La présente invention concerne les sondes pour détecter l'activité enzymatique de type glycosidase. En particulier, l'invention concerne de nouveaux substrats fluorogènes pour détecter la présence d'une glycosidase catalytiquement active et un procédé de détection utilisant de tels substrats.

Dans l'analyse d'un échantillon biologique ou chimique, la détection d'une activité glycosidase peut être très utile (Boonacker E. et Van Noorden C. J. F. (2001). Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with spécial référence to proteolysis. J. Histochem. Cytochem. 49, 1473-1486 ; Perry, J. D., James, A. L, Morris, K. A., Oliver, M., Chilvers, K. F., Reed, R. H., & Gould, F. K. (2006). Evaluation of novel fluorogenic substrates for the détection of glycosidases in Escherichia coli and enterococci. Journal of Applied Microbiology, 101(5), 977-985 ; Orenga, S., James, A. L., Manafi, M., Perry, J. D., & Pincus, D. H. (2009). Enzymatic substrates in microbiology. Journal of Microbiological Methods, 79(2), 139-155). Les organismes entiers, les cellules ou les extraits cellulaires, les liquides biologiques ou les mélanges chimiques sont des exemples d'échantillons biologiques ou chimiques dans lesquels une activité glycosidase peut être détectée. Les glycosidases sont une vaste famille d'enzymes qui inclut de nombreux biomarqueurs de diverses pathologies. Elles sont impliquées aussi dans de nombreux processus cellulaires bénins et font donc l'objet d'études innombrables de la part des biologistes cellulaires. Ainsi, leur détection peut donner des informations concernant un état métabolique ou morbide particulier, par exemple. Une détection efficace permettrait également de mettre en place des cribles à haut débit, offrant la possibilité de détecter de nouvelles glycosidases naturelles, ou de développer de nouvelles glycosidases par évolution dirigée d'enzymes connues, ou d'améliorer les performances glycolytiques de certains microorganismes par mutagénèse ou évolution expérimentale de leur génome.

De ce fait, une sonde capable de détecter une activité glycosidase est très utile.

La détection de cette activité par capture de lumière de fluorescence émise par une sonde est un procédé bien plus sensible que la collecte du reste de lumière blanche lors d'une simple absorption par la sonde, c'est-à-dire que le seuil de détection est bien plus bas. La détection d'une émission de fluorescence est très aisée à mettre en œuvre, de sorte que les sondes fluorescentes sont des outils très attractifs pour les sciences de la vie. Par exemple, la classe des fluorophores conduisant à un transfert de proton intramoléculaire dans un état excité, nommés ESIPT (ESIPT de l'anglais « Excited State Intramolecular Proton Transfer »), est décrite, notamment, dans a) Ormson, S.M., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994) 19, 45-91 ; b) Legourrierec, D., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994), 19, 211-275 ; et c) Zhao, J., Ji, S., Chen, Y., Guo, H., & Yang, P. (2012). Excited state intramolecular proton transfer (ESIPT): from principal photophysics to the development of new chromophores and applications in fluorescent molecular probes and luminescent materials. Physical Chemistry Chemical Physics, 14 (25), 8803. La première interprétation de la fluorescence élevée trouvée dans certains composés phénoliques comme étant un phénomène ESIPT peut être attribuée à Weller (pour le salicylate de méthyle : Weller, A. (1961). Fast Reactions of Excited Molécules. Progress in Reaction Kinetics and Mechanism 1, 187), et à Heller et Williams (pour les hydroxyphenylbenzoxazoles : Heller A., et Williams, D.L., J. Phys. Chem. (1970) 74, 4473-4480).

La classe des fluorophores ESIPT est particulièrement attractive pour le chercheur dans les sciences de la vie, du fait de ses propriétés exceptionnelles comparées aux fluorophores conventionnels. Les propriétés exceptionnelles des fluorophores ESIPT sont :

(a) un grand déplacement de Stokes dépassant souvent 130 nm et capable d'atteindre des valeurs de 250 nm qui permet des choix instrumentaux maximisant la sensibilité de détection ;

(b) une excellente résistance au photoblanchiment avec des taux qui peuvent être de plusieurs ordres de grandeur supérieurs à ceux de fluorophores modèles comme la fluorescéine ;

(c) la possibilité de concevoir des fluorophores qui émettent une fluorescence brillante à l'état solide, une propriété rare parmi tous les fluorophores connus. Cette dernière performance permet la production d'un signal de haute intensité au niveau du site d'activation, avec une dilution minimale causée par la diffusion;

(d) la possibilité de concevoir des fluorophores ESIPT qui émettent dans le rouge ou le proche infrarouge (600 à 850 nm) où la transparence des tissus est la plus élevée ; une sonde utilisant de tels fluorophores serait alors particulièrement appropriée pour l'imagerie chez l'animal vivant ; et enfin

(e) la possibilité de concevoir un substrat n'émettant pas de fluorescence en remplaçant l'atome d'hydrogène porté par l'hydroxyle d'un fluorophore ESIPT par un substituant possédant une réactivité spécifique vis-à-vis d'un analyte chimique ou biochimique, le clivage de ce substituant entraînant l'apparition de la fluorescence.

Le niveau de sensibilité d'une méthode de détection de l'activité enzymatique, par utilisation d'un substrat donnant lieu à une production de fluorescence, est étroitement lié (i) au taux de photoblanchiment, (ii) au degré d'accumulation du signal fluorescent sur son site de production (et donc au taux de diffusion depuis ce site, et à la question de savoir si le fluorophore précipite ou non) (iii) au mode éteint/allumé réel dans lequel le substrat fonctionne (absence de bruit de fond qui serait dû à une fluorescence du substrat non transformé), et (iv) au degré de superposition du spectre d'excitation et du spectre d'émission (leur séparation au niveau de la ligne de base étant la configuration la plus favorable ; voir point (a) ci-dessus). Le point (iv) revêt une importance toute particulière, car la séparation complète au niveau de la ligne de base offre l'opportunité d'un choix de filtres très large pour la source lumineuse (pour exciter le fluorophore à toutes les longueurs d'ondes possibles), mais de manière encore plus importante, pour le détecteur (pour récolter des photons provenant de toutes les longueurs d'ondes émises par le fluorophore). Le point (iv) minimise aussi la perturbation du processus de détection par l'autofluorescence tissulaire (caractérisée par un faible déplacement de Stokes des fluorophores naturels), un problème récurrent rencontré avec les fluorophores établis, qui présentent eux aussi un faible déplacement de Stokes.

Parmi la classe importante des fluorophores ESIPT, la dichloro-HPQ (6-chloro-2-(5-chloro-2- hydroxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone ; numéro CAS : 28683-92-3) est particulièrement intéressante, étant donné qu'elle est parfaitement insoluble dans les milieux aqueux/physiologiques, tout en étant fortement fluorescente à l'état solide et seulement à l'état solide. Néanmoins, il est très difficile d'utiliser la dichloro-HPQ dans la conception d'une sonde moléculaire qui renseigne sur l'activité d'une glycosidase. D'ailleurs, les principales activités pour lesquelles une sonde à base de HPQ a déjà été conçue (et commercialisée) sont celles des phosphatases, du fait de l'impossibilité de créer une sonde à base de HPQ stable avec un hydroxyle phénolique glycosylé car le produit résultant est enclin à une hydrolyse spontanée rapide qui, bien entendu, libère la dichloro-HPQ insoluble libre et produit ainsi un signal fluorescent erroné ("signal de fond"). Il convient également de noter que la commercialisation par Molecular Probes de tels composés glycosylés (ELF 97 substrat glucuronidase (No. E6587) et ELF 97 substrat chitinase/N-acetylglucosaminidase (No. E22011) a été interrompue en 2008 en raison de l'instabilité à l'hydrolyse intrinsèque des glycosides phénoliques, et en particulier de ceux qui sont construits à partir des phénols appauvris en électrons, telle que la dichloro- HPQ. En effet, il est connu que n'importe quel glycoside à base d'un nitrophénol (qui est un phénol aussi appauvri en électrons que la dichloro-HPQ) s'hydrolyse spontanément à pH physiologique. Il est également connu que ce problème de stabilité s'aggrave sévèrement à des pH plus acides (par exemple à un pH de 6,5), par comparaison au pH physiologique (pH 7,4). Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant dans la conception de substrats d'enzymes à plusieurs composants déclencheur/espaceur(s)/fluorophore en utilisant des espaceurs à auto-immolation comme agent de liaison. On peut notamment citer les travaux de l'un des inventeurs de la présente demande de brevet correspondant aux demandes WO 2013/045854, WO 2014/020285 et WO 2015/197981 qui utilisent un espaceur auto-effondrable reliant un substrat de peptidase et/ou glycosidase à un groupe aryle entraînant, après clivage du substrat, la cyclisation de l'espaceur et la libération d'un fluorophore ESIPT.

Cependant, avec les technologies existantes, la détection des glycosidases n'est pas suffisamment fiable (les sondes sont instables et libèrent de la fluorescence en l'absence de l'enzyme cible), requiert un temps trop long (la réponse enzymatique est trop lente) et/ou n'est pas suffisamment précise (le fluorophore libéré ne précipite pas en un point mais diffuse dans le milieu).

Dans ce contexte, les Demandeurs proposent de nouveaux substrats d'enzyme glycosidase offrant une cinétique de réponse enzymatique particulièrement rapide. L'invention propose d'utiliser un nouvel espaceur qui permet de créer une sonde stable, adaptée à l'incorporation d'un fluorophore ESIPT, avec ainsi une minimisation de la fluorescence de fond de la sonde non transformée, et qui permet une augmentation significative de la sensibilité, et, de ce fait, pourrait conduire à une réduction de la quantité à utiliser et pourrait ainsi, notamment, rendre possible une application en imagerie in vivo, tout en réduisant les problèmes de toxicité.

L'objectif de l'invention est de proposer de nouveaux substrats de glycosidase qui soient stables en milieu aqueux et qui restent non fluorescents ou faiblement fluorescents à une longueur d'onde bien différente de celle à laquelle le fluorophore libéré est lui fluorescent, mais qui réagissent rapidement avec des glycosidases pour produire une petite molécule fluorescente correspondant à un fluorophore ESIPT. Selon l'invention, il est proposé un substrat de glycosidase ayant les propriétés suivantes :

- une grande spécificité pour une glycosidase particulière, en fonction du choix du groupement glycosyle présent sur la sonde ;

- une absence de fluorescence de fond grâce à une haute stabilité de la sonde en l'absence de l'enzyme cible, une précipitation du fluorophore sur le site de l'enzyme et une absence de diffusion du fluorophore dans le milieu ; et

- une cinétique rapide de transformation sous l'action de la glycosidase cible.

Le substrat de glycosidase selon l'invention permet ainsi de conserver les avantages des substrats de glycosidase de l'art antérieur (i.e. grande spécificité pour une glycosidase particulière et absence de fluorescence de fond), tout en ayant une cinétique rapide de transformation sous l'action de la glycosidase cible.

Plus précisément, l'invention concerne des composés de formule (I) :

dans laquelle :

- RI est tel que H0R1, obtenu après clivage de la liaison -C(0)-0R1 présente sur la formule (I), appartient à la classe des fluorophores conduisant à un transfert de proton intramoléculaire dans un état excité, nommés ESIPT,

- R2, R3 et R4 sont définis comme suit :

o soit R2 est un (Cl-C4)alkyle, R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène, et R4 est un (Cl-C4)alkyle,

o soit R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène et R2 et R4 sont liés entre eux et forment avec les atomes de carbone et d'azote auxquels ils sont liés un hétérocycle aliphatique, cet hétérocycle pouvant être substitué par un groupement hydrosolubilisant,

o soit R2 est un (Cl-C4)alkyle et R3 et R4 sont liés entre eux et forment avec l'atome de carbone auxquels ils sont liés un carbocycle aliphatique,

- R5 et R6 sont identiques ou différents et représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un (Cl-C4)alkyle, ou un (C5-C10)aryle,

- R7 est un atome d'hydrogène, ou un groupe choisi parmi les (Cl-C4)alkyle et (Cl- C4)alcoxy,

- R8 représente un atome d'hydrogène, ou un groupe (Cl-ClO)alkyle, substitué ou non substitué, ou un groupe -D1-D2-D3 avec :

o Dl représentant un groupe triazolyle ou -Cl-h-triazolyle,

o D2 représentant un groupe (Cl-ClO)alkylène, (Cl-ClO)alcènylène, ou (Cl-

C10)alcynylène, lesdits groupes étant éventuellement interrompus par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O ou N, un groupe glycosyle divalent, un groupe -0-(CHR-CHR'-0) _n - ou

-N-(CHR-CHR'-0) _n -, n étant un entier variant de 1 à 20, R et R', identiques ou différents, représentant H ou CH3 à condition que R et R' ne soient pas simultanément CH3, un acide aminé ou un peptide, ou une combinaison de ces groupes, o D3 représentant un motif maléimidocaproyl, acide aminé, peptide, acide folique, anticorps ou fragment d'anticorps lié à D2, par une fonction acide carboxylique qu'il comprend, formant un lien ester ou amide,

- R9 et R'9, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe électro-attracteur tel qu'un atome d'halogène, ou un groupe choisi parmi - N0 ₂ , -CN ou -NH-C(0)-CH ₂ -Ab avec Ab représentant un anticorps,

- V représente un atome d'oxygène ou un atome de soufre,

- X, Y et Z sont tels que :

o soit X représente CR10, Y représente CR'10 et Z représente OR0,

o soit X représente CR10, Y représente COR0 et Z représente R'10,

o soit X représente CR10, Y représente un atome d'azote et Z représente OR0,

o soit X représente un atome d'azote, Y représente COR0 et Z représente RIO

avec :

o R0 représentant un groupement glycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule de formule (I), et

o RIO et R'10, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène ou un groupe électro-donneur tel qu'un (Cl-C20)alkyle, un (C5-C24)aryle, ou un

(Cl-C20)alcoxy,

sous la forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique.

