreszenz wird zunächst eine künstliche Nukleinsäure-Sequenz, die für die ermittelte Durchschnitts- Sequenz kodiert, erstellt und zumindest ein entsprechendes Nukleinsäure-Molekül synthetisiert. Dieses Nukleinsäure-Molekül wird mit einem geeigneten Promotor verbunden und das Protein dann in einem geeigneten System exprimiert. Das erfindungsgemäße Verfahren führt also zu einem neuen, vollständig funktionsfähigen fluoreszierenden Protein. Das Verfahren kann dabei einfach und ohne grossen apparativen Aufwand durchgeführt werden. Ferner wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht lediglich ein bekanntes Protein verändert, sondern dieses geht vielmehr von mehreren bekannten Proteinen aus, so dass die positiven Eigenschaften der verschiedenen Proteine in dem neuen Protein vereint werden können. Auf diese Weise können neue fluoreszierende Proteine hergestellt werden, ohne dass bisher unbekannte natürliche Proteine mit viel Aufwand isoliert und kloniert werden müssen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei die Durchschnitts-Sequenz vor dem Erstellen der künstlichen Nukleinsäure-Sequenz am N-Terminus und/oder C- Terminus durch Austausch zumindest einer Aminosäure modifiziert. Zum Erreichen einer optimalen Kozak-Region im Bereich des Start-Codons kann beispielsweise nach der Startaminosäure Methionin die zusätzliche Aminosäure Valin eingeführt werden. Am C-Terminus kann ferner beispielsweise die zusätzliche hydrophile Aminosäure Serin angefügt werden, um die Löslichkeit des Proteins zu verbessern.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass anschließend, d. h. nach Erstellung und Expression der Durchschnitts-Sequenz, in dem künstlichen Nukleinsäure-Molekül zumindest ein Codon ausgetauscht und/oder durch Mutagenese verändert wird und hierdurch zumindest eine Aminosäure der Durchschnitts-Sequenz ausgetauscht wird. Durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren können bestimmte Eigenschaften des künstlichen Proteins, wie beispielsweise Stabilität, Löslichkeit, Kompatibilität oder Funktionalität, in vorteilhafter Weise verändert werden. Dabei kann insbesondere die Fluoreszenz, d. h. die gemeinsame Funktion der ursprünglichen bekannten Proteine, gezielt beeinflusst bzw. verbessert werden.

Erfindungsgemäß konnten andere Mutanten des fluoreszierenden Durchschnitts- Proteins (Durchschnitts-FP) generiert werden, die in Bezug auf die Löslichkeit in der Zelle und die Helligkeit der Fluoreszenz deutlich verbessert sind. Dabei betragen die Abweichungen der Mutantenklone vom Durchschnitts-FP in Bezug auf die Aminosäure-Sequenz maximal 10%, d. h. die Homologie der erfindungsgemäßen Proteine untereinander beträgt mindestens 90%.

In weiterer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Protein nach der Expression isoliert und/oder aufgereinigt wird, damit es der weiteren Verwendung in geeigneter Form zugeführt werden kann.

Kurze Beschreibung der Abbildungen Die Erfindung wird im weiteren anhand der Figuren beispielhaft näher erläutert.

