本发明涉及一种叶酸衍生物， （R ) -2- ( 2- ( R ) -3,4-二羟基 -5-羰基 -2，5- 二氢呋喃） -2-羟基乙基 -4- ( 6- ( 2-氨基 -4-叛基 -3,4-二氢嚷啶 ) 甲氨基 )苯甲 酸酯。 本发明还涉及制备所述叶酸衍生物的方法， 包含该叶酸衍生物的组合 物和试剂盒， 使用所述叶酸衍生物治疗和诊断癌症的用途， 以及所述叶酸衍 生物在制备用于诊断和治疗癌症的组合物中的 用途。 背景技术

研究表明，肿瘤细胞表面的叶酸受体与正常细 胞相比具有更高的表达 这与肿瘤细胞的迅速自我复制、 分裂及增殖有关。 叶酸与叶酸受体有很高的 亲和力， 而且当叶酸的 γ-羧基与其他小分子偶联后， 它仍能保持与叶酸受体 的高亲和力， 所以叶酸可以作为一些药物的有效载体 ^[2] ， 通过形成叶酸复合 物或叶酸衍生物， 利用叶酸受体的介导来定位肿瘤， 成为肿瘤诊断与治疗的 一条积极路径。

目前已经实验研究的叶酸复合物或叶酸衍生物 包括叶酸-丝裂霉素、 叶 酸-喜树碱、 叶酸 -去乙酰基长春碱单酰肼、 叶酸-埃坡霉素等。 这些叶酸复合 物或叶酸衍生物都具有很好的抗肿瘤活性， 并且具有较高的与叶酸受体的亲 和力， 可以选择性地作用于肿瘤细胞， 毒性比原有药物降低， 一部分在临床 研究中显示出广阔的应用前景。

设计合成与叶酸受体有高亲和力的叶酸复合物 或叶酸衍生物，探索针对 某种肿瘤细胞的最合适的间隔物 (Spacer) , 寻找出更活泼的可断裂键， 开发 具有更高实用价值的叶酸复合物或叶酸衍生物 ， 具有重要意义， 也是临床的 迫切需求。 发明内容

本发明的发明人制备了一种新的叶酸衍生物， 即（ R ) -2- ( 2- ( R ) -3,4- 二羟基 -5-羰基 -2,5-二氢呋喃） -2-羟基乙基 -4- ( 6- ( 2-氨基 -4-叛基 -3,4-二氢喋 啶） 甲氛基）苯甲酸酯， 其具有如下式 I的结构。 ^^据呋喃类化合物的抗肿 瘤属性， 可以将该叶酸衍生物作为载体， 应用于肿瘤的诊断与治疗。 此外， 发明人通过大量的实验发现了在特定实验条件 下， 通过将叶酸和抗坏血酸

(即维生素 C )通过一系列工艺步骤发生脱羧酯化， 能够以较高的收率有效 地制备具有如下式 I结构的叶酸衍生物， 由此完成了本发明。

式 I

在另一个方面， 本发明提供包含本发明式 I的叶酸衍生物的组合物。 所 述组合物在应用于肿瘤细胞的诊断与治疗时， 其中的本发明的叶酸衍生物能 够与叶酸受体靶位展现出高亲和力， 并具有在细胞内快速裂解等优点。 这些 性质具有良好的应用前景， 比如可以将本发明的叶 S史衍生物和包含本发明的 叶酸衍生物的組合物用于肿瘤细胞特异性的诊 断和治疗。

在另一个方面， 本发明提供制备本发明式 I的叶酸衍生物的方法， 所述 方法包括将叶酸在含氢键破坏剂和吡啶的溶剂 中溶解，在硫氮化合物存在下 发生氧化反应，在硫代硫酸钠的催化下与抗坏 血酸在高温条件下进行脱羧酯 化， 通过例如减压蒸馏或真空干燥的方法去除溶剂 ， 并任选地进行纯化。

本发明还提供了包含本发明式 I的叶 S交衍生物的組合物和试剂盒， 使用 所述叶酸衍生物、 组合物和试剂盒用于诊断和治疗肿瘤细胞的方 法， 以及所 述叶酸衍生物、组合物在制备用于诊断和治疗 肿瘤细胞的药物或试剂盒中的 用途。