Les composés (I) selon l'invention, en fonction du groupe glycosyle sélectionné, agissent comme une sonde moléculaire capable de révéler la présence d'une activité enzymatique glycosidase spécifique par détection de fluorescence. La liaison RO-0 présente dans les composés de formule (I) est susceptible d'être clivée, par hydrolyse, en présence d'une enzyme glycosidase agissant en tant que catalyseur de la réaction de clivage.

Plus spécifiquement, la sonde est invisible avant de rencontrer l'enzyme glycosidase ciblée, (c'est-à-dire "sonde furtive"), mais quand elle est modifiée chimiquement par ladite enzyme, elle se fragmente via une réaction en cascade pour produire une fluorescence intense. La sonde est composée de 4 composants moléculaires : i) un tandem d'espaceurs auto-effondrables qui porte, à une extrémité ii) un groupe glycosyle jouant le rôle de substrat pour l'enzyme cible et, à l'autre, iii) un groupe OR1 qui, quand il est libéré sous sa forme hydroxylée HOR1 par ladite fragmentation, en milieux aqueux, appartient à la classe des fluorophores ESIPT. Le tandem d'espaceurs comprend un espaceur de type éliminant et un espaceur de type cyclisant et préorganisé pour une cyclisation. Ce choix particulier de tandem d'espaceurs permet d'obtenir deux propriétés fondamentales pour la sonde moléculaire correspondante: (a) elle la rend insensible à la dégradation spontanée et donc à la production d'un signal fluorescent faussement positif, et (b) elle garantit une cinétique de fragmentation rapide lors de la transformation par l'enzyme cible pour une performance adaptée aux applications dans le domaine des sciences de la vie. Le groupe R0 est capable d'être clivé du reste de la molécule par l'action de la glycosidase cible, ce qui conduit à un intermédiaire instable qui s'immole par des réactions d'élimination et de cyclisation/clivage, spontanément et rapidement, pour libérer un précipité fluorescent et ainsi produire un signal fluorescent. Cette architecture moléculaire unique permet une réponse enzymatique particulièrement rapide, et notamment bien plus rapide que celle obtenue par l'emploi de la sonde décrite dans le document WO 2014/020285.

La présente invention concerne donc les composés de formule (I), quelle que soit leur variante de mise en œuvre décrite dans la présente demande de brevet, pour la détection in vivo, chez l'homme, d'une glycosidase. Les composés de formule (I) selon l'invention peuvent également être utilisés pour détecter une glycosidase, in wVo chez l'animal.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour détecter in vitro ou ex vivo la présence d'une glycosidase au moyen du composé (I) selon l'invention. Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour détecter in vitro ou ex vivo la présence d'une glycosidase comprenant les étapes de :

- mise en contact d'un échantillon suspecté de contenir ladite glycosidase avec un composé (I) selon l'invention,

- application de conditions appropriées pour permettre la formation d'un composé fluorescent, notamment sous la forme d'un précipité, par clivage de la liaison covalente entre O et R0, suivi d'un clivage de la liaison -C(0)-ORl, suite à des réactions d'élimination et de cyclisation du tandem d'espaceurs conduisant à la libération de HOR1, et

- analyse quantitative ou qualitative dudit précipité fluorescent.

Le précipité qui peut être obtenu à partir des composés de formule (I) selon l'invention, par clivage de la liaison covalente entre O et R0, suivi d'un clivage de la liaison -C(0)-ORl suite à une élimination et une cyclisation du tandem d'espaceurs, est fortement fluorescent, alors que le composé de formule (I) correspondant est peu fluorescent ou pas fluorescent du tout. Les composés selon l'invention, qui sont des substrats d'enzyme glycosidase, se comportent comme des sondes fonctionnant selon le mode éteint/allumé. En particulier, le procédé de détection selon l'invention peut être mis en œuvre dans des conditions physiologiques, notamment dans un milieu aqueux tamponné à un pH de l'ordre de 7,4.

L'invention concerne encore les composés de formule (II), intermédiaires dans la synthèse des composés de formule (I) :

dans laquelle :

- R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R'9 et V sont tels que définis pour les composés de formule (I),

- R12 représente un atome d'hydrogène, ou un groupe protecteur des fonctions aminé,

- X, Y' et Z' sont tels que :

o soit X représente CR10, Y' représente CR'10 et Z' représente OR'O,

o soit X représente CR10, Y' représente COR'O et Z' représente R'10,

o soit X représente CR10, Y' représente un atome d'azote et Z' représente OR'O, o soit X représente un atome d'azote, Y' représente COR'O et Z représente RIO, avec R'O représentant un groupe R0 dont toutes les fonctions alcools sont protégées par un groupe protecteur, et R0, RIO et R'10 étant tels que définis pour les composés de formule (I),

sous la forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique.

L'invention concerne encore un procédé de préparation d'un composé (I) comprenant les étapes suivantes :

- disposer d'un composé (II) tel que défini dans le cadre de l'invention,

- disposer d'un composé (III) de formule :

avec RI tel que défini pour les composés de formule (I) et M représentant un groupe partant, notamment un atome d'halogène, et en particulier un atome de chlore, un groupe imidazolyle ou un paranitrophénoxy, et de préférence M représentant un atome de chlore,

obtenir le composé (IV) par réaction d'addition dudit composé (II) sur ledit composé (III), ledit composé (IV) ayant pour formule :

dans lequel RI, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R'9, V, X, Y' et Z' sont tels que définis pour les composés de formule (I) et (II), et

- déprotéger les fonctions alcools présentes dans le groupe R'O dudit composés (IV) pour obtenir ledit composé (I).

Les différents composés selon l'invention peuvent se trouver sous toutes les formes d'isomères optiques possibles, éventuellement en mélange selon toutes proportions, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement. Selon un mode de réalisation particulier, les composés selon l'invention comportant un carbone asymétrique se trouvent sous une forme racémique, les formes R et S se trouvant en proportions sensiblement égales. Selon un autre mode de réalisation, les composés de formule (I) de l'invention peuvent se trouver sous une forme enrichie en un diastéréoisomère ou énantiomère, avec un excès diastéréoisomérique ou énantiomérique supérieur à 80%, voire même supérieure à 95%, voire sous une forme isomérique pure c'est-à- dire avec un excès diastéréoisomérique ou énantiomérique supérieur à 99 %.

Les composés (I) sont isolés sous une forme enrichie en un diastéréoisomère ou énantiomère par les techniques classiques de séparation : on pourra utiliser, par exemple des recristallisations fractionnées d'un sel du racémique avec un acide ou une base optiquement active dont le principe est bien connu ou, le plus souvent, les techniques classiques de chromatographies sur phase chirale ou non chirale.

Le cas échéant lorsque les composés selon l'invention comprennent une fonction salifiables, ils peuvent se trouver sous la forme d'un sel, notamment d'un chlorhydrate ou d'un trifluoroacétate. L'invention va être décrite de manière plus détaillée. Auparavant, certains termes utilisés vont être définis.

Définitions

Par « hétérocycle aliphatique », on entend au sens de la présente invention un cycle saturé, substitué ou non substitué, comportant de 3 à 20 chaînons, de préférence de 5 à 10 chaînons, et mieux encore 5, 6, 7 ou 8 chaînons, et comportant au moins un hétéroatome, tel que 0, N ou S.

Par « carbocycle aliphatique », on entend au sens de la présente invention un cycle saturé, substitué ou non substitué, comportant de 3 à 20 chaînons, de préférence de 5 à 10 chaînons, et mieux encore 5, 6, 7 ou 8 chaînons, constitué exclusivement par des atomes de carbone. Par « alkyle », on entend une chaîne hydrocarbonée saturée qui peut être linéaire ou ramifiée. De préférence, le terme alkyle désigne, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et préférentiel lement de 1 à 6 atomes de carbone, et notamment un groupe (Cl-C4)alkyle. Méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, iso- butyle et tert-butyle sont des exemples de groupes (Cl-C4)alkyle (alkyle avec 1 à 4 atomes de carbone).

Par « alkylène », on entend un groupe alkyle divalent.

Par « aryle », on entend un cycle mono-, bi- ou polycyclique, hydrocarboné insaturé comportant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 5 à 24 chaînons, de 5 à 20 chaînons, de préférence de 5 à 15 chaînons, et comprenant au moins un cycle aromatique alternant liaisons simples et liaisons doubles. A titre d'exemple de groupe aryle, on peut citer les groupes phényle, naphtyle, anthrancényle, phénanthrényle et cinnamyle. Le terme aryle inclut également de tels cycles mono-, bi- ou polycycliques, hydrocarbonés insaturés, dont l'un des carbones constitutifs se trouve sous la forme carboxy -C(O)- tel que le lH-phénalène-l-one (CAS no. 548-39-0).

Par « arylène », on entend un groupe aryle divalent.

Par « hétéroaryle », on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycyclique, comportant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 5 à 24 chaînons, de préférence de 6 à 20 chaînons, préférentiel lement de 6 à 15 chaînons et comprenant au moins un groupe aromatique et au moins un hétéroatome, choisi parmi les atomes d'oxygène, azote ou soufre, intégré au sein du carbocycle. A titre d'exemple de groupe hétéroaryle, on peut citer les 2-, 3- ou 4-pyridinyle, 2- ou 3-furoyle, 2- ou 3-thiophényle, pyrrolyle, imidazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, benzothiazolyle, oxazolyle, benzoxazolyle, isoxazolyle, pyridinyle, pyrazinyle, pyrimidinyle, tétrazolyle, thiadiazolyle, oxadiazolyle, triazolyle, pyridazinyle, indolyle, oxanyle, 4(lH)-quinolinonyle, dibenzothiophényle, dibenzofuranyle, et 9H-carbazolyle. Le terme hétéroaryle inclut également lesdits groupes dont l'un des carbones constitutifs se trouve sous la forme carboxy -C(O)- tel que le 4(3H)-pyrimidinonyle ou le 4(3H)-quinazolinonyle.

Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est substitué sans plus de précision, cela signifie qu'il est substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode ou fluor, les groupes cyano, alkyle, trifluoroalkyle, trifluorométhyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétéroaryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alcoxy, aryloxy, alcoxycarbonyle, aryloxycarbonyle, lesdits groupes pouvant eux- mêmes être substitués. Les termes utilisés pour la définition de ces substituants sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier.

Par « alcoxy » et « aryloxy », on entend respectivement un groupe -O-alkyle et -O-aryle, avec alkyle et aryle tels que définis dans le cadre de la présente invention.

Par « haloalkyle », on entend une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée, dans laquelle au moins un atome d'hydrogène a été remplacé par un atome d'halogène.

Par « glycosidase », on entend une enzyme glycoside hydrolase qui a la capacité de catalyser l'hydrolyse de liaisons glycosidiques, de manière à libérer au moins un composé osidique. Par groupe « glycosyle », on entend tout sucre mono- ou poly-saccharide lié au reste de la molécule par un lien glycosyle, c'est-à-dire via son carbone anomérique. Le carbone anomérique peut adopter la configuration alpha ou beta. A titre d'exemple de groupe glycosyle, on peut citer les groupements mono-glycosyle, c'est-à-dire formé d'une seule unité saccharidique, et poly- glycosyle, c'est-à-dire formé de plusieurs unités saccharidiques identiques ou différentes. Les unités saccharidiques peuvent être notamment du type hexoses ou pentoses, et choisies parmi le galactose, le glucose, le mannose, le gulose, l'allose, l'altrose, l'idose, le talose, le fucose, le fructose, l'arabinose, le lyxose, le ribose et le xylose, par exemple. Les unités saccharidiques peuvent être de stéréochimie L ou D.

De manière classique, le terme « alcènyle » désigne une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée comprenant au moins une double liaison carbone-carbone, et présentant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 2 à 20 atomes de carbone, et de préférence de 2 à 6 atomes de carbone.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « alcénylène » désigne un groupe alcènyle divalent.

Le terme « alcynyle » désigne une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone, et présentant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 2 à 12 atomes de carbone, et de préférence de 2 à 6 atomes de carbone.

Par « alcynylène », on entend un groupe alcynyle divalent.

Par « groupe hydrosolubilisant », on entend un groupe hydrophile qui permet d'améliorer la solubilité de la sonde dans un milieu aqueux, par rapport notamment à une sonde qui n'en diffère que par le remplacement du groupe hydrosolubilisant pas un atome d'hydrogène.

La « fluorescence » est la propriété par laquelle une molécule qui est excitée par de la lumière d'une longueur d'onde donnée émet de la lumière à une plus grande longueur d'onde. La fluorescence est un phénomène qui résulte de l'interaction d'un fluorophore avec un photon incident. Ce processus est appelé excitation. L'absorption du photon amène un électron dans le fluorophore à passer de son état fondamental à un niveau d'énergie supérieur. Ensuite, l'électron revient à son niveau original en émettant un photon. Ce processus est appelé émission de fluorescence. Le fluorophore émet ensuite de la lumière à une plus grande longueur d'onde que celle du photon absorbé. Ceci est dû simplement au fait que l'énergie du photon émis est inférieure à celle du photon absorbé, du fait de la dissipation d'énergie pendant la durée de vie de l'état excité. Cette définition est donnée dans la demande de brevet WO 2004/058787. Les composés (I) selon l'invention sont appelés « substrat de glycosidase » car ils sont transformés en une autre substance pendant une réaction chimique, en particulier une hydrolyse, catalysée par une glycosidase. Pendant une telle réaction en milieu aqueux, les composés (I) (appelés également « sonde ») sont clivés sous l'action de la glycosidase cible, ce qui conduit à la formation d'un précipité fluorescent et d'un produit non fluorescent.