Figur 1 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von 9 fluoreszierenden Proteinen (FPs), bei dem die Sequenzen derart untereinander angeordnet sind, dass sich unter Einführung von Lücken eine optimale Übereinstimmung von invarianten Aminosäuren oder ähnlichen Bereichen für alle Proteine ergibt. Dabei wurden den einzelnen FPs jeweils Rangnummern zugeordnet : Rangnummer 1 : Aequorea victoria GFP (Gene (1992) 111,229) Rangnummer 2 : Zoanthus sp. zFP506 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 3 : Zoanthus sp. zFP538 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 4 : Discosoma striata dsFP483 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 5 : Discosoma sp. "red"dsFP583 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 6 : Anemonia majano amFP486 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 7 : Clavularia sp. cFP484 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969) Rangnummer 8 : Renilla mulleri GFP (WO 99/49019) Rangnummer 9 : Ptilosarcus gurneyi GFP (WO 99/49019) Hieraus wurde die Durchschnitts-Sequenz bzw. durch das Einfügen zusätzlicher Modifikationen das Durchschnitts-FP gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt. a) Aminosäure-Positionen 1 bis 53 b) Aminosäure-Positionen 54 bis 109 c) Aminosäure-Positionen 110 bis 164 d) Aminosäure-Positionen 165 bis 222 e) Aminosäure-Positionen 223 bis 234 Die Nummerierung der Positionen bezieht sich hier auf die ermittelte Durchschnitts-Sequenz. An den Stellen, an denen in der Durchschnitts-Sequenz eine Lücke vorliegt, werden die Positionen nicht fortlaufend nummeriert, sondern mit den Zusätzen"b"bzw."c"versehen. Ausnahmen hiervon bilden lediglich die Positionen 1 b und 226b, an denen im Durchschnitts-FP gegenüber der ermittelten Durchschnitts-Sequenz zusätzliche Aminosäuren eingefügt sind.

Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus der Plasmide, die zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens und zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine in Escherichia coli und Säugetierzellen verwendet werden. Figur 3 zeigt fluoreszenzmikroskopische Bilder von NlH3T3-Zellen, die mit Expressionsplasmiden für verschiedene Mutageneseprodukte der erfindungsgemäßen Proteine transfiziert wurden. A : 9 Stunden nach Transfektion, B : 24 Stunden nach Transfektion.

Figur 4 zeigt fluoreszenzmikroskopische Bilder von NlH3T3-Zellen (Fluoreszein- Filtersatz) nach Transfektion mit einem Expressionsplasmid für ein Mutageneseprodukt eines erfindungsgemäß hergestellten Proteins (p2A9-c15m3).

A : Aufnahme 6 Stunden nach Transfektion bei Bestrahlung mit Fluoreszein- Anregungsfilter, B : Aufnahme nach 10 Sekunden Bestrahlung mit Fluoreszein- Anregungsfilter, C : Aufnahme nach 2 Sekunden Bestrahlung mit DAPI- Anregungsfilter zur Regeneration und anschließender Bestrahlung mit Fluoreszein-Anregungsfilter.

Figur 5 zeigt fluoreszenzmikroskopische Bilder von Escherichia coli-Zellen (DH5), die mit je 7,1 ig eines Plasmids ohne fluoreszierendes Protein (pMCS5, Negativkontrolle ; A) und eines Expressionplasmids (pExpAcFP ; B), welches das Gen für das Durchschnitts-FP enthält, transformiert wurden. Von einer ÜN-Kultur der transformierten Zellen wurden jeweils 2 mi pelletiert, der Überstand dekantiert, das Pellet mit dem letzten Tropfen resuspendiert und von dieser Suspension jeweils 10 pl auf einen Objektträger mit Deckgläschen gegeben.

Beschreibung der Erfindung Das nachfolgende Beispiel dient der näheren Erläuterung der Erfindung, ohne diese jedoch auf die beispielhaft offenbarten Stoffe und Verfahren zu beschränken.