在优选的实施方案中， 包含本发明式 I的叶酸衍生物的组合物或试剂盒 进一步含有叶酸、 亚曱基蓝、 糖类还原剂， 以应用于上皮组织肿瘤的诊断。 发明详述

叶酸与叶酸受体有很高的亲和力，本发明的叶 酸衍生物保持了这种叶酸 所具有的与叶酸受体的高亲和力， 同时其结构中呋喃环上活泼的羟基使二氢 呋喃环在细胞内分离比较容易， 能在进入细胞之后快速释放以发挥作用。 本发明式 I的叶酸衍生物， 即（ R ) -2- ( 2- ( R ) -3 ,4-二羟基 -5-羧基 -2,5- 二氢呋喃） -2-羟基乙基 -4- ( 6- ( 2-氨基 -4-簇基 -3,4-二氢喋啶） 甲氨基）苯甲 酸酯， 是一种白色晶体， 其二氢呋喃结构中位于 3 , 4位的两个羟基非常活 跃， 促使该叶酸衍生物与细胞膜表面的叶酸受体以 高亲和力结合， 在经由细 胞内吞转运至细胞内后， 快速与叶酸受体分离。 在分离之后， 该叶酸衍生物 在细胞内水解， 参与细胞的生化反应。。

本发明中所述的氢键破坏剂是本领域公知并常 用的那些，可选自但不限 于尿素、 二曱基甲酰胺（DMF )、 氢氧化钠、 二甲基亚砜（DMSO )、 十二烷 基硫酸钠。 在优选的实施方案中， 所述氢键破坏剂是二甲基甲酰胺或二甲基 亚砜。

本发明中所述的硫氮化合物是本领域公知并常 用的那些，可选自但不限 于谷胱甘肽（GSSG )、 过硫酸铵、 硫堇等。 在优选的实施方案中， 所述硫氮 化合物是谷胱甘肽或过硫酸铵。

本发明的制备方法中所指的高温脱羧酯化条件 的温度范围为 80-200摄 氏度， 优选 85-150摄氏度， 更优选 90-100摄氏度。

本发明的制备方法中溶剂的去除可以通过减压 蒸馏进行。在优选的实施 方案中， 减压蒸餾在真空度 >0.9、 使沸点为 80-90 °C的条件下进行。 溶剂的 去除也可以通过本领域技术人员公知的方式使 用真空干燥进行。

在去除溶剂之后， 即可获得本发明式 I的化合物。 在获得了本发明式 I 的化合物之后， 优选对其进行纯化。 在优选的实施方案中， 所述纯化通过洗 涤进行。 洗漆可以包括用水洗涤， 例如 1-3次， 每次洗涤在加水后搅拌 5-30 分钟， 再静置 72小时， 并离心去除上清液。

在本发明的组合物中， 除了含有本发明式 I的叶酸衍生物之外， 还可以 包含叶酸、 亚甲基蓝、 糖类还原剂中的一种或多种。 本发明的组合物可以应 用于肿瘤细^ ^的检测， 例如上皮组织的检测。

在另外一方面， 由于本发明式 I的叶酸衍生物结构中二氢呋喃环的抗病 毒、 抗肿瘤等特点， 本发明式 I的叶酸衍生物以及包含该叶酸衍生物的组合 物还可以应用于肿瘤的治疗， 如宫颈癌、 卵巢癌等。

在本发明的检测方法中， 所检测的肿瘤细胞可以来源于哺乳动物受试 者， 所述哺乳动物包括但不限于人。

在本发明的治疗方法中， 治疗的受试者可以是哺乳动物， 例如人。 下面通过实施例来进一步的描述本发明，但不 应将这些具体的实施例理 解为对本发明范围的限制。 实施例

实施例 1.式 I化合物的制备

将 3g叶酸加入作为溶剂的含 60%二曱基曱酰胺和 lg吡啶的 100ml溶液 中，撹拌 1小时使其溶解，再加入 lg谷胱甘肽，搅拌 10分钟溶解，加入 O.lg 硫代硫酸钠搅拌 5分钟溶解，加入 3g抗坏血酸后在 90摄氏度搅拌 5分钟溶 解， 减压蒸铺， 真空度 >0.9， 沸点 83°C。 后加入水搅拌 30分钟， 静置 72小 时后， 弃去上清液， 以进行洗涤純化， 将洗涤过程重复 3次。 回收纯化步骤 后的白色结晶物， 即为本发明式 I的叶酸衍生物， 获得了 74%的收率。 实施例 2.式 I化合物的制备

实施与实施例 1类似的方法，但用 95ml二甲基亚砜代替二曱基甲酰胺， 将吡啶调整为 O.lg, 叶酸溶解的搅拌时间调整为 2小时， 再将硫代硫酸钠调 整为 0.3g, 对于本发明式 I的叶酸衍生物获得了 71%的收率。 实施例 3. 式 I化合物的制备