Le « tandem d'espaceurs » au sens de la présente invention est le fragment du composé (I) qui porte à une extrémité un groupe glycosyle -R0 et à l'autre extrémité un groupe -OR1 qui, une fois libéré par hydrolyse, appartient à la classe des fluorophores ESIPT. Ce tandem d'espaceur est constitué d'un premier espaceur de type éliminant (qui va subir une réaction d'élimination suite à l'hydrolyse libérant R0) et un deuxième espaceur de type cyclisant (qui va cycliser suite à l'élimination de l'espaceur de type éliminant, permettant alors de générer HOR1). La figure 1 représente le mécanisme de dégradation, à partir des composés de formule (I), faisant appel au tandem d'espaceur selon l'invention.

Composés de formule (I)

La présente invention concerne les composés de formule (I) :

dans laquelle :

- RI est tel que HOR1, obtenu après clivage de la liaison -C(0)-ORl présente sur la formule (I), appartient à la classe des fluorophores conduisant à un transfert de proton intramoléculaire dans un état excité, nommés ESIPT,

- R2, R3 et R4 sont définis comme suit :

o soit R2 est un (Cl-C4)alkyle, R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène, et R4 est un (Cl-C4)alkyle, o soit R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène et R2 et R4 sont liés entre eux et forment avec les atomes de carbone et d'azote auxquels ils sont liés un hétérocycle aliphatique, cet hétérocycle pouvant être substitué par un groupement hydrosolubilisant,

o soit R2 est un (Cl-C4)alkyle et R3 et R4 sont liés entre eux et forment avec l'atome de carbone auxquels ils sont liés un carbocycle aliphatique,

R5 et R6 sont identiques ou différents et représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un (Cl-C4)alkyle, ou un (C5-C10)aryle,

R7 est un atome d'hydrogène, ou un groupe choisi parmi les (Cl-C4)alkyle et (Cl- C4)alcoxy,

R8 représente un atome d'hydrogène, ou un groupe (Cl-ClO)alkyle, substitué ou non substitué, ou un groupe -D1-D2-D3 avec :

o Dl représentant un groupe triazolyle ou -CH ₂ -triazolyle,

o D2 représentant un groupe (Cl-ClO)alkylène, (Cl-ClO)alcènylène, ou (Cl- C10)alcynylène, lesdits groupes étant éventuellement interrompus par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O ou N, un groupe glycosyle divalent, un groupe -0-(CHR-CHR'-0) _n - ou

-N-(CHR-CHR'-0) _n - avec n étant un entier naturel variant de 1 à 20, R et R', identiques ou différents, représentant H ou CH3 à condition que R et R' ne soient pas simultanément CH3, un acide aminé ou un peptide, ou une combinaison de ces groupes,

o D3 représentant un motif maléimidocaproyl, acide aminé, peptide, acide folique, anticorps ou fragment d'anticorps lié à D2, par une fonction acide carboxylique qu'il comprend, formant un lien ester ou amide,

R9 et R'9, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe électro-attracteur tel qu'un atome d'halogène, ou un groupe choisi parmi - NO2, -CN ou -NH-C(0)-CH ₂ -Ab avec Ab représentant un anticorps,

V représente un atome d'oxygène ou un atome de soufre,

X, Y et Z sont tels que :

o soit X représente CR10, Y représente CR'10 et Z représente OR0, o soit X représente CR10, Y représente COR0 et Z représente R'10, o soit X représente CR10, Y représente un atome d'azote et Z représente OR0, o soit X représente un atome d'azote, Y représente COR0 et Z représente RIO

avec :

o RO représentant un groupement glycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule de formule (I), et

o RIO et R'10, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène ou un groupe électro-donneur tel qu'un (Cl-C20)alkyle, un (C5-C24)aryle, ou un

(Cl-C20)alcoxy,

sous la forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique.

Le groupe OR1 est sélectionné de manière à ce que le précipité fluorescent obtenu qui correspond à RIOH, libéré après clivage de la liaison -C(0)-ORl, soit un fluorophore ESIPT. De préférence, RI est un groupe aromatique comprenant un ou plusieurs cycles aromatiques substitués ou non substitués, lesdits cycles pouvant comprendre un au plusieurs hétéroatomes choisis parmi les atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre et/ou un ou plusieurs atomes de carbone sous la forme d'un carbonyle C=0.

Des exemples de tels groupements OR1 répondent à la formule (Al):

dans laquelle :

- soit X2 est un atome d'oxygène et XI est un groupe -NH ₂ , -OH, -SH, (Cl-C20)alkyle, (C5-C24)aryle, -O-(Cl-C20)alkyle, -O-phényle, -NH-(C1-C20)alkyle ou -NH-phényle, -S- (Cl-C20)alkyle ou -S-(C5-C24)aryle, lesdits groupes alkyle et phényle pouvant être substitués ou non substitués,

soit X2 représente un atome d'azote et est lié à XI qui représente alors CH, O, S, N ou NH pour former un (C5-C24)hétéroaryle substitué ou non substitué,

représente un (C5-C24)aryle ou un (C5-C24)hétéroaryle, substitué ou non substitué, par exemple choisi parmi les groupes phényle, naphtyle, et :

lesdits groupes pouvant être substitués ou non substitués,

avec X3 qui représente S, O ou NRd et Rd qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle.

Les fluorophores ESIPT montrent un déplacement de Stokes qui dépassent les 100 nm et accèdent souvent 200 nm. Tous les fluorophores ESIPT perdent cette émission de fluorescence correspondant à un déplacement de Stokes supérieur à 100 nm, si leur groupement OH du type phénolique, donnant lieu au transfert de proton intra-moléculaire à l'état excité, est alkylé, acylé ou autrement fonctionnalisé. Cette fonctionnalisation empêche de transférer un atome d'hydrogène à l'hétéroatome X2 sur l'illustration donnée avec la formule (Al), lors de l'excitation par irradiation, et ainsi empêche l'émission de fluorescence caractéristique du processus de transfert de proton. L'incorporation de l'hydroxyle HOR1 dans le groupement carbamate du composé de formule (I) empêche le transfert de proton. Le transfert de proton intramoléculaire pourra ensuite se produire grâce au groupement hydroxy obtenu suite à la coupure de la liaison -C(O) - OR1. Le plus souvent, le groupe RI correspond à un groupe phényle qui est non substitué ou substitué et/ou qui est fusionné avec un ou plusieurs carbocycles insaturés, comprenant éventuellement un hétéroatome tel que l'azote. Ce dérivé phénoxy OR1, lorsqu'il n'est pas lié au substrat, correspond sous sa forme protonée à un dérivé phénolique HO-R1 qui appartient à la classe des fluorophores ESIPT.

Des dérivés -OR1 correspondent, par exemple, à l'une des structures préférées (A2) ou (A3) suivantes : (A2), dans laquelle :

T est -NH-C(O)-, -S-, -0-, -NH-, -N((Cl-C20)alkyle)- ou -N((C5-C24)aryle)-

Re est un atome d'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons comme -CN ou -COORh, avec Rh qui représente un groupe (Cl-C4)alkyle, ou bien Re est -CONRiRj, avec Ri et Rj, identiques ou différents, qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle, ou bien Re est -CF3, ou un groupe

2-oxazolyle, 2-thiazolyle, 2-imidazolyle, 2-benzoimidazolyle, 4-pyrimidinon-2-yle ou quinazolinon-2-yle,

Rf est un atome d'hydrogène, un atome de chlore, brome, iode ou fluor, -OH,

-NH2, -NRkRI, -NHRk ou -ORk, avec Rk et RI identiques ou différents qui représentent chacun indépendamment un groupe (Cl-C4)alkyle,

ou bien Re et Rf sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et 0,

R est un atome d'hydrogène, Br, Cl, I ou F,

(A3), dans laquelle :

o T' est -NH2, -OH, un groupe (C5-C24)aryle, un groupe (Cl-C4)alkyle, -SH, -NHR'g, -OR'g, -NR'gRh' ou -SR'g, R'g et Rh', identiques ou différents, représentant un groupe (Cl-C4)alkyle ou aryle,

o R'e est atome d'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons comme -CN, ou -COOR'i, avec R'i qui représente un groupe (Cl-C4)alkyle, ou R'e est -CONR'jR'k, avec R'j et R'k, identiques ou différents, qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle, ou bien R'e est -CF3, ou un groupe

2-oxazolyle, 2-thiazolyle, 2-imidazolyle, 2-benzoimidazolyle, 4-pyrimidinon-2-yle, ou quinazolinon-2-yle,

o R'f est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome, d'iode ou de fluor, -OH, -NH2, -NR'IR'm ou -OR'I, avec R'I et R'm, identiques ou différents, qui représentent un groupe (Cl-C4)alkyle,

o ou bien R'e et R'f sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et O.

On pourra notamment se référer aux demandes WO 2013/045854, WO 2014/020285 et WO 2015/197981 qui donnent des exemples de tels fluorophores ESIPT qui peuvent être utilisés dans la présente invention.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, RI est un groupe aromatique avec -ORl qui répond à l'une des formules (A4) ou (A5) suivantes :

Le très grand déplacement de Stokes de tels fluorophores (approximativement 170 nm pour A5) ou de tout analogue de la HPQ contribuera à l'excellente sensibilité de la sonde et rendra le fluorophore libéré aisément distinguable de la fluorescence native pouvant provenir de l'échantillon biologique sur laquelle l'analyse va être menée.

Selon un mode de réalisation de l'invention, R2 est un (Cl-C4)alkyle, R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène, et R4 est un (Cl-C4)alkyle. Selon un mode particulier de réalisation, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe (Cl-C4)alkyle, par exemple méthyle ou éthyle. Selon un mode particulier de réalisation, R2 = R3 = R4 = -CH3. Selon un autre mode de réalisation, R3 est un (Cl-C4)alkyle ou un atome d'hydrogène et R2 et R4 sont liés entre eux et forment avec les atomes de carbone et d'azote auxquels ils sont liés un hétérocycle aliphatique, cet hétérocycle pouvant être substitué par un groupement hydrosolubilisant. Selon un mode particulier de réalisation, R3 est un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle, de préférence un atome d'hydrogène, et R2 et R4 sont liés entre eux et forment un enchaînement

-(CH2)m- avec m = 3, 4 ou 5. Selon un autre mode particulier de réalisation, R3 est un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle, de préférence un atome d'hydrogène, et R2 et R4 sont liés entre eux et forment un enchaînement -CH2CH2-NRI I-CH2- dans le sens de R2 vers R4, Rl l représentant un atome d'hydrogène ou

-(L)n-GP avec n qui est égal à 0 ou 1, L un bras de liaison et GP un groupe hydrosolubilisant, i.e. le composé (I) a alors pour formule :

Bien souvent, pour des raisons de synthèse, n = 1 et L est un bras de liaison, et notamment un bras -(Ll)mi-(L2)m2-(L'l)m'i- (dans le sens pipérazine -> groupe GP) avec :

- Ll et L'1, identiques ou différents, qui sont choisis parmi -O-, -NH-, -N(Cl-C6)alkyl)- , -N(phényl)-, -N(aryl)-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(O)-, -OC(0)-0-, -NHC(0)-0-, -OC(O)- NH-, -NHC(0)-NH-, -S-, -SO2-, -N=N-, -NHC(O)- et -CONH- ;

- L2 qui est choisi parmi les groupes divalents suivants : (Cl-C20)alkylène, (Cl- C20)alcénylène, (Cl-C20)alcynylène, (C6-C24)arylène, (C7-C44)alkylarylène, (C7-C44)alcénylarylène, (C7-C44)alcynylarylène, (C7- C44)alkylcycloalkylène, (C7-C44)alcénylcycloalkylène, (C7-C44)alcynylcycloalkylène, (C7-C44) alkylhétérocycloalkylène,

(C7-C44)alcénylhétérocycloalkylène, (C7-C44)alcynylhétérocycloalkylène ; lesdits groupes pouvant être interrompus ou se terminer par un groupe triazole, et pouvant être non substitués ou substitués, notamment par un ou plusieurs substituants choisis parmi les (Cl-ClO)alcoxy, (Cl-ClO)alkyle, (C6-C10)aryle, amido, imido, phosphido, nitrido, (C1-C10) alcényle,

(C1-C10) alcynyle et -OH ; et

- ml, m'1 et m2, identiques ou différents, qui sont égaux à 0 ou 1.

Le bras L, lorsqu'il est présent, sera choisi pour éloigner le groupe GP de la pipérazine ou pour des questions de synthèse. Selon un mode de réalisation préféré, L représente -(Ll) _m i-(L2) _m 2- (L'l)m'i avec Ll = -C(O)-, ml = m2 = 1, m'1 = 1 ou 0 et L2 et L'1 tels que définis précédemment, et notamment L représente -C(0)-(CH2) _P -L3- avec p qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 et L3 qui est un groupe triazole et notamment un groupe lH-l,2,3-triazole.

GP est un groupe hydrosolubilisant. A titre d'exemple de groupe hydrosolubilisant, on peut citer les groupes capables de former une espèce chargée en solution aqueuse. A titre d'exemple de groupe hydrosolubilisant GP, on peut citer les fonctions Fl choisies parmi les aminé (primaire, secondaire, ou tertiaire), amidine, guanidine ou tétrazole ; les fonctions F2 cationiques ou anioniques, et notamment les groupes type ammonium, carboxylate, sulfonate ou phosphate ; les groupements comprenant une ou plusieurs de ces fonctions Fl et/ou F2 ; les polyéthylèneglycols ; les sucres ou polysaccharides tels que le glucose, le galactose et le mannose ; les groupes peptidiques tels que la poly-lysine, la poly-arginine, les TAT-peptides. A titre d'exemple de fonctions aminé, on peut citer -NH ₂ , -NH(C1-C4)alkyle, et les dialkylamines dans lesquelles les groupes alkyle sont identiques ou différents et comprennent de 1 à 4 atomes de carbone.