Beispiel : Herstellung des künstlichen autofluoreszenten Proteins Für die Herstellung des künstlichen autofluoreszenten Proteins nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden die Aminosäuresequenzen der folgenden natürlich vorkommenden Proteine, die als gemeinsame Funktion Autofluoreszenz aufweisen, unter Festlegung einer Rangfolge zugrundegelegt : Rangnummer 1 : Aequorea victoria GFP Rangnummer 2 : Zoanthus sp. zFP506 Rangnummer 3 : Zoanthus sp. zFP538 Rangnummer 4 : Discosoma striata dsFP483 Rangnummer 5 : Discosoma sp."red"dsFP583 Rangnummer 6 : Anemonia majano amFP486 Rangnummer 7 : Clavularia sp. cFP484 Rangnummer 8 : Renilla mulleri GFP Rangnummer 9 : Ptilosarcus gurneyi GFP Die Anordnung der Aminosäuresequenzen erfolgte zunächst in Form eines "alignments", bei dem unter Einführung von Lücken eine Übereinstimmung der Positionen von invarianten Aminosäuren für alle Proteine erzielt wurde, wobei die Aminosäuresequenzen derart zueinander ausgerichtet wurden, dass unter Beibehaltung der jeweiligen Reihenfolge der Aminosäuren die höchstmögliche Anzahl identischer Aminosäuren in Bezug auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind (vgl. Matz et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17,969-973). Die Aminosäuresequenzen von Renilla mulleri GFP und Ptilosarcus gumeyi GFP wurden dann hierzu ergänzend unter Berücksichtigung offensichtlich invarianter Aminosäuren angefügt (siehe Figur 1 a-e). Die sich aus dieser Anordnung ergebende Folge der jeweils eindeutig häufigsten Aminosäuren wurde an den übrigen Positionen durch diejeinige der häufigsten Aminosäuren ergänzt, die an dieser Position die höchste Rangnummer besitzt. Die daraus resultierende Durchschnitts-Sequenz wurde daraufhin sowohl am N-Terminus als auch am C- Terminus modifiziert. Zum Erreichen einer optimalen Kozak-Region im Bereich des Start-Codons wurde nach der Startaminosäure Methionin die zusätzliche Aminosäure Valin eingeführt. Am C-Terminus wurde die zusätzliche hydrophile Aminosäure Serin angefügt, um die Löslichkeit des Proteins nicht durch einen hydrophoben C-Terminus zu erschweren. Für diese Proteinsequenz (Seq ID No. 1) wurde nun eine kodierende DNA-Sequenz (Seq ID No. 2) unter Berücksichtigung der Codons entworfen, die in Säugetierzellen besonders häufig auftreten. Für die Klonierung des gewünschten FP-Gens (FP = Fluoreszierendes Protein) in das Expressionsplasmid pExpA wurden 12 teilkomplementäre DNA-Oligonukleotide (Seq ID Nos. 3-14) verwendet, aus denen in zwei aufeinanderfolgenden PCR- Reaktionen das gesamte FP-Gen amplifiziert wurde. Durch anschließenden Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen Xba I und Not I wurde ein DNA- Fragment erhalten, das nach Ligation mit dem Xba I/Not I Fragment von pExpA das Expressionplasmid pExpA-cFP ergab (siehe Figur 2A). Dieses führt nach Transformation von Escherichia coli-Zellen (DH5) zu Ampicillin-resistenten Bakterienkolonien, die im Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von Fluoreszenzfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht im blauen Wellenlängenbereich von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein), eine grüne Fluoreszenz zeigen (siehe Figur 5B), während bei der entsprechenden Negativkontrolle keine Fluoreszenz detektiert werden konnte (siehe Figur 5A). Bereits für das unmittelbar aus dem Verfahren hervorgegangene Durchschnitts-FP (Seq ID Nr. 1) konnte also Autofluoreszenz nachgewiesen werden, ohne das hierzu eine anschließende Mutagenese notwendig gewesen wäre.

Zur Funktionsoptimierung durch Mutagenese des so erhaltenen autofluoreszenten Gens wurden mehrere Strategien angewendet. Zunächst wurden ausgehend von pExpA-cFP mittels PCR Mutationen in das FP-Gen eingeführt. Dies geschah unter Verwendung von Primern, die so gewählt waren, dass sie mit pExPA-cFP in Bereichen außerhalb der kodierenden Sequenz hybridisierten, jedoch so, dass die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Xba I und Not I noch enthalten waren. Dies ermöglichte eine Zufallsmutagenese über den gesamten kodierenden Bereich. Die PCR wurde in Gegenwart von Mn2+-lonen durchgeführt, was zu einer erwünschten Erhöhung der Fehlerrate der verwendeten Taq-DNA Polymerase führt. Die so erhaltenen PCR-Produkte wurden mit Xba I und Not I verdaut und anschließend mit dem passenden Fragment von pExpA ligiert und in Escherichia coli Zeilen (DH5) transformiert. Von den Ampicillin-resistenten Kolonien wurden die bei Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop deutlich helleren ausgewählt. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität wurde durch nochmalige Transformation in Escherichia coli-Zellen verifiziert, die Plasmid-DNA präpariert und die Sequenz des FP-Gens ermittelt.