实施与实施例 1类似的方法，但用 0.3 g过疏酸铵代替谷胱甘肽，对于本 发明式 I的叶酸衍生物获得了 75%的收率。 实施例 4. 式 I化合物的制备

实施与实施例 1类似的方法， 但用 95ml二甲基亚砜和 0.3g过硫酸铵分 别替换二甲基曱酰胺和谷胱甘肽， 将叶酸溶解的搅拌时间调整为 2小时， 再 将硫代硫酸钠调整为 0.3g，对于本发明式 I的叶酸衍生物获得了 76%的收率。

在以上实施例 1-4中， 所述的 "百分比，，为"重量百分比"。 收率 =合成目标 产物消耗的理论上的反应物 /实际参加反应的反应物。 实施例 5

在以下组合物的应用实施例中，通过实施例和 对比例进一步说明本发明 的组合物。 其中， 以宫颈上皮组织为检查对象， 以宫颈组织病理学检查结果 为参照标准， 用敏感性说明含组合物的检测剂的检出率， 敏感性越高， 发现 异常上皮组织的能力强； 用特异性说明含组合物的检测剂的准确性， 特异性 越高， 表明检出的异常上皮组织与病理学检查结果符 合率高。

具体而言， 在本发明中， 敏感性和特异性如下定义和计算：

敏感性 =真阳性人数 / (真阳性人数+假阴性人数 ) 100%

特异性 =真阴性人数 / (真阴性人数 +假阳性人数 ) X 100% 分别以下表 1 中指定的各组分将药用级叶酸和叶酸衍生物（ R ) -2- ( 2- ( R ) -3 ,4-二羟基 -5-叛基 -2,5-二氢呋喃） -2- 基乙基 -4- ( 6- ( 2-氨基 -4-談基 -3,4-二氢喋啶） 甲氨基）苯甲酸酯在常温和常压下溶解， 加入生物检测剂亚 甲基蓝搅拌并使其溶解， 加入还原剂葡萄糖搅拌 30分钟， 后加入分析纯乙 酸搅拌混合制成检测剂组合物。

将检测剂组合物用大棉签蘸取，涂抹在宫颈上 皮组织上，立即取出棉签， 即刻观察棉签的颜色变化， 棉签的颜色为淡黄棕色， 提示上皮组织无病变； 棉签的顏色为绿色或蓝绿色， 提示炎性病变、 尖锐湿疣 (HPV 病毒感染)和 CIN I病变； 棉签的颜色为褐绿色、 紫黑色， 提示 CINII+病变。

同时， 在上皮组织多点取活组织送组织病理学检查， 然后以组织病理学 检测结果为标准，测试检测剂的敏感性和特异 性，在表 1中列出了测试结果。 实施例 6

与实施例 5中类似地配制检测剂组合物，具体组分的构� �参照以下的表 1中指定的各组分含量， 配制方法和检测方法与实施例 5的方法相同， 具体 而言， 将实施例 5中的葡萄糖用还原剂己糖衍生物代替。 在表 1中列出了测 试结果。 对比例 1

在常温和常压下，将 5ml的乙酸加入 95ml的蒸 水中混合， 制成 5%的 乙酸溶液， 用大棉签蘸取， 涂抹在宫颈上皮组织上， 等待一分钟， 在宫颈的 鳞柱交界处观察上皮组织上有无乙酸白化区出 现， 并观察其边界、 厚度、 颜 色、 反应时间等， 如果有边界清晰的乙酸白化区， 提示 CIN I以上病变。 所 有观察的上皮组织同时多点取活组织送组织病 理学检查， 以组织病理学检测 结果为标准， 测试 5%乙酸溶液的敏感性和特异性， 在表 1 中列出了测试结 果。 对比例 2

在常温和常压下， 将 10g的琪化钾溶解于 100ml蒸馏水中， 加入 5g的 碘， 搅拌溶解， 制成卢戈氏碘液， 用大棉签蘸取， 涂抹在宫颈上皮组织上， 观察上皮组织是否碘染， 正常上皮呈赤棕色或黑色， 而异常上皮呈厚的芥末 黄或土黄色， 提示 CIN I以上病变。 同时对所有观察的上皮组织多点取活组 织送组织病理学检查， 以组织病理学检测结果为标准， 测试卢戈氏碘液的敏 感性和特异性， 在表 1中列出了测试结果。 表 1

参考文献

1. Tran T, Shatnawi A, Zheng X, et al. (2005) Enhancement of folate receptor alpha expression in tumor cells through the glucocorticoid receptor: a promising means to improved tumor detection and targeting. Cancer Res 65: 4431-4441.

2、 Leamon CP.Reddy JA. Folate-targeted chemotherapy [J].Adv Drug Deliv Rev,2004,56:1127-1141.