Selon un autre mode de réalisation, R2 est un (Cl-C4)alkyle et R3 et R4 sont liés entre eux et forment avec l'atome de carbone auxquels ils sont liés un carbocycle aliphatique, de préférence un cyclohexyle.

Ces deux manières de préorganiser l'espaceur pour la cyclisation, consistant soit à introduire deux substituants alkyle (ou formant un carbocycle) sur le carbone en alpha du groupement - N-C(V)-0-, soit à inclure la liaison entre l'azote du groupement -N-C(V)-0- et son carbone alpha dans un hétérocycle, accélèrent le processus d'immolation.

Selon un mode de réalisation, R5 et R6 sont identiques et représentent un atome d'hydrogène. Selon un mode de réalisation, R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Cl-C4)alkyle tel qu'un méthyle, et de préférence un atome d'hydrogène.

Selon un mode de réalisation, R5, R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène.

Selon un mode de réalisation, R8 un atome d'hydrogène.

Selon un autre mode de réalisation, R8 est un groupe -D1-D2-D3, avec Dl, D2 et D3 tels que définis dans le cadre de la présente invention. Selon ce mode de réalisation, D3 peut notamment représenter un motif acide folique, anticorps ou peptide, qui sont des groupements ciblant un récepteur cellulaire, afin d'améliorer la sélectivité des composés de formule (I) pour certaines cellules particulières.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, R8 est un groupe -D1-D2-D3, avec Dl représentant un groupe -CH ₂ -triazolyle, D2 représentant un groupe (C1-C10) alkylène, de préférence interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi 0 ou N, de préférence 0, et D3 réprésentant un motif maléimidocaproyl, acide aminé, peptide, acide folique, anticorps ou fragment d'anticorps, de préférence acide folique, lié à D2 par une fonction acide carboxylique qu'il comprend de manière à former un lien ester ou amide, de préférence une fonction amide. Selon un mode particulier de réalisation, R8 est un groupe -Dl- -D3 de formule suivante :

Selon un mode de réalisation, au moins un des groupes R9 ou R'9 représente un atome d'halogène, un groupe -NO2, ou un groupe -CN, de préférence un groupe -NO2. Selon un mode de réalisation préféré, R9 représente un atome d'hydrogène et R'9 représente un atome d'halogène, un groupe -NO2 ou un groupe -CN, de préférence un groupe Selon un mode de réalisation, RIO, et le cas échéant RIO', représente(nt) un atome d'hydrogène. Selon un mode de réalisation, V représente un atome d'oxygène.

Les groupements R0 ont la caractéristique de pouvoir être clivés du reste de la molécule sous l'action d'une enzyme glycosidase. L'enzyme joue le rôle de catalyseur de la coupure entre R0 et l'atome d'oxygène auquel il est lié. Une telle coupure peut être la conséquence d'une hydrolyse en milieu aqueux pour laquelle l'enzyme glycosidase va jouer le rôle de catalyseur. C'est pourquoi ladite enzyme glycosidase est dite catalytiquement active.

R0 représente un groupement glycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule. R0 est apte à être clivé du reste de la composé de formule (I) sous l'action catalytique d'une enzyme glycosidase, en particulier en milieu aqueux. A titre d'exemples d'enzyme glycosidase qui peuvent êtres ciblés par les sondes fluorogènes selon l'invention, on peut citer la N-acétyl- β-galactosaminidase ; la N-acétyl- -glucosaminidase ; la - a-amylase ; la -a-arabinofuranosidase ; la - a-arabinosidase ; la ^■ β-cellobiosidase ; la- -chitobiosidase ; la - a-galactosidase ; la - β- galactosidase ; la - a-glucosidase ; la- -glucosidase ; la- -glucuronidase ; la - a-maltosidase ; la - a-mannosidase ; la- -mannosidase ; la- -xylosidase ; la- -D-fucosidase ; la -a-L-fucosidase ; la- -L-fucosidase ; la L-iduronidase ou de la cellulase (Orenga, S., James, A. L, Manafi, M., Perry, J. D., & Pincus, D. H. (2009). Enzymatic substrates in microbiology. Journal of Microbiological Methods, 79(2), 139-155).

Le groupement R0 sera, de préférence, choisi de manière à être spécifique d'une glycosidase d'intérêt. En revanche, certaines glycosidases ont la capacité de cliver un ensemble de groupements R0 différents ; parmi elles, on peut citer l'hexosaminidase. Tous les groupements glycosyle possibles qui correspondent à un groupe RO-0 clivable en milieu aqueux en présence d'une glycosidase peuvent être utilisés en tant que RO. Les unités glycosyle peuvent être fonctionnalisées ou non, notamment avec un groupement acétyl ou amino. Les N- acétylhexosamines sont des exemples de groupe glycosyle. Le plus souvent, le groupe glycosyle comprendra de 1 à 50 unités saccharidiques. Dans le cas d'un polyglycosyle, il pourra s'agir d'un homopolymère ou d'un copolymère avec une structure aléatoire, alternée ou block.

Des exemples de tels groupes RO sont donnés ci-après : les groupements mono-glycosylés choisis parmi le galactosyle, le glucosyle, le mannosyle, le gulosyle, l'allosyle, l'altrosyle, l'idosyle, le talosyle, le fucosyle, le fructosyle, l'arabinosyle, le lyxosyle, le ribosyle, le xylosyle, le glucuronyle et le N-acétyl-hexosaminyle et les groupements polyglycosylés constitués de plusieurs de ces groupements monoglycosylés identique ou différents.

Selon un mode de réalisation, RO est un groupe clivable sous l'action d'une glycosidase, choisie parmi la N-acétyl-p-galactosaminidase ; la N-acétyl-p-glucosaminidase ; la α-amylase ; la a- arabinofuranosidase ; la α-arabinosidase ; la β-cellobiosidase ; la β-chitobiosidase ; la a- galactosidase ; la β-galactosidase ; la α-glucosidase ; la β-glucosidase ; la β-glucuronidase ; la a- maltosidase ; la α-mannosidase ; la β-mannosidase ; la β-xylosidase ; la β-D-fucosidase ; la a- L-fucosidase ; la β-L-fucosidase ; la L-iduronidase ou de la cellulase ; et RO est un groupement mono-glycosylé lié par son carbone anomérique choisi parmi le galactosyle, le glucosyle, le mannosyle, le gulosyle, l'allosyle, l'altrosyle, l'idosyle, le talosyle, le fucosyle, le fructosyle, l'arabinosyle, le lyxosyle, le ribosyle, le xylosyle, le glucuronyle et le N-acétyl-hexosaminyle ou un groupement polyglycosylé constitué de plusieurs, par exemple de 2 à 20, de préférence de 2 à 10, et plus particulièrement de 2 à 6, de ces groupements monoglycosylés identiques ou différents.

Selon un mode de réalisation, R0 est un groupe clivable sous l'action d'une galactosidase, par exemple une β-galactosidase, d'une induronidase, d'une glucosidase, d'une N-acétyl-D- glucosaminidase, d'une N-acétyl-D-galactosaminidase, d'une mannosidase, d'une fucosidase, d'une glucuronidase, notamment d'une β-glucuronidase ou d'une cellulase ; et R0 est un groupement mono-glycosylé, lié par son carbone anomérique, choisi parmi le D-glucuronyle, le L-iduronyle, le D-glucopyranosyle, le D-galactopyranosyle, le N-acétyl-D-glucosaminyle, le N-acétyl-D- galactosaminyle, le D-mannopyranosyle, le L-fucopyranosyle ou un groupement polyglycosylé constitué de plusieurs, par exemple de 2 à 20, de préférence de 2 à 10, et plus particulièrement de 2 à 6, de ces groupements monoglycosylés identiques ou différents.

Selon un mode de réalisation, X, Y et Z sont tels que :

- soit X représente CR10, Y représente CR'10 et Z représente OR0, - soit X représente CR10, Y représente CORO et Z représente R'10

avec RIO, R'10 et RO tels que définis dans le cadre de l'invention.

Dans le cadre de la présente invention, on utilisera, en particulier, les définitions spécifiques des substituants données en combinaison.

Selon un premier mode de réalisation particulier, le composé (I) est tel que représenté par la formule (la) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique, où RI, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, RO et V sont tels que définis dans le cadre de la présente invention :

Selon un deuxième mode de réalisation particulier de l'invention, le composé (I) est tel que représenté par la formule (Ib) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RI, R2, R3, R4, R9, R'9, X, Y et Z sont tels que définis dans le cadre de la présente invention :

Selon un troisième mode de réalisation, le composé (I) est tel que représenté par la formule (le) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RO et RI sont tels que définis dans le cadre de la présente invention :

Selon un quatrième mode de réalisation, le composé (I) est tel que représenté par la formule (Id) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RI, R2, R3, R4, R9, R'9, Dl, D2, D3, X, Y et Z sont tels que définis dans le cadre de l'invention : D 1 O R2

Selon un cinquième mode de réalisation, le composé (I) est tel que représenté par la formule (le) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RO, RI, Dl, D2, et D3 sont tels que définis dans le cadre de l'inventi

Selon un mode particulier de réalisation, les composés de formule (I) sont tels que représentés par la formule (If) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RO est tel que défini dans le cadre de l'invention :

Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne les composés, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, choisis parmi : 2018/114933

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Composés de formule (II)

La présente invention concerne encore les composés de formule (II)

dans laquelle :

- R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R'9 et V sont tels que définis pour les composés de formule (I),

R12 représente un atome d'hydrogène, ou un groupe protecteur des fonctions aminé, - X, Y' et Z' sont tels que :

o soit X représente CR10, Y' représente CR'10 et Z' représente OR'O,

o soit X représente CR10, Y' représente COR'O et Z' représente R'10,

o soit X représente CR10, Y' représente un atome d'azote et Z' représente OR'O, o soit X représente un atome d'azote, Y' représente COR'O et Z représente RIO,

avec RO' représentant un groupe RO dont toutes les fonctions alcools sont protégées par un groupe protecteur, et RO, RIO et R'10 étant tels que définis pour les composés de formule (I),

sous la forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique.

Les composés de formule (II) sont des intermédiaires de synthèse des composés de formule (I). Par groupe protecteur des fonctions aminé, on entend les groupes protecteurs tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed. John Wiley et Sons, 2006 et dans Protective Groups, Kocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlag.

Selon un mode de réalisation, R12 représente un groupe protecteur des fonctions aminé. A titre d'exemple, R12 représente un groupe protecteur des fonctions aminé choisi parmi les groupes allyle ou carbamate, tel qu'un groupe tert-butoxycarbonyle (Boc), fluorophényleméthoxycarbonyle (Fmoc), allyloxycarbonyle (Alloc) ou 2,2,2- trichloroéthoxycarbonyle (Troc).

Selon un autre mode de réalisation particulier, R12 représente un atome d'hydrogène.

Selon un mode de réalisation, R'O représente un groupe R0 dont toutes les fonctions alcools sont protégées par un groupe protecteur des fonctions alcool, de préférence dans les conditions réactionnelles utilisées lors de la réaction entre les composés (II) et (III), et notamment par des groupes silyle tel que les groupes triméthylsilyle, tert-butyldiméthylsilyle, tert-butyldiphénylsilyle et triiso-propylsilyle ; sous forme d'acétal, et notamment de 1,3-dioxolane ; ou sous forme d'ester d'acides gras.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le composé (II) est tel que représenté par la formule (Ha) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous une forme enrichie en un isomère optique, où R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R12, RO et V sont tels que définis dans le cadre de l'invention :

Selon un deuxième mode de réalisation particulier de l'invention, le composé (II) est tel que représenté par la formule (Ilb) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où R2, R3, R4, R9, R'9, R12, X, Y et Z sont tels que définis dans le cadre de l'invention :

Selon un troisième mode de réalisation, le composé (II) est tel que représenté par la formule (Ile) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RO et R12 sont tels que définis dans le cadre de l'invention :

Selon un quatrième mode de réalisation particulier de l'invention, le composé (II) est tel que représenté par la formule (Ild) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où R2, R3, R4, R9, R'9, R12, Dl, D2, D3, X, Y et Z sont tels que définis dans le cadre de l'invention :

Selon un cinquième mode de réalisation, le composé (II) est tel que représenté par la formule (Ile) ci-dessous, sous forme d'un mélange d'isomères optiques selon toutes proportions, ou sous forme enrichie en un isomère optique, où RO, R12, Dl, D2 et D3 sont tels que définis dans le cadre de l'invention :

Procédé de préparation des composés de formule (I)

La présente invention concerne encore un procédé de préparation d'un composé (I), tel que décrit dans le cadre de la présente invention, comprenant les étapes suivantes :

- disposer d'un composé (II) tel que décrit dans le cadre de l'invention,

- disposer d'un composé (III) de formule :

avec RI tel que défini pour les composés de formule (I), et M représentant un groupe partant, notamment un atome d'halogène, et en particulier de chlore, un groupe imidazolyle ou un paranitrophénoxy, et de préférence M représentant un atome de chlore,

- obtenir le composé (IV) par réaction d'addition dudit composé (II) sur ledit composé (III), ledit composé (IV) ayant pour formule :

dans laquelle RI, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R'9, V, X, Y', et Z' sont tels que définis pour les composés de formule (I) et (II), et

- déprotéger les fonctions alcools présentes dans le groupe R'O dudit composés (IV) pour obtenir ledit composé (I).