In einer weiteren Mutagenese wurden die verbesserten pExpA-cFP Plasmide kombiniert und abermals in Gegenwart von Mn2+-lonen amplifiziert. Diesmal wurden die restriktionsverdauten PCR-Produkte jedoch mit dem Xba I und Not I geschnittenen p2A9-Fragment ligiert, um Plasmide zu erhalten, die sich für die Expression sowohl in Escherichia coli Zellen, als auch in Säugetierzellen eignen.

Alternativ wurden PCR-Reaktionen durchgeführt, um speziell die N-und C- terminalen Bereiche zu verändern. Der 5'-Primer hybridisierte mit dem FP-Gen und enthielt anstelle der ersten 6 Codons an 18 Positionen eine Mischung aller 4 Basen, ebenso der 3'-Primer anstelle der letzten 6 Codons, sodass im translatierten Protein am N-und C-Terminus eine Zufallsfolge von 6 beliebigen Aminosäuren entstand. Diese PCR-Produkte wurden ebenfalls mit Xba I und Not I verdaut und mit dem entsprechenden Fragment von p2A9 ligiert.

In einem dritten Ansatz wurden ausgewählte Codons durch PCR mit teilhomologen Primern gezielt mutiert, um einzelne Aminosäurecodons auszutauschen. Auch hier wurden die erhaltenen PCR-Produkte mit Xba I und Not I verdaut und mit dem entsprechenden p2A9-Fragment ligiert. Aus allen drei Ansätzen wurden nach der Ligation und anschließender Transformation von Escherichia coli Zellen (DH5) 48 Kolonien ausgewählt, die eine hohe Helligkeit in der Fluoreszenz aufwiesen, und die Plasmid-DNA präpariert. Diese wurde daraufhin in einem Folgexperiment in NlH3T3-Zellen transformiert, um diejenigen Klone für eine Sequenzierung auszuwählen, die bei Transfektion dieser Zellen zu einer höheren Fluoreszenz führen.

Kfonieruna der Expressionsplasmide Für die Expression der oben genannten Proteine in geeigneten Escherichia coli- Zellen wurden Plasmide konstruiert, die eine kodierende Sequenz für FP (FP = Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle des lac-Promoters enthalten (pExpA- cFP, siehe Figur 2A). Die Plasmide wurden durch Modifikation von pMCS5 (MoBiTec, Göttingen, Deutschland) hergestellt. pMCS5 ist ähnlich aufgebaut wie pBluescript SK (-) (Stratagene) und unterscheidet sich von diesem nur im 5'- Bereich der kodierenden Sequenz für das lacZa-Fragment. pMCS5 besitzt daher den lac-Promoter und nachgeschaltet den lac-Operator, wodurch die Expression einer eingefügten kodierenden Sequenz von der Abwesenheit von aktivem lac- Repressor abhängt. Um in jedem Fall in Escherichia coli-Zellen eine konstitutive Expression zu erreichen, wurde pMCS5 so modifiziert, dass der lac-Operator nicht mehr enthalten ist. An dessen Stelle wurde das frühe mRNA Polyadenylierungssignal aus SV40 eingesetzt, um ein Umkonstruieren dieses Expressionsplasmides für Escherichia coli in ein Expressionsplasmid für Säugetierzellen vorzubereiten (p2A9-cFP, siehe Figur 2B). Dieses geschah durch zusätzliches Einfügen von regulatorischen Promotersequenzen, die eine Expression des nachgeschalteten Gens in Säugetierzellen hervorrufen. Als besonders wirksam erwies sich eine Kombination aus dem vollständigen "unmittelbar-frühen"Promoter des Cytomegalovirus (CMV), gefolgt von einem 100 Basenpaaren langen Fragment des lac-Promoters aus Escherichia coli sowie dem 180 Basenpaar langen 3'-Ende des"unmittelbar-frühen"CMV-Promoters. Diese Fragmente wurden jeweils per PCR mit Primern hergestellt, die zusätzlich zu den homologen Bereichen Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme enthielten.