Selon un mode de réalisation, la réaction d'addition du composé (II) sur le composé (III) est réalisée avec un composé (II) dans lequel R12 est un atome d'hydrogène.

Selon un autre mode de réalisation, on dispose d'un composé (II) dans lequel R12 n'est pas un atome d'hydrogène, et une étape de déprotection de la fonction aminé du composé (II) est réalisée préalablement à la réaction d'addition du composé (II) sur le composé (III), de sorte à obtenir un composé (II) tel que R12 = H.

Lorsque V = 0, le composé (II) peut être avantageusement obtenu selon les étapes suivantes :

- disposer d'un composé (V) de formule suivante :

- disposer d'un composé (VI) de formule suivante :

- et obtenir le composé (II) par réaction d'addition dudit composé (VI) sur le composé

(V),

dans lesquelles R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R'9, R12 X, Y' et Z' sont tels que définis dans le cadre de l'invention, et K représente un groupe partant, en particulier un halogène, et notamment le chlore, ou un groupe imidazolyle ou paranitrophénoxy. Lorsque R8 = D1-D2-D3, R8 peut être introduit par click chemistry. La formation d'un groupe triazole pourra être réalisée par réaction entre des fonctions -N3 et alcynyle, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Plus particulièrement, lorsque R8 = D1-D2-D3, avec Dl représentant un groupe -CH2-triazolyle, D2 représentant un groupe (C1-C10) alkylène, de préférence interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi 0 ou N, de préférence 0, et D3 réprésentant un motif acide folique, lié à D2 par une fonction acide carboxylique qu'il comprend de manière à former un lien amide, R8 peut être introduit par réaction entre un alcyne, porté par le précurseur du composé de formule (I), et un azoture selon une réaction de cycloaddition de Huisgens. L'azoture est formé préalablement par réaction entre la fonction acide de l'acide folique et la fonction aminé d'un composé de formule H2N-D2-N3.

Il est également possible, de manière préférée, d'utiliser les procédés illustrés dans les exemples.

Détection de la présence de qlvcosidase

Les composés de formule (I) selon l'invention peuvent être utilisés pour détecter une glycosidase, in vivo chez l'animal ou chez l'être humain.

L'administration du composé de formule (I) peut être réalisée par une injection intraveineuse ou intrapéritonéale, ou bien de façon cutanée, en pulvérisant un spray contenant la molécule en solution par exemple.

L'analyse de la fluorescence du composé de formule (I) peut avoir lieu au moyen d'une chambre d'imagerie selon des techniques de type tomographie par fluorescence ou épifluorescence. L'invention concerne également un procédé pour détecter in vitro ou ex vivo la présence d'une glycosidase au moyen d'un composé (I) selon l'invention. Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour détecter in vitro ou ex vivo la présence d'une glycosidase comprenant les étapes de :

- mise en contact d'un échantillon suspecté de contenir ladite glycosidase avec un composé (I) selon l'invention,

- application de conditions appropriées pour permettre la formation d'un composé fluorescent, notamment sous la forme d'un précipité, par clivage de la liaison covalente entre 0 et RO, suivi d'un clivage de la liaison -C(0)-0R1, conduisant à la libération de

HOR1 et

- analyse quantitative ou qualitative dudit précipité fluorescent.

L'échantillon peut être tout échantillon biologique approprié, issu d'un homme, d'un animal, d'un végétal ou d'un microorganisme. Dans le cas d'un échantillon issu d'un homme ou d'un animal, il peut s'agir notamment d'un prélèvement de fluide biologique, notamment un échantillon de sang total, de sérum, de plasma, d'urine, d'un prélèvement tissulaire ou de cellules isolées, et en particulier d'un milieu cellulaire. Dans le cas d'un échantillon issu d'un végétal, il peut s'agir d'un extrait de plante, de champignon ou d'algue, de cellules vivantes, et en particulier d'un milieu cellulaire. Il est également possible que l'échantillon comprenne directement le végétal. Dans le cas d'un échantillon issu d'un microorganisme, le microorganisme peut être une bactérie, un virus, un champignon ou une levure, et peut concerner également un microbiote. L'échantillon peut comprendre directement le microorganisme, ou bien un extrait de celui-ci ou encore du milieu de culture dans lequel le microorganisme a été incubé. Dans tous les cas, le prélèvement peut être utilisé tel quel, ou bien être soumis, avant mise en présence de la sonde, à une préparation de type enrichissement ou culture, bien connue de l'homme de l'art.

Dans le cas d'un échantillon provenant d'un animal, d'un végétal ou d'un microorganisme, l'invention concerne un procédé pour détecter la présence d'une glycosidase catalytiquement active comprenant les étapes de :

- mise en contact d'un échantillon suspecté de contenir ladite glycosidase avec un composé (I) selon l'invention, ledit,

- application de conditions appropriées pour permettre la formation d'un composé fluorescent, notamment sous la forme d'un précipité, par clivage de la liaison covalente entre 0 et R0, suivi d'un clivage de la liaison -C(0)ORl, suite à des réactions d'élimination et de cyclisation du tandem d'espaceurs, et

- analyse quantitative ou qualitative dudit précipité fluorescent.

L'analyse du composé ou précipité fluorescent peut comprendre :

- une étape d'exposition du précipité fluorescent à une source lumineuse capable de produire de la lumière à une longueur d'onde d'absorption du précipité fluorescent, et

- une étape de détection de la fluorescence du précipité résultante.

L'analyse peut en outre comprendre une étape, subséquente à l'étape de détection de la fluorescence, de tri des échantillons analysés basé sur le signal fourni par ledit précipité fluorescent. Les échantillons triés peuvent être des colonies de microorganismes séparées dans l'espace, tel que sur des boites de cultures microbiologiques. Les échantillons triés peuvent également être de petits objets, liquides, solides, gélatineux ou de composition hétérogène, contenant soit des biomolécules soit des colonies de microorganismes. Lorsque la détection est faite en parallèle sur plusieurs échantillons, le tri peut être effectué, par exemple, par déviation d'un flux d'échantillons mis en mouvement dans un dispositif permettant de les trier selon un signal optique, représentatif de la fluorescence émise, tel que cytomètre en flux ou dispositif de milli- ou micro-fluidique digitale. La présente invention rend l'activité des glycosidases accessible par imagerie par fluorescence utilisant des fluorophores ESIPT. De manière avantageuse, aucun bruit de fond dû à une dégradation spontanée (c'est-à-dire en l'absence de glycosidase cible, en milieu physiologique) n'est observé. La sonde elle-même est peu ou n'est pas fluorescente, en particulier à la longueur d'onde d'émission du fluorophore ESIPT libre sur laquelle l'instrument de détection/imagerie est réglé. La sonde fonctionne ainsi dans le mode éteint/allumé et peut être utilisée pour le développement d'analyses avec une sensibilité maximale. Cette invention permet, en fonction du groupe R0 sélectionné, de cibler des glycosidases avec une sélectivité élevée pour des groupements glycosyles particuliers.

Les sondes selon l'invention sont attractives pour plusieurs applications à haute sensibilité dans les sciences de la vie, et notamment : (1) le criblage à haut rendement d'une activité glycosidase exprimée par des colonies bactériennes sur une plaque gélosée (analyse sur colonies) ; (2) la détection in vitro de glycosidase dans des liquides biologiques (hématologie et autres) ; (3) la visualisation d'une activité glycosidase au niveau d'une simple cellule en cytométrie de flux; (4) la détection de glycosidases subcellulaires dans des cellules cultivées (microscopie de fluorescence confocale) ; (5) la détection histochimique de glycosidase (à l'échelle tissulaire) ; et finalement (6) l'imagerie in vivo d'un animal entier.

Ainsi, les composés de formule (I), en tant que substrats de glycosidase selon la présente invention, ont un grand nombre d'applications potentielles. Les exemples de telles applications incluent la conception d'analyses sur colonies bactériennes. Celles-ci sont actuellement réalisées sur une plaque gélosée (boîte de Pétri) où jusqu'à 3 000 colonies peuvent être distinguées sans avoir à les séparer activement dans des compartiments séparés comme les puits contenus dans une plaque à puits multiples. Il est ainsi possible de (1) concevoir des tests sur échantillons cliniques permettant d'identifier parmi un ensemble de lignées bactériennes une lignée pathogène d'intérêt et (2) réaliser des tests parallèles massifs d'une banque de protéines de sa propre production exprimée par un hôte bactérien classique (souvent commercial). Cette collection de protéines peut bien entendu contenir une protéine d'intérêt particulier, par exemple une glycosidase ayant une sélectivité pour un groupement glycosyle spécifique, ou une glycosidase hydrolysant une liaison glycosidique non naturelle. Dans le domaine de l'évolution dirigée des glycosidases en général ou des enzymes en particulier, il existe une forte demande pour des analyses efficaces et sensibles pour cribler de très grands nombres de variants de protéines dépassant aisément 10 ⁶ . L'application de la sonde selon l'invention peut être envisagée le plus aisément par dissolution dans la solution gélosée avant qu'elle soit versée dans la plaque où elle se gélifie. A titre d'alternative, les substrats sont incubés avec les colonies par immersion d'un filtre avant qu'il soit pressé sur les colonies. Le principal avantage auquel la sonde selon l'invention contribue pour une telle analyse sur colonies est la précipitation sur site du fluorophore ; une dilution du signal fluorescent par diffusion est donc très réduite, ce qui permet de plus grandes durées d'incubation et donc une plus grande sensibilité pour l'analyse. Le très grand déplacement de Stokes de la dichloro-HPQ (approximativement 140 nm) ou de tout analogue de la HPQ ne devrait pas rester mésestimé ; il contribue aussi à l'excellente sensibilité et la fluorescence émise est aisément distinguable de la fluorescence native qui pourrait provenir de l'échantillon biologique.

Les sondes selon l'invention peuvent servir aussi pour l'imagerie par fluorescence macroscopique, c'est-à-dire au niveau de l'organisme entier. Dans ce cas, la sonde pénétrera dans la paroi cellulaire pour atteindre l'activité d'intérêt.

Les exemples, en relation avec les figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.

La figure 1 est un schéma montrant le mécanisme de dégradation à partir des composés de formule (I) et faisant appel au tandem d'espaceurs.

La figure 2 est une courbe de l'évolution de la fluorescence à l'état solide pour les sondes 13 et 27 des exemples 1 et 3, et pour la sonde 28 de l'art antérieur à 37 °C (concentration : 10 μΜ).

La figure 3 représente les courbes de l'évolution de la fluorescence à l'état solide pour la sonde 21 de l'exemple 2 à 37 °C (concentrations : 0 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 25 μΜ et 50 μΜ).

La figure 4 représente le signal lumineux témoignant de l'activité cellulase produite par un micro-organisme.

La figure 5 est un graphe représentant la cinétique de détection d'activité cellulase dans un milieu de culture de microorganisme.

Exemples

Généralités

La chromatographie sur colonne a été réalisée sur gel de silice 60-mesh (40-63 μιτι). Les spectres de RMN de ^J H et de ¹³ C ont été enregistrés à 300 MHz et à 75 ou 125 MHz, respectivement, dans le chloroforme deutéré, le DMSO deutéré ou le méthanol deutéré. Les déplacements chimiques (δ) sont indiqués en ppm et notés en référence au tétraméthylsilane ou d'après des signaux résiduels du solvant ; les abréviations s = singulet, d = doublet, t = triplet, m = multiplet, b = large sont utilisées. Les constantes de couplage de RMN (J) sont indiquées en Hertz. Les analyses par fluorescence ont été réalisées dans des plaques en polypropylène noir à 96 puits (Corning Costar, Corning Inc.), et enregistrées sur un fluorimètre à microplaques (EnSpire plate reader de Perkin Elmer). Sauf quand cela est spécifié, les produits chimiques ont été achetés avec la qualité de réactif analytique et utilisés sans autre purification.

Le DCM sec commercial a été séché et purifié par passage sur colonne d'alumine activée sous argon (GT S100 Solvant Station System). La TEA a été distillée à partir de l'hydrure de calcium et conservée sur des pastilles de KOH. Les autres réactifs notés secs ont été séchés sur tamis moléculaires. Si le contraire n'est pas indiqué, toutes les réactions ont été conduites sous atmosphère d'air avec des solvants et réactifs commerciaux, sans séchage ou purification supplémentaire. De l'eau millipore obtenue à partir d'un système de purification Elga Purelab a été utilisée dans toutes les expériences.

Les abréviations suivantes sont utilisées :

DIPEA = diisopropyléthylamine

TEA = triéthylamine

py = pyridine

DCM = dichlorométhane

Rdt = rendement

DMSO = diméthylsulfoxyde

TFA = acide trifluoroacétique

rt = température ambiante

Exemple 1

Le composé 13 est préparé comme décrit sur le Schéma 1 suivant.

Schéma 1 : synthèse chimique du composé 13

94% 2 35% quant.

Préparation du composé 2 :

A une solution de 2-aminométhylpipéridine 1 (3.0 g, 26.3 mmol, 1.0 eq.) dans 100 mL de toluène a été ajouté petit à petit de l'anhydride phtalique (3.89 g, 26.3 mmol, 1.0 eq.) et goutte à goutte de la triéthylamine (550 pl., 3.95 mmol, 0.15 eq.). Le mélange a ensuite été chauffé à reflux pendant 2h à l'aide d'un appareil Dean-Stark. Ensuite, le mélange a été filtré et le solvant a été évaporé sous pression réduite. Le composé 2 (6.605 g, 24.7 mmol, rdt: 94%) a été obtenu sous forme de solide jaune pâle et utilisé sans purification.

!H-NMR (300 MHz, CDC ): δ (ppm) = 7.89-7.82 (m, 2H), 7.75-7.68 (m, 2H), 3.68 (d, J = 4 Hz, 2H), 3.13-3.05 (m, 1H), 2.98-2.88 (m, 1H), 2.64-2.54 (m, 1H), 1.87-1.78 (m, 1H), 1.76-1.68 (m, 1H), 1.63-1.54 (m, 1H), 1.45-1.34 (m, 2H), 1.30-1.15 (m, 1H). ¹³ C-NMR (75 MHz, CDC ): δ (ppm) = 168.4, 133.7, 131.9, 123.0, 55.5, 46.4, 43.4, 30.6, 26.1, 24.1.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 245.1290, cale. 245.1290

Préparation du composé 3 :

A une solution de composé 2 (6.605 g, 24.7 mmol, 1.0 eq.) dans 80 mL d'éthanol refroidi dans un bain de glace, du carbonate de potassium (4.36 g, 31.6 mmol, 1.3 eq.), de l'iodure de tétra- n-butylammonium (912 mg, 2.47 mmol, 0.10 eq.) et du bromure d'allyle (2.73 mL, 31.6 mmol, 1.3 eq.) ont été ajoutés. Le bain de glace a été enlevé et le mélange a été agité pendant 36 h. A la fin de la réaction, le mélange a été filtré sur Célite et évaporé sous pression réduite. L'huile résiduelle a été dissolute dans EtOAc et une solution aqueuse saturée de NH ₄ CI est ajoutée. Les deux phases ont été séparées et la phase organique a été lavée deux fois avec une solution aqueuse saturée de NH ₄ CI. Les phases aqueuses combinées ont été extraites 3 fois avec EtOAc. Les phases organiques combinées ont été séchées avec Na ₂ S04, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (DCM pur, puis DCM : MeOH : Et ₃ N / 99:0.5:0.5 / v:v:v) pour obtenir le composé 3 sous forme d'huile jaune qui cristallise (2.24 g, 7.89 mmol, yield: 35%).

^-NMR (300 MHz, CDC ): 5 (ppm) = 7.84-7.78 (m, 2H), 7.72-7.65 (m, 2H), 5.95-5.81 (m, 1H), 5.22-5.08 (m, 2H), 3.93 (dd, 1H, J = 13 Hz, J = 5 Hz), 3.73 (dd, 1H, J = 13 Hz, J = 8 Hz), 3.42 (dd, 1H, J = 14 Hz, J = 6 Hz), 3.21 (dd, 1H, J = 14 Hz, J = 6 Hz), 2.88-2.76 (m, 2H), 2.37-2.28 (m, 2H), 1.74-1.47 (m, 4H), 1.40-1.25 (m, 2H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCI ₃ ): <5 (ppm) = 168.3, 135.5, 133.8, 132.0, 123.0, 117.2, 57.6, 57.3, 50.3, 38.4, 28.1, 24.7, 22.0.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 285.1595, cale. 285.1603

Préparation du composé 4 :

A une solution de 3 (1.312 g, 4.6 mmol, 1.0 eq.) dans / ^' PrOH : H ₂ 0 / 6:1 / v:v (50 mL) refroidie dans de la glace a été ajouté petit à petit du borohydrure de sodium (874 mg, 23 mmol, 5.0 eq.). Après avoir agité à température ambiante pendant une nuit, le pH a été acidifié à pH = 1 à l'aide d'une solution aqueuse de HCI à 37%. Le mélange a été filtré et ensuite chauffé à 80°C pendant 2 h. / ^' PrOH a été évaporé sous pression réduite et la solution aqueuse résultante a été lavée 5 fois avec de l'éther diéthylique et ensuite lyophilisé. Le composé 4 a été obtenu sous forme de poudre blanche (1.045 g, 4.6 mmol, rdt quantitatif).

RMN du produit basique (l-allyl-2-(aminométhyl)pipéridine) : ^J H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ): δ (ppm) = 5.99-5.86 (m, 1H), 5.24-5.13 (m, 2H), 3.41 (ddt, 1H, J = 14 Hz, J = 5.7 Hz, J = 1.5 Hz), 3.04-2.90 (m, 3H), 2.74 (dd, 1H, J = 13 Hz, J = 3.3 Hz), 2.21 (tt, 2H, J = 9.6 Hz, J = 3.3 Hz), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.68-1.43 (m, 2H), 1.39-1.25 (m, 3H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 134.93, 116.87, 61.47, 56.23, 51.93, 42.97, 28.28, 24.95, 23.66.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 155.1543, cale. 155.1548

Préparation du composé 6 :

De l'acétobromogalactose 5 (700 mg, 1.70 mmol, 1.0 eq.), du 4-hydroxy-3-nitrobenzaldéhyde (313 mg, 1.87 mmol, 1.1 eq.) et de l'Ag ₂ 0 (1.300 g, 5.61 mmol, 3.3 eq.) ont été dissouts dans de l'acétonitrile et agités pendant une nuit à température ambiante. Le mélange réactionnel a ensuite été filtré sur Célite et concentré sous pression réduite. L'huile résultante a été purifiée par colonne chromatographique sur gel de silice (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 4:6 / v:v) pour obtenir le composé 6 sous forme de solide jaune pâle (669 mg, 1.34 mmol, rdt : 79%).

^-NMR (300 MHz, DMSO-ûfe): δ (ppm) = 9.98 (s, 1H), 8.45 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.26 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.80 (d, J = 8 Hz, 1H), 5.40 (bs, 1H), 5.30-5.27 (m, 2H), 4.55 (td, J = 6 Hz, J = 1 Hz, 1H), 4.15 (d, J = 6 Hz, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.96 (s, 3H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 188.55, 170.24, 170.07, 169.16, 153.45, 141.25, 133.96, 131.48, 126.84, 118.80, 100.09, 71.82, 70.35, 67.59, 66.58, 61.36, 20.66, 20.61, 20.59, 20.55. HRMS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 520.1052, cale. 520.1067

Préparation du composé 7 :

A une solution de composé 6 (636 mg, 1.28 mmol, 1.0 eq.) dans CHCb : /PrOH 5: 1 v:v (12 mL) dans un bain de glace a été ajouté du borohydrure de sodium (53 mg, 1.41 mmol, 1.1 eq.). La réaction a été agitée pendant lh et arrêtée par ajout d'une solution aqueuse saturée de NH ₄ CI. Après 5 minutes d'agitation, les phases sont séparées et la phase aqueuse a été extraite 2 fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques combinées ont été séchées avec Na ₂ S0 , filtrées et évaporées sous pression réduite pour donner le composé 7 sous forme de poudre blanche

(605 mg, 1.22 mmol, rdt : 95%) qui a été utiliées dans l'étape suivante sans purification.

JH-NMR (300 MHz, DMSO-ûfe): δ (ppm) = 7.80 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,43 (t, J = 6 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.31-5.19 (m, 2H), 4.53-4.45 (m, 3H), 4.19-4.08 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 1.95 (s, 3H). ¹³ C-NMR (125 MHz, DMSO-ûfe): δ (ppm) = 170.54, 170.46, 170.13, 169.47, 147.70, 140.84, 138.90, 132.41, 122.80, 118.30, 99.34, 71.35, 70.54, 68.34, 67.72, 61.94, 61.87, 21.10, 20.98, 20.92.

HRMS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 522.1209, cale. 522.1224

Préparation du composé 8 :

A une solution de composé 7 (120 mg, 0.240 mmol, 1.0 eq.) dans du DCM sec (5ml_) refroidie dans de la glace a été ajouté successivement du chloroformate de 4-nitrophényl (107 mg, 0.53 mmol, 2.2 eq.) et de la pyridine (48 μΙ_, 0.60 mmol, 2.5 eq.) goutte à goutte. Le mélange réactionnel a été agité à 0°C pendant 30 min et à température ambiante pendant 2h. A la fin de la réaction, la reaction a été arrêtée à l'aide d'une solution aqueuse HCI 1 M et les phases ont été séparées. La phase organique a été lavée avec une solution de HCI 1 M, et les phases aqueuses combinées ont été extraites avec du DCM. Les phases organiques ont été séchées avec Na ₂ S04, filtrées et évaporées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (gradient éther de pétrole : acétate d'éthyle / 85: 15 to 50:50 / v:v) pour obtenir le composé 7 sous forme de solide blanc (111 mg, 0.18 mmol, rdt : 75%).

^J H-NMR (300 MHz, CDCb): δ (ppm) = 8.32 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.44-7.39 (m, 3H), 5.59 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.17-5.14 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 11 Hz, 3 = 1 Hz, 1H), 4.23-4.14 (m, 2H), 2.23 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb): <5= 171.0, 137.8, 135.1, 129.4, 128.9, 128.9, 128.8, 128.4, 127.3, 127.2, 80.1, 62.8, 54.2, 53.0, 49.7, 43.9, 41.0, 40.1, 28.5 ppm.

MS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 687.1263, cale. 687.1286

Préparation du composé 9 :

A une suspension de composé 4 (44 mg, 0.20 mmol, 1.3 eq.) dans du DCM (3 mL) a été ajouté le composé 8 (100 mg, 0.150 mmol, 1.0 eq.). Le mélange réactionnel est refroidi dans un bain de glace et de la DIPEA (81 pL, 0.47 mmol, 3.1 eq.) a été ajoutée. Après 5 minutes, le bain de glace est retiré et le mélange réactionnel est chauffé à 30°C pendant une nuit. Le mélange a ensuite été lavé avec des solutions aqueuses saturées de Na ₂ C03 et NaHC0 ₃ , séchées avec Na ₂ S0 ₄ , filtrées et évaporées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice pour obtenir le composé 9 sous forme de solide blanc (56 mg, 0.083 mmol, rdt : 55%).

NMR: ^J H-NMR (300 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 7.82 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.93-5.75 (m, 1H), 5.56 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.32 (bs, 1H), 5.22-5.06 (m, 6H), 4.29-4.14 (m, 2H), 4.11-4.06 (m, 1H), 3.43-3.22 (m, 3H), 2.99-2.88 (m, 2H), 2.43-2.36 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.76-1.25 (m, 6H).

1 ³ C-NMR (125 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 170.31, 170.19, 170.13, 169.40, 156.26, 148.92, 141.30, 134.68, 133.19, 133.14, 124.59, 119.83, 117.75, 100.82, 71.47, 70.57, 67.85, 66.75, 64.74, 61.37, 58.30, 56.36, 51.99, 42.51, 28.97, 25.00, 23.73, 20.70, 20.67, 20.59.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 680.2683, cale. 680.2667

Préparation du composé 10 :

Une solution de composé 9 (20 mg, 0.029 mmol, 1.0 eq.) et d'acide 1,3-diméthylbarbiturique (37 mg, 0.24 mmol, 8.0 eq.) dans du DCM sec (3 ml_) a été dégasée avec un flux d'argon. Ensuite, du palladium (0) tétrakis(triphénylphosphine) (0.6 mg, 0.0005 mmol, 2 mol %) a été ajouté. À la fin de la réaction, le mélange réactionnel a été évaporé à sec et purifié par colonne chromatographique sur gel de silice pour obtenir le composé 10 sous forme de solide blanc (13 mg, 0.020 mmol, rdt : 70%).

^-NMR (300 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 7.82 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.56 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.32-5.26 (m, 1H), 5.14-5.06 (m, 4H), 4.30-4.15 (m, 2H), 4.11-4.06 (m, 1H), 3.29-3.20 (m, 1H), 3.11-3.00 (m, 2H), 2.72-2.58 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 2H), 1.42-1.34 (m, 2H), 1.31-1.26 (m, 1H). ¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 170.32, 170.19, 170.14, 169.40, 156.15, 148.92, 141.30, 133.14, 133.10, 124.59, 119.84, 100.82, 71.48, 70.57, 67.85, 66.73, 64.73, 61.36, 56.03, 46.88, 46.68, 30.26, 26.47, 24.26, 20.70, 20.67, 20.59.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 640.2337, cale. 640.2354

Préparation du composé 12:

A une suspension de composé 10 (13 mg, 0.020 mmol, 1.0 eq.) dans du DCM sec (2 ml_) sous atmosphère d'argon et refroidie dans de la glace a été ajoutée goutte à goutte une solution de composé 11 (8 mg, 0.021 mmol, 1.05 eq.) et de DIPEA (10 pL, 0.060 mmol, 3.0 eq.). Après l'addition, le mélange réactionnel a été mélangé à 0°C pendant 30 min puis à température ambiante pendant une nuit. Le mélange réactionnel a ensuite été lavé 3 fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCC et la phase organique a été séchée avec Na ₂ S04, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice pour obtenir le composé 12 sous forme de poudre blanche (10 mg, 0.010 mmol, rdt : 52%). ^-NMR (300 MHz, CDC ): <5 (ppm) = 10.41-10.29 (m, 1H), 8.24 (bs, 1H), 8.16-8.05 (m, 1H), 7.85-7.63 (m, 2.5H), 7.57-7.46 (m, 2H), 7.45-7.37 (m, 0.5H), 7.25-7.08 (m, 2H), 6.23-6.10 (m, 0.5H), 5.83-5.75 (m, 0.5H), 5.57 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.17- 4.96 (m, 2H), 4.94-4.69 (m, 1H), 4.58 (bs, 1H), 4.33-3.99 (m, 4H), 3.79-3.63 (m, 1H), 3.39- 3.01 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.82-1.24 (m, 6H).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDC ): <5 (ppm) = 170.36, 170.20, 170.14, 169.39, 161.09, 156.42, 152.66, 149.05, 147.37, 140.98, 139.32, 135.29, 133.30, 132.64, 132.37, 130.70, 129.72, 127.87, 125.88, 125.39, 125.04, 124.39, 124.03, 122.30, 119.77, 114.09, 100.76, 71.43, 70.62, 67.84, 66.73, 64.44, 61.31, 40.84, 29.72, 29.40, 25.38, 22.72, 20.69, 20.60, 18.89.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 972.2077, cale. 972.2109

Préparation du composé 13 :

A une solution de composé 12 (10 mg, 0.010 mmol, 1.0 eq.) dans du méthanol sec (2 mL) dans un bain de glace a été ajouté du méthoxyde de sodium (1.1 mg, 0.020 mmol, 2.0 eq.). Le mélange réactionnel a été agité pendant 1 h à 0 °C. Ensuite, la réaction est arrêtée avec de la résine Dowex®50X8-100, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le produit 13 a été obtenu sous forme de résine blanche

(8 mg, 0.010 mmol, rdt quantitatif). Une haute pureté a été obtenue à l'aide d'une HPLC préparative en phase inverse (isocratique, eau : acétonitrile 1 : 1 v:v avec 0.1% TFA) pour donner le composé 13 sous forme de poudre blanche.