Für das Einfügen der künstlichen FP Gene wurden zwischen dem kombinierten Promoter und der Polyadenylierungssequenz Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Xba I und Not I eingefügt.

Versuchsbeschreibunq : Die Expression von FP in Säuaetierzellen führt zu Autofluoreszenz der Zellen : NlH3T3-Zellen (adhärent, 2,5 x 105 Zellen pro Vertiefung in 12-Loch Schale, bis zur 70-80 % igen Konfluenz kultiviert) wurden mit 1 pg Vektor-DNA mit Exgene (MBI Fermentas) transfiziert. Die Plasmide p2A9-cl5m2 (Seq ID No. 15), p2A9- c15m3 (Seq ID No. 17), p2A9-c15m12 (Seq ID No. 19) und p2A9-c15m48 (Seq ID No. 21) enthielten verschieden mutierte Gene, c15m2 (Seq ID No. 16), c15m3 (Seq ID No. 18), c15m12 (Seq ID No. 20) und c15m48 (Seq ID No. 22), für das FP (FP = Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle eines kombinierten Promoters, der zur konstitutiven Expression des nachgeschalteten Gens in Escherichia coli Zellen und Säugetierzellen führt. Nach 9 (siehe Figur 3A) bzw. 24 Stunden (siehe Figur 3B) wurden die Zellen im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Unter Verwendung von Fluoreszenzfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht im blauen Wellenlängenbereich von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein), konnten bei allen Zellen, die mit FP oder mutierten FP enthaltenden Plasmiden transfiziert waren, eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden.

Versuchsbeschreibunq : Die Autofluoreszenz von FP bleicht aus und läßt sich durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht regenerieren : NlH3T3-Zellen (adhärent, 2,5 x 105 Zellen pro Vertiefung in 12-Loch Schale, bis zur 70-80 % igen Konfluenz kultiviert) wurden mit 1 gg Vektor-DNA mit Exgene (MBI Fermentas) transfiziert. Das Plasmid p2A9-c15m3 enthielt ein mutiertes Gen c15m3 für FP (FP = Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle eines kombinierten Promoters, der zur konstitutiven Expression des nachgeschalteten Gens in Escherichia coli-Zellen und Säugetierzellen führt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Anregungsfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht im blauen Wellenlängenbereich von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein), konnten bei Zellen, die mit diesem mutierten FP enthaltenden Plasmid transfiziert waren, eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden (siehe Figur 4A). Diese Fluoreszenz schwächte sich während der Betrachtung innerhalb weniger Sekunden bis zum fast völligen Verschwinden ab (siehe Figur 4B). Nach Bestrahlung des Sichtfeldes mit kurzwelligem Licht im sichtbaren blauen bis ultravioletten Bereich (320 nm bis 400 nm, DAPI-Anregungsfilter) läßt sich die Fluoreszenz mit dem Fluoreszein-Filtersatz wieder beobachten (siehe Figur 4C), d. h sie konnte mit dem kürzerwelligen Licht regeneriert werden. Dieses mutierte FP kann also beispielsweise zum Nachweis von zeitabhängigen zellulären Prozessen, wie Proteindiffusion oder-transport, oder zur optischen Informationsspeicherung verwendet werden.

Vergleich der Aminosäuresequenzen des Durchschnitts-FP und dessen Mutanten mit den bekannten fluoreszierenden Proteinen : Tabelle 1 zeigt die Unterschiede in der Aminosäure-Sequenz zwischen den einzelnen modifizierten Proteinen cFP2, cFP3, cFP12 und cFP48, die durch die mutierten Gene c15m2 (Seq ID No. 16), c15m3 (Seq ID No. 18), c15m12 (Seq ID No. 20) und c15m48 (Seq ID No. 22) kodiert werden, im Vergleich mit dem Dur. chschnitts-FP (D-FP). Die Nummerierung der Aminosäure-Positionen ist dabei derjenigen der Durchschnitts-Sequenz gemäß Figur 1 entnommen. Hieraus ergeben sich Abweichungen der einzelnen Proteine in Bezug auf das Durchschnitts-FP zwischen 6 % und 8 %, d. h. relative Ähnlichkeiten zwischen 92 % und 94 % (Tabelle 2). Dagegen zeigt Tabelle 2, dass die Unterschiede der neuen erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine zu den bekannten Proteinen, die Ausgangspunkt für die Ermittlung der Durchschnitts-Sequenz waren, relativ hoch sind. Es ergeben sich hier lediglich Sequenz-Homologien zwischen 32 % und 69 %. Es konnte also eine völlig neue Gruppe von Aminosäure-Sequenzen bzw. Proteinen bereitgestellt werden, die deutliche Autofluoreszenz zeigen und vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten bieten.