!H-NMR (300 MHz, CD ₃ OD): <5 (ppm) = 8.07 (m, 1H), 7.73-7.69 (m, 2H), 7.67-7.60 (m, 2H), 7.50-7.31 (m, 2H), 7.31-7.23 (m, 1H), 7.13-7.05 (m, 1H), 5.02-4.93 (m, 1H), 4.93-4.82 (m, 2H), 4.51-4.40 (m, 1H), 4.13-4.03 (m, 1H), 3.83-3.78 (m, 1H), 3.77- 3.71 (m, 1H), 3.68-3.58 (m, 3H), 3.53-3.44 (m, 2H), 3.12-3.01 (m, 1H), 2.94-2.83 (m, 1H), 1.59-1.25 (m, 6H).

1 ³ C -NMR (125 MHz, CD3OD): <5 (ppm) = 163.06, 158.56, 154.58, 152.42, 151.11, 149.16,

148.62, 141.78, 136.22, 134.26, 134.07, 132.97, 132.68, 132.09, 131.01, 130.43, 129.97, 126.45, 126.12, 125.42, 125.22, 123.48, 118.91, 103.10, 96.37, 77.36, 74.86, 71.96, 70.10, 65.76, 62.32, 53.19, 52.68, 41.16, 27.00, 26.27, 19.86.

HRMS: ESI: m/z [M+H] ⁺ trouvé: 804.1671 cale. 804.1687

Exemple 2

Le composé 21 est préparé comme décrit sur le Schéma 2 suivant.

Schéma 2 : synthèse chimique du composé 21.

Préparation du composé 15 :

Une procédure analogue à celle emioyée pour la préparation du composé 6 a été utilisée à partir de l'acétobromo-D-cellobiose 14 (2 g, 2.86 mmol, 1.0 eq.), de la 4-hydroxy-3-nitrobenzaldéhyde (478 mg, 2.86 mmol, 1.0 eq.) et de Ag ₂ 0 (729 mg, 3.15 mmol, 1.1 eq.) pour obtenir le composé 15 sous forme de solide jaune pâle (1.864 g, 2.37 mmol, rdt : 83%).

Ή-ΝΜΙ* (300 MHz, CDC ): δ (ppm) = 9.98 (s, 1H), 8.30 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.35-5.05 (m, 5H), 4.95 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.64-4.57 (m, 2H), 4.38 (dd, J = 13 Hz, J = 4 Hz, 1H), 4.16-3.98 (m, 3H), 3.94-3.87 (m, IH), 3.74-3.67 (m, IH), 2.12 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.00 (s, 3H).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb) : <5 (ppm) = 189.23, 170.88, 170.54, 170.46, 170.11, 169.71, 169.68, 169.47, 153.68, 141.40, 134.58, 131.65, 127.10, 118.64, 101.22, 98.98, 76.24, 73.60, 73.19, 72.39, 71.93, 70.97, 68.11, 61.91, 21.02, 20.88, 20.86.

HRMS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 808.1874, cale. 808.1912

Préparation du composé 16 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 7 a été employée à partir du composé 15 (650 mg, 0.83 mmol, 1.0 eq.) et de NaBH ₄ (34 mg, 0.91 mmol, 1.1 eq.) pour obtenir le composé 16 sous forme de poudre blanche (580 mg, 0.74 mmol, rdt : 89%), qui a été utilisé sans purification dans la réaction suivante.

^-NMR (300 MHz, CDCb) : <5 (ppm) = 7.82 (d, 3 = 2 Hz, IH), 7.54 (dd, 3 = 9 Hz, 3 = 2 Hz, IH), 7.32 (d, 3 = 9 Hz, IH), 5.31-5.06 (m, 5H), 4.97 (t, 3 = 8 Hz, IH), 4.74 (d, 3 = 6 Hz, IH), 4.64-4.57 (m, 2H), 4.40 (dd, 3 = 13 Hz, 3 = 4 Hz, I H), 4.15-4.07 (m, 2H), 4.01-3.95 (m, IH), 3.84-3.78 (m, IH), 3.74-3.68 (m, IH), 2.14 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.87 (t, 3 = 6 Hz, IH).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb) : <5 (ppm) = 170.48, 170.20, 170.12, 169.79, 169.54, 169.32, 169.11, 148.15, 141.10, 137.49, 131.78, 123.00, 119.23, 100.71, 99.61, 76.01, 73.04, 72.86, 72.23, 71.95, 71.60, 70.85, 67.83, 63.04, 61.63, 61.57, 20.60, 20.54, 20.41.

HRMS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 810.2022, cale. 810.2069

Préparation du composé 17 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 8 a été utilisée à partir du composé 16 (400 mg, 0.51 mmol, 1.0 eq.), du chloroformate de 4-nitrophényle (225 mg, 1.07 mmol, 2.2 eq.) et de pyridine (102 pl., 1.27 mmol, 2.5 eq.) pour obtenir le composé 17 sous forme de poudre blanche (380 mg, 0.40 mmol, rdt : 79%).

^J H-NMR (300 MHz, CDCb) : δ (ppm) = 8.32 (d, 3 = 9 Hz, 2H), 7.92 (d, 3 = 2 Hz, I H), 7.63 (dd, 3 = 9 Hz, 3 = 2 Hz, IH), 7.41 (d, 3 = 9 Hz, 2H), 7.35 (d, 3 = 9 Hz, 2H), 5.32-5.07 (m, 5H), 4.97 (t, 3 = 8 Hz, IH), 4.67-4.58 (m, 2H), 4.64-4.57 (m, 2H), 4.40 (dd, 3 = 13 Hz, 3 = 4 Hz, IH), 4.15-4.06 (m, 2H), 4.03-3.97 (m, IH), 3.87-3.81 (m, IH), 3.74-3.68 (m, IH), 2.14 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 3H).

1 ³ C-NMR (75 MHz, CDCb) : δ (ppm) = 170.51, 170.07, 170.05, 169.68, 169.33, 169.28, 169.03, 155.27, 152.18, 149.47, 145.42, 140.92, 133.94, 130.03, 125.35, 125.29, 121.71, 119.05, 100.75, 99.22, 75.98, 73.09, 72.80, 72.09, 71.91, 71.54, 70.70, 68.81, 67.74, 61.56, 61.53, 20.60, 20.55, 20.42.

HRMS: ESI: [M+Na] ⁺ m/z trouvé 975.2103, cale. 975.2131

Préparation du composé 18 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 9 a été utilisée à partir des composés 17 (100 mg, 0.11 mmol, 1.0 eq.), 4 (30 mg, 0.20 mmol, 1.3 eq.) et de DIPEA (40 pl., 0.23 mmol, 2.1 eq.) pour obtenir le composé 18 sous forme de solide blanc (68 mg, 0.070 mmol, rdt : 67%).

^-NMR (300 MHz, CDCb): δ (ppm) = 7.82 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.94-5.80 (m, 1H), 5.44-5.06 (m, 9H), 4.96 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.64-4.56 (m, 2H), 4.40 (dd, J = 13 Hz, J = 4 Hz, 1H), 4.15-4.06 (m, 2H), 4.01-3.95 (m, 1H), 3.84-3.78 (m, 1H), 3.73-3.67 (m, 1H), 3.44-3.24 (m, 3H), 3.05-2.91 (m, 2H), 2.42 (bs, 1H), 2.22 (t, J = 11 Hz, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.08 (s, 6H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.77-1.26 (m, 6H).

1 ³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 170.49, 170.18, 170.12, 169.72, 169.47, 169.29, 169.02, 156.20, 148.73, 141.14, 134.66, 133.19, 132.93, 124.56, 119.18, 117.69, 100.80, 99.37, 75.94, 73.01, 72.86, 72.18, 72.06, 71.59, 70.84, 67.74, 64.64, 61.51, 61.48, 58.28, 56.31, 51.93, 42.47, 28.93, 24.94, 23.67, 20.69, 20.64, 20.54, 20.52.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 968.3545, cale. 968.3512

Préparation du composé 19 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 10 a été utilisée à partir du composé 18 (68 mg, 0.070 mmol, 1.0 eq.), d'acide 1,3-diméthylbarbiturique (86 mg, 0.56 mmol, 8.0 eq.) et de palladium(O) tétrakis(triphénylphosphine) (1.6 mg, 0.0014 mmol, 2 mol %) pour obtenir le composé 19 sous forme de solide blanc (49 mg, 0.053 mmol, rdt : 77%).

^J H-NMR (300 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 7.79 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.49-5.42 (m, 1H), 5.29-5.04 (m, 7H), 4.95 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.63-4.55 (m, 2H), 4.39 (dd, J = 13 Hz, J = 4 Hz, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.84-3.78 (m, 1H), 3.73-3.67 (m, 1H), 3.30-3.21 (m, 1H), 3.12-3.02 (m, 2H), 2.70-2.62 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.08 (s, 6H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.85-1.12 (m, 6H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 170.50, 170.20, 170.12, 169.72, 169.48, 169.30, 169.02, 156.10, 148.74, 141.15, 133.18, 132.84, 124.56, 119.20, 100.82, 99.36, 75.93, 73.02, 72.87, 72.19, 72.08, 71.60, 70.85, 67.75, 64.68, 61.53, 61.47, 56.00, 46.83, 46.63, 30.22, 26.42, 24.22, 20.70, 20.66, 20.55, 20.53. HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 928.3230, cale. 928.3199

Préparation du composé 20 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 12 a été utilisée à partir des composés 19 (49 mg, 0.053 mmol, 1.0 eq.), 11 (21 mg, 0.054 mmol, 1.05 eq.) et de DIPEA (28 pl., 0.16 mmol, 3.0 eq.) pour obtenir le composé 20 sous forme de poudre blanche (29 mg, 0.023 mmol, rdt : 43%).

^-NMR (300 MHz, CDC ): δ (ppm) = 10.52 (bs, 1H), 8.21 (bs, 1H), 8.10-7.97 (m, 1H), 7.76-7.64 (m, 2.5H), 7.56 (m, 0.5H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.18-7.09 (m, 2H), 6.17-6.07 (m, 0.5H), 5.76 (bs, 0.5H), 5.30-5.04 (m, 5H), 4.95 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.91-4.72 (m, 2H), 4.63- 4.48 (m, 3H), 4.40 (dd, J = 13 Hz, J = 4 Hz, 1H), 4.19-4.04 (m, 3H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.83- 3.57 (m, 3H), 3.37-3.18 (m, 1.5H), 3.11-2.98

(m, 0.5H), 2.12 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.06 (s, 6H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.81- 1.44 (m, 6H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 170.52, 170.21, 170.18, 169.74, 169.50, 169.31, 169.04, 161.13, 156.33, 154.23, 152.63, 149.11, 147.57, 147.34, 140.89, 135.28, 133.22, 132.80, 132.24, 130.59, 129.54, 127.82, 126.91, 125.85, 125.24, 124.84, 124.17, 122.22, 119.11, 100.85, 99.30, 75.97, 72.98, 72.90, 72.24, 72.20, 72.08, 71.61, 70.85, 67.76, 64.47, 61.53, 61.48, 51.46, 40.79, 26.03, 25.27, 20.70, 20.67, 20.54, 18.84.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 1260.2914, cale. 1260.2954

Préparation du composé 21 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 13 a été utilisée à partir du composé 20 (23 g, 0.018 mmol, 1.0 eq) et de méthoxyde de sodium (1.0 mg, 0.036 mmol, 2.0 eq.) pour obtenir le composé 21 sous forme de poudre blanche (17 mg, 0.017 mmol, rdt : 97%).

JH-NMR (300 MHz, CD ₃ OD): <5 (ppm) = 8.19 (bs, 1H), 7.85-7.81 (m, 2H), 7.79-7.72 (m, 2H), 7.62-7.43 (m, 2H), 7.40-7.33 (m, 1H), 7.27-7.17 (m, 2H), 5.14-5.04 (m, 1.5H), 4.99-4.94 (m, 1H), 4.62-4.52 (m, 0.5H), 4.47 (d, J = 8 Hz, 2H), 4.26-4.16 (m, 1H), 3.97-3.82 (m, 3H), 3.74- 3.56 (m, 5H), 3.44-3.35 (m, 3.5H), 3.30-2.95 (m, 3H), 3.11-2.98 (m, 0.5H), 1.72-1.15 (m, 6H). ¹³ C-NMR (75 MHz, CD3OD): <5 (ppm) = 161.65, 157.10, 153.33, 153.05, 150.98, 149.35, 148.93, 147.75, 147.23, 140.47, 134.82, 132.84, 132.67, 131.57, 130.77, 129.62, 129.05, 128.55, 125.05, 123.86, 122.08, 117.46, 103.16, 100.77, 78.53, 76.75, 76.50, 75.55, 74.94, 73.51, 73.00, 72.99, 69.98, 64.34, 61.05, 60.19, 51.29, 39.52, 25.73, 24.79, 18.46.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé: 966.2201, cale. 966.2215 Exemple 3 Le composé 21 est préparé comme décrit sur le Schéma 3 suivant.