Darüber hinaus konnte eine zusätzliche Funktion bzw. vorteilhafte Eigenschaft in den erfindungsgemäßen Proteinen erzeugt werden.

Liste der verwendeten Abkürzungen : CMV Cytomegalovirus C-Terminus C-terminales Ende einer Aminosäuresequenz DNA Desoxyribonukleinsäure FACS Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting) FP fluoreszierendes Protein GFP grün-fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) nm Nanometer (Einheit der Wellenlänge) N-Terminus N-terminales Ende einer Aminosäuresequenz PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) Seq ID Nr. Sequenz-Identifikationsnummer (gemäß Sequenzprotokoll) SV40 Simian Virus 40 pg Mikrogramm Position 2 3 4 6 7 10 44 98 108 125 128 150 174 183 213 223 224 225 226 227 228 Protein D-FP V A K K N K T F I F V K Y K V G I A L P S cFP2 - A K E N T A I A L A E H E A K S R S T K cFP3 - A K E N T A I A L A E H E A G I A L P S cFP12 - A K E N T A I A L A E H E A K V W G - - cFP48 E L C V A K A I A L A E H E A G I A L P S Tabelle 1 : Unterschiede in den Aminosäure-Sequenzen zwischen dem Durchschnittis-FP (D-FP) und den einzelnen<BR> mutierten fluoreszierenden Proteinen (Klone cFP2/Seq. ID Nr. 15, cFP3/Seq ID Nr. 17, cFP12/Seq ID Nr. 19<BR> und cFP48/Seq ID Nr. 21) bezogen auf die Position der Aminosäuren im Durchschnitts-FP gemäß Seq ID N@ Fluoreszierende D-FP cFP2 cFP3 cFP12 cFP48 Proteine Aequorea victoria GFP 32,02 32,46 33,33 32, 74 32, 02 Zoanthus sp. zFP 506 68,86 65,79 67,11 65, 93 66, 23 Zoanthus sp. zFP 538 67, 11 63, 16 63,60 63, 27 63, 60 Discosoma striata 58, 77 55,70 55,70 56,19 56, 58 dsFP 438 Discosoma sp."red" 59, 21 56,14 56,14 56,64 56,14 dsFP583 Anemonia majano 57, 89 54,82 54,82 55,31 54,39 amFP486 Clavularia sp cFP484 66,23 63,60 64,04 63, 72 63, 60 Renilla mulleri GFP 53, 07 50,44 51,32 50, 88 50, 44 Ptilocarpus gurneyi 50, 88 48,68 49,56 49,12 49,12 GFP D-FP 100, 00 92, 11 94, 74 92, 92 93, 86 cFP2 92, 11 100, 00 97,37 98, 67 94, 74 cFP3 94, 74 97,37 100,00 98, 23 97, 37 cFP12 92, 11 97, 81 97, 37 100, 00 94, 74 cFP48 93, 86 94,74 97,37 95, 58 100, 00 Tabelle 2 : Relative Ähnlichkeiten der fluoreszierenden Proteine in Prozent bezogen auf die jeweiligen Aminosäuresequenzen.

(D-FP (Seq ID Nr. 1) = Durchschnitts-FP ; cFP2 (Seq ID Nr. 15), cFP3 (Seq ID Nr. 17), cFP12 (Seq ID Nr. 19) und cFP48 (Seq ID Nr. 21) = Mutierte D-FP-Klone)