Schéma 3 : synthèse chimique du composé 27.

Préparation du composé 22 :

A une solution de 3 (335 mg, 1.48 mmol, 1.0 eq.) dans 5 mL de dichlorométhane ont été ajoutés du carbonate de potassium (636 mg, 4.6 mmol, 3.1 eq.) et goutte à goutte du chloroformiate de méthyle (115 pL, 1.48 mmol, 1.0 eq.). Après 10 minutes d'agitation à température ambiante, le solvant a été évaporé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice pour obtenir le composé 22 sous forme d'une huile jaune claire (282 mg, 1.33 mmol, rdt: 90%). ^-NMR (300 MHz, CDCb): δ (ppm) = 5.96-5.82 (m, 1H), 5.24-5.16 (m, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.41-3.30 (m, 3H), 3.01-2.91 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 1.75-1.70 (m, 1H), 1.60-1.56 (m, 2H), 1.54-1.40 (m, 2H), 1.37-1.24 (m, 1H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): <5(ppm) = 157.34, 134.50, 117.71, 58.62, 56.29, 51.90, 42.31, 28.85, 24.92, 23.58.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 213.1601, cale. 213.1603

Préparation du composé 23 :

A une solution de tétrahydruroaluminate de lithium (2.64 mmol, 2.0 eq.) dans 5 mL de tétrahydrofurane, 22 (280 mg, 1.32 mmol, 1.0 eq.) a été ajouté goutte à goutte et le milieu a été agité à 40°C pendant une nuit. Le solvant a été évaporé et le produit 23 utilisé sans purification.

^J H-NMR (300 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 5.97-5.82 (m, 1H), 5.24-5.08 (m, 2H), 3.43-3.33 (m, 1H), 2.98-2.84 (m, 2H), 2.71-2.53 (m, 3H), 2.46-2.30 (m, 3H), 2.23-2.12 (m, 2H), 1.83-1.23 (m, 8H).

1 ³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 127.43, 124.84, 61.65, 58.05, 55.71, 52.99, 52.19, 50.49, 48.26, 45.28, 34.14, 27.96, 26.19, 21.68, 21.43, 20.96, 20.02.

Préparation du composé 24 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 9 a été utilisée à partir des composés 8 (150 mg, 0.23 mmol, 1.0 eq.), 23 (100 mg, 0.42 mmol, 1.8 eq.) et de DIPEA (300 pL, 1.72 mmol, 7.6 eq.) pour obtenir le composé 24 sous forme de solide blanc (84 mg, 0.12 mmol, rdt : 53%).

^J H-NMR (500 MHz, CDCb): δ (ppm) = 7.75 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.90-5.72 (m, 1H), 5.50 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.12-4.99 (m, 6H), 4.25-4.11 (m, 2H), 4.11-4.01 (m, 1H), 3.58-3.47 (m, 1H), 3.35-3.19 (m, 2H), 3.09-2.96 (m, 1H),

2.88 (d, J = 3 Hz, 3H), 2.81-2.71 (m, 1H), 2.68-2.58 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.70-1.36 (m, 6H).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb): <5 (ppm) = 170.29, 170.18, 170.11, 169.38, 156.04, 148.92, 141.16, 135.08, 133.27, 133.23, 124.60, 119.66, 117.51, 100.69, 71.41, 70.53, 67.81, 66.74, 65.25, 61.36, 57.46, 57.10, 51.26, 49.88, 35.68, 30.92, 29.67, 28.20, 24.90, 22.60, 20.64.

LRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 694.2, cale. 694.2823.

Préparation du composé 25 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 10 a été utilisée à partir du composé 24 (84 mg, 0.12 mmol, 1.0 eq.), d'acide 1,3-diméthylbarbiturique (95 mg, 0.61 mmol, 5.0 eq.) et de palladium(O) tétrakis(triphénylphosphine) (1 mg, 0.0012 mmol, 1 mol %) pour obtenir le composé 25 sous forme de solide blanc (49 mg, 0.07 mmol, rdt : 62%).

^-NMR (500 MHz, CDCb): δ (ppm) = 7.78 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.51 (dd, J = 10 Hz, J = 8 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 3 Hz, 1H), 5.32-5.26 (m, 1H), 5.13-4.98 (m, 4H), 4.24-4.19 (m, 1H), 4.16-4.10 (m, 1H), 4.08-4.03 (m, 1H), 3.26-3.19 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 3.06-3.01 (m, 1H), 2.93 (d,

J = 7 Hz, 3H), 2.82-2.68 (m, 1H), 2.61-2.51 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.79-1.75 (m, 1H), 1.61-1.50 (m, 2H), 1.42-1.20 (m, 3H).

¹³ C-NMR (125 MHz, CDCb): δ (ppm) = 170.34, 170.22, 170.16, 169.42, 156.23, 148.93, 141.26, 133.30, 133.20, 124.59, 119.74, 100.77, 71.47, 70.57, 67.86, 66.77, 65.28, 61.39, 55.55, 55.12, 46.80, 36.00, 30.56, 26.30, 24.35, 20.72, 20.70, 20.62.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 654.2484, cale. 654.2504

Préparation du composé 26 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 12 a été utilisée à partir des composés 25 (25 mg, 0.04 mmol, 1.0 eq.), 11 (21 mg, 0.04 mmol, 1.0 eq.) et de DIPEA (33 μΙ_, 0.19 mmol, 5.0 eq.) pour obtenir le composé 26 sous forme de poudre blanche (10 mg, 0.01 mmol, rdt : 27%).

^J H-NMR (300 MHz, CDCb): δ (ppm) = 10.65-10.32 (m, 1H), 8.27-8.14 (m, 1H), 8.06-7.90 (m, 1H), 7.86-7.67 (m, 3H), 7.57-7.46 (m, 1H), 7.46-7.34 (m, 1H), 7.34-7.21 (m, 1H), 7.11-7.03 (m, 1H), 5.56-5.49 (m, 1H), 5.46 (br s, 1H), 5.13-4.98 (m, 2H), 4.98-4.67 (m, 1H), 4.55 (br s, 1H), 4.31-3.97 (m, 4H), 3.93-3.78 (m, 1H), 3.28-3.03 (m, 2H), 3.01-2.88 (m, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.78-1.23 (m, 6H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCb): δ (ppm) = 170.41, 170.30, 170.25, 169.52, 160.53, 156.49, 153.10, 149.15, 147.52, 141.32, 139.29, 135.29, 133.31, 132.92, 132.28, 130.79, 129.79, 127.87,

126.09, 125.49, 125.13, 124.45, 124.38, 122.55, 119.83, 114.28, 100.84, 71.54, 70.67, 67.94,

66.82, 65.99, 61.42, 40.78, 29.83, 29.46, 26.68, 25.40, 20.78, 20.70, 20.54, 19.04.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé 986.2219, cale. 986.2260

Préparation du composé 27 :

Une procédure analogue à celle emloyée pour la préparation du composé 13 a été utilisée à partir du composé 26 (10 g, 0.01 mmol, 1.0 eq) et de méthoxyde de sodium (2.0 mg, 0.04 mmol, 3.5 eq.) pour obtenir le composé 27 sous forme de poudre blanche (3.57 mg, 0.004 mmol, rdt : 43%).

Les spectres RMN sont trop peu résolus pour être attribués.

HRMS: ESI: [M+H] ⁺ m/z trouvé: 818.1838, cale. 818.1838 Exemple 4

Les sondes 13, 21 et 27 selon l'invention ont été évaluées par incubation avec l'enzyme cible, la β-galactosidase (EC 3.2.1.23 ; « b-gal » ; commercial) dans un milieu in vitro dans des micro- plaques à multi-puits conçues pour des lecteurs à fluorescence. Les sondes ont été évaluées selon les critères suivants :

-mise en évidence de l'intensité de fluorescence élevée générée par la présence de l'activité enzymatique (« allumé »),

-mise en évidence de l'absence totale (« éteint ») de fluorescence dans des échantillons qui ne contiennent pas l'enzyme cible (pas de fluorescence intrinsèque),

-mise en évidence de l'absence de toute dégradation hydrolytique de la sonde au cours du temps démontrant la robustesse de la sonde à pH 7 dans un milieu aqueux (pas de signal faussement positif),

-mise en évidence de la rapidité de réponse à la présence de l'activité enzymatique permettant d'atteindre rapidement un signal maximal,

-mise en évidence de la cinétique améliorée de la sonde à deux espaceurs,

-mise en évidence de la forte photo-stabilité du fluorophore solide généré sous irradiation prolongée par le lecteur de fluorescence.

Ces résultats ont été comparés avec ceux obtenus avec une sonde de l'art antérieur (composé I. l de la demande WO 2014/020285) comportant un espaceur de type cyclisant (28) :

(28)

Protocole de détection de la fluorescence :

Des solutions mères de sondes à 10 mM dans MeOH ont été diluées avec PBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, Invitrogen Corp.) pour obtenir des solutions avec des gammes de concentration allant de 50 μΜ à 1 mM. 10 pL de chacune de ces solutions ont été ajoutées à 80 pL de PBS dans une plaque noire à 96 puits, et chauffées à 37 °C avant addition de l'enzyme purifiée. Les concentrations finales de sonde étaient comprises dans la gamme allant de 5 μΜ à 100 μΜ. La plaque a ensuite été incubée à 37 °C (ou 25 °C) et la fluorescence a été mesurée au cours du temps par un lecteur de fluorescence (EnSpire, Perkin Elmer ; longueurs d'onde d'acquisition : K _ex = 355 nm, A _em = 530 nm). Les courbes résultantes sont la moyenne de duplicats.

Résultats :

Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 2 et 3.

Comparé à la sonde 28, la sonde 13 selon l'invention comportant un tandem d'espaceur éliminant/cyclisant permet de bénéficier d'une plus grande rapidité de réponse tout en conservant une haute stabilité de la sonde en l'absence de l'enzyme cible (absence de faux signal positif). Ainsi, dans les mêmes conditions de température, de pH et de concentration, la sonde 13, basée sur un tandem d'espaceurs, a une réponse enzymatique 5 fois plus rapide que celle de la sonde 28 qui ne comporte qu'un seul espaceur. De plus, en l'absence d'enzyme, la sonde 13 est stable sur plus de 15h et ne génère aucune fluorescence mesurable.

Les sondes 21 et 27 selon l'invention permettent de bénéficier d'une plus grande rapidité de réponse tout en conservant une haute stabilité de la sonde en l'absence de l'enzyme cible (absence de faux signal positif).

La sonde 21 a été testée à différentes concentration : 5 μΜ, 10 μΜ, 25 μΜ et 50 μΜ. La fluorescence mesurée est proportionnelle à la concentration de la sonde. Une fluorescence peut être détectée dès une teneur de 5 μΜ de la sonde 21.

Exemple 5

Un surnageant de culture d'une souche de levure ne sécrétant pas (A) ou sécrétant (B) une β- glucosidase a été ajouté à la sonde 21 selon l'invention répondant à cette activité enzymatique. Pour cela, des cellules de levures portant un plasmide qui confère une résistance à l'hygromycine et portant ou non une cassette d'expression d'une beta-glucosidase sécrétée sont cultivées pendant 86h à 30°C dans 5 mL de milieu riche YPD (10 g de Bacto Peptone Difco, 10 g de Bacto Yeast Extract Difco,

20 g de Glucose, 20 g de Bacto Agar, qsp IL d'eau distillée) contenant 200 pg/mL d'hygromycine. La culture est ensuite centrifugée à 4000 tr/min sur une centifugeuse Allegra 25R (Beckman/Coulter), dans un rotor oscillant (TS-5.1-500) à 20°C et 20 pL de surnageant sont prélevés et rajoutés à 180 pL d'une solution PBS1X contenant la sonde substrat à 50 μΜ. Le mélange est ensuite homogénéisé et incubé 30 minutes à 37°C. Puis, 10 pL de ce mélange sont déposés entre lame et lamelle de microscope et observés par microscopie à fluorescence avec un filtre d'excitation à 340 nm et un filtre d'émission à 525 nm.

Les photographies, représentées en figure 4, sont obtenues au grossissement lOOx à immersion sur un microscope Zeiss, AX10. Les précipités fluorescents (points blancs) apparaissent distinctement ce qui permet d'envisager une utilisation par imagerie haut débit (segmentation et quantification automatisée).

Exemple 6

La cinétique de détection d'activité cellulase dans un milieu de culture de microorganisme a été évaluée par lecture optique sur appareil MITHRAS LB 940 de l'activité enzymatique d'un surnageant de culture de cellules de levure qui sécrètent ('Surnageant') ou qui ne sécrètent pas ('Contrôle') la β-glucosydase.

Des cultures de levures sont menées comme dans le protocole décrit à l'exemple 5 jusqu'à l'obtention de 20 pL de surnageant. Ce surnageant est ensuite rajouté à 180 pL d'une solution PBS1X contenant la sonde 21 selon l'invention à 50 μΜ dans un puits de microplaques à fond opaque. La lecture du signal est faite au cours du temps sur un appareil MITHRAS LB 940, après excitation de la sonde à 340 nm et recueil de l'émission à 535 nm.

Les résultats, représentés en figure 5, montrent que l'invention permet de détecter l'activité glycosidase sécrétée dans le surnageant dès 45 minutes d'incubation, que le signal est maximal après 3h45 d'incubation, et que le rapport signal sur bruit est alors d'environ 55.